專利名稱：作為肺癌標(biāo)志物的cybp的制作方法
作為肺癌標(biāo)志物的CYBP本發(fā)明涉及幫助評(píng)估肺部癌癥或肺癌(=LC)，且特別是幫助評(píng)估非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)的方法。它公開(kāi)了“鈣周期蛋白結(jié)合蛋白”(CYBP)作為L(zhǎng)C，特別是NSCLC的標(biāo)志物的用途。此外，它特別涉及從自個(gè)體衍生的液體樣品來(lái)評(píng)估肺癌的方法，其通過(guò)測(cè)量所述樣品中的CYBP來(lái)進(jìn)行。例如，CYBP的測(cè)量可以用于肺癌的早期檢測(cè)或經(jīng)歷手術(shù)的患者的監(jiān)護(hù)。盡管在檢測(cè)和治療方面有進(jìn)展，癌癥仍然是主要的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。在各種類型的癌癥中，LC是西方世界常見(jiàn)的癌癥，并且是癌癥相關(guān)死亡的最常見(jiàn)原因之一。這很大部分由于疾病的早期檢測(cè)的診斷缺口。LC在它的早期階段中主要是無(wú)癥狀的。所有肺癌的大多數(shù)在晚期階段時(shí)檢出，此時(shí)疾病已經(jīng)變得不能手術(shù)。大部分LC腫瘤可以分成小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。SCLC占所有肺癌病例的約20-25%。SCLC是LC的攻擊性神經(jīng)內(nèi)分泌類型，并且具有非常差的預(yù)后， 即使在早期階段中被檢出。SCLC很少能通過(guò)切除術(shù)來(lái)治愈性治療。由于疾病進(jìn)展的速度， SCLC—般僅用兩期來(lái)分類即，有限的和大范圍的疾病，而不用更復(fù)雜的TNM分期系統(tǒng)(見(jiàn)下文)。約75-80%的LC病例被分組到NSCLC的類別中，包括鱗狀細(xì)胞癌(癌=CA)、腺 CA(包括腺泡CA、乳頭狀CA、支氣管肺泡腫瘤、實(shí)體瘤和混合亞型的亞類)、和大細(xì)胞癌(包括巨細(xì)胞瘤、透明細(xì)胞CA、腺鱗CA和未分化的CA的亞類)。如果在晚期階段時(shí)檢出，NSCLC 也具有非常差的預(yù)后。癌癥的分期是疾病就程度、進(jìn)展、細(xì)胞類型和腫瘤級(jí)別而言的分類。 它將癌癥患者分組，從而關(guān)于預(yù)后和治療選擇可以進(jìn)行普遍化。當(dāng)今， Μ系統(tǒng)是根據(jù)癌癥的解剖學(xué)程度最廣泛使用的分類系統(tǒng)。它代表了國(guó)際公認(rèn)的、統(tǒng)一的分期系統(tǒng)。其中有三種基本變量τ(原發(fā)性腫瘤的程度)、Ν(區(qū)域性淋巴結(jié)的狀態(tài))和M(遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的存在或缺失)。由UICC(國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì))編，1997(Sobin， L. H.和 Fleming, I. D.，TNM 80(1997) 1803-4)出版了 TNM 標(biāo)準(zhǔn)。原發(fā)性腫瘤的外科切除術(shù)作為早期NSCLC的選擇治療是廣泛接受的。隨著NSCLC 的進(jìn)展，且更具體地，從 IIIa(T3mM0、T1N2M0、T2N2M0、T3N2M0)到 IIIb(T4N0M0、T4N1M0、 T4N2M0)期的轉(zhuǎn)變，促成了內(nèi)科醫(yī)生的方法方面的顯著變化。然而，如果在更早期階段期間檢出癌癥(Ia-IIIa;優(yōu)選最多到T3WM0期)，五年存活率在35%和80%之間變化。在Ia 期((T1N0M0)；小腫瘤大小，無(wú)轉(zhuǎn)移)檢出具有明顯最好的預(yù)后，五年存活率達(dá)80%。如果有的話，手術(shù)很少用于NSCLC的IIIb-IV期的管理。IV期對(duì)應(yīng)于遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移， 即疾病擴(kuò)散超出肺和區(qū)域淋巴結(jié)。在后面的III和IV期五年存活率分別跌至小于15%和之間。特別重要的是，NSCLC的早期診斷翻譯為好得多的預(yù)后。在早至Ia(TlNOMO)、 Ib (T2N0M0), IIa(TlNlMO)、lib (T3N0M0)、禾口 IIIa(T3NlM0)期診斷的患者，如果適當(dāng)?shù)刂委?，有高達(dá)80%的機(jī)會(huì)診斷后存活5年。這必須與一旦已存在遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移診斷的患者低于
的5年存活率相比較。在本發(fā)明的意義上，LC的早期評(píng)估是指在Ia和IIIa之間的腫瘤階段的評(píng)估，如上文所定義的。
優(yōu)選的是，在Ia和IIIa之間的階段評(píng)估LC。大多數(shù)肺癌在它們變得有癥狀時(shí)檢出。當(dāng)前的檢測(cè)方法包括胸部χ-射線、螺旋式計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)、痰細(xì)胞學(xué)和支氣管鏡檢術(shù)。然而，對(duì)于這些手段用于大規(guī)模篩查的適用性存在爭(zhēng)論。肺癌的許多血清腫瘤標(biāo)志物處于臨床使用之中。細(xì)胞角蛋白19的可溶性30kDa 片段(CYFRA21-1)、癌胚發(fā)生抗原(CEA)、神經(jīng)元特異的烯醇酶(NSE)、和鱗狀細(xì)胞癌抗原 (SCC)是最主要的LC標(biāo)志物。然而，它們無(wú)一滿足篩查工具所需要的靈敏性和特異性的標(biāo)準(zhǔn)(Thomas，L，Labor und Diagnose (2000) TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/ Main，Germany)。為了具有臨床實(shí)用性，作為單一標(biāo)志物的新的診斷標(biāo)志物應(yīng)當(dāng)與本領(lǐng)域已知的其它標(biāo)志物相當(dāng)，或更好。或者，新的標(biāo)志物應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生診斷靈敏性和/或特異性方面的進(jìn)展， 如果分別地單獨(dú)使用或與一種或多種其它標(biāo)志物組合使用的話。測(cè)試的診斷靈敏性和/或特異性通過(guò)它的接受者操作特征來(lái)最好地評(píng)定，其將在下文詳細(xì)描述。全血、血清或血漿是在臨床常規(guī)中最廣泛使用的樣品來(lái)源。會(huì)幫助可靠的癌癥檢測(cè)或提供早期預(yù)后信息的早期LC腫瘤標(biāo)志物的鑒定可以產(chǎn)生將大大地幫助這種疾病的診斷和管理的方法。因而，存在著急迫的臨床需求來(lái)改善LC的體外評(píng)估。改善LC的早期診斷是特別重要的，因?yàn)榕c在疾病的進(jìn)展期診斷的那些患者相比，早期診斷的患者存活機(jī)會(huì)要高得多。特別地，迫切需要可靠地監(jiān)測(cè)LC治療、在LC方面篩選個(gè)體及在LC治療后測(cè)試肺癌復(fù)發(fā)的方法。近來(lái)已經(jīng)綜述了生物化學(xué)標(biāo)志物在肺癌中的臨床實(shí)用性(Duffy，Μ. J.，Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38(2001)225-262)。當(dāng)前認(rèn)為CYFRA 21-1是目前已知的最好的肺癌腫瘤標(biāo)志物。雖然沒(méi)有器官特異性，它主要地在肺組織中發(fā)現(xiàn)。在針對(duì)其它良性肺部疾病的95%的特異性時(shí)，CYFRA21-1對(duì)于肺癌的靈敏性被描述為在46% -61%之間。CYFRA 21-1的血清水平升高還與顯著的良性肝病、腎機(jī)能不全和侵入性膀胱癌相關(guān)。CYFRA 21-1測(cè)試推薦用于手術(shù)后的治療監(jiān)護(hù)。CEA屬于癌胚抗原的組，通常在胚胎發(fā)生期間產(chǎn)生。CEA不是器官特異性的，并且主要用于結(jié)腸直腸癌的監(jiān)測(cè)。除了惡性腫瘤之外，還有幾種良性的疾病諸如硬化、支氣管炎、胰腺炎和自體免疫性疾病與升高的CEA血清水平有關(guān)。在針對(duì)良性肺部疾病的95%的特異性時(shí)，它對(duì)肺癌的靈敏性報(bào)告為29-44%。CEA的一個(gè)優(yōu)選用途是肺癌的治療監(jiān)護(hù)。NSE是SCLC的腫瘤標(biāo)志物。一般地，發(fā)現(xiàn)升高的NSE血清水平與神經(jīng)外胚層和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤關(guān)聯(lián)。還在具有良性肺部疾病和腦部疾病，諸如腦膜炎或腦部的其它炎性疾病，以及對(duì)頭部的外傷性損傷的患者中發(fā)現(xiàn)升高的血清水平。雖然在95%特異性時(shí)對(duì)SCLC 的靈敏性報(bào)告為60-87%，但是NSE測(cè)試對(duì)于NSCLC的性能是差的(7_25%的靈敏性)。NSE 推薦用于SCLC的治療監(jiān)護(hù)。proGRP是在SCLC的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)中有用的腫瘤標(biāo)志物。還在患有非惡性肺部/胸膜疾病，諸如特發(fā)性肺纖維化或結(jié)節(jié)病的患者中發(fā)現(xiàn)升高的血清水平。雖然ProGRP在SCLC 領(lǐng)域中的靈敏性(在95%特異性時(shí))報(bào)告為47-86%，但是proGRP測(cè)試在NSCLC領(lǐng)域中的性能是差的，因?yàn)殪`敏性報(bào)告為10%以下。SCC最初在宮頸的鱗狀細(xì)胞CA中鑒定。SCC對(duì)LC的靈敏性一般是低的(18_27%)。
4因此，認(rèn)為SCC測(cè)試不適合于篩查。然而，由于對(duì)鱗狀細(xì)胞CA的更高的靈敏性，SCC的一個(gè)優(yōu)選用途是治療監(jiān)護(hù)，雖然CYFRA 21-1 一般表現(xiàn)得更好。在免疫組織化學(xué)調(diào)查中，Zhai等(Journal of Histochemistry and Cytochemistry，第56卷(8) :765-772,2008)已經(jīng)通過(guò)用單克隆抗CacyBP抗體的免疫組織化學(xué)染色分析了一大批人正常組織和癌中的CacyBP蛋白表達(dá)譜。在此研究中，在多個(gè)腺癌和鱗癌中觀察到CacyBP染色。陽(yáng)性染色的百分比在鼻咽癌(71% )、胰腺癌(70% )、乳腺癌(63%)、和骨源性肉瘤(63%)中最高。比較而言，僅約45%的肺腺癌樣品和50%的肺鱗癌樣品得到染色。關(guān)于標(biāo)志物譜和針對(duì)改善的肺癌診斷，公開(kāi)了一種方法(khneider，J.等ht. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151)，其使用基于模糊邏輯的分類算法來(lái)組合CYFRA 21_1、NSE 和作為一般炎癥標(biāo)志物的C-反應(yīng)性蛋白(CRP)的血清水平。作者報(bào)告了在95%的特異性時(shí)92%的靈敏性。然而，在此研究中，例如CYFRA21-1作為單一腫瘤標(biāo)志物的靈敏性報(bào)告為在95%特異性時(shí)的72%，其顯著高于許多其它報(bào)告的研究。Duffy，Μ. J.，于Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 UOOl) 225-262 報(bào)告了 46%和 61 %之間的靈敏性。這種由Schneider等實(shí)現(xiàn)的異乎尋常的高性能引起了一些懷疑，并且可能是由于幾個(gè)事實(shí)。首先，對(duì)照患者的集體似乎比患者集體年輕，即，組不是良好地年齡匹配的， 而且患者集體包含了許多的晚期。第二且更為關(guān)鍵的是，算法的性能是對(duì)于如下的訓(xùn)練集 (training set)的樣品檢查的，所述訓(xùn)練集的樣品用于模糊邏輯合格者的確定。因此，這些合格者嚴(yán)格來(lái)說(shuō)是對(duì)這個(gè)集合“修整得到的”，并且不能應(yīng)用于獨(dú)立的驗(yàn)證集。在正常的情況下，必須預(yù)期的是，同樣的算法適用于更大的、獨(dú)立的以及良好平衡的驗(yàn)證集會(huì)產(chǎn)生顯著降低的總體性能。本發(fā)明的任務(wù)是調(diào)查是否可以鑒定出可以在評(píng)估LC中使用的生物化學(xué)標(biāo)志物。令人^C訝地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了標(biāo)志物CYBP (鈣周期蛋白結(jié)合蛋白、CacyBP、Siah-相互作用蛋白、S100A6-結(jié)合蛋白)，特別是人CYBP(hCYBP)的使用可以至少部分克服當(dāng)前本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)已知的標(biāo)志物的一些問(wèn)題。本發(fā)明涉及體外評(píng)估肺癌的方法，包括測(cè)量樣品中CYBP的存在和/或濃度，以及將所述測(cè)量結(jié)果，特別是所測(cè)定的濃度用于肺癌的評(píng)估。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以出于監(jiān)測(cè)及篩選目的而使用新的標(biāo)志物CYBP。在患者監(jiān)測(cè)中使用時(shí)，依照本發(fā)明的診斷方法可以幫助評(píng)估腫瘤負(fù)荷、治療的功效和患者隨訪中的腫瘤復(fù)發(fā)。CYBP的水平升高與腫瘤負(fù)荷正相關(guān)。在化學(xué)療法后，CYBP的短期(幾小時(shí)至14天)的升高可以充當(dāng)腫瘤細(xì)胞死亡的指標(biāo)。在患者的隨訪(3個(gè)月至10 年)中，可以使用CYBP的升高作為腫瘤復(fù)發(fā)的指標(biāo)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以出于篩選目的而使用依照本發(fā)明的診斷方法。艮口， 使用它來(lái)評(píng)估沒(méi)有LC的先前診斷的受試者，其通過(guò)測(cè)量CYBP的水平，并將測(cè)量到的水平與 LC的存在或不存在相關(guān)聯(lián)來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明還涉及通過(guò)生物化學(xué)標(biāo)志物來(lái)在體外評(píng)估LC的方法，包括測(cè)量樣品中 CYBP和一種或多種其它LC標(biāo)志物的存在和/或濃度，并將測(cè)量結(jié)果，特別是測(cè)定到的濃度用于LC的評(píng)估。優(yōu)選的是，所述一種或多種其它LC標(biāo)志物選自CYFRA 21-1, CEA、NSE、 proGRP 和 SCC。
本發(fā)明還涉及包含CYBP和一種或多種其它標(biāo)志物的標(biāo)志物組在LC評(píng)估中的用途，其中優(yōu)選的其它標(biāo)志物選自CYFRA 21-l、CEA、NSE、proGRP和SCC。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及至少包含CYBP和CYFRA 21-1的標(biāo)志物組在LC評(píng)估中的用途。本發(fā)明還涉及至少包含CYBP和CEA的標(biāo)志物組在LC評(píng)估中的用途。本發(fā)明還涉及至少包含CYBP和SCC的標(biāo)志物組在LC評(píng)估中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及進(jìn)行依照本發(fā)明的方法的試劑盒，其至少包含特異性測(cè)量CYBP 所需要的試劑和任選地用于進(jìn)行所述測(cè)量的輔助試劑。本發(fā)明還提供了進(jìn)行依照本發(fā)明的方法的試劑盒，其至少包含分別特異性測(cè)量 CYBP和CYFRA 21-1所需要的試劑和任選用于進(jìn)行所述測(cè)量的輔助試劑。本發(fā)明還提供了進(jìn)行依照本發(fā)明的方法的試劑盒，其至少包含特異性測(cè)量CYBP 和一種或多種其它肺癌標(biāo)志物所需要的試劑。本發(fā)明還提供了進(jìn)行依照本發(fā)明的方法的試劑盒，其至少包含分別特異性測(cè)量 CYBP和CEA所需要的試劑和任選用于進(jìn)行所述測(cè)量的輔助試劑。本發(fā)明還提供了進(jìn)行依照本發(fā)明的方法的試劑盒，其至少包含分別特異性測(cè)量 CYBP和SCC所需要的試劑和任選用于進(jìn)行所述測(cè)量的輔助試劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及體外評(píng)估肺癌的方法，包括測(cè)量樣品中a) CYBP，和b)任選地一種或多種其它肺癌標(biāo)志物的存在和/或濃度，并c)在肺癌評(píng)估中使用測(cè)量結(jié)果，特別是步驟(a)和任選地步驟(b)中測(cè)定到的濃度。術(shù)語(yǔ)“測(cè)量”包括樣品中CYBP的定性的或定量的測(cè)量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述測(cè)量是定性的或半定量的測(cè)量，即，測(cè)定CYBP是存在還是缺乏，或者測(cè)定CYBP的濃度是高于還是低于截留值。如熟練技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)的，在是_(存在)或否_(缺乏)測(cè)定法中， 測(cè)定法靈敏性通常設(shè)置為匹配所述截留值。例如，截留值可以從一組健康個(gè)體的測(cè)試來(lái)確定。優(yōu)選的是，所述截留設(shè)置為產(chǎn)生90%的特異性，還優(yōu)選的是所述截留設(shè)置為產(chǎn)生95% 的特異性，或還優(yōu)選的是所述截留設(shè)置為產(chǎn)生98%的特異性。例如，存在高于截留值的值可以指示肺癌的存在。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述測(cè)量是定量測(cè)量。在此實(shí)施方式中， CYBP的濃度與基礎(chǔ)的診斷問(wèn)題如疾病的階段、疾病進(jìn)展或?qū)χ委煹捻憫?yīng)相關(guān)。鈣周期蛋白(S100A6)是一種屬于SlOO蛋白家族的鈣結(jié)合蛋白(綜述于 Zimmer 等，Brain Res.Bull. 37(1995)，417-429 ;Heizmann 和 Cox，Biometals 11(1998)， 383-397)。它的基因基于其細(xì)胞周期依賴性表達(dá)而發(fā)現(xiàn)(Calabretta等，J. Biol. Chem. 261 (1986)，12628-12632)。此基因在細(xì)胞周期的G0到S期之間的轉(zhuǎn)變期間以其最高水平表達(dá)，但是其表達(dá)在急性髓樣白血病中脫調(diào)節(jié)(Calabretta等，Proc. Natl. Sci USA 83(1986)，1495-1498)。自埃列希腹水腫瘤(Ehrlich ascites tumor, EAT)細(xì)胞第一次純化并表征該蛋白質(zhì)(Kuznicki 和 Filipek, Biochem. J. 247 (1987)，663-667 ；Kuznicki 等， Biochem. JJ63 (1989)，951-956)。后來(lái)，發(fā)現(xiàn)鈣周期蛋白在成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞中、在具有高增殖活性的細(xì)胞、及那些經(jīng)歷分化的細(xì)胞中以高水平表達(dá)(Leonard等，Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 3156-3167 ；Guo 等，Cell Growth Differ. 1 (1990), 333-338 ；Tonini 等， Cancer Res. Sl (1991)，1733-1737 ；Kuznicki 等，Exp. Cell. Res. 200 (1992)，425-430)。已經(jīng)鑒定出鈣周期蛋白的數(shù)種可能的蛋白質(zhì)靶物。已經(jīng)顯示了鈣周期蛋白在體外以Ca2+-依賴性方式與甘油醛-3-磷酸脫氫酶、膜聯(lián)蛋白II(Filipek等，Eur. J. Biochem. 195(1991)，795-800)、膜聯(lián)蛋白 VI (Zeng 等，Int. J. Biochem. 25 (1993)， 1019-1027)、膜聯(lián)蛋白 XI CTokumitsu 等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 186(1992)， 1227-1235)、鈣調(diào)結(jié)合蛋白(Mani 等，Biochemistry 2(1993)，11217-11223)、和 CacyBP (鈣周期蛋白結(jié)合蛋白)(Filipek和Kuznicki，J. Neurochem. 70(1998)，1793-1798 ；Filipek和 Wojda, Biochem. J. 320 (1996)，585-587)相互作用。雖然已經(jīng)確定了在沒(méi)有和存在鈣的情況中的鈣周期蛋白的三維結(jié)構(gòu)(Potts等，Nat. Struct. Biol. 2 (1995)，790-796)，但是靶物相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其在細(xì)胞中作為鈣傳感器的推斷的作用仍然不清楚。最初自EAT細(xì)胞鑒定、純化、并表征CacyBP (Filipek和Wojda(1996)，見(jiàn)上文)。 對(duì)胰凝乳蛋白酶片段的氨基酸測(cè)序提示了，它是一種新的蛋白質(zhì)，因此將CacyBP自小鼠腦cDNA文庫(kù)克隆，并測(cè)序(Filipek和Kuznicki (1998)，見(jiàn)上文)。人CYBP的氨基酸序列 (Swiss PROT Q9HB71)以SEQ ID N0:1描述。除了最近提交的假設(shè)的蛋白質(zhì)(其明顯是 CacyBP的人同系物)外，CacyBP的核苷酸序列揭示了與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)中保存的任何其它序列沒(méi)有同源性。在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)重組CacyBP，并且顯示了在生理鈣濃度發(fā)生它與鈣周期蛋白的相互作用(Filipek和Kuznicki (1998)，見(jiàn)上文)。最近的研究揭示了 CacyBP以高水平存在于小鼠和大鼠腦中，特別在神經(jīng)元細(xì)胞中(Jastrzebska等， J. Histochem. Cytochem. 48 (2000)，1195-1202)。CYBP可以牽涉鈣依賴性泛素化及隨后的對(duì)靶蛋白的蛋白體降解。它可能充當(dāng)泛素 E3復(fù)合物中的分子橋。它參與泛素介導(dǎo)的對(duì)β-聯(lián)蛋白(CTNNBl)的降解。CYBP 在生理鈣濃度與 SlOO 家族 S100A1、S100A6、S100B、S100P 和 S100A12 的蛋白質(zhì)相互作用。它是一些大的E3復(fù)合物的一種構(gòu)件，所述E3復(fù)合物至少由UBE2D1、SIAHU CACYBP/SIP、SKPl、APC 和 TBLlX 構(gòu)成。它與 SIAHl、SIAH2 和 SKPl 直接相互作用。CYBP位于低鈣濃度的胞質(zhì)及細(xì)胞核中。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，在視黃酸(RA)誘導(dǎo)和鈣升高后，它位于細(xì)胞核和胞質(zhì)兩者中。細(xì)胞核部分可以是磷酸化的。本領(lǐng)域中沒(méi)有提示組織提取物和體液中的CYBP的靈敏性且特異性測(cè)定會(huì)容許肺癌的評(píng)估。令人驚訝地，在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)了，組織溶胞物樣品和/或體液中的CYBP的存在和 /或量的測(cè)定容許肺癌的評(píng)估?？梢栽隗w液諸如血液、血清或血漿中以高靈敏性測(cè)量CYBP。 此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 LC的可靠評(píng)估通過(guò)測(cè)量來(lái)自個(gè)體的液體樣品內(nèi)的CYBP是有可能的，即在使用蛋白質(zhì)CYBP作為標(biāo)志物時(shí)在LC的診斷中不需要組織和活組織檢查樣品。甚至更令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)了如自個(gè)體的體液測(cè)量的CYBP的水平升高與肺癌有關(guān)。如對(duì)于熟練技術(shù)人員明顯的，本發(fā)明不應(yīng)解釋為受限于SEQ ID NO 1的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)CYBP。本發(fā)明還涵蓋CYBP的生理學(xué)或人工片段、CYBP的二級(jí)修飾、及CYBP的等位變體。 優(yōu)選地，人工片段涵蓋以合成方式或通過(guò)重組技術(shù)生成的肽，其包含至少一個(gè)診斷上感興趣的由至少6個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的表位，如自SEQ ID NO :1中所公開(kāi)的序列衍生的。有利地，可以使用此類片段來(lái)生成抗體或者在免疫測(cè)定法中作為標(biāo)準(zhǔn)品使用。更優(yōu)選地，人工片段包含適合于建立三明治式免疫測(cè)定法的至少兩個(gè)感興趣表位。如本文中所使用的，下列每項(xiàng)術(shù)語(yǔ)具有此部分中與其有關(guān)的意義。冠詞“一個(gè)”和“一種”在本文中用于指冠詞的一個(gè)/種或超過(guò)一個(gè)/種(即，至少一個(gè)/種)的語(yǔ)法賓語(yǔ)。舉例而言，“一種標(biāo)志物”意指一種標(biāo)志物或超過(guò)一種標(biāo)志物。術(shù)語(yǔ)“至少”用于指明任選地可以存在一個(gè)或多個(gè)別的賓語(yǔ)。舉例而言，至少包含(標(biāo)志物) CYBP和CYFRA 21-1的標(biāo)志物組可以任選地包含一種或多種其它標(biāo)志物。
表述“一個(gè)/種或多個(gè)/種”表示1至50，優(yōu)選地1至20，還優(yōu)選的是2、3、4、5、6、 7、8、9、10、12 或 15。 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)志物，，或“生物化學(xué)標(biāo)志物，，是指用作目標(biāo)用于分析患者的測(cè)試樣品的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類的分子目標(biāo)的例子是蛋白質(zhì)或多肽。用作本發(fā)明中的標(biāo)志物的蛋白質(zhì)或多肽預(yù)期包括所述蛋白質(zhì)的天然存在的變體以及所述蛋白質(zhì)或所述變體的片段，特別是免疫學(xué)可檢測(cè)的片段。免疫學(xué)可檢測(cè)的片段優(yōu)選地包含所述標(biāo)志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20個(gè)連續(xù)的氨基酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，例如，在炎癥期間由細(xì)胞釋放的或細(xì)胞外基質(zhì)中存在的蛋白質(zhì)可能受到損傷，并可能被降解或切割成此類片段。某些標(biāo)志物以無(wú)活性的形式合成，其隨后可以通過(guò)蛋白酶解來(lái)活化。如熟練技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)的，蛋白質(zhì)或其片段也可以作為復(fù)合物的一部分存在。此類復(fù)合物也可以用作本發(fā)明意義上的標(biāo)志物。標(biāo)志物多肽的變體由相同的基因編碼，但是例如由于可變mRNA或前-mRNA加工，在它們的等電點(diǎn)(=PI)或分子量(=MW)、或這兩方面可以不同。變體氨基酸序列與相應(yīng)的標(biāo)志物序列是95%相同或更相同。另外/或者，標(biāo)志物多肽或其變體可以攜帶翻譯后的修飾。優(yōu)選的翻譯后修飾是糖基化、?；?或磷酸化。優(yōu)選地，通過(guò)使用特異性結(jié)合劑來(lái)自樣品特異性測(cè)量標(biāo)志物CYBP。特異性結(jié)合劑是，例如，CYBP的受體、結(jié)合CYBP的凝集素或CYBP的抗體。特異性結(jié)合劑對(duì)它相應(yīng)的目標(biāo)分子至少具有IO7Vmol的親和力。特異性結(jié)合劑優(yōu)選地對(duì)它的目標(biāo)分子具有108l/mol、或還優(yōu)選的IO9Vmol的親和力。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)的，術(shù)語(yǔ)特異性用于指示樣品中存在的其它生物分子沒(méi)有顯著地結(jié)合對(duì)CYBP特異的結(jié)合劑。優(yōu)選地， 結(jié)合與目標(biāo)分子不同的生物分子的水平產(chǎn)生如下的結(jié)合親和力，其是與目標(biāo)分子的親和力的最多僅10%或更小、僅5%或更小、僅2%或更小或僅或更小。優(yōu)選的特異性結(jié)合劑會(huì)滿足親和力和特異性的上述兩種最小標(biāo)準(zhǔn)。特異性結(jié)合劑優(yōu)選地是與CYBP反應(yīng)的抗體。術(shù)語(yǔ)抗體是指多克隆抗體、單克隆抗體、此類抗體的抗原結(jié)合片段、單鏈抗體以及包含抗體的結(jié)合域的遺傳構(gòu)建體。可以使用保留特異性結(jié)合劑的上述標(biāo)準(zhǔn)的任何抗體片段。抗體通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)白勺規(guī)禾呈來(lái)生成，例如，如記載于 Ti jssen (Ti jssen, P. , Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B. V. , Amsterdam,全書，具體的是第 43 頁(yè)-第78頁(yè))的。另外，熟練的技術(shù)人員都知道基于免疫吸附劑的方法，其可以用于抗體的特異性分離。通過(guò)這些手段，多克隆抗體的質(zhì)量以及由此它們?cè)诿庖邷y(cè)定法中的性能可以得到增強(qiáng)(Tijssen,P.，見(jiàn)上文，第108頁(yè)-第115頁(yè))。對(duì)于如本發(fā)明中所公開(kāi)的成果，可以使用兔中生成的多克隆抗體。然而，明顯的是，還可以使用來(lái)自不同物種，例如大鼠或豚鼠的多克隆抗體，以及單克隆抗體。由于單克隆抗體可以以恒定的性能以任何所需要的量生成，它們代表了臨床的常規(guī)測(cè)定法的開(kāi)發(fā)中的理想工具。針對(duì)CYBP的單克隆抗體的生成和在依照本發(fā)明的方法中的用途分別還代表其它優(yōu)選的實(shí)施方案。如熟練技術(shù)人員現(xiàn)在會(huì)領(lǐng)會(huì)的，CYBP已經(jīng)被鑒定為在肺癌的評(píng)估中有用的標(biāo)志物，各種免疫診斷規(guī)程可以用于實(shí)現(xiàn)與本發(fā)明的成果相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。例如，可以使用生成抗體
8的備選策略。此類策略包括使用代表CYBP的表位的合成肽來(lái)免疫，等等?；蛘撸梢允褂?DNA免疫，又稱為DNA疫苗接種。對(duì)于測(cè)量，可以將自個(gè)體獲得的樣品在適合于結(jié)合劑CYBP-復(fù)合物形成的條件下與CYBP的特異性結(jié)合劑一起溫育。不需要規(guī)定此類條件，因?yàn)槭炀毤夹g(shù)人員無(wú)需任何創(chuàng)造性的工作便可以容易地鑒定此類合適的溫育條件。測(cè)量結(jié)合劑CYBP-復(fù)合物的量并用于肺癌的評(píng)估中。如熟練技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)的，存在著許多方法來(lái)測(cè)量特異性結(jié)合劑CYBP-復(fù)合物的量，所有都在相關(guān)的教科書中詳細(xì)描述了(參見(jiàn)例如，Tijssen P.，見(jiàn)上文，或 Diamandis, E. P.禾口 Christopoulos, T. K.(編)，Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))。優(yōu)選地，在三明治型測(cè)定形式中檢測(cè)CYBP。在此類測(cè)定法中，使用第一特異性結(jié)合劑來(lái)在一側(cè)捕捉CYBP，并在另一側(cè)使用經(jīng)標(biāo)記以直接或間接可檢出的第二特異性結(jié)合劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)使用三明治式免疫測(cè)定法來(lái)實(shí)施樣品中的 CYBP的測(cè)量，其中使用經(jīng)鏈霉親合素包被的微量滴定板。在此三明治式測(cè)定法中，使用針對(duì)CYBP的生物素化多克隆抗體作為捕捉抗體，并使用針對(duì)CYBP的洋地黃毒苷化 (digoxigenylate)多克隆抗體作為第二特異性結(jié)合配偶。最后，通過(guò)抗洋地黃毒苷辣根過(guò)氧化物酶綴合物和適合的過(guò)氧化物酶底物來(lái)顯現(xiàn)所形成的三明治式復(fù)合物。如上文所提及的，可以從自個(gè)體樣品獲得的液體樣品測(cè)量CYBP。在LC的診斷中應(yīng)用標(biāo)志物CYBP不需要組織和活組織檢查樣品。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的方法用血漿作為液體樣品材料來(lái)實(shí)施。在本發(fā)明的意義上的“肺癌標(biāo)志物”是在與標(biāo)志物CYBP組合時(shí)添加LC評(píng)估中的相關(guān)信息的任何標(biāo)志物。對(duì)于LC的評(píng)估，如果在給定特異性時(shí)的靈敏性，或如果在給定敏感性時(shí)的特異性分別可以通過(guò)將所述標(biāo)志物納入已經(jīng)包含標(biāo)志物CYBP的標(biāo)志物組合中來(lái)改善，該信息被認(rèn)為是相關(guān)的或具有附加價(jià)值。優(yōu)選地，分別在靈敏性或特異性方面的改善在ρ = . 05、. 02、. 01或更低的顯著性水平上是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。優(yōu)選地，所述一種或多種其它 LC 標(biāo)志物選自 CYFRA 21-1、CEA、NSE、proGRP 和 SCC。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“樣品”是指為了體外評(píng)估的目的獲得的生物學(xué)樣品。在本發(fā)明的方法中，樣品或患者樣品優(yōu)選地可以包括任何體液或組織提取物。優(yōu)選的測(cè)試樣品包括血液、血清、血漿、痰和支氣管灌洗液。優(yōu)選的樣品是全血、血清、血漿、支氣管灌洗液或痰，血漿是最優(yōu)選的。術(shù)語(yǔ)“評(píng)估肺癌”用于指示依照本發(fā)明的方法會(huì)(單獨(dú)地或與其它標(biāo)志物或變量， 例如由UICC列出的標(biāo)準(zhǔn)(參見(jiàn)上文)一起)，例如，幫助內(nèi)科醫(yī)生建立或確認(rèn)LC的不存在或存在，或在預(yù)后、復(fù)發(fā)的檢測(cè)(手術(shù)后患者的隨訪)、篩選和/或監(jiān)測(cè)治療、特別是化學(xué)療法方面幫助醫(yī)師。如熟練技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)的，在體外進(jìn)行任何此類評(píng)估。后來(lái)丟棄患者樣品。患者樣品僅僅用于本發(fā)明的體外診斷方法，并且患者樣品的材料不轉(zhuǎn)移回患者體內(nèi)。通常，所述樣品是液體樣品，例如全血、血清或血漿。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過(guò)生物化學(xué)標(biāo)志物來(lái)在體外評(píng)估LC的方法，包括測(cè)量樣品中CYBP的濃度并將測(cè)定到的濃度用于LC的評(píng)估。本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地能夠在顯著百分比的自LC患者衍生的樣品中檢出標(biāo)志物蛋白質(zhì)CYBP。甚至更令人驚訝地，他們已經(jīng)能夠證明，可以使用自個(gè)體獲得的此類樣品中的CYBP的存在和/或濃度來(lái)評(píng)估肺癌。診斷的理想情況會(huì)是如下的情況，其中單一的事件或過(guò)程會(huì)引起相應(yīng)的疾病，例如在傳染性疾病中。在所有其它情況下，正確的診斷可以是非常困難的，特別是當(dāng)疾病的病因不被完全了解時(shí)，如LC的情況。如熟練技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)的，對(duì)于給定的多因素疾病，例如LC，沒(méi)有生物化學(xué)標(biāo)志物是具有100%特異性同時(shí)具有100%靈敏性的診斷性的。然而， 生物化學(xué)標(biāo)志物，例如CYFRA21-l、CEA、NSE、proGRP、SCC或如在此所顯示的CYBP可以用于以某些可能性或預(yù)測(cè)價(jià)值評(píng)估，例如，疾病的存在、缺乏或嚴(yán)重程度。因而，在常規(guī)臨床診斷中，一般地，各種臨床癥狀和生物標(biāo)志物在潛在的疾病(underlying disease)的診斷、治療和管理中一起考慮。生物化學(xué)標(biāo)志物可以分別地測(cè)定，或在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，它們可以使用基于芯片或珠的陣列技術(shù)同時(shí)測(cè)定。然后，為每個(gè)標(biāo)志物使用單獨(dú)的截留值獨(dú)立地解釋生物標(biāo)志物的濃度，或組合它們用于解釋。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的LC評(píng)估以如下的方法進(jìn)行，所述方法包括測(cè)量樣品中a)CYBP、和b) —種或多種其它肺癌標(biāo)志物的存在和/或濃度，并c)將所述測(cè)量結(jié)果，例如步驟(a)和步驟(b)中分別測(cè)定的濃度用于肺癌的評(píng)估。在LC的評(píng)估中，標(biāo)志物CYBP在下列一個(gè)或多個(gè)方面中會(huì)是有利的篩查、診斷輔助、預(yù)后、療法例如化學(xué)治療、放射治療和免疫治療的監(jiān)測(cè)。篩選篩選定義為測(cè)試的系統(tǒng)性應(yīng)用以鑒定個(gè)體，例如有風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的疾病的指示物， 例如肺癌的存在。優(yōu)選地，篩選群體由已知具有比肺癌的平均風(fēng)險(xiǎn)更高風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體構(gòu)成，如吸煙者、戒煙者、以及暴露于鈾、石英或石棉的工作者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用痰作為肺癌篩選中的樣品。對(duì)于許多疾病，在循環(huán)中總是沒(méi)有單一的生物化學(xué)標(biāo)志物會(huì)滿足篩選目的所需要的靈敏性和特異性標(biāo)準(zhǔn)。這看起來(lái)對(duì)于肺癌也是成立的。不得不預(yù)期的是，會(huì)不得不在LC 篩選中使用包含多種標(biāo)志物的標(biāo)志物組。本發(fā)明中建立的數(shù)據(jù)指明，標(biāo)志物CYBP會(huì)形成適合于篩選目的的標(biāo)志物組的必備的一部分。因此，本發(fā)明涉及CYBP作為L(zhǎng)C標(biāo)志物組(即， 包含CYBP和一種或多種其它用于LC篩選目的的標(biāo)志物的標(biāo)志物組)的一種標(biāo)志物的用途。優(yōu)選的其它標(biāo)志物選自CYFRA 21-l、CEA、NSE、proGRP和SCC。診斷輔助標(biāo)志物可以幫助特定器官中良性對(duì)惡性疾病的區(qū)別診斷，幫助區(qū)分腫瘤的不同組織學(xué)類型、或建立手術(shù)前的基線標(biāo)志物值。今天，在肺癌的檢測(cè)中使用的重要方法是放射學(xué)和/或計(jì)算機(jī)斷層攝影(CT)掃描。小的結(jié)節(jié)，即，疑似組織的小的區(qū)域可以通過(guò)這些方法來(lái)顯現(xiàn)。然而，這些結(jié)節(jié)中的許多(在CT的情況中超過(guò)90% )代表良性的組織變化，而僅少數(shù)結(jié)節(jié)代表癌性組織。標(biāo)志物 CYBP的使用可以幫助良性和惡性結(jié)節(jié)的區(qū)別。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在免疫組織學(xué)方法中使用標(biāo)志物CYBP以建立或確認(rèn) LC的不同的組織學(xué)類型。由于CYBP作為單一標(biāo)志物可能優(yōu)于其它LC標(biāo)志物，如CEA或NSE，不得不預(yù)期的是，CYBP會(huì)作為診斷輔助使用，特別是通過(guò)建立手術(shù)前的基線值進(jìn)行。如此，本發(fā)明還涉及 CYBP用于為L(zhǎng)C在手術(shù)之前確定基線值的用途。預(yù)后預(yù)后指示物可以定義為癌癥患者和他們的腫瘤的臨床的、病理學(xué)的、或生物化學(xué)的特征，其以某些可能性預(yù)測(cè)疾病結(jié)果。它們主要用途是幫助合理地規(guī)劃患者管理，即， 分別避免攻擊性疾病的處理不足和無(wú)痛性疾病的過(guò)度處理。Molina R等，Tumor Biol. (2003)24 :209-218 評(píng)估了 CEA、CA 125、CYFRA 21-1, SSC 和 NSE 在 NSCLC 中的預(yù)后價(jià)值。 在他們的研究中，標(biāo)志物NSE、CEAjP LDH(乳酸脫氫酶)的異常血清水平看起來(lái)指示了更短的存活。由于單獨(dú)的CYBP顯著地有助于LC患者與健康對(duì)照的區(qū)分，不得不預(yù)期的是，它會(huì)幫助評(píng)估患有LC的患者的預(yù)后。手術(shù)前CYBP的水平會(huì)最可能與一種或多種其它LC標(biāo)志物和/或TNM分期系統(tǒng)組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在LC患者的預(yù)后中使用CYBP?；瘜W(xué)療法的監(jiān)測(cè)Merle, P.等，Int. J. of Biological Markers (2004) 19 :310-315 已經(jīng)評(píng)估了用誘導(dǎo)化學(xué)療法治療的局部晚期NSCLC患者中的CYFRA 21_1血清水平變化。他們斷定，CYFRA 21-1血清水平的早期監(jiān)測(cè)可以是III期NSCLC患者中腫瘤響應(yīng)和存活的有用的預(yù)后工具。 另外，報(bào)道已經(jīng)描述了 CEA在監(jiān)測(cè)LC患者的治療方面的用途(Fukasawa T.等，Cancer & Chemotherapy (1986) 13 :1862-1867)。大多數(shù)這些研究是回顧性的、非隨機(jī)的，并含有少量的患者。如在用CYFRA 21-1研究的情況中，CEA研究提示了 a)當(dāng)接受化學(xué)療法時(shí)具有CEA 水平降低的患者比CEA水平未能降低的患者具有更好的結(jié)果，和(b)對(duì)于幾乎所有患者， CEA水平的升高與疾病進(jìn)展有關(guān)。預(yù)期的是，對(duì)于化學(xué)療法的監(jiān)測(cè)，CYBP會(huì)是至少分別與CYFRA21-1或CEA —樣好的標(biāo)志物。因而，本發(fā)明還涉及CYBP在化學(xué)療法下的LC患者的監(jiān)測(cè)中的用途。隨訪經(jīng)歷目的在于癌性組織的完全除去的外科切除術(shù)的大部分LC患者以后形成復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性疾病(Wagner，H.，Chest (2000) 117 :110-118 ；Buccheri, G.等，Ann. Thorac. Surg. (2003)75 =973-980) 0大多數(shù)這些復(fù)發(fā)發(fā)生在手術(shù)后前2_3年內(nèi)。因?yàn)槿绻麢z出太晚的話復(fù)發(fā)性/轉(zhuǎn)移性疾病總是致死的，相當(dāng)多的研究已經(jīng)集中于在早期并且如此是潛在可治療階段時(shí)的LC復(fù)發(fā)。因此，許多LC患者經(jīng)歷手術(shù)后的監(jiān)護(hù)計(jì)劃，其常常包括CEA的常規(guī)監(jiān)測(cè)。外科切除術(shù)之后一年的CEA連續(xù)監(jiān)測(cè)已經(jīng)顯示了在大約97%的特異性下以大約的靈敏性檢出早期術(shù)后復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性疾病，甚至在沒(méi)有懷疑的癥狀或病征的情況下(Buccheri，G.等， Ann. Thorac. Surg. (2003)75 :973-980)。如此，LC患者在手術(shù)后的隨訪是合適的生物化學(xué)標(biāo)志物的用途的最重要的領(lǐng)域之一。由于CYBP在所調(diào)查的LC患者中的高度靈敏性，有可能的是，單獨(dú)的或與一種或多種其它標(biāo)志物組合的CYBP會(huì)大大幫助LC患者的隨訪，特別是手術(shù)后的LC患者。包含CYBP和一種或多種其它LC標(biāo)志物的標(biāo)志物組在LC患者的隨訪方面的使用代表了本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案。本發(fā)明在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中涉及CYBP分別在LC的診斷領(lǐng)域中或在LC的評(píng)估中的用途。
在又進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及與一種或多種肺癌標(biāo)志物分子組合的 CYBP作為肺癌的標(biāo)志物分子在獲自個(gè)體的液體樣品的肺癌評(píng)估中的用途?？梢耘cCYBP的測(cè)量組合的優(yōu)選的其它選定LC標(biāo)志物是CYFRA21-1、CEA、NSE、proGRP、和/或SCC。再進(jìn)一步優(yōu)選的是，在LC的評(píng)估中使用的標(biāo)志物組包含CYBP和選自CYFRA 21-1和CEA的至少一種其它標(biāo)志物分子。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)的，存在著許多方法來(lái)使用兩種或更多種標(biāo)志物的測(cè)量以改善所調(diào)查的診斷問(wèn)題。在十分簡(jiǎn)單的、但盡管如此常常有效的方法中，如果樣品對(duì)于調(diào)查的至少一種標(biāo)志物呈陽(yáng)性，假定陽(yáng)性結(jié)果。例如，當(dāng)診斷傳染性疾病如AIDS時(shí)，這可以是該情況。然而，經(jīng)常地，評(píng)估標(biāo)志物的組合。優(yōu)選地，對(duì)標(biāo)志物組的標(biāo)志物，例如對(duì)CYBP和 CYFRA 21-1測(cè)量的值在數(shù)學(xué)上組合，組合的值與基礎(chǔ)的診斷問(wèn)題相關(guān)聯(lián)?？梢酝ㄟ^(guò)任何適合的現(xiàn)有技術(shù)數(shù)學(xué)方法來(lái)組合標(biāo)志物值。將標(biāo)志物組合與疾病相關(guān)聯(lián)的公知的數(shù)學(xué)方法采用了一些方法，如，辨別分析(DA)(即，線性的、二次的、正規(guī)化的DA)、Kernel方法(即， SVM)、非參數(shù)方法(即，k-最近鄰分類法)、PLS(偏最小二乘方)、基于樹的方法(即，邏輯回歸、CART、隨機(jī)!^rest法、Boosting/Bagging法)、一般化的線性模型(即，邏輯回歸)、 基于主分量的方法(即，SIMCA)、一般化的加法模型、基于模糊邏輯的方法、基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法的方法。熟練技術(shù)人員在選擇合適的方法來(lái)評(píng)估本發(fā)明的標(biāo)志物組合方面將沒(méi)有困難。優(yōu)選地，在將本發(fā)明的標(biāo)志物組合與例如LC的不存在或存在相關(guān)聯(lián)中使用的方法選自DA(即，線性的、二次的、正規(guī)化的辨別分析)、Kernel方法(即，SVM)、非參數(shù)方法 (即，k-最近鄰分類法)、I^LS(偏最小二乘方)、基于樹的方法(即，邏輯回歸、CART、隨機(jī) !^rest法、Boosting法)或一般化的線性模型(即，邏輯回歸)。關(guān)于這些統(tǒng)計(jì)方法的細(xì)節(jié)參見(jiàn)下列參考文獻(xiàn)Ruczinski，I.等，J· of Computational and Graphical Statistics， 12 (2003)475-511 ；Friedman，J. H.，J. of the American Statistical Association 84(1989) 165-175 ；Hastie，Trevor, Tibshirani，Robert，F(xiàn)riedman，Jerome，The Elements of Statistical Learning，Springer Series in Statistics，2001 ；Breiman, L.， Friedman, J. H. ,01shen,R. A. ,Stone,C. J. (1984)Classification and regression trees， California:Wadsworth ；Breiman,L.，Random ForestsiMachine Learning，45(2001) 5-32 ； Pepe，M. S.，The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series，28 (2003)；及 Duda，R. 0.，Hart，P. E.， Stork，D. G.，Pattern Classification，Wiley Interscience，第 2 片反(2001)。本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案是使用關(guān)于生物標(biāo)志物的潛在組合的優(yōu)化的多變量截留，以及辨別狀態(tài)A與狀態(tài)B，例如患病與健康。在此類型的分析中，標(biāo)志物不再是獨(dú)立的， 而是形成標(biāo)志物組。通過(guò)診斷方法的接受者運(yùn)行特征(ROC)最好地描述了診斷方法的精確性(特別參見(jiàn) Zweig，M. H.和 Campbell，G.，Clin. Chem. 39 (1993) 561-577)。ROC 圖是在所觀察數(shù)據(jù)的整個(gè)范圍里連續(xù)改變判斷閾值產(chǎn)生的所有的靈敏性/特異性對(duì)的圖。實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的臨床性能取決于它的診斷精確性，或正確地將受試者分類到臨床上相關(guān)的亞群中的能力。診斷精確性衡量了所述測(cè)試正確地區(qū)分所調(diào)查受試者的兩種不同狀況的能力。此類狀況例如健康和患病，或者良性對(duì)惡性疾病。
在每種情況中，通過(guò)在判定閾值的完整范圍上標(biāo)繪出靈敏性對(duì)1-特異性，ROC圖描繪了兩種分布之間的重疊。在y_軸上是靈敏性，或者真陽(yáng)性分?jǐn)?shù)[定義為(真陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果的數(shù)目)/(真陽(yáng)性的數(shù)目+假陰性測(cè)試結(jié)果的數(shù)目)]。這也被稱為存在疾病或狀況的陽(yáng)性。它單獨(dú)地從受影響的亞群中計(jì)算。在χ-軸上是假陽(yáng)性分?jǐn)?shù)，或1-特異性[定義為 (假陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)目)/(真陰性的數(shù)目+假陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)目)]。它是特異性的指數(shù)，并且完全從未受影響的亞群中計(jì)算。因?yàn)槭褂脕?lái)自兩個(gè)不同亞群的測(cè)試結(jié)果完全分開(kāi)地計(jì)算真陽(yáng)性和假陽(yáng)性分?jǐn)?shù)，ROC圖獨(dú)立于樣品中的疾病患病率。在ROC圖上的每個(gè)點(diǎn)代表了對(duì)應(yīng)于特定的判斷閾值的靈敏性/1-特異性對(duì)。具有理想辨別力(在結(jié)果的兩個(gè)分布中沒(méi)有重疊)的測(cè)試具有穿過(guò)左上角的ROC圖，那里真陽(yáng)性分?jǐn)?shù)是1. 0，或100% (理想的靈敏性)， 而假陽(yáng)性分?jǐn)?shù)是0(理想的特異性)。沒(méi)有辨別力的測(cè)試的理論圖(兩個(gè)組的結(jié)果分布相同)是從左下角到右上角的45°對(duì)角線。大多數(shù)圖落入這兩個(gè)極端之間。(如果ROC圖完全落入45°對(duì)角線以下，這容易通過(guò)將“陽(yáng)性”的標(biāo)準(zhǔn)從“大于”轉(zhuǎn)換成“小于”來(lái)補(bǔ)救，或者反之亦然。)定性地，圖越靠近左上角，測(cè)試的總體精確度越高。量化實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的診斷精確性的一個(gè)優(yōu)選的方式是通過(guò)單個(gè)數(shù)值表示它的性能。 例如，此類總體參數(shù)是所謂的“總誤差”或備選地“曲線下面積=AUC”。最常見(jiàn)的全局度量是ROC圖下的面積。按照慣例，這個(gè)面積永遠(yuǎn)大于等于0. 5 (如果不是，可以反轉(zhuǎn)判斷規(guī)則使它如此)。數(shù)值范圍為1. 0 (兩個(gè)組的測(cè)試值的理想分離)和0. 5 (在測(cè)試值的兩個(gè)組之間沒(méi)有明顯的分布差異)之間。該面積不僅取決于圖的特定部分，諸如最靠近對(duì)角線的點(diǎn)或在90%特異性下的靈敏性，還取決于整個(gè)圖。這是ROC圖多么接近理想的圖(面積=1.0) 的定量的、描述性的表述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及改善相對(duì)于健康對(duì)照的LC診斷精確度的方法，其通過(guò)分別測(cè)量樣品中至少CYBP和CYFRA 21-1的濃度，以及任選地CEA、proGRP、 NSEdP /或SCC的濃度，并且將測(cè)定到的濃度與LC的存在或不存在相關(guān)聯(lián)，與基于任何單獨(dú)調(diào)查的單一標(biāo)志物的分類法相比，所述改善使得更多的患者被正確地分類為患有LC對(duì)健康對(duì)照。在依照本發(fā)明的優(yōu)選的方法中，分別至少測(cè)定生物標(biāo)志物CYBP和CYFRA 21-1的濃度，并在LC的評(píng)估中使用標(biāo)志物組合。在依照本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，分別至少測(cè)定生物標(biāo)志物CYBP和CEA的濃度，并在LC的評(píng)估中使用標(biāo)志物組合。在依照本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，分別至少測(cè)定生物標(biāo)志物CYBP、CYFRA21_1 和CEA的濃度，并在LC的評(píng)估中使用標(biāo)志物組合。在依照本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，分別至少測(cè)定生物標(biāo)志物CYBP、CYFRA21_1 和proGRP的濃度，并在LC的評(píng)估中使用標(biāo)志物組合。在依照本發(fā)明的再進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，分別至少測(cè)定生物標(biāo)志物CYBP、 CYFRA21-1和SCC的濃度，并在LC的評(píng)估中使用標(biāo)志物組合。提供以下的實(shí)施例和附圖
來(lái)幫助理解本發(fā)明，它們的真實(shí)范圍在所附權(quán)利要求書中列出。應(yīng)當(dāng)理解的是，可以在不背離本發(fā)明的精神的前提下在所列的規(guī)程中進(jìn)行修改。
實(shí)施例
實(shí)施例1針對(duì)肺癌標(biāo)志物蛋白質(zhì)CYBP的抗體的生成生成針對(duì)肺癌標(biāo)志物蛋白質(zhì)CYBP的多克隆抗體制備物以通過(guò)免疫檢測(cè)測(cè)定法， 例如Wfestern印跡和ELISA在測(cè)量CYBP的血清和血漿和血液水平中進(jìn)一步使用抗體。在大腸桿菌中的重組蛋白表達(dá)為了生成針對(duì)CYBP的抗體，在大腸桿菌中生成重組抗原因此，使用合適的正向和反向引物自編碼如SEQ ID N0:1中所規(guī)定的227個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)CYBP-cDNA克隆PCR擴(kuò)增CTBP編碼區(qū)。正向引物的特征在于(除EcoRI克隆和核糖體結(jié)合位點(diǎn)外)以符合讀碼框的方式引入CYBP多肽的編碼N端MRGSHHHHHHIEGR肽延伸物(SEQ ID NO 2)的寡核苷酸。將經(jīng) EcoRI/BamHI消化的PCR片段連接到相應(yīng)的pQE-30(Qiagen，Hilden，Germany)載體片段中， 隨后將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XLl-blue感受態(tài)細(xì)胞中。在序列分析后，遵循制造商的指令將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中以在pQE載體系列的IPTG誘導(dǎo)型T5啟動(dòng)子下表達(dá)。對(duì)于MRGSHHHHHHIEGR-CYBP融合蛋白的純化，通過(guò)離心來(lái)將11過(guò)夜誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物成團(tuán)粒，并將細(xì)胞團(tuán)粒在20mM磷酸鈉緩沖液、500mM氯化鈉，pH 7. 4 (其含有l(wèi)mg/ml溶菌酶和Complete 無(wú)EDTA蛋白酶抑制劑片劑)中重懸浮。通過(guò)超聲波處理來(lái)破壞細(xì)胞， 通過(guò)離心來(lái)使不溶性材料成團(tuán)粒，并將上清液應(yīng)用于Ni-次氮基三乙酸(Ni-NTA)金屬-親和層析用數(shù)個(gè)床體積的裂解緩沖液清洗該柱，接著用20mM磷酸鈉緩沖液、500mM氯化鈉、 20mM咪唑，pH 7. 4清洗。最后，用20mM磷酸鈉緩沖液、500mM氯化鈉，pH 7. 4中的20至 500mM的咪唑梯度洗脫結(jié)合的抗原，并將其在75mM HEPES-緩沖液，pH 7. 5，IOOmM氯化鈉、 ImM EDTA、6. 5%蔗糖中于4°C貯存。多克隆抗體的生成a)免疫對(duì)于免疫，制備1 1比率的蛋白質(zhì)溶液(100μ g/ml蛋白質(zhì)CYBP)和完全弗氏佐劑的新鮮乳狀液。在第1天、第7天、第14天和第30天、第60天和第90天用Iml乳狀液免疫每只兔。抽取血液，并使用所得的抗CYBP血清，如下文所描述的。b)通過(guò)用辛酸和硫酸銨的序貫沉淀來(lái)從兔血清純化IgG (免疫球蛋白G)用4個(gè)體積的乙酸鹽緩沖液(60mM，pH 4. 0)來(lái)稀釋1個(gè)體積的兔血清。用2M Tris-堿來(lái)將pH調(diào)節(jié)至4. 5。在有力攪拌下逐滴添加辛酸(25 μ 1/ml稀釋的樣品)。在 30分鐘后，將樣品離心(13 OOOx g，30分鐘，4°C)，棄去團(tuán)粒，并收集上清液。通過(guò)添加2M Tris-堿來(lái)將上清液的pH調(diào)節(jié)至7. 5。在有力攪拌下通過(guò)逐滴添加4M硫酸銨溶液至終濃度2M來(lái)使上清液中的免疫球蛋白沉淀。通過(guò)離心(8000x g，15分鐘，4°C)來(lái)收集沉淀的免疫球蛋白。棄去上清液。將團(tuán)粒在IOmM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl中溶解，并徹底透析。將透析液離心(13000x g，15分鐘，4°C )，并過(guò)濾(0. 2 μ m)。c)多克隆兔IgG的生物素化使多克隆兔IgG在 IOmM NaH2P04/Na0H,pH 7. 5,30mM NaCl 中達(dá)到 10mg/ml。每ml IgG溶液添加50 μ 1生物素-N-羥基琥珀酰亞胺(DMS0中的3. 6mg/ml)。在于室溫30分鐘后，將樣品在 Superdex 200 (IOmM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl)上層析。收集含有生
14物素化的IgG的級(jí)分。d)多克隆兔IgG的洋地黃毒苷綴合使多克隆兔IgG 在 IOmM NaH2P04/Na0H, 30mM NaCl, pH 7. 5 中達(dá)到 10mg/ml。每 ml IgG溶液添加50 μ 1洋地黃毒苷-3-0-甲基羰基-ε -氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Ληππ g^lle1333054) (DMS0 巾白勺 3. 8mg/ml)。 在于室溫 3O 分鐘后，將樣品在 Superdex 200(10mM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl)上層析。收集含有洋地黃毒苷化的IgG的級(jí)分。實(shí)施例2測(cè)量人血清和血漿樣品中的CYBP的ELISA對(duì)于檢測(cè)人血清或血漿中的CYBP，開(kāi)發(fā)出三明治式ELISA。為了捕捉抗原，將抗 CYBP多克隆抗體(參見(jiàn)實(shí)施例1)與生物素綴合，并固定化于經(jīng)鏈霉親合素包被的表面上， 并且為了檢測(cè)抗原，將抗CYBP多克隆抗體與洋地黃毒苷綴合。將經(jīng)鏈霉親合素包被的微量滴定板與每孔100 μ 1生物素化的抗CYBP多克隆抗體 (1 μ g/ml)于室溫一起溫育10分鐘。隨后，用PBS、0. 05% Tween 20將平板清洗三次。然后，將孔與作為標(biāo)準(zhǔn)抗原的連續(xù)稀釋的重組蛋白(參見(jiàn)實(shí)施例1)或與來(lái)自患者的稀釋的 EDTA-血漿樣品及5 μ g/ml綴合有洋地黃毒苷的抗CYBP多克隆抗體一起溫育2小時(shí)。溫育在溫育緩沖液(包含0. Tween 20,1% BSA的PBQ中進(jìn)行。此后，將平板清洗三次以除去未結(jié)合的成分。在下一步中，將孔與20mU/ml抗生物素-洋地黃毒苷_過(guò)氧化物酶綴合物一起溫育60分鐘。隨后，用相同的緩沖液將平板清洗三次。為了檢測(cè)結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物，將孔與200 μ 1 TMB (四甲基聯(lián)苯胺)溶液(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany，產(chǎn)品目錄編號(hào)120 344 25 001) —起溫育15分鐘，通過(guò)添加50 μ 1 IN硫酸來(lái)停止，并用ELISA讀板儀以450nm(以620nm為參照波長(zhǎng))測(cè)量0D。實(shí)施例3研究群體使用自60名充分表征的NSCLC患者(30名腺-CA，30名鱗狀細(xì)胞CA)衍生的樣品。評(píng)估LC樣品中的CYBP、CEA和CYFRA21-1的水平。表1中顯示了結(jié)果表1:
權(quán)利要求
1.一種在體外評(píng)估肺癌的方法，包括測(cè)量樣品中以下的濃度(a)選自體液的樣品中的CYBP，(b)任選地一種或多種其它肺癌標(biāo)志物，及(c)在肺癌的評(píng)估中使用步驟(a)和任選地步驟(b)的測(cè)量結(jié)果，其中CYBP的檢出指示肺癌。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種其它標(biāo)志物選自下組CYFRA21-1、 CEA、NSE、proGRP 和 SCC。
3.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或多種其它標(biāo)志物是CYFRA21-1。
4.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或多種其它標(biāo)志物是CEA。
5.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或多種其它標(biāo)志物是SCC。
6.CYBP在選自體液和/或組織提取物的樣品中體外評(píng)估肺癌中的用途，其中CYBP的檢出指示肺癌。
7.包含CYBP和一種或多種其它肺癌標(biāo)志物的標(biāo)志物組在選自組織提取物和體液的樣品中體外評(píng)估肺癌中的用途，其中CYBP的檢出指示肺癌。
8.依照權(quán)利要求7的標(biāo)志物組的用途，其中所述一種或多種其它標(biāo)志物選自下組 CYFRA 21-1、CEA、NSEJP SCC。
9.依照權(quán)利要求8的標(biāo)志物組的用途，所述標(biāo)志物組至少包含CYBP和CYFRA21-1。
10.依照權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法或依照權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)的用途，其中所述體液是血漿。
11.一種用于實(shí)施依照權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法的試劑盒，其包含特異性測(cè)量 CYBP和一種或多種其它肺癌標(biāo)志物所需要的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及肺癌的評(píng)估。它公開(kāi)了蛋白CYBP在肺癌評(píng)估中的用途。它還涉及使用自個(gè)體衍生的液體樣品在體外評(píng)估肺癌的方法，其通過(guò)測(cè)量所述樣品中的CYBP來(lái)進(jìn)行。CYBP的測(cè)量可以例如用于肺癌患者的早期檢測(cè)或隨訪。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102439455SQ201080018804
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者H.安德列斯, J.克洛伊克納, J.卡爾, M.塔克, M.希爾羅爾夫, M.羅伊斯勒 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司