專利名稱：人皮膚外植體培養(yǎng)系統(tǒng)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人皮膚外植體培養(yǎng)系統(tǒng)以及使用所述系統(tǒng)測試組合物對皮膚代謝活性的作用。
背景技術(shù)：
體外模型系統(tǒng)一直是基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的重要構(gòu)成部分。由于最新的歐盟法規(guī)禁止使用動物測試化妝品成分，因此為皮膚建立此類模型系統(tǒng)越發(fā)重要。人皮膚外植體已在培養(yǎng)條件下研究50多年，主要研究領(lǐng)域為表皮生物學(xué)和上皮癌研究。然而，這些模型系統(tǒng)主要針對表皮活性，無法重現(xiàn)真皮層和脂肪層的代謝活性以及組織結(jié)構(gòu)。論文"Repair of UVA-Induced Elastic Fiber and Collagen Damage by 0. 05% Retinaldehyde Cream in an ex vivo Human Skin Model，，(在體夕卜人皮膚模型中使用0. 05%視黃醛霜劑修復(fù)UVA誘導(dǎo)的彈性纖維和膠原損傷)(由S. Boisnic等人提交于1998年10月7日在第七屆歐洲皮膚性病學(xué)會年會(Nice，F(xiàn)rance)召開的衛(wèi)星研討會的、題名為"New Concepts for Topical Use of Natural Retinoids, Retinaldehyde in Perspective^ (天然類視色素、視黃醛局部用藥前景的新概念)的論文集(編輯J. "H. Saurat, Geneva, Switzerland ；A. Vahlquist，Uppsala，Sweden))討論了視黃酸對皮膚夕卜植體培養(yǎng)物中的膠原的作用。最近發(fā)表的論文"Effectof Green Coffea Arabica L. Seed Oil on Extracellular Matrix Components and Water-channel Expression in in vitro and ex vivo Human Skin Models，，(Journal of Cosmetic Dermatology, 2009 Mar ；8 (1) :56_62, Velazquez Pereda Mdel C et al.)(綠咖啡豆種子油對體內(nèi)和體外人皮膚模型中細胞外基質(zhì)組分和水通道蛋白表達的作用(《美容皮膚病學(xué)雜志》，2009年3月；第8卷第1期，第 56-62頁，Velazquez Pereda Mdel C等人))的作者沒能說明在外植體培養(yǎng)物中起到的作用。因此，他們用人皮膚組織切片與其受試試劑共同溫育，再進行免疫染色，以證實在合成膠原、彈性蛋白和其他細胞外基質(zhì)組分時的刺激作用。不管這些論文的教導(dǎo)內(nèi)容如何，一直需要這樣的人皮膚外植體模型系統(tǒng)其最能代表所有皮膚區(qū)室的生理復(fù)雜性、代謝活性和結(jié)構(gòu)完整性。還需要增加所培養(yǎng)的活檢組織的表面積，以便能夠研究試劑和組合物的局部施用。直徑4mm的標準活檢組織大小不支持此類研究?！癆 Human Full-Skin Culture System for Interventional Studies，，(Eplast. 2009 ;9 :e5. Published online 2009 January 9，by Lars Steinstraesser et al.)(用于干預(yù)性研究的人全層皮膚培養(yǎng)系統(tǒng)(Eplast. 2009 ；第9卷第e5頁，由Lars Steinstraesser等人于2009年1月9日網(wǎng)上發(fā)表))描述了較大皮膚活檢組織的培養(yǎng)并證實皮膚外植體的組織學(xué)特性保留了 4周。然而， 在該外植體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因表達模式研究中，卻發(fā)現(xiàn)并不與體內(nèi)觀察到的代謝活性類似。一直需要這樣的人皮膚外植體模型系統(tǒng)其最能代表所有皮膚區(qū)室的生理復(fù)雜性、代謝活性和結(jié)構(gòu)完整性，并且具有足夠的表面積以便能夠用受試試劑和組合物進行局部處理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及人皮膚外植體培養(yǎng)系統(tǒng)，所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含置于特定培養(yǎng)基中的直徑高達約25mm的人皮膚活檢組織，所述培養(yǎng)基包含約40體積％至約60體積％的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基、約40體積％至約60體積％的F-12營養(yǎng)混合物、約0. 5重量％至約5 重量％的胎牛血清、1至20 μ g/ml的胰島素、1至20ng/ml的氫化可的松、1至20ng/ml的表皮生長因子以及IX抗生素-抗真菌溶液。本發(fā)明還提供了一種用于確定組合物在局部施用到皮膚時的作用的方法，所述方法包括將直徑高達約25mm的皮膚活檢組織培養(yǎng)在特定培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基包含約40 體積％至約60體積％的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基、約40體積％至約60體積％的？-12 營養(yǎng)混合物、約0. 5重量％至約5重量％的胎牛血清、1至20 μ g/ml的胰島素、1至20ng/ml 的氫化可的松、1至20ng/ml的表皮生長因子以及IX抗生素_抗真菌溶液，從而建立皮膚外植體培養(yǎng)系統(tǒng)；將組合物局部施用到皮膚活檢組織；以及分析皮膚活檢組織對組合物的生物學(xué)響應(yīng)。在另一個實施例中，將組合物或受試試劑施用到上述培養(yǎng)基中，以便將組合物對不同皮膚區(qū)室的生物學(xué)作用與局部遞送的作用區(qū)分開。
具體實施例方式本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)用于延長皮膚外植體的存活期并且用于確保全層皮膚外植體都有代謝活性，進而能夠?qū)植渴┯玫慕M合物的作用進行研究。通常，皮膚外植體采用的形式為尺寸為直徑2_4mm的皮膚活檢組織，因為在標準培養(yǎng)條件下更大的外植體在組織中心會發(fā)生壞死。然而，具有此類小尺寸的皮膚外植體不適合局部施用?，F(xiàn)已鑒定了用以支持更大的人皮膚外植體的完整性的最佳培養(yǎng)基，從而使局部施用的皮膚學(xué)活性的評估得以實現(xiàn)。培養(yǎng)系統(tǒng)包含培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含具有高蔗糖含量的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(“DMEM”)。達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基可以達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(D-MEM) (IX)，液體(高糖)/ 目錄號11965 (Dulbecco' s Modified Eagle Medium(D-MEM) (IX), liquid (high glucose)/cat# : 11965)得自例如 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)。DMEM的含量可在培養(yǎng)基的約40至約60體積％的范圍內(nèi)，例如約50體積％。培養(yǎng)基還包含F(xiàn)-12營養(yǎng)混合物(“F-12”)。F_12營養(yǎng)混合物可以F_12營養(yǎng)混合物(Ham) (IX)，液體 12/ 目錄號:11765(F_12 Nutrient Mixture (Ham) (IX)，liquidl2/ cat# : 11765)得自例如 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)。F-12營養(yǎng)混合物的含量可在培養(yǎng)基的約40至約60體積％的范圍內(nèi)，例如約50體
5積％。培養(yǎng)基還包含牛血清，例如胎牛血清。牛血清可以胎牛血清，合格，熱滅活/目錄 10082-139(Fetal Bovine Serum，Certified，Heat-Inactivated/ciitft 10082—139)得
自例如 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)。牛血清的含量可在培養(yǎng)基的約0. 5至約5重量％的范圍內(nèi)，例如約2重量％。培養(yǎng)基補充有胰島素、氫化可的松、表皮生長因子(“EGF”)和抗生素-抗真菌溶液(“ABAM”)。胰島素的含量可在1至20μ g/ml的范圍內(nèi)，例如10μ g/ml。胰島素可以人胰島素溶液 / 目錄號19278 (insulin solution human/cat# 19278)得自例如 Sigma (St. Louis, MO, USA)。氫化可的松的含量可在1至20ng/ml的范圍內(nèi)，例如lOng/ml。氫化可的松可以氫 ^nT Ι Y _畐身寸 / 巨 :H0135 (hydrocortisone powder, γ—irradiated/cEitft : H0135)得自例如 Sigma (St. Louis, M0, USA)。表皮生長因子的含量可在1至20ng/ml的范圍內(nèi)，例如lOng/ml。表皮生長因子可以重組人表皮生長因子(EGF)/目錄號PHG0311 (Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) /cat# :PHG0311)得自例如 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)?？股豞抗真菌溶液的含量為IX。抗生素-抗真菌溶液可以抗生素-抗真菌溶液(100X)，液體 / 目錄號 15240-062 (Antibiotic-Antimycotic (100X)，liquid/Cat. No. 15240-062)得自例如 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)。將高達約25mm直徑(例如約2至約25mm、或約4至約25mm，或在某些實施例中， 約12mm直徑)的人皮膚外植體置于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基液面應(yīng)與外植體高度相當。在一個實施例中，將外植體在約32°C至約37°C下溫育，例如在約32°C下溫育。意外地發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)溫度從37°C (標準溫度)降低至約32°C，可使外植體存活更久并且提高了其完整性和代謝活性。還意外地發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的首個24小時內(nèi)將培養(yǎng)溫度從37°C (標準溫度)降低至約32°C，然后再將外植體培養(yǎng)于37°C，也可使外植體存活更久并且提高了其完整性和代謝活性。在另一個實施例中，胎牛血清的含量從5%降低至2%。這也可使所培養(yǎng)的外植體存活更久，并且提高了其組織完整性和代謝活性。在另一個實施例中，將外植體在含有5體積％的CO2的標準濕潤氣氛中溫育。每天更換培養(yǎng)基。也就是說，去除并更換培養(yǎng)基和營養(yǎng)物質(zhì)。 本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基可確保組織存活性。如本文所用，“可確保組織存活性”是指可保證組織在培養(yǎng)過程中存活并防止可導(dǎo)致細胞和組織死亡的組織損傷，例如防止組織壞死?？赏ㄟ^對組織學(xué)染色的組織切片進行組織學(xué)分析并說明組織結(jié)構(gòu)完好且正常，來證實組織存活性。也可通過分析已知對細胞存活性至關(guān)重要的基因的基因表達，來測定組織存活性。這些基因包括但不限于定義為“管家基因”的一組基因。管家基因通常為組成性基因， 它們在許多或所有已知條件下都以相對恒定的水平轉(zhuǎn)錄。通常需要管家基因的產(chǎn)物來維持細胞。一般認為無毒試劑的局部處理不會影響管家基因的表達。管家基因的例子包括但不限于肌動蛋白、GAPDH、18S RNA和泛素。也可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法測定組織存活性。本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)使得研究組合物在局部施用到皮膚時的作用得以實現(xiàn)?？蓽y定皮膚外植體在分子、細胞和/或生理水平上對受試組合物的響應(yīng)?？赏ㄟ^組織學(xué)、分子分析、生物標記物分析等方法分析皮膚外植體。具體地講，本發(fā)明使在皮膚外植體所有區(qū)室內(nèi)的代謝活性水平更高，更類似于體內(nèi)皮膚的代謝活性?？墒褂酶鶕?jù)本發(fā)明培養(yǎng)的外植體測定皮膚三個區(qū)室的代謝活性。如本文所用，“代謝活性”是指活性基因表達、或基因產(chǎn)物合成、或蛋白質(zhì)(例如酶)活性以及終產(chǎn)物的生成，這種活性為這些組織區(qū)室所專有，但不是決定組織存活性的唯一因素。在一個實施例中，通過組織特異性基因的基因表達來分析根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的外植體的代謝活性。對于皮膚的表皮區(qū)室，此類基因包括但不限于角質(zhì)細胞表達的基因，例如特定角蛋白(如角蛋白5、14、1和10)、PAR-2、或KGFR，以及黑素細胞特異性基因，例如酪氨酸酶、 TRP-I和TRP-2及其他黑素生成基因。對于皮膚的真皮區(qū)室，此類基因包括但不限于彈性蛋白、彈性蛋白輔助蛋白(例如微纖維蛋白-1和扣針蛋白-5)和膠原(例如膠原1 α 1和膠原4)。對于皮膚的脂肪層，此類基因包括但不限于生脂基因(例如PPAR-Y、瘦素、 GLUT4、FABP4、AdPLAjn Pref-I)和脂解基因(例如PPAR-α、酰基CoA脫氫酶、磷酸二酯酶、 CPT肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶和GPR81)。在本發(fā)明的另一個實施例中，通過對根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的外植體的組織切片進行組織學(xué)或免疫組織化學(xué)染色，來分析皮膚的真皮層的代謝活性。此類染色的例子包括但不限于展現(xiàn)高彈性蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)的Lima彈性蛋白染色、或展現(xiàn)新膠原合成情況的前膠原免疫組織化學(xué)染色。在另一個實施例中，通過分析分泌到根據(jù)本發(fā)明外植體的培養(yǎng)基中的參與脂質(zhì)代謝的分子，來測定這些外植體的脂肪層的代謝活性。此類分子的例子包括但不限于分泌蛋白(例如瘦素)和脂質(zhì)分子分泌物(例如甘油和非酯化脂肪酸)。除非另有規(guī)定，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的相同含義。除非另外指明，否則無論何時使用的任何百分比均為重量 / 重量(w/w) ο以下說明了本發(fā)明的實例。不應(yīng)將本發(fā)明理解為受到其細節(jié)的限制。實例 1在得到知情同意后，從接受整形手術(shù)的健康個體獲得人腹部皮膚。依照US HIPAA法規(guī)的規(guī)定，未公開患者身份以保護保密權(quán)。首先用補充有青霉素/鏈霉素(200 單位/ml青霉素、200yg/ml鏈霉素)、兩性霉素B(5yg/ml)和慶大霉素(20 μ g/ml)的 DMEM在室溫下對鉆取活檢組織(直徑為4和12mm)消毒30分鐘，所有這些試劑均得自 Invitrogen(Carlsbad CA)。將外植體置于表1中列出的不同培養(yǎng)基中，其中補充有抗生素和表2中所列的生長因子混合物，再放置在37°C加濕室中，使之處于5% CO2氣氛下。每天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基A-G為對比物。培養(yǎng)基1根據(jù)本發(fā)明配制。
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表1-所Illi式的培養(yǎng)某(除非另外指明，否_所有材料均_自Invitrogen)
權(quán)利要求
1.一種人皮膚外植體培養(yǎng)系統(tǒng)，所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含置于培養(yǎng)基中的直徑高達約25mm 的人皮膚活檢組織，所述培養(yǎng)基包含約40體積％至約60體積％的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基； 約40體積％至約60體積％的F-12營養(yǎng)混合物； 約0. 5重量％至約5重量％的胎牛血清；1至20 μ g/ml的胰島素；1至20ng/ml的氫化可的松；1至20ng/ml的表皮生長因子； 以及IX抗生素-抗真菌溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)系統(tǒng)，包含約50體積％的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基，約50體積％的F-12營養(yǎng)混合物以及約2重量％的胎牛血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)系統(tǒng)，包含約lOng/ml的表皮生長因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)系統(tǒng)，在約32°C至約37°C下溫育。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)系統(tǒng)，在約32°C下溫育。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)系統(tǒng)，在約32°C下溫育24小時后再在約37°C下溫育。
7.一種測定組合物在局部施用到皮膚時的作用的方法，包括 將直徑高達約25mm的皮膚活檢組織培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基包含 約40體積％至約60體積％的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基；約40體積％至約60體積％的F-12營養(yǎng)混合物； 約0. 5重量％至約5重量％的胎牛血清；IM 20 μ g/ml的胰島素；1至20ng/ml的氫化可的松1至20ng/ml的表皮生長因子； 以及IX抗生素-抗真菌溶液， 從而構(gòu)建皮膚外植體培養(yǎng)系統(tǒng)； 將所述組合物局部施用到所述皮膚活檢組織上；以及分析所述皮膚活檢組織對所述組合物的生物學(xué)響應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含約lOng/ml的表皮生長因子。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述培養(yǎng)系統(tǒng)在約32°C下溫育。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述培養(yǎng)系統(tǒng)在約32°C至約37°C下溫育。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述培養(yǎng)系統(tǒng)在約32°C下溫育24小時后再在約 37 °C下溫育。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述分析步驟為真皮分析，所述真皮分析包括通過選自以下的方法監(jiān)測彈性蛋白纖維生成LUNA染色；對彈性蛋白或彈性蛋白輔助蛋白的基因進行的QPCR或轉(zhuǎn)錄分析；對彈性蛋白或彈性蛋白輔助蛋白的基因進行的蛋白檢測；組織學(xué)染色；以及免疫組織化學(xué)染色。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述分析步驟為真皮分析，所述真皮分析包括通過選自以下的方法監(jiān)測膠原合成不同膠原基因的轉(zhuǎn)錄；不同膠原蛋白的蛋白檢測；組織學(xué)染色；以及免疫組織化學(xué)染色。
14.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述分析步驟為皮膚脂肪層的分析，所述分析包括用脂肪細胞分化試劑處理后對甘油三酯含量進行生化分析以監(jiān)測脂肪生成。
15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述分析步驟為皮膚脂肪層的分析，所述分析包括在使用促脂肪生成試劑后測定游離甘油的釋放以證實脂肪分解。
16.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述分析步驟為皮膚脂肪層的分析，所述分析包括通過選自以下的方法監(jiān)測瘦素代謝所述瘦素基因的轉(zhuǎn)錄；分泌瘦素的蛋白檢測；以及免疫組織化學(xué)染色。
全文摘要
本發(fā)明涉及人皮膚外植體培養(yǎng)系統(tǒng)及其用途。
文檔編號G01N33/50GK102482642SQ201080038259
公開日2012年5月30日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者A·帕帕斯, C·B·林, M·塞伯格, N·陳, Y·胡 申請人:強生消費者公司