專利名稱：用作癌癥治療和診斷的靶基因的jarid1b的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及癌癥研究、癌癥診斷和癌癥治療領(lǐng)域。 特別地，本發(fā)明涉及用于檢測和診斷癌癥的方法以及用于治療和預(yù)防癌癥的方法。此外，本發(fā)明涉及用于篩選用于治療和/或預(yù)防癌癥的候選化合物的方法。
背景技術(shù)：
癌癥是一個(gè)首要的死亡原因，全世界每年有數(shù)以百萬計(jì)的人死于癌癥。癌癥病例的數(shù)目在全球范圍內(nèi)越來越多。癌癥的治療基本上通過手術(shù)、放療和化療來實(shí)施。然而，這些治療的有效性仍然有限。此外，因?yàn)檫@些治療有時(shí)引起不良反應(yīng)，所以許多癌癥患者在治療后遭受身體虛弱。膀胱癌是第二位最常見的生殖泌尿腫瘤，發(fā)病率為全世界每年新增大約357，000 例(NPL 1)。大約三分之一的膀胱癌在診斷時(shí)懷疑是侵入性或轉(zhuǎn)移性疾病(NPL 1-3)。雖然針對(duì)侵襲性膀胱癌的根治性膀胱切除術(shù)仍然是全世界許多地方的標(biāo)準(zhǔn)療法，但是幾乎一半的此類患者在膀胱切除術(shù)后兩年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，并隨后死于該病。在最近二十年里，基于順鉬的組合化療方案諸如CMV(順鉬、甲氨蝶呤、和長春堿)或M-VAC(甲氨蝶呤、長春堿、多柔比星、和順鉬)已經(jīng)主要應(yīng)用于具有晚期膀胱癌的患者(NPL 3-6)。然而，總體預(yù)后仍然很差，而且由這些組合化療引起的不良反應(yīng)非常嚴(yán)重(NPL 7)。因此，迫切需要開發(fā)針對(duì)膀胱癌的新分子靶藥物。肺癌是世界上癌癥死亡的首要原因，而且非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占那些病例的幾乎80% (NPL 8)。已經(jīng)報(bào)告了許多與肺癌形成和進(jìn)展有關(guān)的遺傳改變，但是確切的分子機(jī)制仍然不清楚(NPL 9)。在最近十年里，數(shù)種新開發(fā)的化療劑諸如帕利他賽、多西他賽、吉西他濱、和長春瑞濱已經(jīng)開始為治療具有晚期肺癌的患者提供多個(gè)選項(xiàng)；然而，那些方案與基于順鉬的療法相比每提供的存活效益都非常微小(NPL 10，11)。因此，人們正在急切尋找新治療策略，諸如分子靶向藥物。組蛋白甲基化在調(diào)節(jié)染色質(zhì)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。染色質(zhì)開閉的精確協(xié)調(diào)和組織對(duì)于正常細(xì)胞過程諸如DNA復(fù)制、修復(fù)、重組和轉(zhuǎn)錄是至關(guān)重要的。直到最近，組蛋白甲基化都被認(rèn)定為一種靜態(tài)修飾，但是組蛋白脫甲基酶的鑒定揭示了組蛋白甲基化是受到動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的(NPL 12，13)。組蛋白脫甲基酶不僅調(diào)節(jié)修飾作用本身，而且還通過拮抗效應(yīng)蛋白對(duì)經(jīng)修飾染色質(zhì)的結(jié)合來間接發(fā)揮功能。這樣的例子是JHDM3A/JMJD2A，其消除受到HPl 識(shí)別的H3K9甲基化標(biāo)志并阻止HPl對(duì)H3K9的甲基化擴(kuò)散至周圍染色質(zhì)，從而自染色質(zhì)置換出HPl (NPL 14-16)。從酵母至人類的一個(gè)廣泛的蛋白質(zhì)的家族含有JmjC域，該結(jié)構(gòu)域最近被表征為組蛋白脫甲基酶簽名基序(NPL 17)。盡管對(duì)組蛋白脫甲基酶在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的重要作用的知識(shí)越來越多，但是對(duì)它們的生理功能的了解仍然有限，特別是在人類疾病的背景中。 本發(fā)明人先前顯示了 SMYD3，一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，經(jīng)由它的甲基轉(zhuǎn)移酶活性來刺激細(xì)胞增殖，而且在人類致癌作用中發(fā)揮重要作用(PTL 1, NPL 18-22)。其它研究也指示組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶有助于人類細(xì)胞的惡性改變(NPL M-26)。 引用表專利文獻(xiàn)W02005/071102 非專利文獻(xiàn)Sternberg CN,et al. ，Ann Oncol 1995 6:113-26 [NPL 3]Ardavanis A, et al. , Br J Cancer 2005 92 :645-50 [NPL 4]Lehmann J,et al. , World J Urol 2002 20 :144-50 [NPL 5]Rosenberg JE,et al.，J Urology 2005 174 :14-20 [NPL 6]Theodore C,et al. , Eur J Cancer 2005 41 :1150-7 [NPL 7]Vaughn DJ, et al.，Semin Oncol 1999 Suppl 2 ; 117-22 [NPL 8]Greenlee RT et al. , CA Cancer J Clin 2001 Jan-Feb，51(1) :15-36 [NPL 9]Sozzi G, Eur J Cancer 2001 Oct,37 Suppl 7 :S63_73 [NPL IOjKelly K et al. , J Clin Oncol 2001 Jul 1,19(13) :3210-8 [NPL 11]Schiller JH et al. ，N Engl J Med 2002 Jan 10,346(2) :92-8 [NPL 12]Shi Y. et al. Cell 2004 ；119 :941-53 [NPL 13]Tsukada Y. et al. Nature 2006 ；439 :811-6 [NPL 14]Cloos PA et al.Nature 2006 ；442 :307-11 [NPL 15]Fodor BD et al. Genes Dev 2006 ；20 :1557-62 [NPL 16]Klose RJ et al. Nature 2006 ；442 :312-6 [NPL 17]Klose RJ et al. Nat Rev Genet 2006 ；7 :715-27 [NPL 18]Hamamoto R. et al. Nat Cell Biol 2004 ；6 :731-40 [NPL 19]Hamamoto R. et al. Cancer Sci 2006 ；97 :113-8 [NPL 20]Kunizaki Μ. et al.Cancer Res 2007 ；67 :10759-65 [NPL 21]Silva FP et al. Oncogene 2008 ；27 :2686-92 [NPL 22]Tsuge Μ. et al. Nat Genet 2005 ；37 :1104-7 [NPL 23]Sparmann A. et al. Nat Rev Cancer 2006 ；6 :846-56 [NPL 24]Takeshita F. et al.Proceedings of the National Academy dences of the United States of America 2005 ；102 :12177-82Schneider R. et al. Trends in biochemical sciences 2002 ；27 396-402
發(fā)明概述
本發(fā)明的目的是提供針對(duì)癌癥的新型診斷和治療策略，所述癌癥諸如急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌，尤其是膀胱癌和肺癌。本發(fā)明基于如下的發(fā)現(xiàn)，即JARIDlB(jum0nji，富含AT的相互作用域1B)基因，一種屬于JARID家族的H3K4脫甲基酶，在包括膀胱癌和肺癌在內(nèi)的許多類型的癌癥中的表達(dá)水平與正常組織相比上調(diào)。本發(fā)明人進(jìn)一步檢查了靶向JARID1B基因的小干擾RNA(siRNA) 對(duì)癌性細(xì)胞生長的影響并確認(rèn)了此類siRNA具有抑制癌性細(xì)胞生長的能力。因此，本發(fā)明涉及JARID1B作為癌性標(biāo)志的用途、靶向JARID1B基因的雙鏈分子、靶向JARID1B基因的診斷或治療癌癥的方法、及篩選對(duì)治療癌癥有用的候選藥劑或化合物的方法。本發(fā)明的一個(gè)方面是用于診斷癌癥的方法，包括下列步驟(a)測定源自受試者的生物樣品中JARID1B基因的表達(dá)水平，并(b)將步驟(a)中測得的表達(dá)水平與所述基因的正常對(duì)照水平相比的升高與癌癥的存在關(guān)聯(lián)起來。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，要診斷的癌癥是急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌和腎細(xì)胞癌，更優(yōu)選膀胱癌和肺癌。所述生物樣品可通過自受試者收獲例如活檢樣品、痰、血液、淋巴、胸腔積液或尿液來制備。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 JARID1B基因產(chǎn)物作為癌性標(biāo)志的用途。例如，如果某人檢測出生物樣品(諸如細(xì)胞、組織、血液或其它體液)中自JARID1B基因衍生的mRNA 或多肽的量與非癌性樣品相比過量的話，該生物樣品可確定為污染有癌性細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面是分離的靶向JARID1B基因的雙鏈分子，其包含有義鏈和與其互補(bǔ)的反義鏈，其中所述鏈彼此雜交以形成雙鏈分子，其中所述有義鏈包含與作為靶序列的SEQ ID NO 21或30對(duì)應(yīng)的核酸序列。所述雙鏈分子在導(dǎo)入可過表達(dá)JARID1B基因的癌性細(xì)胞中時(shí)不僅抑制JARID1B基因表達(dá)，而且還抑制細(xì)胞增殖。因此，所述雙鏈分子可對(duì)治療涉及JARID1B基因過表達(dá)的癌癥有用。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈分子具有介于約19個(gè)和約25個(gè)核苷酸的長度。更優(yōu)選地，所述雙鏈分子在有義鏈和/或反義鏈3'端任一或二者處具有由少數(shù)核苷酸組成的一個(gè)或兩個(gè)3'突出端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈分子由單一多核苷酸組成，該單一多核苷酸包含通過間插單鏈核酸序列連接的有義鏈和反義鏈二者。本發(fā)明的雙鏈分子可以自編碼它的載體生成，這通過將載體導(dǎo)入細(xì)胞中來實(shí)現(xiàn)。 因此，本發(fā)明還涵蓋編碼所述雙鏈分子的載體以及分離的分子。本發(fā)明的分離的雙鏈分子和載體適合于治療急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌，更優(yōu)選膀胱癌和肺癌。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于抑制癌細(xì)胞增殖的方法，以及用于治療或預(yù)防癌癥的方法。本發(fā)明的方法包括對(duì)受試者施用分離的靶向JARID1B基因的雙鏈分子或編碼它的載體的步驟。所述雙鏈分子包含有義鏈和與其互補(bǔ)的反義鏈，其中所述鏈彼此雜交以形成雙鏈分子，其中所述有義鏈包含與JARID1B基因或其片段的核酸序列對(duì)應(yīng)的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，JARID1B基因的核酸序列是SEQ ID NO 1的序列。更優(yōu)選地， 所述雙鏈分子具有約19個(gè)-約25個(gè)核苷酸的長度。更優(yōu)選地，所述有義鏈和/或反義鏈任一或二者具有由少數(shù)核苷酸組成的3'突出端。更優(yōu)選地，JARID1B基因片段的核酸序列是SEQ ID NO :21或30的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈分子由單一多核苷酸分子組成，該單一多核苷酸分子包含通過間插單鏈連接的有義鏈和反義鏈二者。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可用于急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞
7性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌，更優(yōu)選膀胱癌和肺癌。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于抑制癌細(xì)胞增殖及用于治療或預(yù)防癌癥的組合物。所述組合物包含分離的靶向JARID1B基因的雙鏈分子或編碼它的載體。所述雙鏈分子包含有義鏈和與其互補(bǔ)的反義鏈，其中所述鏈彼此雜交以形成雙鏈分子，其中所述有義鏈包含與 JARID1B基因或其片段的核酸序列對(duì)應(yīng)的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，JARID1B基因的核酸序列是SEQ ID NO 1的序列。更優(yōu)選地， 所述雙鏈分子具有約19個(gè)-約25個(gè)核苷酸的長度。更優(yōu)選地，所述有義鏈和/或反義鏈任一或二者具有由少數(shù)核苷酸組成的3'突出端。更優(yōu)選地，JARID1B基因片段的核酸序列是SEQ ID NO :21或30的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈分子由單一多核苷酸組成，該單一多核苷酸包含通過間插單鏈連接的有義鏈和反義鏈二者。所述組合物可用于治療癌癥，這通過對(duì)罹患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用來進(jìn)行，所述癌癥諸如急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌，優(yōu)選膀胱癌和肺癌。本發(fā)明的另一個(gè)方面是篩選用于抑制癌細(xì)胞增殖的化合物的方法。通過所述篩選方法鑒定的化合物可以是用于治療或預(yù)防癌癥的候選化合物。此類候選化合物可適合于治療急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌，優(yōu)選膀胱癌和肺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述篩選方法包括下列步驟(a)使測試藥劑或化合物與 JARID1B多肽接觸，(b)檢測所述多肽與所述測試藥劑或化合物之間的結(jié)合，并(c)選擇與所述多肽結(jié)合的測試藥劑或化合物作為候選藥劑或化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述篩選方法包括下列步驟(a)使測試藥劑或化合物與 JARID1B多肽接觸，(b)檢測所述多肽的生物學(xué)活性，并(c)選擇與在測試藥劑或化合物不存在下檢出的所述多肽或片段的生物學(xué)活性相比抑制所述生物學(xué)活性的測試藥劑或化合物作為候選藥劑或化合物。在本發(fā)明中，所述生物學(xué)活性選自下組細(xì)胞增殖活性，凋亡誘導(dǎo)和組蛋白H3脫甲基化活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述篩選方法包括下列步驟(a)使測試藥劑或化合物與表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞接觸，(b)測定JARID1B基因的表達(dá)水平，并(c)選擇與在測試藥劑或化合物不存在下檢出的表達(dá)水平相比降低JARID1B基因的表達(dá)水平的測試藥劑或化合物作為候選藥劑或化合物。JARID1B基因的表達(dá)水平可通過測量來自JARID1B基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物來直接測定，以及通過測量下游基因諸如E2F1和E2F2的表達(dá)水平來間接測定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述篩選方法包括下列步驟(a)使測試藥劑或化合物與其中導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，該載體包含JARID1B的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報(bào)道基因，(b)測量所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性，并(C)選擇與在測試藥劑或化合物不存在下的所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性水平相比降低所述表達(dá)或活性水平的測試藥劑或化合物作為候選藥劑或化合物。優(yōu)選地，對(duì)于通過上文所述的篩選方法選擇的候選藥劑或化合物，通過與癌細(xì)胞接觸，然后選擇抑制癌細(xì)胞增殖的候選藥劑或化合物，來進(jìn)一步進(jìn)行篩選。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)方面可以滿足某些目的，而一個(gè)或多個(gè)其它方面可以滿足某些其它目的。每一個(gè)目的可能不在全部方面均同等地適用于本發(fā)明的每一個(gè)方面。因此，前述目的可以擇一地適用于本發(fā)明的任何一個(gè)方面。在聯(lián)系附圖和實(shí)施例閱讀下面的詳細(xì)說明時(shí)，本發(fā)明的這些和其它目的和特征將變得更加顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，前面的發(fā)明概要和后面的詳細(xì)說明都僅僅提出了優(yōu)選的實(shí)施方案，并不對(duì)本發(fā)明或本發(fā)明的其它可替換實(shí)施方案構(gòu)成限制。附圖簡述

圖1A-C。圖1描繪了英國人和日本人患者中膀胱癌中升高的JARID1B表達(dá)。A顯示了正常膀胱組織和依據(jù)臨床階段分類的膀胱癌組織中使用定量實(shí)時(shí)PCR測量的JARID1B 基因表達(dá)水平的散布圖。B描繪了英國人病例中正常和腫瘤膀胱組織中的JARID1B基因表達(dá)。通過定量實(shí)時(shí)PCR來分析JARID1B的表達(dá)水平，并以盒須圖顯示結(jié)果(中值50 %加盒)。 相對(duì)mRNA表達(dá)顯示依據(jù)GAPDH和SDH表達(dá)來標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)值。使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。C描繪了日本人患者中膀胱正常與腫瘤組織之間的表達(dá)比。通過cDNA微陣列來分析每份樣品的信號(hào)強(qiáng)度，而表達(dá)比是腫瘤中的信號(hào)強(qiáng)度除以正常中的信號(hào)強(qiáng)度(1 為正常)。圖ID-Ε。D描繪了日本人患者中正常與腫瘤膀胱組織之間JARID1B表達(dá)的比較。 通過cDNA微陣列來分析每份樣品的信號(hào)強(qiáng)度，并以盒須圖顯示結(jié)果(中值50%加盒)。使用Marm-Whitney U檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。E描繪了膀胱組織中JARID1B的免疫組織化學(xué)染色。使用未免疫小鼠IgG作為一抗的替代以消除來自IgG非特異性結(jié)合或來自二抗的假陽性響應(yīng)的可能性。用蘇木精和曙紅進(jìn)行復(fù)染色。初始放大率為40倍和400倍。圖2。圖2描繪了通過針對(duì)JARID1B的蛋白質(zhì)表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)來染色的各種背景的膀胱腫瘤的組織微陣列圖像。用蘇木精和曙紅進(jìn)行復(fù)染色。初始放大率為100 倍、200倍和400倍。圖3A-B。圖3描繪了肺癌中升高的JARID1B表達(dá)。A描繪了正常肺與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織之間的表達(dá)比。通過cDNA微陣列來分析每份樣品的信號(hào)強(qiáng)度，而表達(dá)比是腫瘤中的信號(hào)強(qiáng)度除以正常中的信號(hào)強(qiáng)度(1為正常)。B描繪了正常肺與小細(xì)胞肺癌 (SCLC)組織之間的表達(dá)比。通過cDNA微陣列來分析每份樣品的信號(hào)強(qiáng)度，而表達(dá)比是腫瘤中的信號(hào)強(qiáng)度除以正常中的信號(hào)強(qiáng)度(1為正常)。圖3C-D。C描繪了正常與腫瘤肺組織之間的JARID1B表達(dá)的比較。通過cDNA微陣列來分析每份樣品的信號(hào)強(qiáng)度，并以盒須圖顯示結(jié)果(中值50%加盒)。使用Marm-Whitney U檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。D描繪了肺組織中使用小鼠單克隆抗JARID1B抗體的免疫組織化學(xué)染色圖像。使用未免疫小鼠IgG作為一抗的替代來驗(yàn)證來自IgG非特異性結(jié)合或來自二抗的假陽性響應(yīng)的可能性。用蘇木精和曙紅進(jìn)行復(fù)染色。初始放大率為40倍和400倍。圖4。圖4描繪了通過針對(duì)JARID1B的蛋白質(zhì)表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)來染色的各種背景的肺腫瘤的組織微陣列圖像。在組織學(xué)圖像上方顯示了每個(gè)切片的臨床信息。用蘇木精和曙紅進(jìn)行復(fù)染色。初始放大率為100倍、200倍和400倍。圖5。圖5描繪了日本人群中AML、宮頸癌、CML、乳腺癌和腎細(xì)胞癌中升高的 JARID1B表達(dá)。比較了正常與腫瘤組織之間JARID1B的表達(dá)水平。通過cDNA微陣列來分析每份樣品的信號(hào)強(qiáng)度，并以盒須圖顯示結(jié)果(中值50%加盒)。使用Marm-Whitney U檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
圖6。圖6描繪了通過用7. 5ug/ml阿非迪霉素處理M小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞周期阻滯，然后在除去阿非迪霉素后4小時(shí)和12小時(shí)使用抗JARID1B單克隆抗體(Alexa594)、鬼筆毒環(huán)肽(F-肌動(dòng)蛋白，Alexa488)和4' 6' -二脒-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色的SBC5細(xì)胞。插圖顯示了 FACS分析，證明阿非迪霉素處理后4小時(shí)(上部)和12小時(shí)(下部)細(xì)胞周期阻滯的同步釋放。圖7A-E。圖7描繪了膀胱和肺癌細(xì)胞的生長中JARID1B的參與。A描繪了 12個(gè)膀胱癌細(xì)胞系、4個(gè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系和1個(gè)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中JARID1B基因的表達(dá)樣式。B描繪了定量實(shí)時(shí)PCR，顯示SW780和A549細(xì)胞中靶向JARID1B的siRNA (siJARIDlB#l) 對(duì)JARID1B基因的內(nèi)源表達(dá)的抑制。使用靶向EGFP的siRNA(siEGFP)作為對(duì)照。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值加/減SD。C描繪了 JARID1B siRNA敲低對(duì)膀胱癌細(xì)胞系(RT4、SW780 和UMUC3)和肺癌細(xì)胞系(LC319、RERF-LC-AI和SBC5)的生存力的影響。一式三份檢查細(xì)胞生存力。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值加/減SD。使用Student氏t檢驗(yàn)來計(jì)算P值。D 描繪了用對(duì)照siRNA或靶向JARID1B基因的siRNA (siJARID1B#1)處理后72小時(shí)通過FACS 分析的SBC5細(xì)胞的DNA含量。E描繪了 D中的FACS結(jié)果的數(shù)值分析，通過細(xì)胞周期狀態(tài)將細(xì)胞分類。與經(jīng)對(duì)照siRNA處理的癌細(xì)胞相比，用siJARIDlB#l處理后處于sub_Gl期的癌細(xì)胞比例顯著較高。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值加/減SD。使用Mudent氏t檢驗(yàn)來計(jì)算 P值。圖7F-G。F描繪了定量實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果，顯示SW780、A549和SBC5細(xì)胞中兩種不同JARID1B特異性siRNA(siJARIDlB#l和#2)對(duì)內(nèi)源JARID1B表達(dá)的抑制。使用siEGFP和 siNC作為對(duì)照。將mRNA表達(dá)水平依據(jù)GAPDH和SDH表達(dá)來標(biāo)準(zhǔn)化，且數(shù)值是相對(duì)于siEGFP 的(siEGFP = 1)。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值加/減SD。G描繪了 JARID1B siRNA敲低對(duì)膀胱癌細(xì)胞系(SW780和RT4)和肺癌細(xì)胞系(AM9、LC319和SBC5)的生存力的影響。相對(duì)細(xì)胞數(shù)顯示對(duì)經(jīng)siEGFP處理的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)值。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值加/減 SD。使用Student氏t檢驗(yàn)來計(jì)算P值。圖8。圖8描繪了敲低JARID1B表達(dá)后SW780和A549 mRNA表達(dá)譜的二維無監(jiān)督分級(jí)聚類分析。選擇差異表達(dá)基因進(jìn)行此分析。紅色顯示上調(diào)的基因(左邊一欄)；綠色顯示下調(diào)的基因(右邊兩欄)。圖9。圖9描繪了 E2F1和E2F2作為JARID1B的下游基因的確認(rèn)。A和B描繪了用靶向 JARIDlB(siJARIDlB#l)或 EGFP (對(duì)照)的 siRNA 處理后 SW780、A549 和 SBC5 細(xì)胞中通過定量實(shí)時(shí)PCR分析的E2F1 (A)和E2F2(B)的表達(dá)水平。相對(duì)mRNA表達(dá)是任意值，但是對(duì)于每一個(gè)細(xì)胞群，將表達(dá)對(duì)GAPDH和SDH表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化?；谌为?dú)立實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 使用Mudent氏t檢驗(yàn)來計(jì)算P值。C描繪了通過實(shí)時(shí)PCR測量的E2F1和E2F2表達(dá)，它們?cè)诎螂啄[瘤組織中與非瘤膀胱組織相比顯著上調(diào)，與腫瘤組織中JARID1B表達(dá)的上調(diào)成比例。分析了 13份癌癥和正常組織中的每一份，并使用Marm-Whitney U檢驗(yàn)和Spearman氏秩相關(guān)系數(shù)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。D描繪了 JARID1B基因表達(dá)的siRNA敲低對(duì)E2F的轉(zhuǎn)錄活性的影響。使用Cignal E2F報(bào)道物測定試劑盒進(jìn)行此測定法。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值加/減SD。使用Student氏t檢驗(yàn)來計(jì)算P值。E描繪了蛋白質(zhì)水平的JARID1B、E2F1和 E2F2表達(dá)。對(duì)來自siJARIDlB#l或siJARIDlB#2處理后的A549和SBC5細(xì)胞的溶胞物用抗 JARID1B、E2F1、E2F2和肌動(dòng)蛋白抗體進(jìn)行免疫印跡。肌動(dòng)蛋白充當(dāng)內(nèi)部對(duì)照。
圖10。圖10描繪了通過JARID1B的蛋白質(zhì)表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)染色的正常心、腎和肝的圖像。在沒有一抗的情況下實(shí)施對(duì)照染色以消除來自二抗的假陽性響應(yīng)的可能性，并用蘇木精和曙紅進(jìn)行復(fù)染色。初始放大率為40倍和400倍。圖11。圖11描繪了 A549細(xì)胞中JARID1B的亞細(xì)胞定位。A549細(xì)胞。對(duì)這些細(xì)胞通過用7. 5ug/ml阿非迪霉素處理M小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞周期阻滯，然后在除去阿非迪霉素后0、 4、8、12和對(duì)小時(shí)使用抗JARID1B單克隆抗體(Alexa488，綠色)、鬼筆毒環(huán)肽(F-肌動(dòng)蛋白， Alexa594，紅色)和4' 6' -二脒-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI ；藍(lán)色)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。插圖顯示了 FACS分析，證明細(xì)胞周期阻滯的同步釋放，而箭頭指示JARID1B的胞質(zhì)定位。將A549細(xì)胞用含有4%低聚甲醛的PBS(-)固定20分鐘，并用含有0. 1 % Triton X-100的PBS(-)于室溫透化2分鐘。隨后，將細(xì)胞用含有3%牛血清白蛋白的PBS(-)于室溫覆蓋1小時(shí)以封閉非特異性雜交，然后與以1 100比稀釋度稀釋的小鼠抗JARID1B抗體(1G10，Abnova) 一起溫育。用PBS(-)清洗后，用1 1000稀釋的綴合有Alexa594的抗小鼠二抗(Molecular ftObe)對(duì)細(xì)胞染色。用4' ,6' -二脒-苯基吲哚二鹽酸鹽 (DAPI)對(duì)核復(fù)染色。在TCS SP2 AOBS顯微鏡(Leica)下獲得熒光圖像。圖12。圖12描繪了 SBC5細(xì)胞中JARID1B的亞細(xì)胞定位。對(duì)SBC5細(xì)胞通過用 7. 5ug/ml阿非迪霉素處理M小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞周期阻滯，然后在除去阿非迪霉素后0、4、8、 12和M小時(shí)使用抗JARID1B單克隆抗體(Alexa488，綠色)、鬼筆毒環(huán)肽(F-肌動(dòng)蛋白， Alexa594，紅色)和4' 6' -二脒-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI ；藍(lán)色)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。插圖顯示了 FACS分析，證明細(xì)胞周期阻滯的同步釋放，而箭頭指示JARID1B的胞質(zhì)定位。實(shí)施方案的描述現(xiàn)在描述例示性的方法和材料，盡管在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)施方案時(shí)可以使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料。然而應(yīng)理解本發(fā)明并不限于本文描述的特定分子、組合物、方法或方案，因其可根據(jù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)與優(yōu)化而有變化。亦應(yīng)理解說明書中使用的術(shù)語僅以描述特定版本或?qū)嵤┓桨笧槟康?，并非意欲限定本發(fā)明的范圍，所述范圍僅由權(quán)利要求所限定。除非另行定義，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常理解的意義相同。然而，若有沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。因而，在本發(fā)明的語境中，適用下列定義。定義除非另有具體指明，如本文中使用的詞語“一個(gè)”、“一種”、和“該”意思是“至少一個(gè)”。術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、和“核酸分子”在本文中可互換使用，指核酸殘基的多聚物，而且，除非另有具體指明，用其通常為人接受的單字母代碼進(jìn)行指代。所述術(shù)語適用于其中一個(gè)或更多核酸通過酯鍵連接的核酸(核苷酸)多聚體。所述核酸多聚體可包括DNA、RNA或其組合，而且涵蓋天然出現(xiàn)的和非天然出現(xiàn)的核酸多聚體。術(shù)語“多肽”、“肽”、和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的多聚體。所述術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是修飾殘基，或非天然出現(xiàn)的殘基，諸如對(duì)應(yīng)于
11天然出現(xiàn)殘基的人工化學(xué)模擬物的氨基酸多聚體，以及天然出現(xiàn)的氨基酸多聚體。除非另有定義，“癌癥”指過表達(dá)JARID1B基因的癌癥。過表達(dá)JARID1B基因的癌癥的例子包括但不限于急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌和腎細(xì)胞癌，更優(yōu)選膀胱癌和肺癌。TARID1B 基因JARID1B，也稱作Plul，由人類中的旁系同源JARID家族基因(KortschakRD et al.Trends Biochem Sci 2000；25 :294-9, Wilsker D. et al.Genomics2005；86 :242-51) 之一編碼。除了 JmjC域之外，它還含有其它與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子共有的域，包括JmjN域、Bright/ Arid域、C5H2C鋅指、和數(shù)個(gè)PHD域。JARID家族的所有四個(gè)成員都擁有H3K4脫甲基酶活性(Christensen J. et al. Cell2007 ； 128 1063-76，Iwase S. et al. Cell 2007 ； 128 1077-88，Klose RJ et al.Cell2007；128 :889-900, Lee MG et al. Cell 2007 ；128 877-87, Yamane K. et al. MolCell 2007 ;25 :801-12)。雖然可能存在功能冗余，但是每個(gè)成員似乎經(jīng)由募集至不同的染色體區(qū)和不同酶活性而參與不同的生物學(xué)過程(Klose RJ et al. Nat Rev Genet 2006;7:715-27)。JARID1B基因的例示性核酸和多肽序列分別顯示于SEQ ID NO 1和2，但不限于此。另外，序列數(shù)據(jù)亦可通過下述登錄號(hào)獲取分別為例如NM_006618和NP_006609。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，功能等同物亦認(rèn)為是“JARID1B多肽”。在本文中，JARID1B 蛋白的“功能等同物”為具有與JARID1B蛋白等同的生物學(xué)活性的多肽。也就是，任何保留 JARID1B蛋白的生物學(xué)能力的多肽均可用作本發(fā)明中的此類功能等同物。例如，功能等同物包括具有與JARID1B蛋白相似的細(xì)胞增殖活性、抗凋亡活性、脫甲基酶活性或促進(jìn)E2F1和 E2F2表達(dá)的活性的多肽。一般地說，已知蛋白中一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白的功能。 事實(shí)上，已知突變的或經(jīng)過修飾的蛋白(即具有如下氨基酸序列，其中通過替代、刪除、插入和/或添加修飾了一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基)保留原始的生物學(xué)活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 81 :5662-6(1984) ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10 :6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland etal. , Proc Natl Acad Sci USA 79 6409-13(1982))。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)氨基酸序列進(jìn)行改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸的個(gè)別添加、刪除、插入、或替代，或者被認(rèn)為是“保守修飾”的那些修飾，其中蛋白的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白，這些都是本發(fā)明的語境中可接受的。只要保持JARID1B蛋白的活性，氨基酸突變的數(shù)目不受特別限制。然而，一般優(yōu)選改變氨基酸序列的20%或更少，更優(yōu)選氨基酸序列的10%或更少，更優(yōu)選氨基酸序列的 5%或更少。因而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在此類突變體中要突變的氨基酸數(shù)目一般為 30個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選20個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選10個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選6個(gè)氨基酸或更少，甚至更優(yōu)選3個(gè)氨基酸或更少。短語“保守修飾”指如下的修飾，要突變的氨基酸殘基優(yōu)選突變?yōu)楸３职被醾?cè)鏈特性的另一種氨基酸。氨基酸側(cè)鏈特性的例子有疏水性氨基酸仏，1丄，1^，？^，力、親水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下列共同官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含有羥基基團(tuán)的側(cè)鏈(S，T，Y)；含有硫原子的側(cè)鏈(C，M)；含有羧酸和酰胺的側(cè)鏈(D，N, E，Q)；含有堿的側(cè)鏈(R，K，H)；和含有芳香族的側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本領(lǐng)域是公知的。例如，下列8個(gè)組各自包含彼此構(gòu)成保守性替代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守性修飾多肽包括在本發(fā)明的蛋白中。然而，本發(fā)明并不僅限于此，而且蛋白包括非保守性修飾，只要JARID1B蛋白的至少一種生物學(xué)活性得以保留即可。另外，經(jīng)過修飾的蛋白并不排除多態(tài)變體、種間同源物、和那些由這些蛋白的等位基因編碼者。本發(fā)明的多肽可在氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)、糖鏈的有無、或形式方面有變化， 這取決于用于產(chǎn)生它的細(xì)胞或宿主，或使用的純化方法。無論如何，只要它具有與JARID1B 蛋白等同的功能，它就在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以由在嚴(yán)格條件下與JARID1B基因的天然存在核苷酸序列雜交的多核苷酸編碼。短語“嚴(yán)格條件”指這樣的條件，在該條件下， 核酸分子會(huì)與其靶序列雜交，通常在核酸復(fù)雜混合物中，而沒有與其它序列的可檢測的雜交。嚴(yán)格條件取決于序列，而且在不同情況中會(huì)有所不同。較長的序列在更高溫度特異性雜交。對(duì)于核酸雜交詳盡指導(dǎo)可見于Ti jssen，^Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays，，(1993)。 一1 ^/eH-條件選擇為在限定的離子強(qiáng)度pH，比特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低大約5-10°C。Tm是如下的溫度(在限定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)，在該溫度下在平衡時(shí)50%的與靶互補(bǔ)的探針與靶序列雜交(因?yàn)榘行蛄羞^量存在，所以在Tm，在平衡時(shí)50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑(諸如甲酰胺)來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽性信號(hào)是背景的至少兩倍，優(yōu)選背景雜交的10倍。例示性的嚴(yán)格雜交條件包括如下50%甲酰胺、5x SSC、和 SDS，在 42°C溫育，或切 SSCU % SDS、在 65°C溫育，用 0. h SSC 和 0.1% SDS 在50°C清洗。在本發(fā)明的語境中，用于分離編碼與JARID1B蛋白功能等同的多肽的多核苷酸的雜交條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選擇。例如，可用下述步驟進(jìn)行雜交在68攝氏度用 "Rapid-hyb buffer"(Amersham LIFE SCIENCE)進(jìn)行30分鐘或更長的預(yù)雜交，添加經(jīng)過標(biāo)記的探針，并在68攝氏度溫育一小時(shí)或更長。下面的清洗步驟可在例如低嚴(yán)格度條件中進(jìn)行。一種例示性的低嚴(yán)格度條件可包括42°C、2xSSC與0. 1 % SDS，優(yōu)選50°C、2xSSC與0. 1 % SDS0經(jīng)常優(yōu)選使用高嚴(yán)格條件。一種例示性的高嚴(yán)格條件可包括在室溫在hSSC、0. SDS中清洗3次各20分鐘，然后在lxSSC、0. 1 % SDS中在37攝氏度清洗3次各20分鐘，并在lxSSC、0. 1% SDS中在50攝氏度清洗2次各20分鐘。然而，數(shù)種因素，諸如溫度和鹽濃度，可影響雜交的嚴(yán)格度，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可合適地選擇所述因素以達(dá)到所需的嚴(yán)格度。此外，本發(fā)明的基因涵蓋編碼蛋白的此類功能等同物的多核苷酸。除了雜交之外， 可以利用基因擴(kuò)增方法，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，使用基于上述信息的序列合成的引物來分離編碼與JARID1B蛋白功能等同的多肽的多核苷酸。分別與人類基因和蛋白功能等同的多核苷酸和多肽通常與其原始核苷酸或氨基酸序列具有高同源性(也稱作“序列同一性”)?！案咄葱浴?或高序列同一性)通常指 40 %或更高的同源性，優(yōu)選60 %或更高，更優(yōu)選80 %或更高，甚至更優(yōu)選90 %、93 %、95 %、 97%、或更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可遵循“Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80 :726-30(1983) ” 中的算法來確定。TARID1B作為癌件標(biāo)志的用涂發(fā)現(xiàn)了 JARID1B基因的表達(dá)在多種類型的癌組織中特異性升高，如表3所示。因此，JARID1B可用作多種類型的癌癥的癌性標(biāo)志。最近，報(bào)告了 JARID1B基因在乳腺癌和前列腺癌中過表達(dá)(Yamane K. et al. Mol Cell2007 ；25 :801-12, Xiang Y. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2007 ； 104 192洸_31)。然而，不清楚JARID1B是否可用作其它癌癥的癌性標(biāo)志，因?yàn)橐环N類型的癌癥中的基因表達(dá)譜通常不同于其它類型的癌癥中的基因表達(dá)譜。 只有本發(fā)明首次澄清了 JARID1B基因在急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌和腎細(xì)胞癌中的過表達(dá)。如此，本發(fā)明提供了 JARID1B在那些癌癥中作為癌性標(biāo)志的用途。依照本發(fā)明，通過檢測JARID1B基因的過表達(dá)，可確定生物樣品含有癌性細(xì)胞，因此含有自癌性細(xì)胞衍生的產(chǎn)物。就是說，本發(fā)明提供了用于確定生物樣品是否污染有癌性細(xì)胞或癌性產(chǎn)物的方法，其包括對(duì)生物樣品中JARID1B基因的表達(dá)水平定量，并將該表達(dá)水平與已知沒有癌癥的非癌性樣品中的表達(dá)水平比較的步驟。如本文中使用的，術(shù)語“生物樣品”指整個(gè)生物體或其組織、細(xì)胞或組成部分(例如體液，包括但不僅限于血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、臍帶血(amniotic cord blood)、尿液、陰道液和精液)的子集(subset)?！吧飿悠贰边M(jìn)一步指從整個(gè)生物體或其細(xì)胞、組織或組成部分的子集制備的勻漿物、裂解物、提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物，或其級(jí)分或部分。最后，“生物樣品”指含有細(xì)胞組分(諸如蛋白質(zhì)或多核苷酸)的培養(yǎng)基，諸如生物體已在其中繁殖的營養(yǎng)湯或凝膠。例示性的生物樣品包括但不限于活檢標(biāo)本、身體組織和體液諸如血液、痰、胸腔積液或尿液。優(yōu)選地，生物樣品含有這樣的細(xì)胞群體，該細(xì)胞群體包括上皮細(xì)胞，更優(yōu)選源自懷疑為癌性的組織的上皮細(xì)胞。進(jìn)一步，如果必要，可從所得的身體組織與體液中純化所述細(xì)胞，并將其用為生物樣品。然而，任何生物材料均可作為生物樣品用于測定，只要它包括目標(biāo)JARIDIB轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。例如，依照本發(fā)明，可診斷癌癥，包括急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌和腎細(xì)胞癌?；蛘?，本發(fā)明提供了一種用于檢測生物樣品中這些癌癥的癌細(xì)胞的方法。為了診斷這些癌癥或檢測癌細(xì)胞，來源于自要診斷或檢測的受試者收集的下列器官的生物樣品可用作生物樣品淋巴細(xì)胞或包括淋巴細(xì)胞的血液樣品用于急性髓細(xì)胞性白血病，慢性髓細(xì)胞性白血病，膀胱用于膀胱癌，宮頸用于宮頸癌，肺用于肺癌，及腎用于腎細(xì)胞癌。JARID1B基因的表達(dá)水平可使用本領(lǐng)域已知方法通過檢測JARID1B的mRNA、蛋白質(zhì)或活性來定量。所述方法的詳情記載于下文“用于診斷癌癥的方法”。本發(fā)明的方法可提供有用的信息來利用生物材料、癌癥診斷、癌癥治療等等。用于診斷癌癥的方法本發(fā)明還提供了利用JARID1B基因的表達(dá)水平來檢測癌細(xì)胞或診斷癌癥的方法。 本發(fā)明的方法可適合于診斷急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、 肺癌和腎細(xì)胞癌。根據(jù)本發(fā)明，可提供用于檢查受試者狀況的中間結(jié)果。所述中間結(jié)果可與其它信息結(jié)合起來以協(xié)助醫(yī)生、護(hù)士或其它從業(yè)人員診斷患者罹患所述疾病?；蛘撸景l(fā)明可用于來源于患者的生物樣品中檢測出癌性細(xì)胞，并為醫(yī)生提供對(duì)診斷罹患所述疾病的患者有用的信息?；蛘?，本發(fā)明提供了一種用于檢測或鑒定源自受試者的生物樣品中癌細(xì)胞的方法，所述方法包括測定源自受試者的生物樣品中JARID1B基因表達(dá)水平的步驟，其中所述表達(dá)水平與所述基因的正常對(duì)照水平相比的升高指示組織中存在或懷疑存在癌細(xì)胞。此類結(jié)果可以與別的信息組合來幫助醫(yī)生、護(hù)士、或其它保健從業(yè)人員診斷受試者患有疾病。換言之，本發(fā)明可以給醫(yī)生提供有用信息來診斷受試者患有疾病。例如，依照本發(fā)明，當(dāng)關(guān)于自受試者獲得的組織中癌細(xì)胞的存在有疑問時(shí)，通過考慮JARID1B基因的表達(dá)水平，加上疾病的其他不同方面，包括組織病理學(xué)、血液中的已知腫瘤標(biāo)志物的水平、 和受試者的臨床過程等，能做出臨床決策。例如，一些公知的血液中的診斷性急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌或腎細(xì)胞癌標(biāo)志物如下。急性髓細(xì)胞性白血病；WTl膀胱癌；SCC，TPA,或IAP乳腺癌；BCA225,TPA, CEA, IAP，或 CA15-3慢性髓細(xì)胞性白血?。籅CR-ABL宮頸癌；SCC，TPA，或CA125月市癌；AP，ACT,BFP, CA19-9, CA50, CA72—4，CA130, CEA, KM0-1, NSE, SCC, SPl， Span-I，TPA，CSLEX，SLX，STN 禾口 CYFRA前列腺癌；PSA，或PAP腎細(xì)胞癌；IAP就是說，在本發(fā)明的這個(gè)具體實(shí)施方案中，基因表達(dá)分析的結(jié)果作為中間結(jié)果，用于進(jìn)一步診斷受試者的疾病狀態(tài)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于檢測癌癥之診斷標(biāo)志物的方法，所述方法包括檢測源自受試者的生物樣品中JARID1B基因表達(dá)作為急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌或腎細(xì)胞癌診斷標(biāo)志物的步
馬聚ο本發(fā)明的方法包括下述步驟(a)測定源自受試者的生物樣品中JARID1B基因的表達(dá)水平；并(b)將步驟(a)中測得的表達(dá)水平較之該基因的正常對(duì)照水平的提高與癌性細(xì)胞的存在相關(guān)聯(lián)。用本方法診斷的受試者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的例子包括但不僅限于，例如， 人類，非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬以及牛。根據(jù)本發(fā)明，測定在所述源自患者的生物樣品中JARID1B基因的表達(dá)水平。表達(dá)水平可在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平確定，使用本領(lǐng)域熟知的方法。舉例而言，JARID1B的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量?？稍谛酒蜿嚵猩蠈?shí)施所述檢測。對(duì)檢測多個(gè)基因(例如，多種癌癥特異性基因)，包括JARID1B基因，的表達(dá)水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用JARID1B基因的序列信息制備上述探針。此類序列信息可得自網(wǎng)絡(luò)上的序列數(shù)據(jù)庫，諸如GeneBank ，但不限于此。舉例而言，JARID1B基因的例示性序列顯示于SEQ ID NO l(GenBank登錄號(hào)NM_006618)，但不限于此。探針通常包括JARID1B基因序列的至少10個(gè)、至少20個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)、至少200個(gè)核苷酸。除了 JARID1B 基因的這些片段之外，JARID1B基因的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)記物例如染料、熒光和同位素來標(biāo)記，且所述基因的表達(dá)水平可以作為發(fā)生雜交的標(biāo)記物的強(qiáng)度來加以檢測。進(jìn)一步，JARID1B基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過基于擴(kuò)增的檢測技術(shù)(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于JARID1B基因的序列信息制備。舉例而言，用于實(shí)施例的引物(SEQ ID N0:7、8、9和10)可用于通過RT-PCR或Northern印跡的檢測，但本發(fā)明并不僅限于此。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件與低嚴(yán)格條件下與JARID1B mRNA雜交。本文所用的短語“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的，在不同的環(huán)境下會(huì)不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下發(fā)生。一般地，嚴(yán)格條件的溫度選擇為比特定序列在限定的離子強(qiáng)度和PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低大約5°C。Tm 是(在限定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度。因?yàn)榘行蛄幸话氵^量存在，因此在Tm下，平衡時(shí)50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴(yán)格條件是這樣的其中鹽濃度小于大約1. OM鈉離子，典型地大約0. 01-1. OM鈉離子 (或其它鹽)，pH7. 0-8. 3，溫度對(duì)于較短的探針或引物(例如10-50個(gè)核苷酸)是至少大約 30°C，用于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，本發(fā)明的診斷可以通過檢測翻譯產(chǎn)物來進(jìn)行。例如，可以確定JARID1B蛋白的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此類方法使用特異識(shí)別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或變體(例如嵌合抗體、 SCFV、Fab、F(ab，)2、FV等)均可用于檢測，只要它們保留對(duì)JARID1B蛋白的結(jié)合能力即可。 制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價(jià)物。作為另一種基于JARID1B的翻譯產(chǎn)物檢測其基因的方法，可利用針對(duì)JARID1B蛋白的抗體通過免疫組織化學(xué)分析觀察其染色的強(qiáng)度。即，觀察到強(qiáng)染色表明所述蛋白質(zhì)的存在增加，且同時(shí)表明JARID1B基因的高表達(dá)水平。另外，JARID1B蛋白的數(shù)量可通過測量JARID1B蛋白的生物學(xué)活性，諸如組蛋白脫甲基化來測定。如上文所述，JARID1B已表征為賴氨酸脫甲基酶家族之一，其能特異性消除組蛋白H3賴氨酸4的甲基(Yamane K. et al. MolCell 2007;25:801-12)。因此，組蛋白脫甲基化活性可用于基于其生物學(xué)活性來定量JARID1B蛋白。組蛋白脫甲基化水平可通過本領(lǐng)域公知方法來測定。當(dāng)使用組蛋白脫甲基化活性來定量JARID1B蛋白時(shí)，自受試者組織或細(xì)胞制備的勻漿物、裂解物或提取物可優(yōu)選用作生物樣品，但不限于此?？蓪⑸飿悠放c甲基化的組蛋白一起溫育，然后評(píng)估脫甲基化水平，例如通過檢測組蛋白脫甲基化所致的甲醛或過氧化氫釋放或殘余甲基化組蛋白(使用針對(duì)甲基化組蛋白的抗體)來進(jìn)行。一些商品化產(chǎn)品可供組蛋白脫甲基化測定法使用，諸如EpiQuik全局組蛋白甲基化測定試劑盒 (Epigentek Group Inc.)。或者，細(xì)胞增殖活性可用作JARID1B蛋白的生物學(xué)活性。依照本發(fā)明，抑制 JARID1B基因表達(dá)導(dǎo)致抑制膀胱癌和肺癌細(xì)胞中的細(xì)胞生長，因此假定JARID1B蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖。為了測定JARID1B蛋白的細(xì)胞增殖活性，在生物樣品存在下培養(yǎng)細(xì)胞，然后通過檢測增殖速度或通過測量細(xì)胞周期或集落形成活性，可測定生物樣品的細(xì)胞增殖活性。另外，除JARIDIB基因的表達(dá)水平外，亦可確定其它癌癥相關(guān)基因，例如已知在癌癥中有差異表達(dá)的基因的表達(dá)水平，以提高所述診斷的準(zhǔn)確性。生物樣品中JARID1B基因表達(dá)水平的升高可通過與對(duì)照水平比較來檢測。對(duì)照水平可以與測試生物樣品同時(shí)確定，使用先前從疾病狀態(tài)(癌性或非癌性) 已知的受試者收集和保存的樣品。或者，對(duì)照水平可以借助統(tǒng)計(jì)方法，根據(jù)通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的JARID1B基因表達(dá)水平獲得的結(jié)果加以確定。進(jìn)一步，對(duì)照水平可以是來自先前測試過的細(xì)胞的表達(dá)模式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，可以將生物樣品中JARID1B基因的表達(dá)水平與從多個(gè)參考樣品確定的多個(gè)對(duì)照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自患者的生物學(xué)樣品的組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對(duì)照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中JARID1B基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)值。標(biāo)準(zhǔn)值可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，平均值+/-2 S.D.或平均值+/-3 S.D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。在本發(fā)明的語境下，從已知非癌性的生物樣品確定的對(duì)照水平稱作“正常對(duì)照水平”。另一方面，如果對(duì)照水平是從癌性生物樣品確定的，則稱作“癌性對(duì)照水平”。當(dāng)JARID1B基因的表達(dá)水平相比正常對(duì)照水平有所提高或與癌性對(duì)照水平相似， 則生物樣品可能含有癌性細(xì)胞，其指示受試者可能正罹患或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生癌癥。受試生物學(xué)樣品的表達(dá)水平與對(duì)照水平間的差異，可以相對(duì)已知表達(dá)水平不會(huì)隨著細(xì)胞的癌或非癌狀態(tài)改變的對(duì)照基因(例如管家基因)的表達(dá)水平加以標(biāo)準(zhǔn)化。示例對(duì)照基因包括，但不僅限于，β -肌動(dòng)蛋白、甘油醛-3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。如果在生物樣品中的表達(dá)水平較之正常對(duì)照水平增加了例如10%，25%或50% 的話，或增加到超過1. 1倍，超過1. 5倍，超過2. 0倍，超過3. 0倍，超過5. 0倍，超過10倍或者更多，則可認(rèn)為其是升高的。另一方面，若生物樣品中的表達(dá)水平相對(duì)于癌性對(duì)照水平的差異在10 %、25 %或50 %之內(nèi)，則可認(rèn)為是升高的。用于檢測癌癥的試劑念本發(fā)明提供了用于檢測癌癥的試劑盒，所述癌癥諸如急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌和腎細(xì)胞癌。本發(fā)明的試劑可用于檢測生物樣品中的癌性細(xì)胞，其可用于診斷癌癥。具體地，所述試劑可檢測生物樣品中JARID1B基因的表達(dá)，所述試劑可選自下組(a)用于檢測JARID1B基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測JARIDIB蛋白的試劑；和(c)用于檢測JARID1B蛋白的生物學(xué)活性的試劑。適于檢測JARID1B基因的mRNA的試劑包括特異性結(jié)合或識(shí)別JARID1B mRNA的寡核苷酸，諸如具有與JARID1B mRNA的一部分互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對(duì)JARID1B mRNA為特異性的引物與探針。可基于本領(lǐng)域眾所周知的方法制備這類寡核苷酸，例如“用于診斷癌癥的方法”中所述的方法。如果需要，可將用于檢測JARID1B mRNA 的試劑固定化在固體基質(zhì)上。另一方面，適于檢測JARID1B蛋白質(zhì)的試劑包括針對(duì)JARID1B蛋白質(zhì)的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進(jìn)一步，任何所述抗體的片段或變體(例如，嵌合抗體、 scFv,Fab,F(ab' )2、Fv等等)均可用作所述試劑，只要它們保留與JARID1B蛋白的結(jié)合能力。為檢測JARID1B蛋白制備此類抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且在本發(fā)明中可使用任何方法制備上述抗體及其等價(jià)物。進(jìn)一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號(hào)的分子通過直接連接或間接標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物與標(biāo)記抗體以及檢測抗體與其靶的結(jié)合的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標(biāo)記物與方法。如果需要，可將用于檢測JARID1B 蛋白的試劑固定化在固體基質(zhì)上。另外，可以將JARID1B蛋白作為JARID1B蛋白的生物學(xué)活性來檢測。組蛋白脫甲基化活性和細(xì)胞增殖活性是JARID1B蛋白的例示性生物學(xué)活性。生物樣品中的組蛋白脫甲基化活性可通過在將甲基化組蛋白與生物樣品一起溫育后使用針對(duì)甲基化組蛋白的抗體檢測殘余甲基化組蛋白來測定。故而，本發(fā)明的試劑盒可包括甲基化組蛋白和抗甲基化組蛋白抗體?；蛘?，本發(fā)明的試劑盒可包括帶有標(biāo)記的甲基的甲基化組蛋白，以檢測組蛋白脫甲基化所致的甲醛釋放。另一方面，生物樣品中的細(xì)胞增殖活性可通過在生物樣品存在下培養(yǎng)細(xì)胞，然后檢測增殖速度或測量細(xì)胞周期或集落形成能力來測定。是故，本發(fā)明的試劑盒可包括用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基和容器。所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。所述試劑盒可包括用于結(jié)合針對(duì) JARID1B基因的探針或針對(duì)JARID1B蛋白的抗體的固體基質(zhì)以及試劑，用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基與容器，陽性與陰性對(duì)照試劑，以及用于檢測針對(duì)JARID1B蛋白質(zhì)的抗體的第二抗體。 本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括其它從商業(yè)和用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾器、針頭、注射器和帶有使用說明的裝箱單(例如，書面的、磁帶、CD-ROM等等)。這些試劑等可以裝在帶有標(biāo)簽的容器中。合適的容器包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可從多種材料制得，例如玻璃或塑料。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)所述試劑是針對(duì)JARID1B mRNA的探針時(shí)，所述試
18劑可固定化于固體基質(zhì)例如多孔條上，以形成至少一個(gè)檢測位點(diǎn)。所述多孔條的測量或檢測區(qū)域可包含多個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)都包含寡核苷酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對(duì)照的位點(diǎn)。或者，對(duì)照位點(diǎn)可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位點(diǎn)可包含不同量的固定化寡核苷酸，即，在第一個(gè)檢測位點(diǎn)上量較大而在接下來的位點(diǎn)上量較小。在加入測試樣品之后，顯示可檢測信號(hào)的位點(diǎn)的數(shù)量提供了在樣品中存在的JARIDlBmRNA量的定量指征。所述檢測位點(diǎn)可配置為具有任何合適地可檢測的形狀，通常是橫跨測試條寬度的條狀或點(diǎn)狀。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括陽性對(duì)照或JARID1B標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明的的陽性對(duì)照樣品可通過收集JARID1B陽性樣品諸如源自急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌和腎細(xì)胞癌的細(xì)胞，隨后測定其JARID1B水平來制備?；蛘?，可將純化的JARID1B蛋白或JARID1B基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中以形成所述陽性樣品或JARID1B標(biāo)準(zhǔn)品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括陰性對(duì)照樣品。本發(fā)明的陰性對(duì)照樣品是不表達(dá)JARID1B的細(xì)胞或組織諸如非癌性細(xì)胞。雙鏈分子本文中使用的術(shù)語“分離的雙鏈分子”指抑制靶基因表達(dá)的核酸分子，而且包括例如短干擾RNA (siRNA，例如雙鏈核糖核酸(dsRNA)或小發(fā)夾RNA (shRNA))與短干擾DNA/ RNA(siD/R-NA,例如DNA與RNA的雙鏈嵌合體(dsD/R-NA)或DNA與RNA的小發(fā)夾嵌合體 (shD/R-NA))。如本文中使用的，靶序列的有義鏈?zhǔn)腔虻膍RNA或cDNA序列內(nèi)的核苷酸序列，其會(huì)導(dǎo)致完整mRNA翻譯的抑制，如果本發(fā)明的雙鏈核酸分子被導(dǎo)入表達(dá)該基因的細(xì)胞內(nèi)的話。對(duì)于某基因的mRNA或cDNA序列內(nèi)的核苷酸序列，當(dāng)包含與靶序列對(duì)應(yīng)的序列的雙鏈多核苷酸抑制該基因在表達(dá)該基因的細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)，該核苷酸序列可確定為靶序列。抑制基因表達(dá)的雙鏈多核苷酸可以由靶序列和長2至5個(gè)核苷酸的3'突出端(例如im)組成。本文中使用的術(shù)語“siRNA “指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。使用將siRNA 導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括其中以DNA為模板轉(zhuǎn)錄RNA的那些。所述siRNA包括靶基因的有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)的一部分、靶基因反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)的一部分、或兩者。所述siRNA可如此構(gòu)建使得單個(gè)轉(zhuǎn)錄物具有靶基因的有義核酸序列及與其互補(bǔ)的反義核酸序列，例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所述siRNA可為dsRNA或shRNA。本文中使用的術(shù)語“dsRNA”指包含相互互補(bǔ)的序列的兩個(gè)RNA分子的構(gòu)建體，所述兩個(gè)RNA分子通過所述互補(bǔ)序列退火以形成雙鏈RNA分子。所述兩條鏈的核苷酸序列可不僅包含選自靶基因序列中蛋白質(zhì)編碼序列的“有義”或“反義” RNA，亦可包括具有選自所述靶基因的非編碼區(qū)域的核苷酸序列的RNA分子。本文中使用的術(shù)語“shRNA”指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的siRNA，所述莖-環(huán)結(jié)構(gòu)包含彼此互補(bǔ)的第一區(qū)和第二區(qū)(即有義鏈和反義鏈)。兩個(gè)區(qū)的互補(bǔ)程度和方向足以使兩個(gè)區(qū)之間發(fā)生堿基配對(duì)，所述第一區(qū)和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接在一起，而且所述環(huán)是因?yàn)榄h(huán)區(qū)內(nèi)的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對(duì)而形成的。shRNA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈(intervening single-strand)”本文中使用的術(shù)語“siD/R-NA”指包含RNA和DNA 二者的雙鏈核酸分子，包括RNA和DNA的雜合體和嵌合體，其阻止靶mRNA的翻譯。在本說明書中，雜合體表示這樣的分子， 其中由DNA組成的多核苷酸和由RNA組成的多核苷酸相互雜交形成雙鏈分子；而嵌合體表示組成所述雙鏈分子的鏈中的一條或兩條可以同時(shí)含有RNA和DNA。使用將siD/R-NA導(dǎo)入細(xì)胞的常規(guī)技術(shù)。所述siD/R-NA包括靶基因的有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)的一部分、靶基因的反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)的一部分、或兩者。siD/R-NA可以這樣構(gòu)建，使單個(gè)轉(zhuǎn)錄物同時(shí)具有來自靶基因的有義核酸序列和互補(bǔ)反義核酸序列，例如發(fā)夾。siD/R-NA 可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。在本文中使用的術(shù)語“dsD/R-NA”是指這樣兩個(gè)分子的構(gòu)建體，所述兩個(gè)分子包含彼此互補(bǔ)的序列并且已經(jīng)藉由所述互補(bǔ)序列退火在一起而形成雙鏈多核苷酸分子。兩條鏈的核苷酸序列可以不僅僅包含選自靶基因序列的蛋白編碼序列的“有義”或“反義”核酸序列，還可以包含具有選自靶基因非編碼區(qū)的核酸序列的多核苷酸。組成dsD/R-NA的兩個(gè)分子中的一個(gè)或兩個(gè)由RNA和DNA 二者組成(嵌合體分子)，或者一個(gè)分子由RNA組成而另一個(gè)由DNA組成(雜合雙鏈)。在本文中使用的術(shù)語“shD/R-NA”是指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的siD/R-NA，所述莖-環(huán)結(jié)構(gòu)包含彼此互補(bǔ)的第一區(qū)和第二區(qū)，即有義鏈和反義鏈。所述區(qū)的互補(bǔ)程度和方向足以使它們之間發(fā)生堿基配對(duì)，第一區(qū)和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接，而且所述環(huán)是因?yàn)樵诃h(huán)區(qū)內(nèi)的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對(duì)而形成的。shD/R-NA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈”。本說明書中使用的術(shù)語“分離的”是指從本來的環(huán)境(例如自然出現(xiàn)時(shí)的自然環(huán)境)中被取出，與其自然狀態(tài)相比發(fā)生了合成性的改變的狀態(tài)。針對(duì)JARID1B基因的雙鏈分子——該分子與JARID1B mRNA雜交——通過與該基因的正常為單鏈的mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，干擾翻譯，抑制蛋白質(zhì)表達(dá)，從而降低或抑制該蛋白的產(chǎn)生。如本文中證明的，在膀胱癌細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系中JARID1B基因的表達(dá)被dsRNA 抑制(圖7B，F(xiàn))，而且因此，那些細(xì)胞系的生長受到抑制(圖7C，G)。因此本發(fā)明提供了有能力在導(dǎo)入表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞時(shí)抑制該基因表達(dá)以及細(xì)胞增殖的分離的雙鏈分子。本發(fā)明的雙鏈分子可用于抑制涉及JARID1B基因過表達(dá)的癌細(xì)胞增殖，因此它們可提供用于治療癌癥的新方法。例如，本發(fā)明的雙鏈分子適合應(yīng)用于觀察到JARID1B基因過表達(dá)的癌癥，諸如急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌(表幻。更優(yōu)選地，膀胱癌和肺癌適合于本發(fā)明的雙鏈分子。設(shè)計(jì)具有抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)能力的雙鏈分子的方法是已知的(見例如， W02004/048566和美國專利No. 6，506, 559，本文通過提述并入其全部內(nèi)容)。例如，可以從 Ambion 網(wǎng)站(www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder. html)訪問用于設(shè)計(jì) siRNA 的計(jì)算機(jī)程序。該計(jì)算機(jī)程序可以根據(jù)如下的規(guī)程選擇雙鏈分子的靶核苷酸序列。靶點(diǎn)的選擇1.從轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描搜尋AA雙核苷酸序列。記錄每個(gè) AA的出現(xiàn)及其3’側(cè)相鄰的19個(gè)核苷酸作為潛在siRNA靴點(diǎn)。Tuschl等建議避免針對(duì)5’ 和3’非翻譯區(qū)(UTR)以及鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個(gè)堿基之內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA，因?yàn)檫@些區(qū)域可能更富含調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，而UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可能干擾 SiRNA核酸內(nèi)切酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將潛在靶點(diǎn)與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(人、小鼠、大鼠等)進(jìn)行比較，將任何與其他編碼序列具有顯著同源性的靶序列排除在考慮之外。主要使用BLAST(Altschul SF等， Nucleic Acids Res 1997 Sep 1,25(17) :3389-402)，其可見于 NCBI 服務(wù)器www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/。3.選擇合格的靶序列用于合成。通常沿著待評(píng)估的基因的長度選擇幾個(gè)靶序列。使用上述設(shè)計(jì)方法，本發(fā)明中分離雙鏈分子的靶序列被設(shè)計(jì)為SEQ IDNO 21和 30。對(duì)以上述靶序列為目標(biāo)的雙鏈分子檢查其抑制表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞生長的能力。 因此，例示性的本發(fā)明雙鏈分子包括與作為靶序列的SEQ ID NO :21或30對(duì)應(yīng)的核酸序列。 然而，任何來自JARID1B的序列均可作為本發(fā)明雙鏈分子的靶序列，只要雙鏈分子保留抑制JARID1B表達(dá)和細(xì)胞增殖的能力。本發(fā)明的雙鏈分子可以靶向單個(gè)靶序列。本發(fā)明的雙鏈分子包括包含靶序列和/或靶序列之互補(bǔ)序列的任何核酸序列的分離多核苷酸。本發(fā)明的雙鏈分子的多核苷酸例子包括那些包含與SEQ ID N0:21或30對(duì)應(yīng)的核酸序列和/或這些序列的互補(bǔ)序列的多核苷酸；然而，本發(fā)明并不僅限于這些例子， 且上述核酸序列中的次要修飾是可以接受的，只要所述經(jīng)修飾分子保留抑制JARID1B基因表達(dá)的能力。本文中，短語“次要修飾”當(dāng)用于和核酸序列相關(guān)時(shí)表示對(duì)所述序列替換、缺失、添加或插入一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)核酸。在本發(fā)明的語境下，術(shù)語“數(shù)個(gè)”當(dāng)用于核酸替換、 缺失、添加和/或插入時(shí)可意指3-7個(gè)，優(yōu)選3-5個(gè)，更優(yōu)選3-4個(gè)，進(jìn)一步更優(yōu)選是3個(gè)核苷酸殘基。當(dāng)用于本發(fā)明雙鏈分子的分離多核苷酸由RNA或其衍生物組成時(shí)，核苷酸序列中的堿基“t”應(yīng)替換為“U”。本文中使用的術(shù)語“互補(bǔ)”指多核苷酸中核苷酸單元之間的 Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對(duì)，且術(shù)語“結(jié)合”意指兩個(gè)多核苷酸間物理的或化學(xué)的相互作用。當(dāng)所述多核苷酸包含修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯酶聯(lián)接時(shí)，這些多核苷酸亦可以同樣地發(fā)生相互結(jié)合。一般而言，互補(bǔ)多核苷酸序列在合適條件下雜交以形成包含很少或沒有錯(cuò)配的穩(wěn)定雙鏈體。進(jìn)一步，有義鏈和與其互補(bǔ)的反義鏈可通過雜交形成雙鏈分子或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，上述雙鏈體在每10個(gè)匹配中包含不超過一個(gè)錯(cuò)配。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈體的鏈完全互補(bǔ)，這樣的雙鏈體不包含錯(cuò)配。對(duì)JARID1B基因而言所述雙鏈分子長度優(yōu)選少于6393個(gè)核苷酸。舉例而言，雙鏈分子長度小于500、200、100、75、50或25個(gè)核苷酸。進(jìn)一步，所述雙鏈分子的有義鏈可長于 19個(gè)核苷酸，優(yōu)選長于21個(gè)核苷酸，且更加優(yōu)選長度在約19與25個(gè)核苷酸之間。因而， 本發(fā)明提供了包含有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中有義鏈包括與靶序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度為19至25個(gè)核苷酸對(duì)的雙鏈分子。依照本發(fā)明，可使用實(shí)施例中利用的方法對(duì)本發(fā)明的雙鏈分子測試其能力。例如，在體外依照標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)由JARID1B基因mRNA的一部分的有義鏈和與其互補(bǔ)的反義鏈構(gòu)成的雙鏈分子測試它們降低膀胱癌和肺癌細(xì)胞系(例如253J、253J-BV、HT1197、HT1376、 J82、SCaBER, UMUC3、EJ28、RT4、T24 和 SW780，用于膀胱癌；SBC5、A549、H2170、LC319、禾口RERF-LC-AI，用于肺癌)中JARID1B mRNA生成的能力。另外，例如，JARID1B mRNA在與候選雙鏈分子接觸的細(xì)胞中與在候選分子不存在下培養(yǎng)的細(xì)胞相比的降低可例如使用JARID1B mRNA的引物通過RT-PCR來檢測，如實(shí)施例1 “定量實(shí)時(shí)PCR”項(xiàng)下所述。然后可對(duì)在體外基于細(xì)胞的測定法中降低JARIDlBmRNA生成的序列測試它們對(duì)細(xì)胞生長的抑制效果。然后， 對(duì)在體外基于細(xì)胞的測定法中抑制細(xì)胞生長的序列，可使用患有癌癥的動(dòng)物(例如裸鼠異種移植物模型)測試它們的體內(nèi)能力，以確認(rèn)降低的JARID1B mRNA生成和降低的癌細(xì)胞生長。當(dāng)將雙鏈分子導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，雙鏈分子充當(dāng)識(shí)別RISC復(fù)合物中mRNA的同源序列的向?qū)?。被識(shí)別的靶RNA受到Dicer的核酸酶活性的切割和降解，由此雙鏈分子最終降低或抑制了由該RNA編碼的多肽生成(表達(dá))。如此，本發(fā)明的雙鏈分子可通過其生成在嚴(yán)格條件下與JARID1B基因的mRNA特異性雜交的單鏈的能力來定義。在本文中，將mRNA中與自雙鏈分子生成的單鏈雜交的部分稱作“靶序列”或“靶核酸”或“靶核苷酸”。在本發(fā)明中，“靶序列”的核苷酸序列不僅可使用mRNA的RNA序列來顯示，而且也可以以自mRNA合成的cDNA的DNA序列來顯示。本發(fā)明中所述雙鏈分子可包含一個(gè)或更多修飾核苷酸和/或非磷酸二酯連接。本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾具有增加所述雙鏈分子的穩(wěn)定性、可用性和/或細(xì)胞攝入的能力。一般技術(shù)人員明白本發(fā)明分子可包含的其它類型的化學(xué)修飾(W003/070744 ； W02005/045037)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用修飾以提供改善的抗降解性或改善的攝入。 上述修飾的例子包括但不僅限于，硫代磷酸酯聯(lián)接、2’-0_甲基核糖核苷酸(特別是在雙鏈分子的有義鏈上)、2’ -脫氧-氟代核糖核苷酸、2’ -脫氧核糖核苷酸、“通用堿基”核苷酸、 5’ -C-甲基核苷酸以及倒轉(zhuǎn)脫氧脫堿基殘基的摻入(US20060122137)。另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用修飾來增強(qiáng)雙鏈分子的穩(wěn)定性或增加尋靶效率。這樣的修飾包括但不限于雙鏈分子兩條互補(bǔ)鏈之間的化學(xué)交聯(lián)、雙鏈分子一條鏈的3’或5’ 末端的化學(xué)修飾、糖修飾、核堿基修飾和/或骨架修飾、2-氟代修飾的核糖核苷酸和2’-脫氧核糖核苷酸(W02004/(^9212)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，修飾可以用于增加或減少針對(duì)靶 mRNA中和/或互補(bǔ)雙鏈分子鏈中互補(bǔ)核苷酸的親和力(W02005/044976)。例如，未修飾的嘧啶核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl)嘧啶替代。另外，未修飾的嘌呤可以用7-脫氮(7-deZa)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙鏈分子在有義鏈和/或反義鏈3’端任一或二者處具有由少數(shù)核苷酸組成的3’突出端，當(dāng)雙鏈分子是具有3’突出端的雙鏈分子時(shí)，可以把3’突出核苷酸替換成脫氧核糖核苷酸(Elbashir SM 等，Genes Dev 200IJan 15,15(2) :188-200)。優(yōu)選地，用于本發(fā)明雙鏈分子的3'突出端由兩個(gè)脫氧核糖核苷酸"t"組成。例如，本發(fā)明具有3'突出端的雙鏈分子的例示性序列顯示于SEQ ID而19或觀(有義鏈)和SEQ ID NO :20或四(反義鏈)，其包括與SEQ ID NO :21或30對(duì)應(yīng)的靶序列和由兩個(gè)脫氧核糖核苷酸〃 t"組成的3'突出端序列。關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，可以利用公開文獻(xiàn)如US20060234970。本發(fā)明不限于這些實(shí)例，可以將任何已知化學(xué)修飾應(yīng)用于本發(fā)明的雙鏈分子，只要所得分子保留抑制靶基因表達(dá)的能力。此外，本發(fā)明的雙鏈分子可以包含DNA和RNA 二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。 具體而言，由DNA鏈與RNA鏈形成的雜合多核苷酸或DNA-RNA嵌合體多核苷酸表現(xiàn)出提高
22的穩(wěn)定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA鏈(多核苷酸)和RNA鏈(多核苷酸) 組成的雜合型雙鏈分子、或在任一單鏈(多核苷酸)或兩條單鏈(多核苷酸)上同時(shí)包含 DNA和RNA的嵌合型雙鏈分子，諸如此類，來增強(qiáng)所述雙鏈分子的穩(wěn)定性。DNA鏈和RNA鏈的雜合體可以是這樣的雜合體，其中有義鏈?zhǔn)荄NA而反義鏈?zhǔn)?RNA,或者相反，只要它在導(dǎo)入表達(dá)靶基因的細(xì)胞中后能夠抑制該基因表達(dá)。優(yōu)選地，有義鏈多核苷酸是DNA而反義鏈多核苷酸是RNA。同樣，嵌合型雙鏈分子可以是其中的有義鏈和反義鏈均由DNA和RNA組成，或者有義鏈或反義鏈中的任一條由DNA和RNA組成，只要在導(dǎo)入表達(dá)靶基因的細(xì)胞中時(shí)，所述雙鏈分子具有抑制該基因表達(dá)的活性即可。為了提高雙鏈分子的穩(wěn)定性，分子中優(yōu)選包含盡可能多的DNA;而為了誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)抑制，要求分子在一定范圍內(nèi)是RNA，以充分地誘導(dǎo)表達(dá)抑制。作為嵌合型雙鏈分子的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例，雙鏈分子的上游部分區(qū)域(即位于有義鏈或反義鏈內(nèi)的靶序列或其互補(bǔ)序列之側(cè)翼的區(qū)域)為RNA。優(yōu)選地，所述上游部分區(qū)表示有義鏈的5’側(cè)(5’端)和反義鏈的3’側(cè)(3’端)。或者，將位于有義鏈5’末端側(cè)翼或者反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域稱為上游部分區(qū)域。就是說，在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域由RNA組成，或者有義鏈5’末端側(cè)翼的區(qū)域和反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域均由 RNA組成。例如，本發(fā)明的嵌合型或雜合型雙鏈分子包含以下組合。有義鏈5，_[—DNA—]_3，3，-(RNA)-[DNA]-5，反義鏈，有義鏈5，-(RNA)-[DNA]-3，3，-(RNA)-[DNA]-5，反義鏈，和有義鏈5，-(RNA)-[DNA]-3，3，_(—RNA)_5，反義鏈。上游部分區(qū)優(yōu)選是由9-13個(gè)核苷酸組成的域，從雙鏈分子的有義鏈或反義鏈內(nèi)的靶序列或其互補(bǔ)序列的末端算起。此外，這種嵌合型雙鏈分子的優(yōu)選實(shí)例包括這樣的實(shí)例鏈長為19-21個(gè)核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半?yún)^(qū)(對(duì)于有義鏈為5’側(cè)區(qū)域而對(duì)于反義鏈為3’側(cè)區(qū)域)是RNA，而另一半是DNA。在這樣的嵌合型雙鏈分子中，抑制靶基因表達(dá)的效果比反義鏈整體為RNA時(shí)強(qiáng)得多(US20050004064)。在本發(fā)明中，雙鏈分子可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，例如短發(fā)夾RNA(shRNA)以及由DNA與 RNA組成的短發(fā)夾(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列， 其形成緊密的發(fā)夾轉(zhuǎn)彎，可以用來通過RNA干擾來沉默基因表達(dá)。shRNA或shD/R-NA在單一多核苷酸上包含有義靶標(biāo)序列和反義靶標(biāo)序列，其中所述序列被環(huán)序列隔開。通常，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被細(xì)胞機(jī)制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA進(jìn)一步與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)結(jié)合。這種復(fù)合物結(jié)合并切割與所述dsRNA或dsD/R-NA的靶標(biāo)序列匹配的mRNA。為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，可以在有義序列與反義序列之間設(shè)置由任意核苷酸序列構(gòu)成的環(huán)序列。因此，本發(fā)明還提供具有通式5’ -[A]-[B]-[A’ ]-3’的雙鏈分子。式中，[A] 為有義鏈，包含與靶序列對(duì)應(yīng)的序列；[B]為間插單鏈；[A']為反義鏈，包含與[A]互補(bǔ)的序列。靶序列可以是例如與SEQ ID NO 21或30對(duì)應(yīng)的序列。本發(fā)明不限于這些實(shí)例，在雙鏈分子保持抑制JARID1B基因的表達(dá)的能力的前提下，[A]中的靶序列可以是在這些實(shí)例的基礎(chǔ)上修飾而得到的序列。區(qū)域[A]與[A']雜交而形成由區(qū)域[B]構(gòu)成的環(huán)。間插單鏈部分[B]、即環(huán)序列，長度優(yōu)選可以為3 23個(gè)核苷酸。例如，環(huán)序列可以選自由以下的序列組成的組(www. ambion. com/techlib/tb/tb_506. html)。此外，由23個(gè)核苷酸組成的環(huán)序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul 25,418(6896) :435-8, Epub 2002 Jun 26)CCC、CCACC 或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul 25,418(6896) 435-8，Epub 2002 Jun 26 ；UUCG :Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May,20(5) :500-5 ；Fruscoloni Pet al. , Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18,100(4) 1639-44，Epub 2003 FeblO ；UUCAAGAGA =Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun,4(6) 457-67。優(yōu)選的具有本發(fā)明的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈分子實(shí)例如下所示。在下面的結(jié)構(gòu)中，環(huán)序列可以選自由 AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC 和 UUCAAGAGA 組成的組；但本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例不限于此CAGUGAAUGAGCUCCGGCA (SEQ ID NO: 31) -[B] -UGCCGGAGCUCAUUCACUG (SEQ ID NO :32)(對(duì)靶序列 SEQ IDNO 21)；本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例是GGAAUAUGGAGCUGACAUU(SEQID NO: 33) - [B] -AAUGUCAGCUCCAUAUUCC (SEQ ID NO :34)(對(duì)革巴序歹丨J SEQ IDNO :30)。此外，為了增強(qiáng)雙鏈分子的抑制活性，可以將少數(shù)核苷酸添加到靶序列的有義鏈和/或反義鏈的3’末端，作為3’突出端。添加的核苷酸的數(shù)目為至少2個(gè)，通常為2-10 個(gè)，優(yōu)選為2-3個(gè)。核苷酸的種類不受限制，但優(yōu)選“U”或“t”。添加的核苷酸在雙鏈分子的有義鏈和/或反義鏈的3’末端形成單鏈。當(dāng)雙鏈分子具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，反義鏈的3'末端添加有3'突出端。此類雙鏈分子的優(yōu)選例包括但不限于CA⑶GAAUGAGCUCCGGCA(SEQ IDNO :31)-[B]_UGCCGGAGCUCAUUCAC UGTT (SEQ ID NO :20)(對(duì)于靶序列 SEQ ID NO :21)和 GGAAUAUGGAGCUGACAUU (SEQ ID NO :3 3) - [B] -AAUGUCAGCUCCAUAUUCCTT (SEQ ID NO :29)(對(duì)于靶序歹lj SEQID NO :30)。對(duì)于雙鏈分子的制備方法沒有特殊限制，但優(yōu)選采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的化學(xué)合成方法。根據(jù)化學(xué)合成方法，分別合成有義和反義單鏈多核苷酸，然后采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ顾鼈兺嘶鸬揭黄穑瑏慝@得雙鏈分子。退火的具體例子包括其中將合成的單鏈多核苷酸以優(yōu)選至少約3 7、更優(yōu)選約4 6、最優(yōu)選基本上等摩爾量(即約5 5的摩爾比)的摩爾比混合。然后，將混合物加熱到雙鏈分子解離的溫度，再緩慢冷卻。經(jīng)退火的雙鏈多核苷酸可以采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的常用方法來純化。純化方法的例子包括利用瓊脂糖凝膠電泳的方法，或者其中任選地除去剩余的單鏈多核苷酸(例如利用適當(dāng)?shù)拿高M(jìn)行降解)的方法。所述位于JARID1B序列側(cè)翼的調(diào)控序列可為相同或不同的，以使得它們的表達(dá)能夠獨(dú)立地，或者以時(shí)間性或空間性方式被調(diào)控。所述雙鏈分子可通過將JARID1B基因模板克隆入載體(例如含有來自小核RNA (snRNA) U6的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄單元或人類Hl RNA 啟動(dòng)子的載體)以在胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。編碼本發(fā)明雙鏈分子的載體本發(fā)明還包括編碼一種或多種本文所述的雙鏈分子的載體、以及包含該載體的細(xì)胞。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含編碼處于可表達(dá)形式的本發(fā)明雙鏈分子的核酸序列。在本說明書中，術(shù)語“處于可表達(dá)的形式”，是指該載體當(dāng)被導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，將表達(dá)該分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體包含雙鏈分子表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)元件。本發(fā)明的這種載體可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的雙鏈分子，也可以直接用作癌癥治療的活性成分?；蛘撸景l(fā)明提供了如下的載體，其包括具有有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸組合中的任一個(gè)，其中所述有義鏈核酸包括SEQ ID NO :21或30的核苷酸序列，而所述反義鏈核酸由與有義鏈互補(bǔ)的序列組成，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉(zhuǎn)錄物彼此雜交以形成雙鏈分子，且其中所述載體在導(dǎo)入表達(dá)JARID1B的細(xì)胞中時(shí)抑制所述基因的表達(dá)。優(yōu)選地，多核苷酸是長度為約19個(gè)至25個(gè)核苷酸的寡核苷酸(例如來自SEQ ID NO :1核苷酸序列的連續(xù)核苷酸)。更優(yōu)選地，多核苷酸組合包括單一核苷酸轉(zhuǎn)錄物， 其具有經(jīng)單鏈核苷酸序列相連接的有義鏈和反義鏈。更優(yōu)選地，多核苷酸組合具有通式 5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是包括SEQ ID NO :21或30的核苷酸序列；[B]是由約 3個(gè)至約23個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列；而[A']是與[A]互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明的載體可通過下述方法生成例如，將JARID1B序列克隆入表達(dá)載體中，使調(diào)控序列可操作性地連接于JARID1B序列，以允許兩條鏈的表達(dá)(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄) (Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5)。例如，作為 mRNA 之反義鏈的 RNA分子由第一啟動(dòng)子(例如位于克隆DNA的3’末端側(cè)翼的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄，對(duì)mRNA而言為有義鏈RNA分子由第二啟動(dòng)子(例如位于克隆DNA的5’末端側(cè)翼的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄。有義和反義鏈在體內(nèi)雜交，產(chǎn)生用于沉默該基因的雙鏈分子構(gòu)建體。或者，使用分別編碼雙鏈分子之有義鏈和反義鏈的兩個(gè)載體構(gòu)建體來分別表達(dá)有義鏈和反義鏈，隨后形成雙鏈分子構(gòu)建體。而且，克隆的序列可編碼具有二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的構(gòu)建體，即，載體的單一轉(zhuǎn)錄物同時(shí)包含靶基因的有義序列和互補(bǔ)的反義序列二者。也可以配置本發(fā)明的載體使得其實(shí)現(xiàn)在靶細(xì)胞的基因組中的穩(wěn)定插入(關(guān)于同源重組盒載體的說明，參見Thomas KR & Capecchi MR5Cell 1987,51 :503-12)?？梢詤⒖祭鏦olff 等，Science 1990,247 :1465-8 ；美國專利第 5，580，859 號(hào)、第 5，589，466 號(hào)、 第 5，804，566 號(hào)、第 5，739，118 號(hào)、第 5，736，524 號(hào)、第 5，679，647 號(hào)和 WO 98/04720。基于DNA的輸送技術(shù)的例子包括“裸DNA”、輔助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導(dǎo)型)輸送、陽離子脂質(zhì)復(fù)合體、和粒子介導(dǎo)型投遞(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)型輸送(例如參照美國專利第5，922，687號(hào))。本發(fā)明的載體包括，例如，病毒性載體或細(xì)菌性載體。表達(dá)載體的例子包括牛痘或雞痘等減毒病毒宿主(參照美國專利第4，722，848號(hào))。該策略涉及例如使用牛痘病毒作為載體來表達(dá)編碼雙鏈分子的核苷酸序列。重組牛痘病毒在被導(dǎo)入表達(dá)靶基因的細(xì)胞時(shí)即表達(dá)該分子并由此抑制細(xì)胞的增殖?？墒褂玫妮d體的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG載體在Mover等，Naturel991，351 :456-60中有記載。其它多種多樣的載體可用于雙鏈分子的治療性施用與生產(chǎn)，例子包括腺病毒載體和腺隨伴病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等?？梢詤⒄绽鏢hata等，Mol Med Today 2000，6 :66-71 ;Shedlock 等，J Leukoc Biol 2000，68 :793-806 ；以及 Hipp 等，In Vivo 2000，14 :571-85。-fflti日月雙 車&〒■吿低,罾M胞,罾@白句力fe在本發(fā)明中，測試了 dsRNA抑制細(xì)胞生長的能力。所述dsRNA有效地敲低(knock down) 了膀胱癌細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系中基因的表達(dá)，同時(shí)亦發(fā)生了細(xì)胞增殖的抑制(圖7)。因此，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞生長，即癌細(xì)胞生長的方法，所述方法通過經(jīng)抑制 JARID1B基因的表達(dá)來誘導(dǎo)JARID1B基因的功能障礙來實(shí)現(xiàn)。依照本發(fā)明，JARID1B基因的表達(dá)在急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌中特異性升高(表幻。因此，本發(fā)明的方法可用于抑制此類癌癥中的細(xì)胞生長。JARID1B基因表達(dá)可通過特異性地靶定JARID1B基因的任何前述的本發(fā)明雙鏈分子或可表達(dá)任何所述雙鏈分子的載體來抑制。例如，包含與作為靶序列的SEQ IDNO :21或30對(duì)應(yīng)的核酸序列的雙鏈分子可優(yōu)選用于本方法。上述本發(fā)明雙鏈分子及載體抑制癌性細(xì)胞之細(xì)胞生長的能力證明其可用于治療上述癌癥的方法。因此，本發(fā)明提供通過施用針對(duì)JARID1B基因的雙鏈分子或表達(dá)所述分子的載體來治療罹患癌癥患者的方法?？赏ㄟ^將細(xì)胞與針對(duì)JARID1B基因的雙鏈分子、表達(dá)該分子的載體或包含同樣分子的組合物接觸來抑制表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞的生長。可進(jìn)一步將所述細(xì)胞與轉(zhuǎn)染劑接觸。合適的轉(zhuǎn)染劑在本領(lǐng)域是已知的。短語“抑制細(xì)胞生長”表示所述細(xì)胞較之未暴露于所述分子的細(xì)胞，以較低速率增殖或具有降低的存活力。細(xì)胞生長可通過本領(lǐng)域已知技術(shù)測定，例如使用MTT細(xì)胞增殖測定。任何種類的細(xì)胞的生長均可根據(jù)本方法進(jìn)行抑制，只要所述細(xì)胞表達(dá)或過表達(dá) JARID1B基因?？勺鳛槔拥募?xì)胞包括急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌，尤其是膀胱癌和肺癌。因此，對(duì)于正罹患或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生與JARID1B有關(guān)的疾病的患者，可通過施用至少一種本發(fā)明雙鏈分子、表達(dá)至少一種所述分子的至少一種載體或包含至少一種所述分子的至少一種組合物進(jìn)行治療。舉例而言，肺癌或膀胱癌患者可根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。癌癥類型可通過根據(jù)所診斷的特定類型腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行鑒定。例如，肺癌可通過CEA、 CYFRA等等作為肺癌標(biāo)志，或通過胸部X光和/或痰細(xì)胞學(xué)進(jìn)行診斷。膀胱癌可以用尿液分析、χ-射線分析或膀胱鏡檢查進(jìn)行診斷。更優(yōu)選地，要用本發(fā)明所述方法治療的患者可以是用這樣的方法選出的在自患者收集的樣品中使用常規(guī)方法諸如RT-PCR和免疫測定法檢測JARID1B的表達(dá)水平。優(yōu)選地，在本發(fā)明的治療之前，對(duì)于來自受試者的所述活檢標(biāo)本使用本領(lǐng)域所知的方法，例如，免疫組織化學(xué)分析或RT-PCR，證實(shí)JARID1B基因的過表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的方法，多種針對(duì)JARID1B基因的雙鏈分子(或表達(dá)同樣分子的載體或含有同樣分子的組合物)可用于施用。為抑制細(xì)胞生長，本發(fā)明的雙鏈分子可直接以可實(shí)現(xiàn)該分子與對(duì)應(yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的形式導(dǎo)入細(xì)胞。另外，如上所述，編碼雙鏈分子的DNA可作為載體導(dǎo)入細(xì)胞。 為將雙鏈分子和載體導(dǎo)入細(xì)胞，可使用轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑，例如FuGENE(Roche diagnostics).Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、Oligofectamine (Invitrogen)與 Nucleofector (Wako pure Chemical)。當(dāng)治療導(dǎo)致臨床效益，諸如受試者中JARID1B基因表達(dá)的減少、癌癥的尺寸、患病率(prevalence)、或轉(zhuǎn)移潛力的降低，可以認(rèn)為該治療是“有效”的。當(dāng)預(yù)防性地適用治療時(shí)，“有效”是指其延遲或防止癌癥形成，或者預(yù)防或緩解癌癥的臨床癥狀。有效性結(jié)合特定腫瘤類型的任何公知的診斷或治療方法來加以確定。應(yīng)理解，本發(fā)明的所述雙鏈分子是亞化學(xué)計(jì)量地降解JARID1B mRNA的。雖不愿拘于任何理論，認(rèn)為本發(fā)明的所述雙鏈分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，與常規(guī)的癌癥療法相比，為實(shí)施治療效應(yīng)而需要輸送到癌癥的位置或其附近的雙鏈分子要少得多。本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了受試者的體重、年齡、性別、疾病類型、癥狀及其它條件、 施用途徑、以及是局部施用還是全身施用等因素的基礎(chǔ)上，能夠容易地確定本發(fā)明的雙鏈分子的有效量。一般而言，本發(fā)明雙鏈分子的有效量是在癌癥部位或其附近胞內(nèi)濃度為大約1納摩爾(nM)到約ΙΟΟηΜ，優(yōu)選大約2nM到大約50nM,更優(yōu)選大約2. 5nM到大約IOnM0 考慮可使用更多或更少量的雙鏈分子。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可方便地及常規(guī)地確定特定情況下所需的確切劑量。本發(fā)明的方法可用于抑制表達(dá)JARID1B基因的癌癥例如急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌，尤其是膀胱癌和肺癌的生長或轉(zhuǎn)移。具體而言，含有與SEQ IDNO :21或30對(duì)應(yīng)的靶序列的雙鏈分子特別優(yōu)選用來治療癌癥。為了治療癌癥，還可以將本發(fā)明的雙鏈分子與不同于所述雙鏈分子的藥劑組合來施用于受試者?；蛘?，本發(fā)明的雙鏈分子還可以與其它旨在用于癌癥治療的治療方法組合來施用于受試者。舉例而言，本發(fā)明所述雙鏈分子可與現(xiàn)在用于治療癌癥或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的治療方法(例如，放射療法，外科手術(shù)，以及使用化療劑的治療)組合施用。在本發(fā)明的方法中，雙鏈分子可以裸雙鏈分子的形式、以與投遞試劑相組合的形式，或者以表達(dá)雙鏈分子的重組質(zhì)粒或者病毒載體的形式施用于受試者。用于與本發(fā)明的雙鏈分子組合施用的合適的投遞試劑包括Mirus TransitTKO脂溶性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚陽離子(例如聚賴氨酸)、或脂質(zhì)體。一種優(yōu)選的投遞試劑是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體能夠幫助將雙鏈分子投遞至特定的組織如視網(wǎng)膜或腫瘤組織中，還能夠增加雙鏈分子的血中半衰期。適合在本發(fā)明的方法中使用的脂質(zhì)體是由常規(guī)的囊泡形成性脂質(zhì)(vesile-forming lipids)形成的，囊泡形成性脂質(zhì)通常包括中性或帶負(fù)電荷的磷脂，以及甾醇，諸如膽固醇。對(duì)一些因素的考慮通?？梢詾橹|(zhì)的選擇提供指導(dǎo)，如期望的脂質(zhì)體大小以及在血流中的脂質(zhì)體的半衰期等。有多種制備脂質(zhì)體的方法是公知的，例如Szoka 等，Ann RevBiophys Bioeng 1980,9 :467 ；美國專利第 4，235，871 號(hào)；第 4，501，728 號(hào)；第 4，837，028號(hào)；第5，019，369號(hào)；將上述文獻(xiàn)的全部內(nèi)容援引并入本說明書。在一些實(shí)施方案中，包被本發(fā)明的雙鏈分子的脂質(zhì)體包含能夠?qū)⒅|(zhì)體輸送至癌癥部位的配體分子。優(yōu)選的配體是與腫瘤或血管內(nèi)皮細(xì)胞中普遍的受體結(jié)合的配體，例如與腫瘤抗原或內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原結(jié)合的單克隆抗體另外，包被本發(fā)明的雙鏈分子的脂質(zhì)體可以經(jīng)過修飾以免被單核巨噬細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，例如，通過使其結(jié)構(gòu)的表面結(jié)合有調(diào)理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以同時(shí)包括調(diào)理作用抑制部分和配體。用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分通常是與脂質(zhì)體膜結(jié)合的大型親水性聚合物。如在本說明書中所使用的，例如，當(dāng)調(diào)理作用抑制部分化學(xué)地或物理地搭接在脂質(zhì)體膜上時(shí)，例如通過脂溶性錨(anchor)插入膜本身，或者通過與膜脂質(zhì)的活性基團(tuán)直接結(jié)合，則調(diào)理作用抑制部分與脂質(zhì)體膜“結(jié)合”。這些調(diào)理作用抑制性親水性聚合物形成保護(hù)性表層，該表層顯著地減少巨噬-單核細(xì)胞系統(tǒng)(“MMS”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(”RES”) 對(duì)脂質(zhì)體的攝入；在例如美國專利第4，920，016號(hào)中對(duì)此有記載，后者的全部公開內(nèi)容援引并入本說明書。因此，與未修飾的脂質(zhì)體相比，被調(diào)理作用抑制部分修飾過的脂質(zhì)體能夠保留在血液循環(huán)中的時(shí)間顯著更長。出于以上理由，這樣的脂質(zhì)體有時(shí)也被稱為“隱形，，(stealth)脂質(zhì)體。已知隱形脂質(zhì)體蓄積在依靠多孔性或“滲漏性”微血管系統(tǒng)供給的組織中。因此， 在以這樣的微血管系統(tǒng)缺損為特征的靶組織，例如實(shí)體瘤中，這些脂質(zhì)體會(huì)高效率地蓄積。 參見 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988,18:6949-53。此外，RES 的攝入的減少阻止隱形脂質(zhì)體在肝臟和脾臟中的顯著蓄積，從而降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用抑制部分修飾的本發(fā)明的脂質(zhì)體能夠?qū)⒈景l(fā)明的雙鏈分子輸送至腫瘤細(xì)胞。適用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選為分子量約500 約40，000道爾頓、更優(yōu)選約2，000 約20，000道爾頓的水溶性聚合物。這樣的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯； 合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直鏈狀、分枝狀或者樹狀聚酰胺胺 (polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalchohols)，諸如化學(xué)結(jié)合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂，諸如神經(jīng)節(jié)苷脂GM115 PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚體也是適合的。此外，抑制調(diào)理作用的聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亞乙基胺或者多核苷酸中的任何一種的嵌段共聚物。抑制調(diào)理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、海藻酸、角叉膠；氨基化多糖類或寡糖(直鏈狀或者分枝狀)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通過與碳酸的衍生物反應(yīng)而生成了羧基結(jié)合的羧基化多糖類或寡糖。優(yōu)選地，調(diào)理作用抑制部分為PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質(zhì)體有時(shí)稱為“PEG化脂質(zhì)體”。調(diào)理作用抑制部分可以通過許多公知技術(shù)中的任何一種結(jié)合到脂質(zhì)體膜上。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯能夠與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨(lipid-soluble anchor)結(jié)合，然后再結(jié)合到膜上。相似地，可以通過還原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性錨來將右旋糖酐聚合物衍生化，所述還原性氨基化中使用Na (CN) BH3和混合溶劑，如60°C的四氫呋喃與水的30 12比例混合物。上文討論了表達(dá)本發(fā)明的雙鏈分子的載體。這樣的表達(dá)至少一種本發(fā)明的雙鏈分子的載體也可以直接施用或者與合適的投遞試劑組合施用，所述合適的投遞試劑包括 Mirus Transit LTl 親脂性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚陽離子(例如聚賴氨酸)或脂質(zhì)體。將表達(dá)本發(fā)明的雙鏈分子的重組病毒載體輸送到患者的癌癥區(qū)域的方法在本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的雙鏈分子可以通過適于將雙鏈分子遞送到癌癥部位的任何手段來施用給受試者。例如，雙鏈分子可以通過基因槍、電穿孔、或者其它合適的非消化道或腸內(nèi)施用途徑來施用。合適的腸內(nèi)施用途徑包括口腔、直腸、或鼻內(nèi)遞送。合適的非消化道施用途徑包括血管內(nèi)施用(例如靜脈內(nèi)推注、靜脈內(nèi)輸注、動(dòng)脈內(nèi)推注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和針對(duì)血管網(wǎng)絡(luò)的導(dǎo)管滴注)，組織周圍和組織內(nèi)注射(例如腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)注射)，皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如利用浸透壓泵)，直接施加到癌癥部位或其附近的區(qū)域，例如借助導(dǎo)管或其它放置裝置(例如，包含多孔性、非多孔性或明膠狀材料的栓劑或植入物)，和吸入。優(yōu)選通過注射或輸注將雙鏈分子或載體施用到癌癥部位或其附近。本發(fā)明的雙鏈分子可以以單一劑量或分多個(gè)劑量來施用。當(dāng)本發(fā)明的雙鏈分子的施用為輸注方式時(shí)，輸注可以是單個(gè)持續(xù)劑量，或者通過多次輸注來施用。優(yōu)選的是將藥劑直接注射到癌癥部位或其附近的組織中。特別優(yōu)選的是將藥劑多次注射到癌癥部位或其附近的組織中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定用于對(duì)給定受試者施用本發(fā)明雙鏈分子的合適劑量方案。例如，雙鏈分子可以一次性施用給受試者，例如以單次注射或者沉積的形式施用到癌癥部位或其附近。或者，雙鏈分子可以在約3 約28日、更優(yōu)選約7 約10日的期間內(nèi)每日一次或二次地施用給受試者。在優(yōu)選的劑量方案中，雙鏈分子可以在7日期間內(nèi)一日一次地注射到癌癥部位或其附近。當(dāng)劑量方案包括多次施用時(shí)，應(yīng)該理解的是，給受試者施用的雙鏈分子的有效量，可以包含在整個(gè)劑量方案中施用的該雙鏈分子的總量。包含本發(fā)明雙鏈分子的組合物除上述外，本發(fā)明亦提供了包含至少一種本發(fā)明的雙鏈分子或編碼它的載體的藥物組合物。所述藥物組合物抑制JARID1B基因表達(dá)，且因此抑制癌細(xì)胞生長，因此它們可用于治療或預(yù)防涉及JARID1B基因過表達(dá)的癌癥，例如急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌。優(yōu)選地，所述藥物組合物可用于治療或預(yù)防膀胱癌和肺癌。任何靶向JARID1B基因的本發(fā)明雙鏈分子或任何編碼該雙鏈分子的本發(fā)明載體可用于本發(fā)明的組合物。上文描述了雙鏈分子和載體的詳情。優(yōu)選地，雙鏈分子包含與作為靶序列的SEQ ID NO :21或30對(duì)應(yīng)的核酸序列。本發(fā)明的所述雙鏈分子優(yōu)選在施用于受試者之前根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)配制為藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物特征為至少是無菌且不含熱原的。本文中所使用的“藥物組合物”包括適用于人類與獸醫(yī)用的組合物。制備本發(fā)明藥物組合物的方法屬于本領(lǐng)域一般技術(shù)，例如，描述于 Remington' s Pharmaceutical Science, 17th ed. ，Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)，其全部公開內(nèi)容通過引用包含于本文中。本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種本發(fā)明的雙鏈分子或編碼它們的載體(例如， 以重量計(jì)為0. 到90% )，或所述分子的生理學(xué)上可接受的鹽，與生理上可接受的載體介質(zhì)混合。生理學(xué)上可接受的載體介質(zhì)優(yōu)選水、緩沖水、生理鹽水、0. 4%鹽水、0. 3%甘氨酸、透明質(zhì)酸及類似物。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物可包含多種雙鏈分子，每一種分子均可針對(duì)JARID1B基因。而且，本組合物可以包含編碼1個(gè)或多個(gè)雙鏈分子的載體。例如，所述載體可以編碼1種或2種本發(fā)明雙鏈分子?；蛘?，本組合物可以包含多種載體，而各載體編碼不同的雙鏈分子。而且，本雙鏈分子可以包含在本本發(fā)明的脂質(zhì)體中。上文描述了脂質(zhì)體的詳情。本發(fā)明的藥物組合物中還可以包含常規(guī)的藥用賦形劑和/或添加劑。合適的藥用賦形劑包括穩(wěn)定化劑、抗氧化劑、浸透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、和PH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括 生理學(xué)生物相容性的緩沖劑(例如氨基丁三醇鹽酸鹽)、補(bǔ)加螯合劑(例如DTPA或DTPA-雙酰胺等)，或鈣螯合劑復(fù)合物(例如、鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)，或者，任選地，補(bǔ)加鈣或鈉鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣)。本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)行包裝以便作為液體使用，或者也可以加以冷凍干燥。對(duì)于固體組合物，可以使用常規(guī)的無毒固態(tài)載體；例如，藥物級(jí)的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。例如，用于口服施用的固體藥物組合物中可以包含上述列舉的任意載體和賦形劑，以及10-95%，優(yōu)選25-75%的本發(fā)明的一種或多種雙鏈分子。用于氣霧劑(吸入)施用的藥物組合物可以包含0.01-20重量％、優(yōu)選1-10重量％的包被于上述脂質(zhì)體中的一種或多種本發(fā)明的雙鏈分子，以及推進(jìn)劑。還可以根據(jù)需要包含載體，例如用于鼻內(nèi)投遞的卵
磷脂等。除上述之外，本組合物中還可以包含其它藥學(xué)活性成分，只要它們不抑制本雙鏈分子的體內(nèi)功能。例如，上述組合物中可以包含常規(guī)用于癌癥治療的化療藥物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明的雙鏈核酸分子在制備用于治療癌癥的藥物組合物中的用途，所述癌癥諸如急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌，尤其是膀胱癌和肺癌。例如，本發(fā)明涉及在細(xì)胞中抑制JARID1B基因表達(dá)的雙鏈核酸分子的用途，該分子包含有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈。可提供任何本發(fā)明雙鏈分子用于此用途，只要該雙鏈分子在導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)具有抑制 JARID1B基因表達(dá)和細(xì)胞增殖的能力。包含與SEQ ID NO 21或30對(duì)應(yīng)的靶序列的雙鏈分子適合于本發(fā)明的用途。此外，本發(fā)明還提供生產(chǎn)用于治療諸如急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌等癌癥的藥物組合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將藥學(xué)或者生理學(xué)可接受的載體與作為活性成分的雙鏈分子一起配制的步驟。包含與SEQ ID NO :21或30對(duì)應(yīng)的靶序列的雙鏈分子適合于本發(fā)明的方法或工藝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供生產(chǎn)用于治療諸如急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌等癌癥的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法或工藝包括將活性成分與藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體混合的步驟，其中所述活性成分是本發(fā)明的雙鏈核酸分子。包含與SEQ ID N0:21或30對(duì)應(yīng)的靶序列的雙鏈分子適合于本發(fā)明的方法或工藝。
在本發(fā)明中，可以用至少一種選自下組的活性成分來治療過表達(dá)JARID1B的癌癥(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。所述癌癥包括但不限于急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌或腎細(xì)胞癌。因而，在施用包含所述活性成分的藥物組合物之前，優(yōu)選確認(rèn)要治療的癌細(xì)胞或組織中JARID1B的表達(dá)水平是否與相同器官的正常細(xì)胞相比升高。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療(過)表達(dá)JARID1B的癌癥的方法，該方法可包括下列步驟i)檢測自具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中JARID1B的表達(dá)水平；ii)將所述JARID1B表達(dá)水平與正常對(duì)照比較；并iii)對(duì)具有與正常對(duì)照相比過表達(dá)JARID1B的癌癥的受試者施用至少一種選自下組的成分(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體?；蛘撸景l(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含至少一種選自下組的成分，用于施用于具有過表達(dá)JARID1B的癌癥的受試者(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。換言之，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于鑒定要用下述各項(xiàng)治療的受試者的方法(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，或(c)它們它們的載體，該方法可包括測定源自受試者的癌細(xì)胞或組織中JARID1B的表達(dá)水平的步驟，其中所述水平與該基因正常對(duì)照相比的升高指示該受試者可用下述各項(xiàng)治療的癌癥(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，或(c)編碼它們的載體。下面會(huì)更加詳細(xì)地描述本發(fā)明治療癌癥的方法。用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的例子包括但不僅限于，例如， 人類，非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬以及牛。根據(jù)本發(fā)明，測定自受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中JARID1B的表達(dá)水平。表達(dá)水平可在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(核酸)水平確定，使用本領(lǐng)域熟知的方法。舉例而言，JARID1B的mRNA可使用探針通過雜交方法(例如，Northern雜交)定量。可在芯片或陣列上實(shí)施所述檢測。 對(duì)檢測JARID1B的表達(dá)水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用JARID1B的序列信息制備此類探針。舉例而言，JARID1B的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)記物諸如染料、熒光物質(zhì)或同位素來標(biāo)記，且所述基因的表達(dá)水平可以作為發(fā)生雜交的標(biāo)記物的強(qiáng)度來加以檢測。進(jìn)一步，JARID1B的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如SEQ ID NO 1)可使用引物通過基于擴(kuò)增的檢測技術(shù)(例如，RT-PCR)定量。上述引物可基于所述基因已知的序列信息制備。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件與低嚴(yán)格條件下與JARID1B的mRNA雜交。本文所用的短語“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的，在不同的環(huán)境下會(huì)不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下發(fā)生。一般地， 嚴(yán)格條件的溫度選擇為比特定序列在限定的離子強(qiáng)度和PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低大約5°C。 Tm是(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與其靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度。因?yàn)榘行蛄幸话氵^量存在，因此在Tm下，平衡時(shí)50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴(yán)格條件是這樣的其中鹽濃度小于大約1. OM鈉離子，典型地大約0.01-1. OM 鈉離子(或其它鹽)，PH7. 0-8. 3，溫度對(duì)于較短的探針或引物(例如10-50個(gè)核苷酸)是至少大約30°C，用于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實(shí)現(xiàn)。或者，本發(fā)明的診斷可以通過檢測翻譯產(chǎn)物來進(jìn)行。例如，可以確定JARID1B蛋白 (SEQ ID NO 2)的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此類方法使用特異識(shí)別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾 (例如嵌合抗體、scFV、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于檢測，只要該片段或經(jīng)修飾抗體保留對(duì)JARID1B蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價(jià)物。作為另一種基于JARID1B的翻譯產(chǎn)物檢測其基因的方法，可利用針對(duì)JARID1B蛋白的抗體通過免疫組織化學(xué)分析測量其染色的強(qiáng)度。即，在此測量中，強(qiáng)染色表明所述蛋白質(zhì)的水平/存在增加，且同時(shí)表明JARIDIB基因的高表達(dá)水平。對(duì)于癌細(xì)胞中靶基因(例如JARID1B基因)的表達(dá)水平而言，如果測定出其較之靶基因的對(duì)照水平(例如正常細(xì)胞中的水平)增加了例如10%，25%或50%的話，或增加到超過1. 1倍，超過1. 5倍，超過2. 0倍，超過5. 0倍，超過10倍或者更多，則可認(rèn)為其在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平是增加的。對(duì)照水平可以與癌細(xì)胞同時(shí)確定，使用先前從疾病狀態(tài)(癌性或非癌性)已知的受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區(qū)獲得的正常細(xì)胞可用作正常對(duì)照。或者，對(duì)照水平可以借助統(tǒng)計(jì)方法，根據(jù)通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的JARID1B基因表達(dá)水平獲得的結(jié)果加以確定。進(jìn)一步，對(duì)照水平可以是源自先前測試過的細(xì)胞的表達(dá)模式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，可以將生物樣品中JARID1B基因的表達(dá)水平與從多個(gè)參考樣品確定的多個(gè)對(duì)照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自受試者的生物樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對(duì)照水平。 而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中JARID1B基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)值。標(biāo)準(zhǔn)值可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，平均值+/-2 S.D.或平均值+/-3 S.D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。
在本發(fā)明的語境下，從已知非癌性的生物樣品確定的對(duì)照水平稱作“正常對(duì)照水平”。另一方面，如果對(duì)照水平從癌性生物樣品確定，則稱作“癌性對(duì)照水平”。當(dāng)JARID1B基因的表達(dá)水平與正常對(duì)照水平相比升高或者與癌性對(duì)照水平相似/ 等同時(shí)，該受試者可診斷為具有要治療的癌癥。更具體地，本發(fā)明提供了(i)診斷受試者是否具有要治療的癌癥，和/或(ii)為癌癥治療選擇受試者的方法，該方法包括下列步驟a)測定自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中JARID1B的表達(dá)水平；b)將該JARID1B表達(dá)水平與正常對(duì)照水平比較；c)如果JARID1B表達(dá)水平與正常對(duì)照水平相比升高的話，將該受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)如果受試者在步驟C)中診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇該受試者進(jìn)行癌癥治療?；蛘?，此類方法包括下列步驟a)測定自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中JARID1B的表達(dá)水平；b)將該JARID1B表達(dá)水平與癌性對(duì)照水平比較；c)如果該JARID1B表達(dá)水平與癌性對(duì)照水平相似或等同的話，將該受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)如果受試者在步驟C)中診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇該受試者進(jìn)行癌癥治療。本發(fā)明還提供了用于確定罹患癌癥的受試者是否可用本發(fā)明的雙鏈分子或編碼它們的載體來治療的試劑盒，其也可用于評(píng)估和/或監(jiān)測癌癥治療的功效。優(yōu)選地，所述癌癥包括但不限于急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌或腎細(xì)胞癌。更具體地，所述試劑盒優(yōu)選包括至少一種在源自受試者的癌細(xì)胞中檢測JARID1B基因表達(dá)的試劑，所述試劑可選自下組(a)檢測JARIDIB基因的mRNA的試劑；(b)檢測JARIDIB的蛋白質(zhì)的試劑；和(c)檢測JARID1B的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的試劑。 適于檢測JARID1B基因的mRNA的試劑包括特異性結(jié)合或識(shí)別JARID1B mRNA的核酸，諸如具有與JARID1B mRNA的一部分互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。這些種類的寡核苷酸的例子有對(duì)JARID1B mRNA為特異性的引物與探針。可基于本領(lǐng)域眾所周知的方法制備這些種類的寡核苷酸。如果需要，可將用于檢測JARID1B mRNA的試劑固定化在固體基質(zhì)上。另外， 在所述試劑盒中可包括多于一種檢測JARID1B mRNA的試劑。 另一方面，適于檢測JARID1B蛋白質(zhì)的試劑包括針對(duì)JARID1B蛋白質(zhì)的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進(jìn)一步，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab' )2、Fv等等)均可用作所述試劑，只要所述片段或經(jīng)修飾抗體保留與 JARID1B蛋白的結(jié)合能力。為檢測蛋白制備此類抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且在本發(fā)明中可使用任何方法制備上述抗體及其等價(jià)物。進(jìn)一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號(hào)的分子通過直接連接或間接標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物與標(biāo)記抗體以及檢測抗體與其靶的結(jié)合的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標(biāo)記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測JARID1B蛋白質(zhì)的試劑。所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。舉例而言，從沒有癌癥或罹患癌癥的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對(duì)照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括其它從商業(yè)和用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾器、針頭、注射器和帶有使用說明的裝箱單(例如，書面的、磁帶、CD-ROM等等)。這些試劑之類的包含在帶有標(biāo)簽的容器中。合適的容器包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可從多種材料制得，例如玻璃或塑料。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述試劑是針對(duì)JARID1B mRNA的探針時(shí)，所述試劑可固定化于固體基質(zhì)例如多孔條上，以形成至少一個(gè)檢測位點(diǎn)。所述多孔條的測量或檢測區(qū)域可包含多個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對(duì)照的位點(diǎn)?；蛘?，對(duì)照位點(diǎn)可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位點(diǎn)可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個(gè)檢測位點(diǎn)上量較大而在接下來的位點(diǎn)上量較小。在加入測試樣品之后，顯示可檢測信號(hào)的位點(diǎn)的數(shù)量提供了在樣品中存在的JARID1B mRNA量的定量指征。所述檢測位點(diǎn)可配置為具有任何合適地可檢測的形狀，通常是橫跨測試條寬度的條狀或點(diǎn)狀。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括陽性對(duì)照樣品或JARID1B標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明的的陽性對(duì)照樣品可通過收集JARID1B陽性樣品，隨后測定其JARID1B水平來制備?；蛘?，可將純化的JARID1B蛋白或多核苷酸添加至不表達(dá)JARID1B的細(xì)胞以形成所述陽性樣品或 JARIDIB標(biāo)準(zhǔn)樣品。在本發(fā)明中，純化的JARIDIB可以是重組蛋白。陽性對(duì)照樣品的JARIDIB 水平例如大于截留值。篩選抗癌化合物本發(fā)明提供了篩選有能力抑制癌細(xì)胞生長的化合物的方法，所述癌細(xì)胞例如急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌。本篩選方法可通過靶向JARID1B基因或蛋白來實(shí)施。通過本方法篩選的化合物可以是用于治療諸如急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、 前列腺癌和腎細(xì)胞癌等癌癥的優(yōu)良候選化合物。尤其是，確認(rèn)了抑制JARID1B基因表達(dá)導(dǎo)致抑制膀胱癌和肺癌中的細(xì)胞增殖(圖7)。因此，通過本方法篩選出的化合物可優(yōu)選用于治療膀胱癌和肺癌。用于篩選的藥劑或化合物在本發(fā)明的語境中，待通過本篩選方法鑒定的藥劑或化合物可以是任何化合物或包含數(shù)種化合物的組合物。而且，根據(jù)本發(fā)明篩選方法暴露于細(xì)胞或蛋白的測試藥劑或組合物可以是單個(gè)化合物或多個(gè)化合物的組合。當(dāng)在方法中使用化合物組合時(shí)，化合物可以順次或同時(shí)加以接觸。任何測試藥劑或化合物，例如，細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗蛋白質(zhì)、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸構(gòu)建體，例如反義RNA、siRNA、核酶以及適體等等或抗體)以及天然化合物，均可用于本發(fā)明的篩選方法中。也可以從本領(lǐng)域熟知的很多組合文庫方法中采取任何辦法來獲得本發(fā)明的測試藥劑或化合物，這些方法包括(1)生物文庫，(2)空間可尋址平行固相或液相文庫(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), (3) 要解卷積(deconvolution)的合成文庫法，“一珠一化合物”(“one-beadone-compound”) 文庫法，以及( 使用親和色譜選擇的合成文庫法。使用親和色譜選擇的生物文庫法限于肽文庫，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文庫(Lam(1997) Anticancer Drug Des. 12 145-67)。合成分子文庫方法的例子可在本領(lǐng)域找到(DeWitt et al. , Proc Natl Acad Sci USA1993,90 :6909-13 ；Erb et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1994,91 :11422-6 ；Zuckermann et al.，J Med Chem 37 :2678-85,1994 ；Cho et al.， Science 1993,261 :1303-5 ；Carell et al. , Angew Chem Int Ed Engl 1994,33:2059; Carell et al. , Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 :2061 ；Gallop et al. , J Med Chem 1994,37 :1233-51) 化合物文庫可提供于溶液中(參見 Houghten，Bio/techniques 1992， 13 :412-21)或珠子上(Lam，Nature 1991,354 :82-4)、芯片上(Fodor，Naturel993, 364 555-6)、細(xì)菌上(美國專利5，223，409)、孢子上(美國專利5，571，698 ；5, 403，484與 5，223，409)、質(zhì)粒上(Cull et al.，Proc Natl Acad Sci USA1992，89 1865-9)或噬菌體 ± (Scott and Smith, Science 1990,249 :386-90 ；Devlin, Science 1990,249 :404-6 ； Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 :6378-82 ；Felici, J Mol Biol 1991， 222 :301-10 ；美國專利申請(qǐng) 2002103360)。通過本發(fā)明任何篩選方法篩選到的化合物的一部分結(jié)構(gòu)通過添加、刪除、和/或置換方式被轉(zhuǎn)換而得到的化合物，包括在通過本發(fā)明篩選方法獲得的藥劑或化合物之內(nèi)。此外，當(dāng)所篩選的測試藥劑或化合物是蛋白質(zhì)時(shí)，為了獲得編碼該蛋白的DNA，可以確定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定編碼蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根據(jù)該序列制備寡DNA作為探針，并用該探針篩選cDNA文庫，以獲得編碼該蛋白的DNA。以其在制備治療或預(yù)防癌癥的候選物測試劑中的有用性為準(zhǔn)對(duì)所得的DNA 進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)本文描述篩選為有用的測試藥劑或化合物亦可為特異性結(jié)合JARID1B蛋白或其缺乏原始蛋白的體內(nèi)生物活性的部分肽的抗體。盡管測試藥劑或化合物文庫的構(gòu)建是本領(lǐng)域眾所周知的，在下文中還是進(jìn)一步提供了鑒定測試藥劑和構(gòu)建用于本篩選方法的這些藥劑或化合物文庫的指導(dǎo)。( )分子建模對(duì)具有目標(biāo)性質(zhì)的化合物的分子結(jié)構(gòu)和/或?qū)Υ种瓢蟹肿蛹碕ARID1B蛋白的分子結(jié)構(gòu)的知識(shí)為人們構(gòu)建測試藥劑或化合物文庫提供了便利。預(yù)篩選適于進(jìn)一步評(píng)估的測試藥劑或化合物的方法之一，是對(duì)測試藥劑與JARID1B蛋白的相互作用進(jìn)行計(jì)算機(jī)建模。計(jì)算機(jī)建模技術(shù)為針對(duì)選定分子的三維原子結(jié)構(gòu)的可視化以及會(huì)與該分子相互作用的新化合物的合理設(shè)計(jì)提供了可能。三維構(gòu)建典型地依賴于從選定分子的χ-射線晶體分析或NMR成像而來的數(shù)據(jù)。分子動(dòng)力學(xué)需要力場數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)圖形系統(tǒng)為預(yù)測新化合物如何連接靶分子，以及實(shí)驗(yàn)操作化合物和靶分子的結(jié)構(gòu)以優(yōu)化結(jié)合特異性提供了可能。 為了預(yù)測當(dāng)分子和化合物之一或二者發(fā)生細(xì)小改變時(shí)分子-化合物相互作用是什么樣的， 需要分子力學(xué)軟件和計(jì)算密集型計(jì)算機(jī)，它們通常耦聯(lián)著分子設(shè)計(jì)程序和用戶之間的用戶友好的、菜單驅(qū)動(dòng)的界面。上文一般性描述的分子建模系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例包括CHARMm和QUANTA程序，PolygenCorporation, ffaltham, Mass。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行構(gòu)建、圖形建模和分子結(jié)構(gòu)分析。利用QUANTA可進(jìn)行分子相互行為的互動(dòng)性構(gòu)建、修飾、和可視化分析。有多篇文獻(xiàn)綜述了與特異蛋白相互作用的藥物的計(jì)算機(jī)建模，例如Rotivinen et al.Acta Pharmaceutica Fennica 1988,97 :159-66 ；Ripka, NewScientist 1988,54—8; McKinlay & Rossmann,Annu Rev Pharmacol Toxicioll989, 29:111-22 ；Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989，291 :189—93 ;Lewis& Dean， Proc R Soc Lond 1989,236 125-40,141-62 ；以及綜述關(guān)于核酸組分模型受體的Askew et al.，J Am Chem Soc 1989， 111 :1082-90。其它可篩選并圖形描述化學(xué)物質(zhì)的計(jì)算機(jī)程序可以從例如Mississauga， Ontario, Canada 的 BioDesign, Inc.，Pasadena, Calif.，Allelix, Inc &司、Cambridge, Ontario 的Hypercube，Inc.等公司獲取。見例如 DesJarlais et al.，J Med Cheml988，31 722-9 ；Meng et al.，J Computer Chem 1992,13 :505-24；Meng et al.，Proteins 1993， 17 :266-78 ；Shoichet et al.，Science 1993,259 1445-50 一旦鑒定出推定的抑制劑，可使用組合化學(xué)技術(shù)基于鑒定出的推定抑制劑的化學(xué)結(jié)果構(gòu)建任何數(shù)量的變體，如下所述。對(duì)于所得的推定的抑制劑，或稱“測試藥劑”文庫，可使用本發(fā)明的方法篩選，以鑒定治療或預(yù)防癌癥的測試藥劑或化合物。(ii)組合化學(xué)合成測試藥劑或化合物的組合文庫可以作為合理藥物設(shè)計(jì)程序——其涉及有關(guān)已知化合物中存在的核心結(jié)構(gòu)的知識(shí)——的一部分來制備。這種策略使得文庫可以保持合理的規(guī)模，便于高通量篩選?；蛘撸赏ㄟ^簡單地合成構(gòu)成文庫的分子家族的所有排列，構(gòu)建簡單的、特別是短的、聚合物性的分子文庫。后一種方法的一個(gè)實(shí)例是全部由長度為6個(gè)氨基酸組成的肽文庫。這種肽文庫包含所有6氨基酸序列組合。這種類型的文庫稱作線性組合化學(xué)文庫。組合化學(xué)文庫的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可以通過化學(xué)或生物合成來產(chǎn)生。組合化學(xué)文庫包括，但不僅限于，肽文庫(見例如美國專利5，010，175 ；Furka, Int J Pept Prot Res 1991,37 :487-93 ；Houghten et al.，Naturel991，354 :84_6)。也可以使用其它用于產(chǎn)生化學(xué)多樣性文庫的化學(xué)。這些化學(xué)包括，但不僅限于，肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被編碼的肽(例如W093/20242)，隨機(jī)生物寡聚體(例如WO 92/00091)， 苯并二氮卓(benzodiaz印ines)(例如美國專利5，觀8，514)，diversomer如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWittet al. , Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909-13)，插烯化 (vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽類肽模擬物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992， 114 :9217-8)，小化合物文庫的模擬物有機(jī)合成(analogous organic synthese) (Chenet al. , J. Amer Chem Soc 1994，116 :2661)，寡聚氨基甲酸鹽(Cho et al.，Sciencel993，
:1303)，和 / 或月太酰膦酸酯(ρ印tidylphosphonates) (Campbell et al. , JOrg Chem 1994,59 :658)，核酸文庫(見 Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology 1995 supplement ；Sambrook et al. , Molecular Cloning :A LaboratoryManual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA)，肽核酸文庫(見例如美國專利 5，539，083)，抗體文庫(見例如 Vaughan et al. , NatureBiotechnology 1996，14(3) :309-14 禾口 PCT/ US96/10287)，碳水化合物文庫(見例如 Liang et al.，Science 1996,274 :1520-22 ； 美國專利5，593，853)，和有機(jī)小分子文庫(見例如苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Decl ；6 (6) :624-31 ；類異戊二烯(isoprenoids)，美國專利 5，569，588 ； 噻唑烷酮(thiazolidinones)和偏硫雜氮雜環(huán)己烷(metathiazanone)，美國專利 5，549，974 ；吡咯烷(pyrrolidines)，美國專利5，525，735和5，519，134 ；嗎啉代化合物，美國專利5，506，337 ；苯并二氮卓，5，288，514 ；等)。(iii)噬菌體展示另一種手段是使用重組噬菌體來產(chǎn)生文庫。使用“噬菌體方法”(Scott& Smith， Science 1990,249 :386-90 ；Cwirla et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1990，87 :6378-82 ; Devlin et al. ,Science 1990，249 :404-6)，可以構(gòu)建非常大的文庫(例如IO6-IO8個(gè)化學(xué)實(shí)體)。再一種手段主要使用化學(xué)方法，其實(shí)例包括Geysen方法(Geysen et al. ,Molecular Immunology 1986,23 :709-15 ；Geysen et al. , JImmunologic Method 1987，102 :259-74) 和 Fodor 等的方法(Science 1991，251 :767-73)。Furka 等(14th International Congress of Biochemistry 1988,Volume #5,Abstract FR 013 ；Furka,Int J Peptide Protein Res 1991,37 :487-93)，Houghten(美國專利 4，631，211)和 Rutter 等(美國專利 5，010，175) 記載了產(chǎn)生肽混合物的方法，可以將這些肽作為激動(dòng)劑或拮抗劑加以測試。用于制備組合文庫的設(shè)備是可商購的(見例如357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA,433AApplied Biosystems, Foster City, CA,9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，有多種組合文庫本身也是商業(yè)可得的(見例如 ComGenex, Princeton, N. J. , Tripos, Inc. , St. Louis,MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等等)。.!ARIDIB結(jié)合性藥劑或化合物的篩選在本發(fā)明中，在急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌中檢測到與正常器官中的表達(dá)相比的JARID1B過表達(dá) (表3)。因此，本發(fā)明提供了用于篩選結(jié)合JARID1B蛋白的藥劑的方法。由于此類癌癥中 JARID1B的表達(dá)，與JARID1B蛋白結(jié)合的藥劑或化合物可望抑制癌細(xì)胞的增殖，并因此對(duì)治療或預(yù)防癌癥是有用的。因此，本發(fā)明亦提供了用于篩選抑制癌細(xì)胞增殖的藥劑或化合物的方法，以及利用JARID1B多肽篩選治療或預(yù)防肺癌的藥劑化合物的方法。具體而言，該篩選方法的一個(gè)實(shí)施方案包括以下步驟(a)將測試藥劑或化合物與自JARID1B基因衍生的JARID1B多肽接觸；(b)檢測所述多肽與所述測試藥劑或化合物之間的結(jié)合活性；并(c)選擇結(jié)合所述多肽的測試藥劑或化合物作為候選藥劑或化合物。依照本發(fā)明，可評(píng)估測試藥劑或化合物抑制細(xì)胞生長或者候選藥劑或化合物治療或預(yù)防JARID1B相關(guān)疾病的治療效果。因此，本發(fā)明亦提供了篩選抑制癌細(xì)胞生長的候選藥劑或化合物的方法或者篩選用于治療或預(yù)防癌癥的候選藥劑或化合物的方法。更具體地，所述方法包括以下步驟(a)將測試藥劑或化合物與自JARID1B基因衍生的JARID1B多肽接觸；(b)檢測所述多肽與所述測試藥劑或化合物之間的結(jié)合活性；
(c)將(b)的結(jié)合水平與所述測試藥劑或化合物不存在下檢測出的結(jié)合水平比較；并(d)將(C)的結(jié)合水平與所述測試藥劑或化合物的治療效果關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明中，治療效果可以與對(duì)JARID1B多肽的結(jié)合活性關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)某種測試藥劑或化合物結(jié)合JARID1B多肽時(shí)，可將所述測試藥劑或化合物鑒定或選擇為具有治療效果的候選藥劑或化合物。或者，當(dāng)某種測試藥劑或化合物不結(jié)合JARID1B多肽時(shí)，可將所述測試藥劑或化合物鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。本發(fā)明的方法將在下面更加詳細(xì)的加以描述。需用于本篩選方法的JARID1B多肽可為重組多肽，或者是來自自然界的蛋白質(zhì)， 或其部分肽。與測試藥劑或化合物接觸的多肽可以是，例如，純化的多肽、可溶蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形式、或者與其它多肽融合的融合蛋白。作為篩選蛋白質(zhì)，例如與JARID1B多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法。上述篩選可通過，例如，免疫沉淀方法，尤其是如下述的方式進(jìn)行。 通過將編碼JARID1B多肽的基因插入外源基因表達(dá)載體，例如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3. 1、 pCAGGS與ρ⑶8，在宿主(例如，動(dòng)物)細(xì)胞等中表達(dá)該基因。為此表達(dá)所用的啟動(dòng)子可為任何通?？墒褂玫膯?dòng)子，包括，例如，SV40早期啟動(dòng)子(Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. AcademicPress, London, 83-141 (1982))、EF-alpha啟動(dòng)子(Kim et al. ,Gene 91 :217-23 (1990))、CAG啟動(dòng)子(Niwa et al.，Gene 108 :193(1991)), RSV LTR 啟動(dòng)子(Cullen，Methods in Enzymology 152 684-704(1987))、SR alpha 啟動(dòng)子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8 :466 (1988))、CMV 立即早期啟動(dòng)子(Seed andAruffo,Proc Natl Acad Sci USA 84 :3365-9 (1987))、SV40 晚期啟動(dòng)子(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1 :385-94(1982))、腺病毒晚期啟動(dòng)子 (Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9 :946 (1989))、HSV TK 啟動(dòng)子等等。將所述導(dǎo)入宿主細(xì)胞以表達(dá)外源基因可根據(jù)任何方法實(shí)施，例如電穿孔方法 ((Chu et al.，Nucleic Acids Res 15 131H6 (1987))、磷酸鈣方法(Chenand Okayama, Mol Cell Biol 7 :2745-52 (1987) )、DEAE 葡聚糖方法(Lopata etal.，Nucleic Acids Res 12 :5707-17(1984) ；Sussman and MiIman，Mol Cell Biol4 1641-3 (1984))、Lipofectin Tj 法(Derijard B. , Cell 76 :1025-37(1994) ；Lamb etal., Nature Genetics 5 22-30(1993) =Rabindran et al.，Science 259 :230-4(1993))等等。對(duì)于由JARID1B基因編碼的多肽，可以把特異性已知的單克隆抗體的識(shí)別位點(diǎn) (表位)導(dǎo)入該多肽的N或C端，從而將該多肽表達(dá)為包含該表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位-抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 13 :85-90 (1995))。能夠利用其多克隆位點(diǎn)表達(dá)與例如半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和綠色熒光蛋白(GFP) 形成的融合蛋白的載體是可商購的。另外，還報(bào)道了如下的融合蛋白，其通過導(dǎo)入僅由數(shù)個(gè)到十二個(gè)(a dozen)氨基酸構(gòu)成的小型表位加以制備，使融合不會(huì)改變JARID1B多肽的性質(zhì)?？梢允褂美缍嘟M氨酸(His-標(biāo)簽)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(Τ7-標(biāo)簽)、人單純皰疹病毒糖蛋白(HSV-標(biāo)簽)、Ε_標(biāo)簽(單克隆噬菌體上的表位)等表位，和識(shí)別它們的單克隆抗體作為篩選與JARID1B多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的表位-抗體系統(tǒng)(ExperimentalMedicine 13:85-90(1995))
在免疫沉淀中，將這些抗體添加到用合適去垢劑制備的細(xì)胞裂解物中而形成免疫復(fù)合體。免疫復(fù)合體由JARID1B多肽、包含與該多肽結(jié)合的能力的多肽、和抗體組成。除了使用針對(duì)上述表位的抗體之外，還可以使用針對(duì)JARID1B多肽的抗體進(jìn)行免疫沉淀。免疫復(fù)合體可以被沉淀，例如當(dāng)抗體是小鼠IgG抗體時(shí)，可以通過蛋白A sepharose或蛋白G s印harose將其沉淀。如果將由JARID1B基因編碼的多肽制備成與表位(例如GST)的融合蛋白，則可以使用特異結(jié)合這些表位的物質(zhì)，例如谷胱甘肽-S印harose 4B，按照與使用針對(duì)JARID1B多肽的抗體的相同的方式來形成免疫復(fù)合體?？勺裱蚋鶕?jù)，例如，文獻(xiàn)中的方法來實(shí)施免疫沉淀(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))。普遍使用SDS-PAGE分析經(jīng)免疫沉淀的蛋白，使用合適濃度的凝膠，可以利用結(jié)合蛋白的分子量來分析該蛋白。由于與JARID1B多肽結(jié)合的蛋白難以通過考馬斯蘭染色或銀染色等普通染色方法檢測到，可以通過如下的方法提高蛋白的檢測靈敏度在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞中的蛋白，并檢測該蛋白。當(dāng)?shù)鞍椎姆肿恿恳阎獣r(shí)，可以直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠上純化出靶蛋白并測定其序列。作為利用JARID1B多肽來篩選結(jié)合該多肽的蛋白的方法，可以使用例如 West-Western 印跡分析法(Skolnik et al. ,Cell 65 :83-90 (1991))。具體地，與 JARID1B 多肽結(jié)合的蛋白可以通過如下方法獲得，從預(yù)期表達(dá)結(jié)合JARID1B多肽的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)細(xì)胞利用噬菌體載體(例如ZAP)制備cDNA文庫，在LB瓊脂糖上表達(dá)蛋白，將表達(dá)出的蛋白固定在濾膜上，使純化并且標(biāo)記的JARID1B多肽與上述濾膜反應(yīng)，并依照標(biāo)記物來檢測表達(dá)與JARID1B多肽結(jié)合的蛋白的噬菌斑。本發(fā)明的多肽可以利用生物素與抗生物素蛋白間的結(jié)合，或者利用特異結(jié)合JARID1B多肽的抗體或與JARID1B多肽融合的肽或多肽(例如 GST)，來進(jìn)行標(biāo)記。也可以使用利用放射性同位素或熒光等的方法?；蛘?，在本發(fā)明篩選方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用利用細(xì)胞的雙雜交系統(tǒng)(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybridsystem" (Clontech) ；"HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；參考文獻(xiàn)見“Dalton and Treisman，Cell 68:597-612(1992)”， "Fields andSternglanz, Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。在雙雜交系統(tǒng)中，使JARID1B多肽與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。從預(yù)期表達(dá)與JARID1B多肽結(jié)合的蛋白的細(xì)胞制備cDNA文庫，使該文庫在被表達(dá)時(shí)與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后，將cDNA文庫導(dǎo)入到上述酵母細(xì)胞中，并從檢測到的陽性克隆(當(dāng)酵母細(xì)胞中表達(dá)出與JARID1B多肽結(jié)合的蛋白時(shí)，兩者的結(jié)合激活報(bào)道基因，使陽性克隆可檢測)分離源自該文庫的cDNA。通過將上面分離的cDNA導(dǎo)入到大腸桿菌中并表達(dá)該蛋白，可制備由該cDNA編碼的蛋白。作為報(bào)道基因，除了 HIS3基因之外， 還可以使用例如Ade2基因、IacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。也可以用親和色譜來篩選與JARID1B基因編碼的多肽結(jié)合的藥劑或化合物。例如，可以把JARID1B多肽固定在親和柱的載體上，而將含有能夠結(jié)合JARID1B多肽的蛋白的測試藥劑或化合物施加到該柱上。這里的測試藥劑或化合物可以是例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞裂解物等。在加載測試藥劑之后，沖洗柱子，從而可以制備得到結(jié)合于JARID1B多肽的藥劑。當(dāng)測試藥劑或化合物是蛋白質(zhì)時(shí)，對(duì)所得蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行分析，根據(jù)該序列合成寡DNA，并用該寡DNA作為探針篩選cDNA文庫，從而獲得編碼該蛋白的DNA。利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可以在本發(fā)明中用作檢測或定量結(jié)合藥劑的裝置。當(dāng)使用這種生物傳感器時(shí)，可以僅使用微量并且沒有標(biāo)記的多肽(例如 BIAcore, Pharmacia)，以表面等離子體共振信號(hào)的形式對(duì)JARID1B多肽與測試藥劑間的相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)的觀察。因此，使用生物傳感器，例如BIAcore，人們就有可能對(duì)JARID1B多肽與測試藥劑或化合物間的結(jié)合進(jìn)行評(píng)估。用于篩選當(dāng)固定的JARID1B多肽暴露于合成化合物或天然物質(zhì)庫或隨機(jī)噬菌體肽展示文庫時(shí)發(fā)生結(jié)合的分子的方法，以及使用基于組合化學(xué)技術(shù)的高通量篩選方法(ffrighton et al.，Science 273:458-64(1996) ；Verdine, Nature384 :11-13(1996)； Hogan, Nature 384 17_9 (1996))，以不僅分離與JARID1B蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)，而且分離與 JARID1B蛋白結(jié)合的化合物(包括激動(dòng)劑和拮抗劑)的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在本發(fā)明中，揭示了抑制JARID1B表達(dá)則降低細(xì)胞生長。因此，通過篩選結(jié)合 JARID1B多肽的候選化合物，可鑒定出有潛力治療或預(yù)防癌癥的候選化合物。這些候選化合物治療或預(yù)防癌癥的潛力可通過二次和/或進(jìn)一步篩選來評(píng)估，以鑒定用于癌癥的治療性藥劑或化合物。抑制TARID1B牛物學(xué)活件的藥劑或化合物的篩詵JARIDIB 蛋白具有組蛋白 H3 脫甲基化活性(Yamane K. et al. Mol Cel 12007 ；25 801-12)，而且依照本發(fā)明，該蛋白具有促進(jìn)E2F1基因和E2F2基因表達(dá)的活性(圖9)、促進(jìn)細(xì)胞增殖活性(圖7C)或抗凋亡活性(圖7E)。利用這些生物學(xué)活性，本發(fā)明提供了篩選可抑制涉及JARID1B基因過表達(dá)的癌細(xì)胞增殖的藥劑或化合物的方法，以及篩選用于治療或預(yù)防此類癌癥的候選藥劑或化合物的方法。因此，本發(fā)明提供了一種方法，其包括下列步驟(a)將測試藥劑或化合物與自JARID1B基因衍生的多肽接觸；(b)檢測步驟(a)所述多肽的生物學(xué)活性；(c)選擇較之測試藥劑或化合物不存在時(shí)的生物學(xué)活性，抑制該生物學(xué)活性的測試藥劑或化合物，作為候選藥劑或化合物。依照本發(fā)明，可評(píng)估測試藥劑或化合物抑制細(xì)胞生長或者候選藥劑或化合物治療或預(yù)防JARID1B相關(guān)癌癥的治療效果。因此，本發(fā)明亦提供了使用JARID1B多肽或其片段篩選用于抑制細(xì)胞生長的候選藥劑或化合物或者用于治療或預(yù)防JARID1B相關(guān)癌癥的候選藥劑或化合物的方法，其包括以下步驟a)將測試藥劑或化合物與JARID1B多肽或其功能性片段接觸；并b)檢測步驟a)的所述多肽或片段的生物學(xué)活性；并c)將b)的生物學(xué)活性與所述測試藥劑或化合物的治療效果關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明中，治療效果可以與JARID1B多肽或其功能性片段的生物學(xué)活性關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)與某種測試藥劑或化合物不存在下檢測到的水平相比該測試藥劑或化合物抑制或抑制JARID1B多肽或其功能性片段的生物學(xué)活性時(shí)，可將所述測試藥劑或化合物鑒定或選擇為具有治療效果的候選藥劑或化合物?；蛘撸?dāng)與某種測試藥劑或化合物不存在下檢測到的水平相比該測試藥劑或化合物不抑制或抑制JARID1B多肽或其功能性片段的生物學(xué)活性時(shí)，可將所述測試藥劑或化合物鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。本發(fā)明所述方法將在下面更加詳細(xì)的加以描述。任何多肽均可用于篩選，只要它們包含JARID1B蛋白的生物學(xué)活性即可。這樣的生物學(xué)活性包括組蛋白H3脫甲基化活性、促進(jìn)E2F1和E2F2基因表達(dá)的活性、細(xì)胞增殖活性和抗凋亡活性。舉例而言，可使用JARID1B蛋白，亦可使用與這些蛋白功能上等價(jià)的多肽。上述多肽可由細(xì)胞內(nèi)源或外源地表達(dá)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種篩選方法，其遵循“JARID1B結(jié)合藥劑或化合物的篩選”中描述的方法，包括下述步驟a)使測試藥劑或化合物與自JARID1B基因衍生的JARID1B多肽接觸；b)檢測所述多肽與所述測試藥劑或化合物之間的結(jié)合；c)選擇結(jié)合所述多肽的測試藥劑或化合物；d)使步驟c)中選出的測試藥劑或化合物與JARID1B多肽接觸；e)將所述多肽的生物學(xué)活性與在所述測試藥劑或化合物不存在下檢出的生物學(xué)活性比較；并f)選擇抑制所述多肽的生物學(xué)活性的測試藥劑或化合物作為用于治療或預(yù)防癌癥的候選藥劑或化合物。通過本篩選分離的藥劑或化合物是JARID1B基因編碼的多肽的拮抗劑的候選者。 術(shù)語“拮抗劑”是指通過結(jié)合多肽而抑制多肽功能的分子。所述術(shù)語還指可降低或抑制 JARID1B基因的表達(dá)的分子。而且，通過本篩選分離的藥劑或化合物是如下藥劑或化合物的候選物，所述藥劑或化合物抑制JARID1B多肽與分子(包括DNA和蛋白)的體內(nèi)相互作用。當(dāng)本方法中要檢測的生物學(xué)活性是細(xì)胞增殖時(shí)，可以通過例如如下方法進(jìn)行檢測制備表達(dá)JARID1B多肽的細(xì)胞，在測試化合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，確定細(xì)胞增殖速度， 測量細(xì)胞周期等，以及通過測量存活細(xì)胞或集落形成能力。選擇降低表達(dá)JARID1B的細(xì)胞的增殖速度的化合物作為治療或預(yù)防癌癥的候選化合物。更具體而言，該方法包括以下步驟(a)使測試化合物與過表達(dá)JARID1B的細(xì)胞接觸；(b)測量細(xì)胞增殖活性；并(c)選擇與測試化合物不存在下的細(xì)胞增殖活性相比降低細(xì)胞增殖活性的測試化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括下述步驟(d)選擇對(duì)不表達(dá)或幾乎不表達(dá)JARID1B的細(xì)胞沒有影響的測試化合物。當(dāng)本方法中要檢測的生物學(xué)活性是抗凋亡時(shí)，它可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施的常規(guī)方法來測定，諸如測量sub-Gl細(xì)胞的數(shù)目、TUNEL方法或LM-PCR方法，使用各種商品化試劑盒來進(jìn)行。例如，sub-Gl細(xì)胞的數(shù)目可使用FACS來測定。凋亡也可通過使用Apotag Direct (oncor)的TUNEL方法或使用ApoAlert LM-PCR梯形物測定試劑盒(Clontech)的 LM-PCR方法依照所附手冊(cè)來檢查。當(dāng)本方法中要檢測的生物學(xué)活性是脫甲基化活性時(shí)，它可通過在適合于底物脫甲基化的條件下使JARID1B多肽與底物(例如包含三或二甲基化賴氨酸4的組蛋白Η； )接觸并檢測底物的脫甲基化水平來測定。更具體地，所述方法包括下列步驟(a)在能夠進(jìn)行底物脫甲基化的條件下在測試藥劑或化合物存在下使JARID1B多肽與要脫甲基化的底物接觸；(b)檢測底物的甲基化水平；并(c)選擇與在測試藥劑不存在下檢出的甲基化水平相比提高底物甲基化水平的測試藥劑或化合物作為候選藥劑。優(yōu)選地，JARID1B多肽要脫甲基化的底物是包含三或二甲基化組蛋白H3賴氨酸4 的組蛋白H3或其片段在本發(fā)明中，JARID1B多肽的脫甲基化活性可通過本領(lǐng)域已知方法來測定。例如， 可在適合于脫甲基化的條件下將JARID1B多肽與具有經(jīng)標(biāo)記的甲基化位點(diǎn)的底物一起溫育。例如，在第4個(gè)氨基酸殘基處具有三或二 -[甲基-14C]-賴氨酸或三或二 -[甲基-3H]-賴氨酸的組蛋白H3肽可優(yōu)選用作脫甲基化的底物。脫甲基化活性可基于溫育后底物中的放射性來測定(即底物中的放射性越高指示JARID1B多肽的脫甲基化活性越低)。底物中的放射性可例如通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影來檢測?；蛘?，在溫育后，可通過常規(guī)方法諸如凝膠過濾和免疫沉淀將底物與JARID1B分開，并通過本領(lǐng)域公知的方法來測量底物中的放射性。其它可連接于底物中的甲基的合適標(biāo)記物，諸如生色和熒光標(biāo)記物， 及檢測這些標(biāo)記物的方法是本領(lǐng)域已知的?；蛘撸琂ARID1B多肽的脫甲基化活性可使用質(zhì)譜術(shù)或選擇性識(shí)別甲基化底物的試劑來測定。例如，針對(duì)甲基化底物的抗體可優(yōu)選用作此類試劑。任何使用此類抗體的免疫學(xué)技術(shù)可用于檢測底物的甲基化水平。例如，當(dāng)?shù)孜锸羌谆M蛋白時(shí)，可優(yōu)選使用針對(duì)甲基化組蛋白(例如包含三或二甲基化賴氨酸4的組蛋白冊(cè))的抗體。此類抗體是商品化的 (例如Abeam Ltd.)。例如，使用識(shí)別甲基化底物的抗體進(jìn)行的ELISA或免疫印跡可用于本發(fā)明。另外，檢測脫甲基化活性的本方法可通過制備表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞，在測試化合物存在下培養(yǎng)細(xì)胞，并測定細(xì)胞中組蛋白的甲基化水平(例如通過使用特異性結(jié)合組蛋白甲基化區(qū)的抗體)來實(shí)施。更具體地，所述方法包括下列步驟(a)使測試藥劑或化合物與表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞接觸；(b)檢測組蛋白H3賴氨酸4的甲基化水平；并(c)選擇與在測試藥劑或化合物不存在下檢出的甲基化水平相比提高甲基化水平的測試藥劑或化合物作為候選藥劑或化合物。或者，當(dāng)要檢測的生物學(xué)活性是促進(jìn)E2F1或E2F2基因表達(dá)的活性時(shí)，它可例如通過實(shí)施例1所示的E2F報(bào)道物測定法來檢測。對(duì)于此方法，使測試化合物與表達(dá)JARID1B 基因的細(xì)胞，諸如癌細(xì)胞接觸。更具體地，所述方法包括下列步驟(a)使測試藥劑或化合物與表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞接觸；(b)測量E2F1基因或E2F2基因的表達(dá)水平；并(c)選擇與在測試藥劑或化合物不存在下的表達(dá)水平相比降低E2F1基因或E2F2基因表達(dá)水平的測試藥劑或化合物作為候選藥劑或化合物。E2F1基因的例示性核酸和多肽序列分別顯示于SEQ ID NO :35和36，但不限于此。 另外，序列數(shù)據(jù)亦可分別以登錄號(hào)NM_005225. 2和NP_005216. 1獲得。E2F2基因的例示性核酸和多肽序列分別顯示于SEQ ID NO :37和38，但不限于此。 另外，序列數(shù)據(jù)亦可分別以登錄號(hào)NM_004091. 2和NP_004082. 1獲得。表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞包括例如自癌癥建立的細(xì)胞系(例如膀胱癌的5637、 253J、253J-BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER 和 UMUC3 ；肺癌的 SBC5 或 H2170 和 LC319)及自臨床癌組織純化的細(xì)胞，此類細(xì)胞可用于本篩選方法。E2F1基因或E2F2基因的表達(dá)水平的測量可通過在細(xì)胞與測試藥劑或化合物接觸之前或之后將包含E2F1基因或E2F2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)及在該調(diào)節(jié)區(qū)控制下的報(bào)道基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞中，然后檢測報(bào)道基因的表達(dá)水平來進(jìn)行。E2F1基因和E2F2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是本領(lǐng)域公知的(例如Araki etal. Oncogene 2003,22 :7632-41, Pilon et al. Mol Cell Biol 2008，28 :7394-401)。報(bào)道基因可以是例如螢光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosomasp.)紅色熒光蛋白 (DsRed)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、IacZ和β -葡糖醛酸糖苷酶(⑶幻等等。另外，有一些商業(yè)產(chǎn)品可用，諸如用于E2F報(bào)道物測定法的Cignal E2F受體測定試劑盒(SuperArray Bioscience Corporation)。或者，E2F1基因和E2F2基因的表達(dá)水平可通過使用本領(lǐng)域公知技術(shù)檢測這些基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物來測定，諸如RT-PCR、Northern印跡測定法、 Western印跡測定法、免疫染色、ELISA測定法和流式細(xì)胞術(shù)分析。在本發(fā)明中，用于制備與給定蛋白功能等同的多肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，而且包括將突變引入蛋白中的已知方法。一般地說，已知蛋白中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白的功能(Mark DF et al.，Proc NatlAcad Sci USA 1984,81 :5662-6; Zoller MJ & Smith Μ, Nucleic Acids Res 1982,10 :6487-500 ；Wang A et al. ， Science 1984,224 :1431-3 ；Dalbadie-McFarland Get al. , Proc Natl Acad Sci USA 1982,79 6409-13)。事實(shí)上，已知突變的或經(jīng)過修飾的蛋白(即具有通過在某氨基酸序列中替代、 刪除、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而經(jīng)過修飾的氨基酸序列的蛋白)保留原始的生物學(xué)活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6(1984) ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10 :6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland et al. ， Proc NatlAcad Sci USA 79 :6409-13 (198 )。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)氨基酸序列進(jìn)行改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸的個(gè)別添加、刪除、插入、或替代，或者被認(rèn)為是“保守修飾”的那些修飾，其中蛋白的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白，這些都是本發(fā)明的語境中考慮到的?！耙种粕飳W(xué)活性”在此定義為較之不存在所述藥劑或化合物時(shí)，對(duì)JARID1B生物學(xué)活性的優(yōu)選至少10%的抑制，更優(yōu)選至少25%、50%或75%的抑制，且最優(yōu)選至少90% 的抑制。在本發(fā)明中，揭示了抑制JARID1B表達(dá)則降低細(xì)胞生長。因此，通過篩選抑制 JARID1B多肽的生物學(xué)活性的候選化合物，可鑒定出有潛力治療或預(yù)防癌癥的候選化合物。 這些候選化合物治療或預(yù)防癌癥的潛力可通過二次和/或進(jìn)一步篩選來評(píng)估，以鑒定用于癌癥的治療性藥劑或化合物。例如，當(dāng)結(jié)合JARID1B蛋白的化合物抑制癌癥的上文所述活性時(shí)，可得出結(jié)論，此類化合物具有JARID1B特異性治療效果。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用不表達(dá)JARID1B多肽的對(duì)照細(xì)胞。因而，本發(fā)明還提供了使用JARID1B多肽或其片段來篩選用于抑制細(xì)胞生長的候選物質(zhì)或用于治療或預(yù)防 JARID1B相關(guān)癌癥的候選物質(zhì)的方法，包括下列步驟a)在測試物質(zhì)存在下培養(yǎng)表達(dá)JARID1B多肽或其功能性片段的細(xì)胞和不表達(dá) JARID1B多肽或其功能性片段的對(duì)照細(xì)胞；b)檢測表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的生物學(xué)活性；并c)選擇與對(duì)照細(xì)胞中及所述測試物質(zhì)不存在下檢出的增殖相比抑制表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞中的生物學(xué)活性的測試化合物。改變TARID1B表汰的藥劑或化合物的篩詵在本發(fā)明中，通過SiRNA減少JARID1B基因表達(dá)可引起抑制癌細(xì)胞增殖(圖7)。 因此，本發(fā)明提供了篩選抑制JARID1B基因表達(dá)的藥劑或化合物的方法。抑制JARID1B基因表達(dá)的藥劑或化合物可望能夠抑制癌細(xì)胞增殖，并因此對(duì)治療或預(yù)防癌癥有用。因此，本發(fā)明亦提供了篩選抑制癌細(xì)胞增殖的藥劑或化合物的方法，以及篩選治療或預(yù)防癌癥的藥劑或化合物的方法。依照本發(fā)明，確認(rèn)了 JARID1B基因的表達(dá)在急性髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、宮頸癌、肺癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌中升高。因此，通過本方法篩選獲得的藥劑或化合物可適合于治療這些癌癥。更具體地，膀胱癌和肺癌是通過本方法篩選獲得的藥劑或化合物的合適靶標(biāo)，因?yàn)榇_認(rèn)了抑制JARID1B基因表達(dá)的化合物抑制那些癌癥中的細(xì)胞增殖(圖7)。在本發(fā)明的語境中，此類篩選可包括例如以下步驟a)使測試藥劑或化合物與表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞接觸；b)檢測JARID1B基因表達(dá)水平；并c)選擇與在測試藥劑或化合物不存在下的表達(dá)水平相比降低JARID1B基因表達(dá)水平的測試藥劑或化合物作為候選藥劑或化合物。依照本發(fā)明，可評(píng)估測試藥劑或化合物抑制細(xì)胞生長或者候選藥劑或化合物治療或預(yù)防JARID1B相關(guān)癌癥的治療效果。因此，本發(fā)明亦提供了篩選用于抑制癌細(xì)胞增殖的候選藥劑或化合物的方法和篩選用于治療或預(yù)防JARID1B相關(guān)癌癥的候選藥劑或化合物的方法。在本發(fā)明的語境中，此類篩選可包括例如以下步驟a)使測試藥劑或化合物與表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞接觸；b)檢測JARID1B基因表達(dá)水平；并c)將b)的表達(dá)水平與所述測試藥劑或化合物的治療效果關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明中，治療效果可以與JARID1B基因表達(dá)水平關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)與某種測試藥劑或化合物不存在下檢測到的水平相比該測試藥劑或化合物降低JARID1B基因的表達(dá)水平時(shí)，可將所述測試藥劑或化合物鑒定或選擇為具有治療效果的候選藥劑或化合物。 或者，當(dāng)與某種測試藥劑或化合物不存在下檢測到的水平相比該測試藥劑或化合物不降低 JARID1B基因表達(dá)水平時(shí)，可將所述測試藥劑或化合物鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。下面將更加詳細(xì)地描述本發(fā)明的方法。
表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞包括，例如，自癌癥建立的細(xì)胞系(例如膀胱癌的5637、 253J、253J-BV、HT1197、HT1376、J82、SCaBER 和 UMUC3 ；SBC5 或 H2170 和 LC319，肺癌)和自臨床癌組織純化的細(xì)胞，此類細(xì)胞可用于上述本發(fā)明的篩選?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，例如，RT-PCR, Northern印跡分析、Western印跡分析、免疫染色或流式細(xì)胞術(shù)分析來估計(jì)表達(dá)水平。在此定義的“降低表達(dá)水平”優(yōu)選為較之在所述藥劑或化合物不存在時(shí)的表達(dá)水平，使JARID1B基因表達(dá)水平降低至少10 %，更優(yōu)選降低至少25 %、50 %或75 %， 最優(yōu)選降低至少95%的水平。本文中的藥劑或化合物包括化學(xué)化合物、雙鏈分子等等。在前面描述了雙鏈分子的制備。在篩選方法中，降低JARID1B基因表達(dá)水平的測試藥劑或化合物可選擇用作抑制癌細(xì)胞增殖的藥劑或化合物，及因此預(yù)期是治療或預(yù)防癌癥的候選藥劑或化合物。在本發(fā)明中，揭示了抑制JARID1B表達(dá)降低細(xì)胞生長。因此，通過篩選抑制 JARID1B多肽的生物學(xué)活性的候選化合物，可鑒定出有潛力治療或預(yù)防癌癥的候選化合物。 這些候選化合物治療或預(yù)防癌癥的潛力可通過二次和/或更進(jìn)一步篩選來評(píng)估以鑒定用于癌癥的治療性藥劑或化合物。另外，JARID1B基因的表達(dá)水平可作為E2F1基因或E2F2基因的表達(dá)水平來檢測， 因?yàn)樵诒景l(fā)明中確認(rèn)了這些基因的表達(dá)通過抑制JARID1B基因表達(dá)而受到抑制。E2F1基因和E2F2基因表達(dá)水平的測量可通過上述E2F報(bào)道物測定法或檢測E2F1基因或E2F2基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物來測定。具體地，本篩選方法可包括下列步驟(a)使測試藥劑或化合物與表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞接觸；(b)測量E2F1或E2F2基因的表達(dá)水平；并(c)選擇與在測試藥劑或化合物不存在下的表達(dá)水平相比降低E2F1基因或E2F2 基因的表達(dá)水平的測試藥劑或化合物作為候選藥劑或化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可包括下列步驟(d)選擇對(duì)幾乎不表達(dá)JARID1B的對(duì)照細(xì)胞沒有影響的測試藥劑或化合物。依照本發(fā)明，揭示了抑制JARID1B表達(dá)降低細(xì)胞生長。另外，揭示了 E2F1基因和 E2F2基因的表達(dá)通過抑制JARID1B基因表達(dá)而受到抑制。因此，本發(fā)明亦提供了篩選用于抑制癌細(xì)胞增殖的候選藥劑或化合物的方法和篩選用于治療或預(yù)防JARID1B相關(guān)癌癥的候選藥劑或化合物的方法。在本發(fā)明的語境中，此類篩選可包括例如以下步驟a)使測試藥劑或化合物與表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞接觸；b)檢測E2F1或E2F2基因的表達(dá)水平；并c)將b)的表達(dá)水平與所述測試藥劑或化合物的治療效果關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明中，治療效果可以與E2F1或E2F2基因的表達(dá)水平關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)與某種測試藥劑或化合物不存在下檢測到的水平相比該測試藥劑或化合物降低E2F1或E2F2 基因的表達(dá)水平時(shí)，可將所述測試藥劑或化合物鑒定或選擇為具有治療效果的候選藥劑或化合物?；蛘撸?dāng)與某種測試藥劑或化合物不存在下檢測到的水平相比該測試藥劑或化合物不降低E2F1或E2F2基因的表達(dá)水平時(shí)，可將所述測試藥劑或化合物鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。
上述步驟與“抑制JARID1B生物學(xué)活性的藥劑或化合物的篩選”中描述的使用促進(jìn)E2F1基因和E2F2基因表達(dá)的活性作為JARID1B多肽的生物學(xué)活性的方法相同。然而， 在本方法中，聚焦于JARID1B基因的表達(dá)水平。當(dāng)使用E2F報(bào)道物測定法來檢測JARID1B 基因的表達(dá)水平時(shí)，可在與測試藥劑或化合物接觸之前或之后將E2F報(bào)道物載體導(dǎo)入細(xì)胞中。在本發(fā)明中，揭示了抑制JARID1B表達(dá)降低細(xì)胞生長。另外，揭示了 E2F1基因和 E2F2基因的表達(dá)通過抑制JARID1B基因表達(dá)而受到抑制。如此，通過篩選抑制E2F1或E2F2 基因表達(dá)水平的候選化合物，可鑒定出有潛力治療或預(yù)防癌癥的候選化合物。這些候選化合物治療或預(yù)防癌癥的潛力可通過二次和/或更進(jìn)一步篩選來評(píng)估以鑒定用于癌癥的治療性藥劑或化合物。或者，本發(fā)明的所述篩選方法可包括下列步驟(a)將測試藥劑或化合物與導(dǎo)入了包含JARID1B轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域與在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域控制下表達(dá)的報(bào)道基因的載體的細(xì)胞接觸；(b)測量所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性；并(c)選擇與在測試藥劑或化合物不存在下的表達(dá)或活性水平相比降低所述報(bào)道基因表達(dá)或活性的測試化合物作為候選藥劑或化合物。依照本發(fā)明，可評(píng)估測試藥劑或化合物抑制細(xì)胞生長或者候選藥劑或化合物治療或預(yù)防JARID1B相關(guān)癌癥的治療效果。因此，本發(fā)明亦提供了篩選用于抑制癌細(xì)胞增殖的候選藥劑或化合物的方法和篩選用于治療或預(yù)防JARID1B相關(guān)癌癥的候選藥劑或化合物的方法。依照另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括以下步驟a)使測試藥劑或化合物與其中導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，該載體包含JARID1B基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報(bào)道基因；b)檢測所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性；并c)將b)的表達(dá)水平與所述測試藥劑或化合物的治療效果關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明中，治療效果可以與所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)與某種測試藥劑或化合物不存在下檢測到的水平相比該測試藥劑或化合物降低所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性時(shí)，可將所述測試藥劑或化合物鑒定或選擇為具有治療效果的候選藥劑或化合物?；蛘?，當(dāng)與某種測試藥劑或化合物不存在下檢測到的水平相比該測試藥劑或化合物不降低所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性時(shí)，可將所述測試藥劑或化合物鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。合適的報(bào)道基因和宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域是眾所周知的。舉例而言，報(bào)道基因?yàn)槲灩馑孛浮⒕G色熒光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)紅色熒光蛋白(DsRed)、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)、Laz與beta-葡萄糖醛酸糖苷酶(⑶幻，而宿主細(xì)胞為C0S7、HEK293、HeLa 等。所述篩選所需的報(bào)道構(gòu)建體可通過將報(bào)道基因序列與JARID1B基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域連接來制備。本文所述的JARID1B基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域是從起始密碼子開始至少500bp上游，優(yōu)選lOOObp，更優(yōu)選5000或IOOOObp上游的區(qū)域。含有所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的核苷酸片段可從基因組文庫中分離出來，或可通過PCR擴(kuò)增。所述篩選所需的報(bào)道構(gòu)建體可通過將報(bào)道基因序列與這些基因中任一的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域連接來制備。鑒別轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的方法，以及其測定法規(guī)程都是眾所周知的(Molecular Cloning，第三版，第17章，2001，Cold Springs Harbor LaboratoryPress) 例如，JARID1B 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)報(bào)告于 Catteau et al. Int J Oncol. 2004,25:5_16。用含有所述報(bào)道構(gòu)建體的載體感染宿主細(xì)胞，且用本領(lǐng)域眾所周知的方法檢測報(bào)道基因的表達(dá)或活性(例如，使用照度計(jì)(luminometer)、吸收光譜儀、流式細(xì)胞儀等等)。 在此定義的“降低表達(dá)或活性”優(yōu)選較之在所述化合物不存在時(shí)，報(bào)道基因的表達(dá)或活性優(yōu)選地被降低至少10 %，更優(yōu)選地，至少降低25 %、50 %或75 %，最優(yōu)選地，降低95 %。在本發(fā)明中，揭示了抑制JARID1B表達(dá)降低細(xì)胞生長。因此，通過篩選抑制所述報(bào)道基因表達(dá)或活性的候選化合物，可鑒定出有潛力治療或預(yù)防癌癥的候選化合物。這些候選化合物治療或預(yù)防癌癥的潛力可通過二次和/或更進(jìn)一步篩選來評(píng)估以鑒定用于癌癥的治療性藥劑或化合物。用于改變E2F1和E2F2表汰的方法依照本發(fā)明，E2F1基因和E2F2基因的表達(dá)通過抑制JARID1B基因表達(dá)而受到抑制(圖9)。它指示E2F1基因和E2F2基因是受JARID1B蛋白影響的候選下游基因。E2F轉(zhuǎn)錄因子是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)蛋白途徑的下游效應(yīng)器且涉及基礎(chǔ)細(xì)胞周期控制的多個(gè)方面(Botz J.et al.Mol Cell Biol 1996 ； 16 :3401-9, DeGregori J. et al.Genes Dev 1995；9 :2873-87, Johnson DG et al.Naturel993 ；365 :349-52, Muller H. et al. Biochim Biophys Acta 2000 ; 1470 :M1_12)。已在多種控制細(xì)胞周期和 DNA 合成的基因中鑒定出E2F因子的結(jié)合位點(diǎn)，包括cdk2和4、細(xì)胞周期蛋白A、D和E、DNA聚合酶、核糖核苷酸還原酶和 PCNA(Yamasaki L. Results Probl Cell Differ 1998 ；22 199-227)。重要的是，在廣泛的多種腫瘤實(shí)體中發(fā)現(xiàn)了 RB-E2F級(jí)聯(lián)中的突變(Dimova DK et al. 0ncogene2005 ；24 :2810-26, Nevins JR. Hum Mol Genet 2001 ；10 :699-703)。雖然這些改變大多影響RB或E2F轉(zhuǎn)錄因子的上游調(diào)節(jié)物，但是越來越多的證據(jù)表明E2F家族自身的失調(diào)在致癌作用中扮演關(guān)鍵性的角色。事實(shí)上，在卵巢癌中，促進(jìn)增殖的E2F1和尤其是 E2F2轉(zhuǎn)錄因子與健康對(duì)照組織相比過表達(dá)(Reimer D. et al. Clin Cancer Res 2007 ； 13 144-51)。另外，這些促進(jìn)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)錄因子的失調(diào)已被描述為多種腫瘤中的預(yù)后指標(biāo) (Ebihara Y. et al. Dis Esophagus2004 ； 17 :150-4, Foster CS et al.Oncogene 2004 ；23 5871-9,Gorgoulis VG et al. J Pathol 2002；198 142-56，Mega S. et al. Dis Esophagus 2005 ；18 :109-13,Oeggerli M. et al. Oncogene 2004 ；23 :5616-23)。因此，促進(jìn)增殖的E2F 轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)可能會(huì)有助于顯著的腫瘤生長優(yōu)勢(shì)，從而促成較差的存活。在本發(fā)明中， 膀胱腫瘤組織中E2F1和E2F2基因二者的表達(dá)水平也比非瘤組織中的表達(dá)水平顯著更高。 E2F/RB途徑的失調(diào)與人類多種組織中的致癌作用有密切聯(lián)系，而且JARID1B可通過解除對(duì)此途徑的管制來促進(jìn)惡性改變。因此，本發(fā)明還提供了通過調(diào)節(jié)JARID1B基因表達(dá)或JARID1B蛋白活性來改變 E2F1基因和E2F2基因的表達(dá)水平的方法。本方法可促進(jìn)新的癌癥療法的開發(fā)，因?yàn)镋2F1 和E2F2失調(diào)涉及致癌作用。在本發(fā)明的語境中，用于改變E2F1基因和E2F2基因的表達(dá)水平的方法包括改變細(xì)胞中JARID1B基因的表達(dá)水平或JARID1B蛋白的活性的步驟。此類步驟通過對(duì)細(xì)胞施用調(diào)控JARID1B基因表達(dá)或JARID1B蛋白活性的化合物來實(shí)施。此類化合物可以是針對(duì)JARID1B基因表達(dá)或JARID1B蛋白的抑制劑或活化劑，優(yōu)選的是通過上述篩選方法篩選獲得的抑制劑。例如，靶向JARID1B基因的反義RNA或雙鏈分子或針對(duì)JARID1B蛋白的抗體可用于本方法。當(dāng)將雙鏈分子用于本方法時(shí)，本發(fā)明的雙鏈分子是可用的。優(yōu)選地，此類雙鏈分子包含與SEQ ID NO 21或30對(duì)應(yīng)的靶序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于改變E2F1基因或E2F2基因表達(dá)的組合物，其包含調(diào)控JARID1B基因表達(dá)或JARID1B蛋白活性的化合物。此類組合物包含至少一種抑制或促進(jìn)JARID1B基因表達(dá)或JARID1B蛋白活性的化合物。優(yōu)選地，所述組合物包含抑制JARID1B基因表達(dá)的本發(fā)明的雙鏈分子或編碼它的載體，更優(yōu)選地，所述雙鏈分子包含與SEQ ID NO 21或30對(duì)應(yīng)的靶序列。在本發(fā)明中，揭示了抑制JARID1B表達(dá)則降低細(xì)胞生長。另外，揭示了 E2F1基因和E2F2基因的表達(dá)通過抑制JARID1B基因表達(dá)而受到抑制。如此，通過篩選改變E2F1或 E2F2基因表達(dá)水平的候選化合物，可鑒定出有潛力治療或預(yù)防癌癥的候選化合物。這些化合物治療或預(yù)防癌癥的潛力可通過第二和/或進(jìn)一步的篩選來評(píng)估以鑒定用于癌癥的治療性藥劑或化合物。本發(fā)明的各方面在下述實(shí)施例中加以描述，它們并無意對(duì)權(quán)利要求中描述的本發(fā)明范圍進(jìn)行限定。除非另行定義，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常理解的意義相同。下面描述了合適的方法和材料，雖然與在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于實(shí)踐或測試本發(fā)明。本發(fā)明將于下列實(shí)施例中進(jìn)一步加以描述，其并不對(duì)權(quán)利要求中描述的本發(fā)明范圍進(jìn)行限定。
實(shí)施例本發(fā)明會(huì)在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步描述，它們不限制權(quán)利要求中描述的發(fā)明范圍。實(shí)施例1通用方法組織樣品和RNA制備收集了 123份原發(fā)性泌尿上皮癌手術(shù)標(biāo)本(在膀胱切除術(shù)時(shí)或是在經(jīng)尿道切除膀胱腫瘤(TUR-Bt)時(shí)收集)，并在液氮中快速冷凍。從沒有惡性證據(jù)的患者中肉眼檢查正常的膀胱泌尿上皮的區(qū)域收集了 23份正常膀胱泌尿上皮組織標(biāo)本。使用組織進(jìn)行此項(xiàng)研究得到了劍橋郡地方科研倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。將總共30張30微米切片勻漿以提取RNA，并切出2張與用于提取RNA的組織相鄰的7微米“三明治”切片，染色并由獨(dú)立的顧問泌尿組織病理學(xué)家評(píng)估細(xì)胞結(jié)構(gòu)和腫瘤階段。另外，依照炎性細(xì)胞浸潤的程度將切片分期(低、 中和顯著)。排除顯示顯著炎性細(xì)胞浸潤的樣品(ffallard MJ et al. Britishjournal of cancer 2006 ；94 :569-77)。使用TRI試劑 (Sigma，Dorset，UK)遵循制造商的方案來提取總RNA。使用RNeasy 迷你試劑盒T、QIAGEN，Crawley, UK)(包括DNA酶步驟)來優(yōu)化RNA純度。實(shí)施Agilent 2100 總RNA生物分析。將來自每份樣品的Iul重懸的RNA施加于RNA 6000 Nano LabChip 并依照制造商的指令處理。所有芯片和試劑來自Agilent Technologies (ffest Lothian, UK)。逆轉(zhuǎn)錄使用NanoDrop ND1000 分光光度計(jì)(Nyxor Biotech, Paris, France)來測定總RNA濃度。依照制造商的指令在20ul反應(yīng)體系中用2ug隨機(jī)六聚物(Amersham)和 Superscript III 逆轉(zhuǎn)錄酶 Qnvitrogen, Paisley, UK)逆轉(zhuǎn)錄 lug 總 RNA。然后用 PCR 級(jí)水將cDNA 1 100稀釋并保存于-20°C。激光捕捉顯微解剖預(yù)期性地(prospectively)遵循上文所述規(guī)程收集用于激光捕捉顯微解剖的組織。自每個(gè)組織切出5個(gè)順序的7um厚的切片并使用Histogene 染色溶液(Arcturus， California，USA)遵循制造商的方案染色。然后立即將載玻片轉(zhuǎn)移用PixCell II激光捕捉顯微鏡 “!·^!!!·^^々，^々)進(jìn)行顯微解剖。此技術(shù)采用低功率紅外激光將熱塑性膜融化在感興趣細(xì)胞上方，使細(xì)胞附著于該膜。自每個(gè)組織中的基質(zhì)和上皮/腫瘤隔室顯微解剖大約10000個(gè)細(xì)胞。使用RNeasy Micro試劑盒OlIAGEN，Crawley, UK)提取RNA。對(duì)于癌或含有腫瘤顯著炎性區(qū)域的基質(zhì)或含有顯著炎性細(xì)胞浸潤的基質(zhì)的區(qū)域，避免以防止污染。如上所述逆轉(zhuǎn)錄總RNA并實(shí)施qRT-PCR。鑒于從這樣的小樣品獲得的RNA產(chǎn)量低， 未實(shí)施NanoDrop 定量，而是使用內(nèi)源18S CT值修正作為完整起始RNA量的精確度量。對(duì) JARIDIB基因?qū)嵤┺D(zhuǎn)錄物分析。為了驗(yàn)證顯微解剖的精確性，依照制造商的指令(Assays on demand, Applied Biosystems, Warrington, UK)使用波形蛋白和tooplakin的引物和探針實(shí)施qRT-PCT。波形蛋白主要在間充質(zhì)組織中表達(dá)，并被用作基質(zhì)標(biāo)志。tooplakin是泌尿上皮分化的標(biāo)志， 且多達(dá)90%的上皮衍生腫瘤中得到保留(Olsburgh J.et al. The Journal of pathology 2003；199 :41-9)。細(xì)胞培養(yǎng)所有細(xì)胞系在適宜培養(yǎng)基中以單層培養(yǎng)=Eagle氏最低限度必需培養(yǎng)基(EMEM) 用于 253J，253J-BV，HT1197，HT1376，J82，SCaBER, UMUC3 膀胱癌細(xì)胞和 SBC5 小細(xì)胞肺癌細(xì)胞；RPMI1640培養(yǎng)基用于5637膀胱癌細(xì)胞和AM9，H2170和LC319非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞； Dulbecco氏改良fegle氏培養(yǎng)基(DMEM)用于EE8膀胱癌細(xì)胞和RERF-LC-AI非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞；McCoy氏5A培養(yǎng)基用于RT4和TM膀胱癌細(xì)胞；Leibovitz氏L-15用于SW780細(xì)胞，補(bǔ)充有10%胎牛血清和抗生素/抗霉菌溶液(Sigma)。所有細(xì)胞于37°C在潮濕空氣中維持，其中含有 5% CO2 (253J, 253J-BV, HT1197, HT1376, J82, SCaBER, UMUC3, SBC5, 5637， A549 H2170, LC319, EJ28, RERF-LC-AI, CT4 和 T24)或無 CO2 (SW780)。依照制造商的方案用 FuGENE6 (ROCHE，Basel, Switzerland)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 本發(fā)明人用自(美國)國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的UniGene數(shù)據(jù)庫選擇的 36，864種cDNA或ESR建立了全基因組cDNA微陣列。此微陣列系統(tǒng)基本上如先前所述構(gòu)建(Kikuchi T. et al. Oncogene 2003 ；22 :2192-205,KitaharaO. et al. Cancer Res 2001； 61 :3544-9, Nakamura T. et al. Oncogene 2004 ；23 :2385-400)。簡言之，使用自各種人類器官分離的poly(A)+RNA作為模板通過RT-PCR擴(kuò)增cDNA ；擴(kuò)增子的長度范圍為200至 1，10此？，沒有重復(fù)或？017(幻序列。準(zhǔn)備許多類型的癌癥和相應(yīng)的非瘤組織的Sum切片， 如先前所述(Kitahara 0. et al. Cancer Res 2001 ；61 :3544-9)。使用 EZ 切割系統(tǒng)(SL MicrotestGmbH, Germany)依照制造商的方案選擇性收集了總共30，000-40, 000個(gè)癌細(xì)胞或非癌性細(xì)胞。總RNA的提取、基于T7的擴(kuò)增、和探針標(biāo)記如先前所述實(shí)施(Kitahara 0. et al. Cancer Res 2001;61:3544-9)。然后分別用 Cy3_dCTP 或 Cy5_dCTP 標(biāo)記來自癌性和非癌性組織的經(jīng)兩次擴(kuò)增的RNA(aRNA)的2. 5-ug定量等分試樣。定量實(shí)時(shí)PCR如上所述，在劍橋Addenbrooke醫(yī)院準(zhǔn)備了 123個(gè)膀胱癌組織和23個(gè)正常膀胱組織。為了定量RT-PCR反應(yīng)，用于人類GAPDH(持家基因)、SDH(持家基因)、JARID1B、E2F1 和E2F2的特異性引物設(shè)計(jì)如下5'GCAAATTCCATGGCACCGTC 3' (SEQ ID NO :3)用于 GAPDH-正向；
5'TCGCCCCACTTGATTTTGG 3' (SEQ ID NO :4)用于 GAPDH-反向；
5'TGGGAACAAGAGGGCATCTG 3' (SEQ ID NO :5)用于 SDH-正向；
5'CCACCACTGCATCAAATTCATG3‘(SEQ ID NO 6)用于 SDH-反向；
5'ATTGCCTCAAAGGAATTTGGCAGTG3 ‘ (SEQ ID NO :7)用于 JARID1B-正向 _1 ；
5'CATCACTGGCATGTTGTTCAAATTC3' (SEQ ID NO 8)用于 JARID1B-反向 _1 ；
5'TGTCACAGTGGAATATGGAGCTGAC3' (SEQ ID NO 9)用于 JARID1B-正向 _2 ；和
5'GCCACTATCAAGATACTCCTCTTCC3' (SEQ ID NO :10)用于 JARID1B-反向 _2
5'GCTGGACCACCTGATGAATATC 3‘(SEQ ID NO 11)用于 E2F1-正向；
5'TCTGCAATGCTACGAAGGTCCTG 3‘(SEQ ID NO 12)用于 E2F1-反向；
5'TGGCAACTTTAAGGAGCAGACAG 3‘(SEQ ID NO :13)用于 E2F2-正向；
5'GGGCACAGGTAGACTTCGATGG 3‘(SEQ ID N0:14)用于 E2F2-反向。
使用 ABI prism 7700 序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems, Warrington, UK)遵
循制造商的方案來實(shí)施PCR反應(yīng)。應(yīng)用不含UNG的50% SYBR GREEN通用PCR主預(yù)混物 (master mix) (Applied Biosystems, Warrington, UK)、正向禾口反向弓|物各 50nM 禾口 2ul 逆轉(zhuǎn)錄cDNA。擴(kuò)增條件為首先5min 95°C，然后45個(gè)循環(huán)，每個(gè)的組成為IOsec 95°C Umin 55°C和IOsec 72°C。然后，將反應(yīng)體系95°C加熱15seC、65°C加熱Imin以繪制解鏈曲線，并冷卻至50°C保持lOsec。靶基因擴(kuò)增的反應(yīng)條件如上所述，而且在每個(gè)反應(yīng)中使用相當(dāng)于 5ng逆轉(zhuǎn)錄RNA的量。將mRNA水平對(duì)GAPDH和SDH表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。免疫細(xì)胞化學(xué)將A549(非小細(xì)胞肺癌)或SBC5(小細(xì)胞肺癌)細(xì)胞用含有4 %低聚甲醛的 PBS(-)固定20分鐘，并用含有0. 1% Triton X-100的PBS(-)于室溫透化2分鐘。隨后， 將細(xì)胞用含有3%牛血清白蛋白的PBS(-)于室溫覆蓋1小時(shí)以封閉非特異性雜交，然后與以1 100比稀釋的小鼠抗JARID1B抗體(lG10，AbnOVa) —起溫育。用PBS(-)清洗后，用 1 1000稀釋的綴合有Alexa594的抗小鼠二抗(Molecular ftx)be)對(duì)細(xì)胞染色。用4'， 6' -二脒-2'-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)對(duì)核復(fù)染色。在TCS SP2 AOBS顯微鏡(Leica) 下獲得熒光圖像。免疫組織化學(xué)染代
用VECTASTAIN ABC 試劑盒(VECTOR LABORATORIES, CA, USA)對(duì)人膀胱和肺癌切片染色。簡言之，通過0. 3% H2O2/甲醇處理來抑制經(jīng)二甲苯去石蠟和脫水的切片的內(nèi)源過氧化物酶活性。通過將切片與3% BSA—起在增濕室中于環(huán)境溫度溫育30分鐘來封閉非特異性結(jié)合，接著與1 100稀釋的小鼠單克隆抗JARID1B (克隆1G10，Abnova)抗體一起于4°C溫育過夜。將切片用PBS(-)清洗兩次，與5ug/ml山羊抗小鼠生物素化IgG —起在含有1 % BSA的PBS (-)中于環(huán)境溫度溫育30分鐘，然后與ABC試劑一起溫育30分鐘。用3， 3' -二氨基聯(lián)苯胺來顯現(xiàn)特異性免疫染色。用從酒精至二甲苯的梯度清洗使載玻片脫水并用蓋玻片封固。使用蘇木精進(jìn)行核復(fù)染色。Western 印跡自RIPA樣緩沖液中的細(xì)胞制備總蛋白提取物。將總蛋白(50ug)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用抗 JARID1B (克隆 lG10，Abnova 或 HPA027179，AtlasAntibodies AB)、抗 E2F1 抗體 (KH-95, Santa Cruz Biotechnology)禾口抗 E2F2 抗體(L-20, Santa Cruz Biotechnology) 探查膜。使用抗肌動(dòng)蛋白(1-19，Santa CruzBiotechnology)作為加載對(duì)照。siRNA 轉(zhuǎn)染靶向人JARID1B轉(zhuǎn)錄物的siRNA寡核苷酸雙鏈體購自SIGMA Genosys。使用 siEGFP,siFFLuc和si陰性對(duì)照(siNC)(它是三種不同寡核苷酸雙鏈體的混合物)作為對(duì)照siRNA。siRNA序列顯示如下。5'GCAGCACGACUUCUUCAAGTT3(SEQ ID NO :15)用于 siEGFP 有義；
5'CUUGAAGAA⑶CGUGCUGCTT3(SEQ ID NO 16)用于 siEGFP 反義；
5'GUGCGCUGCUG⑶GCCAACTT3(SEQ ID NO :17)用于 siFFLuc 有義；
5'GUUGGCACCAGCAGCGCACTT3(SEQ ID NO 18)用于 siFFLuc 反義；
5'AUCCGCGCGAUAGUACGUA 3(SEQ ID NO :22)用于si陰性對(duì)照靶物#1有義；
5'UACGUACUAUCGCGCGGAU 3(SEQ ID NO :23)用于si陰性對(duì)照靶物#1反義；
5'UUACGCGUAGCGUAAUACG 3(SEQ ID NO :24)用于si陰性對(duì)照靶物#2有義；
5'CGUAUUACGCUACGCGUAA 3(SEQ ID NO :25)用于si陰性對(duì)照靶物#2反義；
5'UAUUCGCGCGUAUAGCGGU 3(SEQ ID NO :26)用于si陰性對(duì)照靶物#3有義；
5'ACCGCUAUACGCGCGAAUA 3(SEQ ID NO :27)用于si陰性對(duì)照靶物#3反義；
5'CA⑶GAAUGAGCUCCGGCATT3(SEQ ID NO 19)用于 JARID1B#1 有義；
5'UGCCGGAGCUCAUUCACUGTT3(SEQ ID NO 20)用于 JARID1B#1 反義；
5'GGAAUAUGGAGCUGACAUUTT3(SEQ ID NO 28)用于 JARID1B#2 有義；禾口
5'AAU⑶CAGCUCCAUAUUCCTT3(SEQ ID NO 29)用于 JARID1B#2 反義。
用lipofectamine2000 (Invitrogen)將 siRNA 雙鏈體(IOOnM 終濃度)轉(zhuǎn)染入膀
胱和肺癌細(xì)胞系達(dá)72小時(shí)，并使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8 (DOJINDOLaboratories)檢查細(xì)胞生存力。流式細(xì)胞術(shù)測定法(FACS)為了檢查JARID1B表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期行進(jìn)的影響，用siJARIDlB或?qū)φ?siRNA (siEGFP和siFFLuc)處理SBC5細(xì)胞，并在(X)2溫箱中于37°C培養(yǎng)72小時(shí)。通過胰蛋白酶消化來收集IXlO5個(gè)細(xì)胞，并遵循制造商的指令(CaymanChemical)用碘化丙錠染色。 通過 FACScan (BECKMAN COULTER)及 MultiCycle for Windows 軟件(BECKMAN COULTER)對(duì)細(xì)胞分析詳細(xì)的細(xì)胞周期狀態(tài)。對(duì)于至少20，000個(gè)未設(shè)門的細(xì)胞，測定處于細(xì)胞周期GO/ Gl、S和G2/M期，及任何sub-Gl群的細(xì)胞百分比。標(biāo)記純化的總RNA并雜交到Affymetrix GeneChip U133 Plus 2. 0寡核苷酸陣列 (Affymetrix, Santa Clara, CA)上，依照制造商的指令進(jìn)行。在Affymetrix GCOS軟件(1. 1. 1版)中利用通過將每個(gè)陣列的全局平衡均值信號(hào)強(qiáng)度值調(diào)整至500而確定的縮放因子對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行縮放，并輸入至GeneSpring 6. 2版 (Silicon Genetics)。然后將信號(hào)強(qiáng)度集中至每個(gè)芯片的第50百分位，并且對(duì)于每個(gè)個(gè)別的基因，首先集中至每個(gè)特定子集的中值強(qiáng)度(以使可能的技術(shù)偏倚最小化)，然后集中至整個(gè)樣品集的中值強(qiáng)度。對(duì)任何重復(fù)雜交的強(qiáng)度取平均值，之后進(jìn)行進(jìn)一步分析。只有被 GCOS軟件標(biāo)記為在所有樣品中“存在”(present)或“微量”(marginal)的基因用于進(jìn)一步分析。使用WilC0x0n-Marm-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)來鑒定差異表達(dá)基因(P < 0. 05)。只要適用的話，就應(yīng)用Benjamini-Hochberg假發(fā)現(xiàn)率倍增檢驗(yàn)修正。對(duì)每項(xiàng)比較進(jìn)行分級(jí)聚類分析以評(píng)估每個(gè)鑒定的基因集的樣品間的相關(guān)性?；蛘?，通過RMA和Quantile標(biāo)準(zhǔn)化方法(使用R和Bioconductor)對(duì)探針信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。接著，估計(jì)實(shí)驗(yàn)間變異所致的信號(hào)強(qiáng)度波動(dòng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行(1和 2)，并計(jì)算中點(diǎn)為log2((強(qiáng)度1+強(qiáng)度2)/2) = 5，7，9，11，13，和15的一組強(qiáng)度范圍中的每個(gè)強(qiáng)度范圍的log2(強(qiáng)度2/強(qiáng)度1)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(stdev)。以公式stdev (log2 (強(qiáng)度2/ 強(qiáng)度1)) = a* (log2 ((強(qiáng)度1+強(qiáng)度2、/2)) +b將強(qiáng)度變差建模，并使用最小二乘法估計(jì)參數(shù)a和b。使用這些數(shù)值，計(jì)算出強(qiáng)度波動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。然后在SiJARIDlB(實(shí)驗(yàn))和對(duì)照 (EGFP/FFLuc)(對(duì)照)之間比較每種探針的信號(hào)強(qiáng)度，并通過計(jì)算ζ分?jǐn)?shù)log2(實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度 /對(duì)照強(qiáng)度)/仏*(1呢2((實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度+對(duì)照強(qiáng)度)/幻)+13)來檢驗(yàn)上/下調(diào)。將重復(fù)集的所得P值相乘來計(jì)算每種探針的最終P值。將這些程序應(yīng)用于每項(xiàng)比較EGFP對(duì)siJARIDlB， FFLuc對(duì)siJARIDlB，及EGFP對(duì)FFLuc。確定了上/下調(diào)基因集是那些同時(shí)滿足下列標(biāo)準(zhǔn)的基因(I)EGFP 對(duì) siJARIDlB 的 Benjamini-Hochberg 假發(fā)現(xiàn)率(FDR) <= 0. 05, (2) FFLuc 對(duì)siJARIDlB的FDR <= 0. 05且調(diào)節(jié)方向與(1)相同，以及(3)EGFP對(duì)FFLuc具有與(1) 和(2)相反的方向或EGFP對(duì)FFLuc的P > 0. 05。最后，使用超幾何分布檢驗(yàn)來實(shí)施途徑分析，計(jì)算上/下調(diào)基因集合和每個(gè)GO范疇之間交疊的概率，與隨機(jī)采樣的另一基因列表比較。將該檢驗(yàn)應(yīng)用于鑒定出的上/下調(diào)基因以檢驗(yàn)它們是否在基因本體論數(shù)據(jù)庫定義的 “生物學(xué)過程”(857個(gè)范疇)的每個(gè)范疇中顯著富集(FDR <= 0. 05)。E2F報(bào)道物測定法用Cignal E2F報(bào)道物測定試劑盒(SuperArray Bioscience Corporation)來分析E2F的轉(zhuǎn)錄活性。用siRNA (siJARIDlB、siEGFP和siFFLuc)處理A549和SBC5細(xì)胞并培養(yǎng)M小時(shí)。將經(jīng)siRNA處理的細(xì)胞用在最小(m) CMV啟動(dòng)子和E2F轉(zhuǎn)錄應(yīng)答元件(TRE)串聯(lián)重復(fù)控制下編碼螢火蟲螢光素酶報(bào)道基因的E2F響應(yīng)性螢光素酶構(gòu)建體、陰性對(duì)照、或陽性對(duì)照轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染M小時(shí)后，使用雙重螢光素酶報(bào)道物測定系統(tǒng)(!Iomega)實(shí)施雙重螢光素酶測定，并使用海腎(Renilla)報(bào)道物進(jìn)行內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化，將啟動(dòng)子活性值表述為任意單位。實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行，并使用Student氏t檢驗(yàn)作為統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)施例2
TARID1B表汰在臨床癌癥組織中上調(diào)首先，在臨床膀胱癌樣品的一個(gè)小子集中檢查五種組蛋白脫甲基酶基因，即 JARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1D 和 JARID2 的表達(dá)水平，并且只對(duì) JARID1B 基因發(fā)現(xiàn)了正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間表達(dá)水平的顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。為了驗(yàn)證JmjC組蛋白脫甲基酶的表達(dá)水平在惡性腫瘤中如何變化，在臨床膀胱癌樣品的一個(gè)小子集中使用定量實(shí)時(shí)PCR檢查了五種組蛋白脫甲基酶基因，即JARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1D和JARID2 的表達(dá)水平，并且只對(duì)JARID1B基因發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)了正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間表達(dá)水平的顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，分析了 123個(gè)膀胱癌樣品和23個(gè)正常對(duì)照樣品(英國人)(圖 IA和B)，而且觀察到腫瘤細(xì)胞中與正常組織相比顯著的JARID1B過表達(dá)(P < 0. 0001, Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，圖 1B,表 1)。[表 1]臨床病理特征和JARID1B表達(dá)
權(quán)利要求
1.一種用于檢測或診斷癌癥的方法，所述方法包括下列步驟(a)通過選自下組的任一方法測定源自受試者的生物樣品中jumonji，富含AT的相互作用域IB (JARID1B)基因的表達(dá)水平⑴檢測JARID1B基因的mRNA ；(ii)檢測JARID1B蛋白；和(iii)檢測JARID1B蛋白的生物學(xué)活性；并(b)將步驟(a)中測得的表達(dá)水平與所述基因的正常對(duì)照水平相比的升高與癌癥的存在關(guān)聯(lián)起來。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥選自下組急性髓細(xì)胞性白血病，膀胱癌，慢性髓細(xì)胞性白血病，宮頸癌，肺癌和腎細(xì)胞癌。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述源自受試者的生物樣品包括活檢樣品、痰、血液、胸腔積液或尿液。
4.一種用于診斷癌癥的試劑盒，其中所述試劑盒包括選自下組的試劑(a)用于檢測JARID1B基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測JARID1B蛋白的試劑；和(c)用于檢測JARID1B蛋白的生物學(xué)活性的試劑。
5.權(quán)利要求4的試劑盒，其中所述癌癥選自下組急性髓細(xì)胞性白血病，膀胱癌，慢性髓細(xì)胞性白血病，宮頸癌，肺癌或腎細(xì)胞癌。
6.一種分離的雙鏈分子，其中所述分子在導(dǎo)入表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞中時(shí)抑制所述基因表達(dá)，其中所述分子包含有義鏈和與其互補(bǔ)的反義鏈，其中所述鏈彼此雜交以形成雙鏈分子，其中所述有義鏈包含與SEQ ID NO :21或30對(duì)應(yīng)的核酸序列，其中所述分子具有約 19個(gè)-約25個(gè)核苷酸的長度。
7.權(quán)利要求6的雙鏈分子，其在有義鏈和/或反義鏈3'端任一或二者處具有由2至 10個(gè)核苷酸組成的一個(gè)或兩個(gè)3'突出端。
8.權(quán)利要求6的雙鏈分子，其由單一多核苷酸組成，所述單一多核苷酸包含通過間插單鏈核酸序列連接的有義鏈和反義鏈。
9.權(quán)利要求8的雙鏈分子，其具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]為有義鏈， [B]為由3至23個(gè)核苷酸組成的間插單鏈核酸序列，而[A']為包含與[A]互補(bǔ)的序列的反義鏈。
10.編碼權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)的雙鏈分子的載體。
11.包含包括有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸的組合中的任一項(xiàng)的載體，其中所述有義鏈核酸包含SEQ ID NO :21或30的核苷酸序列，而所述反義鏈核酸由與有義鏈互補(bǔ)的序列組成，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉(zhuǎn)錄物彼此雜交以形成雙鏈分子，且其中所述載體在導(dǎo)入表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞中時(shí)抑制細(xì)胞增殖。
12.一種用于治療或預(yù)防癌癥的方法，其包括給受試者施用分離的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體的步驟，其中所述分子在導(dǎo)入表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞中時(shí)抑制所述基因表達(dá)，其中所述分子包含有義鏈和與其互補(bǔ)的反義鏈，其中所述鏈彼此雜交以形成雙鏈分子，其中所述有義鏈包含與JARID1B基因或其片段的核酸序列對(duì)應(yīng)的核酸序列，且其中所述分子具有約19個(gè)-約25個(gè)核苷酸的長度。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述雙鏈分子是權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的雙鏈分子。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述癌癥選自下組急性髓細(xì)胞性白血病，膀胱癌， 乳腺癌，慢性髓細(xì)胞性白血病，宮頸癌，肺癌，前列腺癌和腎細(xì)胞癌。
15.一種用于治療或預(yù)防癌癥的組合物，其包含分離的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體，其中所述分子在導(dǎo)入表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞中時(shí)抑制所述基因表達(dá)，其中所述分子包含有義鏈和與其互補(bǔ)的反義鏈，其中所述鏈彼此雜交以形成雙鏈分子，其中所述有義鏈包含與JARID1B基因或其片段的核酸序列對(duì)應(yīng)的核酸序列，且其中所述分子具有約19 個(gè)-約25個(gè)核苷酸的長度。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述雙鏈分子是權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的雙鏈分子。
17.權(quán)利要求15或16的組合物，其中所述癌癥選自下組急性髓細(xì)胞性白血病，膀胱癌，乳腺癌，慢性髓細(xì)胞性白血病，宮頸癌，肺癌，前列腺癌或腎細(xì)胞癌。
18.—種篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選藥劑的方法，所述方法包括下列步驟(a)使測試藥劑與JARID1B多肽接觸；(b)檢測所述多肽與測試藥劑之間的結(jié)合活性；并(c)選擇結(jié)合所述多肽的測試藥劑作為候選藥劑。
19.一種篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選藥劑的方法，所述方法包括下列步驟(a)使測試藥劑與JARID1B多肽接觸；(b)檢測所述多肽的生物學(xué)活性；并(c)選擇與在測試藥劑不存在下檢出的所述多肽的生物學(xué)活性相比遏制所述生物學(xué)活性的測試藥劑作為候選藥劑。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述生物學(xué)活性選自下組細(xì)胞增殖活性，抗凋亡活性， 促進(jìn)E2F1基因或E2F2基因表達(dá)的活性，和脫甲基化活性。
21.—種篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選藥劑的方法，所述方法包括下列步驟(a)在測試藥劑存在下使JARID1B多肽與要脫甲基化的底物在適合于該底物脫甲基化的條件下接觸；(b)檢測所述底物的甲基化水平；并(c)選擇與在測試藥劑不存在時(shí)檢出的所述底物的甲基化水平相比提高所述甲基化水平的測試藥劑作為候選藥劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述底物是甲基化的組蛋白H3。
23.權(quán)利要求21的方法，其中在組蛋白H3的賴氨酸4處檢測所述甲基化水平。
24.一種篩選用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選藥劑的方法，所述方法包括下列步驟(a)使測試藥劑與表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞接觸；(b)檢測所述細(xì)胞中組蛋白H3的甲基化水平；并(c)選擇與在測試藥劑不存在時(shí)檢出的組蛋白H3甲基化水平相比提高所述甲基化水平的測試藥劑作為候選藥劑。
25.權(quán)利要求M的方法，其中在組蛋白H3的賴氨酸4處檢測所述甲基化水平。
26.—種篩選用于治療或預(yù)防癌癥的候選藥劑的方法，所述方法包括下列步驟(a)使測試藥劑與表達(dá)JARID1B基因的細(xì)胞接觸；(b)檢測JARIDIB基因的表達(dá)水平；并(c)選擇與在測試藥劑不存在時(shí)檢出的JARID1B基因表達(dá)水平相比降低所述表達(dá)水平的測試藥劑作為候選藥劑。
27.—種篩選用于治療或預(yù)防癌癥的候選藥劑的方法，所述方法包括下列步驟(a)使測試藥劑與其中導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，該載體包含JARID1B的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報(bào)道基因；(b)測量所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性；并(c)選擇與所述測試藥劑不存在時(shí)的表達(dá)或活性水平相比降低所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性水平的測試藥劑作為候選藥劑。
28.權(quán)利要求18-27任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥選自下組急性髓細(xì)胞性白血病，膀胱癌，乳腺癌，慢性髓細(xì)胞性白血病，宮頸癌，肺癌，前列腺癌或腎細(xì)胞癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及JARID1B基因在癌癥中發(fā)揮的作用，特征在于通過施用包含針對(duì)JARID1B基因的雙鏈分子或編碼它們的載體的組合物來治療或預(yù)防癌癥的方法。本發(fā)明的特征還在于通過檢測JARID1B的表達(dá)來診斷癌癥的方法。為了該目的，以JARID1B作為癌癥的血清學(xué)生物標(biāo)志物。還公開了鑒定用于治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選藥劑的方法，該方法使用癌細(xì)胞中的JARID1B表達(dá)或JARID1B表達(dá)所致細(xì)胞增殖作為指標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N33/15GK102414318SQ20108001808
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月23日
發(fā)明者中村佑輔, 浜本隆二, 角田卓也 申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司