專利名稱：在纖維素材料水解中分析纖維素衰變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的分析、篩選和/或衡量感興趣的酶、多肽、酶混合物、多肽混合物和/ 或酶和多肽的混合物的方法。本發(fā)明可用于檢測殘余的纖維素和衡量感興趣的酶、多肽或混合物的水解活性，等等。本公開進一步涉及高通量測定法，例如，公開了用于定量感興趣的酶或多肽在經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(PCQ水解中的纖維素分解活性和/或纖維素酶活性的高通量測定法。
背景技術(shù)：
目前分析、衡量或篩選感興趣的酶、多肽或混合物的方法存在問題，且并不非常適于高通量分析。例如，一種分析經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(下文中稱作“PCS”)水解的方法需要冗長的高壓液相色譜(下文中稱作“HPLC”)分析以確定糖的量。其中，PCS中的纖維素經(jīng)酶法水解為葡萄糖、纖維二糖和更高級的葡聚糖。使用HPLC測量葡萄糖和纖維二糖。 本領(lǐng)域技術(shù)人員，已知底物的纖維素含量，可然后使用該信息計算纖維素至糖的轉(zhuǎn)化百分比。因此，可測量水解中的酶的纖維素分解活性。然而HPLC步驟費時費力。使用HPLC的測定法不適于高通量分析，和/或在單一測定中快速分析多個感興趣的酶。
已進行了使用加載于深孔板中的可移液的底物來改善HPLC測定法的嘗試；然而， 仍然需要水解之后的HPLC糖分析。HPLC測定耗費時間，例如，96孔板需要大約19小時的 HPLC時間。嘗試的改善充滿問題，因為其在HPLC之前包括耗時的過濾、移液和稀釋步驟。
已知測定法中存在的問題導(dǎo)致更高的研究成本，枯燥的測定法格式化(assay formatting)，以及耗時的酶活性衡量。因此，存在對具有改善的準確度和/或減少的操作時間，具有優(yōu)異的準確性，優(yōu)異的反應(yīng)速率和/或優(yōu)異的纖維素轉(zhuǎn)化率(特別是當需要高通量分析時)的測定法和分析方法的持續(xù)需要。發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)將指示劑成分(indicator constituent)或增亮添加劑(brightening additive)如熒光指示劑化合物和/或增強劑添加至水解反應(yīng)，對篩選和/或衡量感興趣的酶、多肽和混合物在含有纖維素材料的水解反應(yīng)中的性能具有顯著的作用。例如，添加熒光指示劑化合物可用于檢測殘余的纖維素并衡量感興趣的酶或酶混合物的水解活性。因此，現(xiàn)已可能在指示劑成分如熒光指示劑提供的益處下進行感興趣的酶和/或多肽的化學(xué)測定。此外，現(xiàn)已可能在減少的時間中進行高通量測定。而且，現(xiàn)已可能以高通量形式檢測出殘余的纖維素并衡量感興趣的酶、多肽或混合物的水解活性。這些方法亦可用于發(fā)現(xiàn)具有改善的性能特征的感興趣的酶或感興趣的多肽和/或?qū)χ圃斐龅拿?、肽或多肽的質(zhì)量控制。在實施方案中，這些方法消除了 HPLC的使用，并且因為避免通常冗長的HPLC測定法而更快速。
本公開的第一個方面涉及分析纖維素材料的水解如木素纖維素水解中的纖維素衰變的方法。本公開的第二個方面涉及確定感興趣的酶或感興趣的多肽是否影響纖維素水解的方法。本公開的第三個方面涉及分析感興趣的酶或多肽的高通量方法。本公開的第四個方面涉及分析酶或多肽性能的方法。本公開的第五個方面涉及用于衡量酶和/或多肽性能的系統(tǒng)。本公開的第六個方面涉及確定感興趣的多肽是否具有纖維素分解增強活性的方法。本公開的第七個方面涉及用于如上所述本公開的諸方面的標準化方法。本公開的第八個方面涉及質(zhì)量控制方法。例如，可在產(chǎn)生一個或多個批次的多肽或酶之后由生產(chǎn)商檢查質(zhì)量控制參數(shù)如酶活性、纖維素酶活性、纖維素分解增強活性和/ 或穩(wěn)定性。此外，質(zhì)量控制參數(shù)如多肽活性、酶活性、纖維素酶活性、纖維素分解增強活性和 /或穩(wěn)定性可由酶或多肽的購買者檢查。本公開的目標通過提供分析纖維素材料(例如木素纖維素)水解中纖維素的衰變的方法來實現(xiàn)，所述方法包括在含有指示劑成分的反應(yīng)介質(zhì)中在指示劑成分會使得纖維素染色的條件下水解含纖維素的纖維素材料；和檢測來自所述指示劑成分的信號，其中所述信號的強度指示由酶水解的纖維素的量。在實施方案中，所述方法在水解步驟之前包括 (a)將纖維素材料(如木素纖維素材料)與指示劑成分相接觸以形成混合物；和(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸。本公開的目標通過提供分析纖維素材料(例如木素纖維素)水解中纖維素衰變的方法來實現(xiàn)，所述方法包括下述步驟(a)將纖維素材料(例如木素纖維素)與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在指示劑成分如熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解含有纖維素的纖維素材料(例如木素纖維素)；和(d)檢測來自所述指示劑成分的信號，其中所述信號的強度指示由酶水解的纖維素的量。在實施方案中，所述指示劑成分是熒光指示劑化合物包括苯和聯(lián)苯的苯乙烯基衍生物，芪(stilbene)衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2_羥喹啉 (carbostyrils)或其混合物。本公開的目標還通過提供確定感興趣的酶和/或感興趣的多肽是否影響纖維素水解的方法來實現(xiàn)，所述方法包括下述步驟在含有指示劑成分的反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分或熒光指示劑化合物會影響纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解纖維素材料；和確定水解反應(yīng)物(hydrolyzed reaction)是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶和/或多肽的纖維素酶活性，和/或由所述感興趣的酶水解的纖維素的量。在實施方案中，所述方法在水解之前包括下述步驟(a)將纖維素材料與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；和(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與適于纖維素水解的含有感興趣的酶和/或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸。本公開的目標還通過提供確定感興趣的酶和/或感興趣的多肽是否影響纖維素水解的方法來實現(xiàn)，所述方法包括下述步驟(a)將纖維素材料與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與適于纖維素水解的含有感興趣的酶和/或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分或熒光指示劑化合物會影響纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解纖維素材料；和(d)確定水解反應(yīng)物是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶和/或多肽的纖維素分解活性，和/或由所述感興趣的酶水解的纖維素的量。在實施方案中，所述光信號指示感興趣的多肽的纖維素分解活性和/或纖維素分解增強活性。
本公開的目標還通過提供分析感興趣的酶和/或感興趣的多肽的高通量方法來實現(xiàn)，包括下述步驟(a)將生物質(zhì)與指示劑成分如熒光化合物相接觸以形成混合物；(b) 在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/或感興趣的多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分如熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解所述含有纖維素的生物質(zhì)；和(d)檢測來自所述指示劑成分例如熒光指示劑化合物的信號，其中信號強度預(yù)示生物質(zhì)水解中感興趣的酶的質(zhì)量參數(shù)，且其中所述反應(yīng)混合物配置于包含至少兩個孔的多孔板。
本公開的目標還通過提供確定感興趣的酶和/或感興趣的多肽是否影響纖維素水解的方法來實現(xiàn)，所述方法包括下述步驟(a)將生物質(zhì)與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與適于纖維素水解的含有感興趣的酶和/或感興趣的多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分如熒光指示劑化合物會結(jié)合纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解所述含有纖維素的生物質(zhì)；和(d)確定水解反應(yīng)物是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶和/或感興趣的多肽影響纖維素水解。這些方法還可包括提供感興趣的酶的步驟。這些方法還可包括提供感興趣的多肽。合適的感興趣的酶的非限定性實例包括選自下組的酶(a)野生型外纖維二糖水解酶，野生型內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶，野生型外-1，4-β-葡糖苷酶，野生型纖維二糖酶或其組合；(b)突變的外纖維二糖水解酶，突變的內(nèi)-1，4- β -葡聚糖酶，突變的外-1，4- β -葡糖苷酶，突變的纖維二糖酶或其組合；和(c) 變體外纖維二糖水解酶，變體內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶，變體外-1，4-β-葡糖苷酶，變體纖維二糖酶或其組合。這些野生型、突變體和變體的組合亦涵蓋于依照本公開的感興趣的酶混合物。本文亦涵蓋具有a)、b)或c)的活性的片段。
本公開的目標還通過提供分析酶性能的方法來實現(xiàn)，所述方法包括下述步驟(a) 將木素纖維素材料與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟 (a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分如熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解含纖維素的木素纖維素材料；和(d)檢測來自所述指示劑成分如熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示由酶水解的纖維素的量。酶性能的非限定性實例包括在木素纖維素水解中纖維素衰變的指標。合適的感興趣的酶的非限定性實例包括選自下組的酶(a)野生型外纖維二糖水解酶，野生型內(nèi)-1，4- β -葡聚糖酶，野生型外-1，4- β -葡糖苷酶，野生型纖維二糖酶或其組合；(b)突變的外纖維二糖水解酶，突變的內(nèi)-1，4- β -葡聚糖酶，突變的外-1，4-β-葡糖苷酶，突變的纖維二糖酶或其組合；和(c)變體外纖維二糖水解酶，變體內(nèi)-1，4- β -葡聚糖酶，變體外-1，4- β -葡糖苷酶，變體纖維二糖酶或其組合。這些野生型、 突變體和變體的組合亦涵蓋于依照本公開的感興趣的酶混合物。本文亦涵蓋具有a)、b)或c)的活性的片段。本公開的目標還通過提供分析生物質(zhì)水解中纖維素衰變的方法來實現(xiàn)，所述方法包括下述步驟(a)將生物質(zhì)與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b) 在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/或感興趣的多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分如熒光指示劑化合物會結(jié)合纖維素的條件下水解含有纖維素的生物質(zhì)；和(d)檢測來自所述指示劑成分如熒光指示劑化合物的信號， 其中所述信號的強度指示生物質(zhì)水解中感興趣的酶和/或感興趣的多肽的質(zhì)量參數(shù)。此類方法可在系統(tǒng)中進行。合適的感興趣的酶的非限定性實例包括選自下組的酶(a)野生型外纖維二糖水解酶，野生型內(nèi)-1，4- β -葡聚糖酶，野生型外-1，4- β -葡糖苷酶，野生型纖維二糖酶或其組合；(b)突變的外纖維二糖水解酶，突變的內(nèi)-1，4- β -葡聚糖酶，突變的外-1，4-β-葡糖苷酶，突變的纖維二糖酶或其組合；和(c)變體外纖維二糖水解酶，變體內(nèi)-1，4- β -葡聚糖酶，變體外-1，4- β -葡糖苷酶，變體纖維二糖酶或其組合。這些野生型、 突變體和變體的組合亦涵蓋于依照本公開的感興趣的酶混合物。本文亦涵蓋具有a)、b)或 c)的活性的片段。本公開的目標還通過提供確定感興趣的酶或多肽是否影響纖維素水解的方法來實現(xiàn)，所述方法包括下述步驟(a)將纖維素材料與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與適于纖維素水解的含有感興趣的酶或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會改變纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解纖維素材料；和(d)確定所述水解反應(yīng)物是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶和/或多肽的纖維素分解活性，和/或由所述感興趣的酶水解的纖維素的量。本公開的目標還通過提供用于衡量酶和/或多肽性能的系統(tǒng)來實現(xiàn)，所述系統(tǒng)包含至少一個反應(yīng)區(qū)，其中所述反應(yīng)區(qū)用于分析纖維素材料(例如木素纖維素)水解中的纖維素衰變，所述反應(yīng)區(qū)包含至少一個用于下述的孔(a)將纖維素材料(例如木素纖維素)與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解含有纖維素的纖維素材料(例如木素纖維素)；和至少一個檢測器，其適于檢測來自所述熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示由酶水解的纖維素的量。在一個系統(tǒng)實施方案中，檢測器位于反應(yīng)介質(zhì)之下，并位于反應(yīng)介質(zhì)所處于的平板之下。本公開的目標還通過提供標準化熒光強度數(shù)據(jù)的方法來實現(xiàn)，所述方法包括下述步驟(a)不添加酶或多肽，確定纖維素材料(例如PCQ的水解反應(yīng)的平均熒光強度；和 (b)使用步驟(a)中確定的熒光強度標準化一種或多種第二水解反應(yīng)的熒光強度。本發(fā)明的目標還在實施方案中通過提供在底物的水解反應(yīng)中分析由一種或多種感興趣的酶或多肽所致的纖維素衰變的方法來實現(xiàn)，所述方法包括在反應(yīng)介質(zhì)中水解含有纖維素的底物，然后添加指示劑成分，其中所述指示劑成分會使得纖維素染色；和檢測來自指示劑成分的信號，其中所述信號的強度指示由感興趣的酶水解的纖維素的量。術(shù)語“纖維素分解酶”或“纖維素酶”在本文中定義為一種或多種(幾種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖苷酶或其組合。測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括(1)測量總纖維素分解活性，和( 測量單獨的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如^iang等，Outlook for cellulase improvement :Screening and selection strategies，2006， Biotechnology Advances M :452-481所綜述的?？偫w維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括Whatman No. 1濾紙、微晶纖維素、細菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用Whatman No. 1濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由 hternational Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC) (Ghose, 1987,Measurement of cellulase activities,Pure App 1 · Chem. 59 :257-68)石角立的。
就本公開而言，纖維素分解活性使用本公開的方法確定，或如為了獲得比較數(shù)據(jù)的目的，通過測量在下述條件下由纖維素分解混合物進行的纖維素材料水解的增加來確定l_20mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS中纖維素在50-65°C進行3-7日，與未添加纖維素分解酶蛋白的對照水解相比較。通常條件為1ml反應(yīng)液，經(jīng)洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM 乙酸鈉 pH 5, ImM MnSO4, 50°C，72 小時，通過 AMINEX HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories, Inc. , Hercules, CA, USA)進行糖分析。
術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”在本文中定義為內(nèi)-1，4-(1，3 ;l，4)-i3_D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-0 -D-glucan 4-glucanohydrolase) (Ε. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1， 4-i3_D-糖苷鍵、混合的β_1，3葡聚糖例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素成分的其它植物材料中的β_1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可通過測量底物粘度的減少或由還原糖測定法Oiang等，2006，Biotechnology Advances 24 452-481)確定的還原端增加來確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)(ihose，1987，Pure and App 1. Chem. 59 :257-268的方法，在pH 5，40°C使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來測定內(nèi)切葡聚糖酶活性。
術(shù)語“纖維二糖水解酶”在本文中定義為1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(1， 4-beta-D-glucan cellobiohydrolase) (Ε. C. No. 3. 2. 1. 91)，其催化纖維素、纖維素寡糖， 或任何包含β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中的l，4-i3-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri，1997，Crystalline cellulose degradation :New insight into the function of ce1lobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15 160-167 ;Teeri 等，1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases :why so efficient on crystalline cellulose ？ ,Biochem. Soc. Trans. 26 :173-178)。就本公開而言，根據(jù) van Tilbeurgh 等，1982，F(xiàn)EBS Letters 149 152—156 及 van Tilbeurgh 和 Claeyssens，1985， FEBS Letters 187 :283-288描述的方法針對熒光性二糖衍生物4-甲基傘形基-β -D-乳糖苷來測定纖維二糖水解酶活性。
術(shù)語“ β -葡糖苷酶”在本文中定義為β -D-葡糖苷葡糖水解酶 (beta-D-glucoside glucohydrolase) (Ε. C. No. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非還原 β -D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)Venturi等，2002，Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum !production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42 :55-66 ^ 基本方法測定β -葡糖苷酶活性。一個單位的β -葡糖苷酶活性定義為在40°C，pH5，以ImM 對硝基苯基-β -D-葡糖吡喃糖苷為底物，在IOOmM檸檬酸鈉，0. 01% TffEEN 20中每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對硝基苯酚。術(shù)語“纖維素分解增強活性”在本文中定義為由GH61A多肽催化的、增強由具有纖維素分解活性的酶水解纖維素材料的生物學(xué)活性。就本發(fā)明而言，通過測量由纖維素分解酶在下述條件下水解纖維素材料所導(dǎo)致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強活性l_50mg總蛋白/g PCS中纖維素，其中總蛋白包含50-99. 5% w/ w的纖維素分解酶蛋白，及0. 5-50% w/w的具有纖維素分解增強活性的GH61A多肽的蛋白質(zhì)，在50-65°C歷時1-7天，與用相等的總蛋白加載量而無纖維素分解增強活性(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中纖維素)所進行的對照水解相比。在一個優(yōu)選的方面，在總蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)WO 02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白重量的2-3%的煙曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)存在下使用 CELLUCLAST 1. 5L(Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)的混合物的纖維素酶蛋白加載量作為纖維素分解活性的來源。具有纖維素分解增強活性的GH61多肽通過降低達到相同水解水平所需的纖維素分解酶的量而增強由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少 1. 01倍，更優(yōu)選至少1. 05倍，更優(yōu)選至少1. 10倍，更優(yōu)選至少1. 25倍，更優(yōu)選至少1. 5倍， 更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10 倍，并且最優(yōu)選至少20倍。術(shù)語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”在本文中定義為一種或多種(幾種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如 Siallom，D.和 Sioham，Y. Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 2003,6 (3) :219-228) 半纖維素酶是植物生物質(zhì)降解中的關(guān)鍵成分。半纖維素酶的實例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶， 阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶和木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素，是支鏈和直鏈糖類的異質(zhì)組，所述糖類在植物細胞壁中通過氫鍵結(jié)合于纖維素微纖維， 交聯(lián)為魯棒的(robust)網(wǎng)絡(luò)。半纖維素亦共價地附于木質(zhì)素，與纖維素一同形成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素多變的結(jié)構(gòu)和組織需要多種酶的協(xié)同作用才能使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊為水解糖苷鍵的糖基水解酶(GH)，或糖酯酶(CE)，其水解乙酸或阿魏酸側(cè)基的酯鍵。這些催化模塊，基于其一級序列的同源性，可分配至通過數(shù)字標記的GH和CE 家族。一些家族，由于總體類似的折疊，可進一步歸類為宗族(clan)，用字母標記(例如， GH-A)。對于這些和其他糖活性酶的最具信息性和最新的分類可從Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy)數(shù)據(jù)庫獲得。半纖維素分解酶活性可根據(jù)(ihose和Bisaria，1987， Pure&AppI. Chem. 59 :1739-1752 測量。術(shù)語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”在本文中定義為水解含木聚糖材料的生物學(xué)活性。兩種測定木聚糖分解活性的基礎(chǔ)方法包括(1)測定總木聚糖分解活性，和( 測定單獨的木聚糖分解活性(內(nèi)切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶)。最近在木聚糖分解酶測定法的進展總結(jié)于幾個公開文獻中，包括Biely和Puchard，Recentprogress in the assays of xylanolytic enzymes,2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11) :1636-1647 ；Spanikova 禾口 Biely，2006，Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by SchizophylIum commune， FEBS Letters 580(19) :4597-4601 ；Herrmann，Vrsanska，Jurickova，Hirsch，Biely 禾口 Kubicek，1997， The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal 321 :375_3810
總木聚糖降解活性可通過確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測量，所述木聚糖包括例如燕麥小麥(oat spelt)、山毛櫸木(beectiwood)和落葉松木(Iarctiwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測量。 最常見的總木聚糖分解活性測定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖， 如 Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3) :257-270 中所述。木聚糖酶活性亦可在37°C用0. 2% AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在0. 01% Triton X-100和200mM磷酸鈉緩沖液PH6中確定。一個單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6，從200mM磷酸鈉pH 6緩沖液中作為底物的0. 2% AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生1. O微摩爾的天青精(azurine)。
就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測量由木聚糖降解酶在下述通常條件下造成的樺木木聚糖(Sigma Chemical Co.，Inc.，St. Louis, MO, USA)水解的增加來確定的 Iml反應(yīng)液，5mg/ml底物(總固形物)，5mg木聚糖分解蛋白質(zhì)/g底物，50mM乙酸鈉pH 5， 50 °C, 24 小時，如 Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47 :273-279所述使用對羥基苯甲酸酰胼(PHBAH)測定法進行糖分析。
術(shù)語“木聚糖酶”在本文中定義為1，4-β -D-木聚糖-木糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 8)， 其催化木聚糖中l(wèi)，4-i3_D-木糖苷鍵的內(nèi)水解。就本公開而言，木聚糖酶活性是使用樺木木聚糖作為底物確定的。一個單位的木聚糖酶活性定義為在50°C，pH 5從2g/L樺木木聚糖作為底物在50mM乙酸鈉，0. 01% TWEEN 20中水解的起始期間每分鐘產(chǎn)生1. O μ mol還原糖(以葡萄糖當量(glucose equivalents)測定，如 Lever，1972，A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47 :273-279 所述)。
術(shù)語“β-木糖苷酶”在本文中定義為β-D木糖苷木糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 37)， 其催化短β (1 — 4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的 D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個單位的β-木糖苷酶定義為在40°C，pH 5從作為底物的 ImM對硝基苯基-β -D-木糖苷在含有0. 01 % TffEEN 20的IOOmM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生 1. Ομ mol 對石肖基苯酷陰離子(p-nitrophenolate anion)。
術(shù)語“乙酰木聚糖酯酶”在本文中定義為羧酸酯酶(EC 3. 1. 1. 72)，其催化乙酰基從聚合木聚糖、乙?；咎?、乙?；咸烟恰⒁宜幡?萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸對硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0. 5mM乙酸對硝基苯酯作為底物，在含有0. 01% TWEEN 20的50mM乙酸鈉pH 5. O中確定的。一個單位的乙酰木聚糖酯酶定義為能夠在PH 5，25°C每分鐘釋放1微摩爾對硝基苯酚陰離子的酶量。
術(shù)語“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase) ”在本文中定義為EC 3. 1. 1. 73 (IUBMBEnzyme Nomenclature)中的4_羥基-3-甲氧基肉桂酰糖水解酶，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解， 以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羥基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。 就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸鈉pH 5. 0中的0. 5mM阿魏酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個單位的阿魏酸酯酶等于能夠在PH 5，25°C每分鐘釋放出Iymol對硝基苯酚陰離子的酶量。
術(shù)語“α-葡糖醛酸糖苷酶”在本文中定義為α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶 (alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase activity)(EC 3.2.1.139)，其 /[崔化 α-D-葡糖苷酸水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，α -葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù) de Vries，1998，J. Bacteriol. 180 :243-249確定的。一個單位的α -葡糖醛酸糖苷酶等于能夠在pH 5，40°C每分鐘釋放出Iymol葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。
術(shù)語“ α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶”在本文中定義為α _L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3. 2. 1. 55)，其催化對α _L_阿拉伯糖苷中的末端非還原性α _L_阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和/或(1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α _L_阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。 就本發(fā)明而言，α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200 μ 1的每ml的IOOmM乙酸納pH 5中5mg的中等粘性小麥阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland, Ltd.， Bray, Co. fficklow)在 40 "C 進行 30 分鐘，接著通過 AMINEX HPX-87H 柱層析(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA, USA)的阿拉伯糖分析來確定的。
術(shù)語“家族3”、“家族5”、“家族6”、“家族7”、“家族10”、“家族11”、“家族61”、 “ GH3 ”、“ GH5 ”、“ GH6 ”、“ GH7 ”、“ GHl O ”、“ GHl 1”、“ GH61”、“ Ce 13 ”、“ Ce 15 ”、“ Ce 16 ” 或 “ Ce 17 ” 在本文中定義為根據(jù) Henrissat B·, 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280 :309-316,及 Henrissat B.禾口 Bairoch Α. ,1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316 :695-696 屬于糖苷水解酶家族 3、5、6、7、10、11 和 61 的多肽。
纖維素材料在本文中定義為任何含有纖維素的材料。生物質(zhì)初生細胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。次生細胞壁(secondary cell wall)在細胞停止生長后產(chǎn)生，其同樣含有多糖并通過共價交聯(lián)至半纖維素的聚合木質(zhì)素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈 β -(1-4) -D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、 阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩(wěn)定細胞壁基質(zhì)。
纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿與造紙廠殘余物(參見，例如，Wiselogel 等，1995，于 Handbook on Bioethanol (CharlesE. Wyman 編),pp. 105-118, Taylor&Francis, Washington D. C. ；ffyman,1994, Bioresource Technology 50 :3-16 ；Lynd,1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25 695-719 ;Mosier 等，，1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, 于 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper 主編，Volume 65, pp. 23-40，Springer-Verlag，New York)。在本文中應(yīng)理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。在一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是木素纖維素，其包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。在一個方面，纖維素材料是草本材料。在另一個方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。 在另一個方面，纖維素材料是林業(yè)殘余物。在另一個方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個方面，纖維素材料是廢紙。在另一個方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個方面，纖維素材料是玉米秸稈。在另一個方面，纖維素材料是玉米纖維。 在另一個方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個方面，纖維素材料是橙皮。在另一個方面， 纖維素材料是稻桿。在另一個方面，纖維素材料是麥桿。在另一個方面，纖維素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一個方面，纖維素材料是芒草屬。在另一個方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個方面，纖維素材料是細菌纖維素。在另一個方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個方面，纖維素材料是棉線頭。在另一個方面，纖維素材料是無定形的磷酸處理的纖維素。在另一個方面，纖維素材料是濾紙。纖維素材料可以直接使用或進行預(yù)處理，使用本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法，如本文所述。在一個優(yōu)選的方面，預(yù)處理纖維素材料。術(shù)語“經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈”或“PCS”在本文中定義為經(jīng)過一種或多種預(yù)處理步驟的源自玉米秸稈的纖維素材料。術(shù)語“變體”在本文中定義為具有生物活性的酶或多肽，其包含改變，即在一個或多個(幾個)位置取代、插入和/或缺失一個或多個(幾個)氨基酸殘基。取代意指用另一個氨基酸替代占據(jù)一個位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)一個位置的氨基酸；而插入意指在占據(jù)一個位置的氨基酸鄰接處添加一個或多個(幾個)氨基酸例如1-5個氨基酸。術(shù)語“野生型”酶在本文中定義為由天然出現(xiàn)的微生物如見于自然界的細菌、酵母或絲狀真菌所表達的酶。術(shù)語“親本酶”在本文中定義為對其進行修飾，例如取代、插入、缺失和/或截短， 以產(chǎn)生本公開的酶變體的酶，如感興趣的酶。該術(shù)語亦指變體可與之相比較和比對的多肽。 所述親本可為天然出現(xiàn)的(野生型)多肽或變體。例如，所述親本蛋白可為氨基酸序列受修飾或改變的天然出現(xiàn)的多肽的變體。親本亦可為等位變體，其為由占據(jù)相同染色體座的基因的兩種或更多種可選形式所編碼的多肽。術(shù)語“分離的多肽”在本文中定義為從來源分離的多肽。在一個優(yōu)選的方面，多肽如通過SDS-PAGE測定的，為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少 20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少
90% 純。術(shù)語“基本上純的多肽”在本文中定義為多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10 %，優(yōu)選至多8 %，更優(yōu)選至多6 %，更優(yōu)選至多5 %，更優(yōu)選至多4 %，更優(yōu)選至多3 %，甚至更優(yōu)選至多2 %，最優(yōu)選至多1 %，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%，并且甚至最優(yōu)選至多0%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，優(yōu)選至少94 %純，更優(yōu)選至少95 %純，更優(yōu)選至少96 %純，更優(yōu)選至少97 %純，更優(yōu)選至少98 % 純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99. 5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。所述多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多肽是“基本上(essentially)純的形式”，即， 所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如， 這能夠通過以下實現(xiàn)通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。
術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。本領(lǐng)域中已知宿主細胞可產(chǎn)生由相同多核苷酸表達的兩種或更多種成熟多肽(即，具有不同的C端和 /或N端氨基酸)的混合物。成熟多肽可使用SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10 :1_6)來預(yù)測。
術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。成熟多肽編碼序列可使用SignalP程序(Nielsen等，1997，見上)來預(yù)測。
參數(shù)“序列同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。
就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000， Trends Genet. 16 :276-277)的Needle程序(優(yōu)選3. 0. 0版或更高版本)中所執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gap penalty) 10，缺口延伸罰分(gap extension penalty)0. 5 和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最長同一性(longest identity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下
(同樣的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))
就本發(fā)明而言，兩個核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包 (EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,見上文)的Needle程序(優(yōu)選3· 0· 0版或更高版本)中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和mmsch，1970，見上文)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0. 5和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最長同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下
(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))
術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽，其中所述片段具有生物活性。
術(shù)語“亞序列(subsequence) ”在本文中定義為從成熟編碼序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的多核苷酸，其中所述亞序列編碼具有生物活性的片段。
術(shù)語“等位變體”在本文中定義為占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
術(shù)語“分離的多核苷酸”在本文中定義為從來源分離的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定的，為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10% 純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純， 并且最優(yōu)選至少90%純。
術(shù)語“基本上純的多核苷酸”在本文中定義為不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6 %，更優(yōu)選至多5 %，更優(yōu)選至多4 %，更優(yōu)選至多3 %，甚至更優(yōu)選至多2 %，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少 99%，最優(yōu)選至少99. 5%純，并且甚至最優(yōu)選至少100%純的。優(yōu)選所述多核苷酸是“基本上純的形式”，即，所述多核苷酸制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。
術(shù)語“編碼序列”在本文中定義為直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、 cDNA、合成或重組多核苷酸。
術(shù)語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的 mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟(包括剪接)加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。
術(shù)語“核酸構(gòu)建體”在本文中定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或?qū)⑵湟员緛聿淮嬖谟?not otherwise exist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段，或其為合成的。當所述核酸構(gòu)建體含有表達編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”同義。
術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為對編碼多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接。
術(shù)語“可操作地連接”在本文中定義為這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達。
術(shù)語“表達”在本文中定義為涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
術(shù)語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。術(shù)語“宿主細胞”在本文中定義為任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋由于在復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不相同的任何親本細胞的后代。術(shù)語“改善的性質(zhì)”在本文中定義為與變體或突變體酶或多肽相關(guān)的特征，其與親本或未突變的酶或多肽相比經(jīng)改善。此類改善的性質(zhì)包括但不限于增強的纖維素分解活性，改變的溫度依存性活性概貌，熱穩(wěn)定性，PH活性，pH穩(wěn)定性，底物特異性，產(chǎn)物特異性， 產(chǎn)物穩(wěn)定性，產(chǎn)物活性和/或化學(xué)穩(wěn)定性。術(shù)語“多肽”在本文中定義為數(shù)個通過肽鍵連接在一起的氨基酸。多肽的非限定性實例包括多肽片段，大蛋白，小蛋白，和蛋白部分。術(shù)語“改善的產(chǎn)物特異性”在本文中定義為相對于親本呈現(xiàn)改變的產(chǎn)物概貌的變體酶或多肽，其中所述改變的產(chǎn)物概貌改善了所述變體或多肽相對于親本在給定應(yīng)用中的性能。術(shù)語“產(chǎn)物概貌”在本文中定義為由酶水解產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)組成。術(shù)語“突變體”在本文中定義為發(fā)生突變的生物體。術(shù)語“突變體酶”在本文中定義為來源于突變體的酶，其中將來自親本細胞的同一酶與所述突變體酶相比時，所述突變體酶具有改變。術(shù)語“模塊”在本文中定義為在系統(tǒng)中實現(xiàn)完善定義的任務(wù)的智能成分。術(shù)語“例如(e. g.) ” 一般指拉丁語短語exempli gratia的縮寫。如用于本文中， “e.g. ”指一個或多個非限定性實例。所謂該術(shù)語是非限定性的，是指例示的對象并不限于提供的具體實例的范圍。術(shù)語“如”用于本文中一般指一個或多個非限定性實例。本公開的這些和其他方面參照下述具體描述會是顯而易見的。


圖IA是顯示本公開的系統(tǒng)的一個實施方案的圖示；圖IB是顯示本公開的系統(tǒng)中的讀板器模塊的一個實施方案的圖示。圖2是顯示幾種3. 8 μ M FB28的稀釋系列在360nm處的激發(fā)之后在460nm處的頂部讀取所收集的熒光發(fā)射的圖的圖像表示。圖3A是顯示在80 μ 1體積的UV可傳遞微滴定板中在360nm處激發(fā)測得的熒光譜的圖的圖像表示。圖3B是顯示用8 μ M熒光增亮劑28在100 μ 1的體積的UV可傳遞微滴定板中在360nm處激發(fā)測得的熒光譜的圖的圖像表示。圖3C是顯示以80 μ 1體積收集的經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈的吸光度譜的圖像表示。圖3D是顯示80 μ 1體積的商業(yè)性木質(zhì)素的吸光度譜的圖像表示。圖4是顯示當將熒光指示劑成分添加至經(jīng)水解的PCS樣品時，熒光強度相對于葡萄糖釋放的圖的圖像表示。圖5A是顯示經(jīng)HPLC測量的釋放的葡萄糖和相應(yīng)的使用PCS-A樣品的熒光發(fā)射強度的圖的圖像表示。圖5A包括添加酶所得的值。圖5B是顯示經(jīng)HPLC測量的釋放的葡萄糖和相應(yīng)的使用PCS-A樣品的熒光發(fā)射強度的圖的圖像表示。圖5B排除了來自未添加酶的生物質(zhì)的值。圖5C是顯示經(jīng)HPLC測量的釋放的葡萄糖和相應(yīng)的使用PCS-B樣品的熒光發(fā)射強度的圖的圖像表示。圖5C包括了添加酶所得的值。圖5D是顯示經(jīng)HPLC測量的釋放的葡萄糖和相應(yīng)的使用PCS-B樣品的熒光發(fā)射強度的圖的圖像表示。圖5D排除了來自未添加酶的生物質(zhì)的值。圖5E是顯示經(jīng)HPLC測量的釋放的葡萄糖和相應(yīng)的使用PCS-B樣品的熒光發(fā)射強度的圖的圖像表示。圖5E包括了添加酶所得的值。圖5F是顯示經(jīng)HPLC 測量的釋放的葡萄糖和相應(yīng)的使用PCS-C樣品的熒光發(fā)射強度的圖的圖像表示。圖5F排除了來自未添加酶的生物質(zhì)的值。
圖6A是顯示在添加和不添加200 μ M指示劑成分時，多個對PCS-A和PCS-B的水解反應(yīng)中葡萄糖濃度對酶加載的圖的圖像表示。圖6Β是顯示使用指示劑成分的水解與不使用指示劑成分的水解之間的偏差的圖的圖像表示。
圖7是顯示當通過加載指示量的纖維素酶(mg/g纖維素)將含200 μ MFB28的5% PCS-A在50°C水解超過72小時時標準化的熒光發(fā)射對時間(h)的圖的圖像表示。誤差棒顯示一標準偏差。
圖8是顯示分別含4、16和204 μ M FB28的1 %、3%和5% PCS-A，在50°C通過添加不同量的根據(jù)W02008/151079獲得的里氏木霉(Trichoderma reesei)纖維素分解蛋白組合物(包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽和米曲霉葡糖苷酶融合蛋白的里氏木霉菌株RutC30培養(yǎng)液)水解超過72小時的圖的圖像表示。釋放的葡萄糖通過HPLC 測量，而纖維素轉(zhuǎn)化是基于5%總固形物處的最大葡萄糖釋放。
圖9A是顯示當用3% PCS和150 μ M FB^在COSTAR 3364平板中使用300 μ 1 反應(yīng)物在50°C將PCS-A水解72小時時，估計的轉(zhuǎn)化率(％)對加載(mg/g纖維素)的圖的圖像表示。圖9B是顯示實際轉(zhuǎn)化率(％ )對加載(mg/g纖維素)的圖的圖像表示，其中實際轉(zhuǎn)化率是基于來自圖9A中的反應(yīng)物通過HPLC測量的葡萄糖和纖維二糖。
圖IOA是顯示本公開的一個實施方案的分析的直方圖的圖像表示，其中顯示了 5mg/g纖維素的加載在內(nèi)側(cè)、外側(cè)和邊緣孔中估計的轉(zhuǎn)化率。圖IOB是顯示本公開的一個實施方案的分析的直方圖的圖像表示，其中顯示了 8mg/g纖維素的加載在內(nèi)側(cè)、外側(cè)和邊緣孔中估計的轉(zhuǎn)化率。注意RutC30指里氏木霉菌株RutC30。
圖11是顯示存在(+)或不存在(_) 150 μ M FB28時在用第一組酶在50°C水解72 小時的3% PCS-A反應(yīng)物中實際轉(zhuǎn)化率(％)對加載(mg/g纖維素)的圖的圖像表示。實際轉(zhuǎn)化率由葡萄糖和纖維二糖的HPLC測量來計算。實際轉(zhuǎn)化率根據(jù)葡萄糖和纖維二糖的 HPLC測量來計算。圖11顯示了存在FB^ (實線，實心符號)和不存在FB^ (虛線，空心符號)時的不同組的酶。
圖12是顯示使用多種模型時轉(zhuǎn)化率(％ )對不同酶的直方圖的圖像表示。顯示了實際HPLC測量的纖維素至葡萄糖和纖維二糖的轉(zhuǎn)化率與來自熒光發(fā)射強度測量的模型的比較。注意RutC30指里氏木霉菌株RutC30。
圖13A是顯示在兩個不同PCS-A批次的72小時水解之后，估計的轉(zhuǎn)化率(％ )對 HPLC測量的轉(zhuǎn)化率(％ )的圖的圖像表示。圖1 是顯示作為某些劑量的放大而作圖的估計的轉(zhuǎn)化率(％ )對加載(mg/g纖維素)的圖的圖像表示。圖13C是顯示作為某些劑量的放大而作圖的估計的轉(zhuǎn)化率(％ )對加載(mg/g纖維素)的圖的圖像表示。
具體實施方式
已發(fā)現(xiàn)添加一種或多種結(jié)合于、染色或增亮纖維素的指示劑成分，如增亮劑或熒光指示劑化合物，有效地最大化或增加對于纖維素水解的速率，可以此速率衡量感興趣的酶或多肽如野生型、突變體、變體和/或重組酶。此外，已發(fā)現(xiàn)依照本公開的方法可以在高通量測定法中實施。這節(jié)約了時間，并提供了一種或多種感興趣的酶、多肽、酶混合物、多肽混合物和/或酶和多肽的混合物的纖維素分解活性和/或纖維素分解增強活性的準確指標。本公開的方法可用于測試大量多肽和/或酶樣品(含有一種或多種感興趣的酶和/ 或多肽、酶混合物、多肽混合物和/或酶和多肽的混合物)，例如對指定的生物質(zhì)樣品具有已知的蛋白濃度的。例如，可有效地衡量來自誘變文庫、野生型篩選和/或發(fā)酵運行的感興趣的酶和/或多肽樣品。依照本公開的合適的感興趣的酶的非限定性實例包括野生型外纖維二糖水解酶，野生型內(nèi)-1，4- β -葡聚糖酶，野生型外-1，4- β -葡糖苷酶，野生型纖維二糖酶或其組合；突變的外纖維二糖水解酶，突變的內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶，突變的外-1， 4-β-葡糖苷酶，突變的纖維二糖酶或其組合；和/或變體外纖維二糖水解酶，變體內(nèi)-1， 4- β -葡聚糖酶，變體外-1，4- β -葡糖苷酶，變體纖維二糖酶或其組合。感興趣的酶亦可包括酶混合物如前述感興趣的酶的組合。感興趣的多肽的非限定性實例包括一種或多種根據(jù) Henrissat B.,1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino—acid sequence similarities, Biochem. J. 280 :309-316,以及 Henrissat 禾口 Bairoch,1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316 :695-696屬于糖基水解酶家族3、5、6、7、10、11和61的多肽。認為可分析多肽和酶的混合物，例如可依照本公開對突變的外纖維二糖水解酶，突變的內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶， 突變的外-1，4-β葡糖苷酶，突變的纖維二糖酶和具有纖維素分解增強活性的GH61多肽進行本測定法。不拘于本公開，認為當一種或多種指示劑成分如熒光指示劑化合物接觸纖維素時，所述指示劑成分結(jié)合于或染色所述纖維素。例如，染色是在適于促進給定指示劑化合物如熒光指示劑化合物結(jié)合于纖維素的條件下進行的。認為染色步驟是有效的，因為指示劑成分如熒光指示劑化合物或染料特異性結(jié)合于纖維素的能力，凸顯(highlight)纖維素與殘余的反應(yīng)介質(zhì)和其中的其他成分的反差。盡管最小的背景凸顯可不至于破壞依照本公開的方法的準確性，背景凸顯(由相同或類似的指示劑成分導(dǎo)致)是不優(yōu)選的，并應(yīng)最小化或避免。不拘于本公開，認為染色或結(jié)合步驟使用所述指示劑成分和纖維素成分之間的部分的可能的相互作用。這些相互作用可包括離子鍵、共價鍵和疏水鍵。所述結(jié)合或染色允許在纖維素水解之后，殘余的纖維素更容易觀察到/測量。在實施方案中，來自指示劑成分如熒光指示劑化合物的信號的強度可用于指示一種或多種感興趣的酶的質(zhì)量參數(shù)。質(zhì)量參數(shù)的非限定性實例包括一種或多種感興趣的酶的性質(zhì)，一種或多種感興趣的酶的產(chǎn)物特異性，一種或多種感興趣的酶的改善的產(chǎn)物特異性和/或改善的性質(zhì)。在實施方案中，來自指示劑成分如熒光指示劑化合物的信號的強度可用于指示一種或多種感興趣的多肽的質(zhì)量參數(shù)。在實施方案中，所需的來自結(jié)合的指示劑成分如熒光指示劑化合物的光信號指示感興趣的酶和/或感興趣的多肽影響纖維素分解。例如，信號如光信號可在一個樣品中比另一個更明亮，指示更多纖維素存在于較明亮的樣品中。此種指示警示本領(lǐng)域技術(shù)人員在較明亮的樣品中的水解不如暗淡的(dull)或較不明亮的樣品有效或完全。
因此，本公開除了其他方法之外，還提供了分析纖維素材料(例如木素纖維素)水解中纖維素衰變的方法，包括下述步驟在含有指示劑成分的反應(yīng)介質(zhì)中在指示劑成分如熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解含有纖維素的纖維素材料(例如木素纖維素)；和檢測來自所述指示劑成分如熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示由酶水解的纖維素的量。
此外，本公開除了其他方法之外，還提供了分析纖維素材料(例如木素纖維素)水解中纖維素衰變的方法，包括下述步驟(a)將纖維素材料(例如木素纖維素)與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在指示劑成分如熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解含有纖維素的纖維素材料(例如木素纖維素)；和(d)檢測來自所述指示劑成分的信號，其中所述信號的強度指示由酶水解的纖維素的量。
在實施方案中，本公開提供了確定感興趣的酶和/或感興趣的多肽是否影響纖維素水解的方法，包括下述步驟在含有指示劑成分的反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分或熒光指示劑化合物會影響纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解纖維素材料；和確定水解反應(yīng)物是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶的纖維素分解活性，感興趣的多肽的纖維素分解增強活性，和/或由所述感興趣的酶，單獨或與感興趣的多肽組合而水解的纖維素的量。在實施方案中，所述反應(yīng)介質(zhì)含有一種或多種感興趣的酶，單獨或與一種或多種感興趣的多肽組合。
在實施方案中，本公開提供了確定感興趣的酶和/或多肽是否影響纖維素水解的方法，包括下述步驟a)將纖維素材料與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與適于纖維素水解的含有感興趣的酶和/ 或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分或熒光指示劑化合物會影響纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解纖維素材料；和(d)確定水解反應(yīng)物是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶的纖維素分解活性，感興趣的多肽的纖維素分解增強活性，和/或由所述感興趣的酶水解的纖維素的量。在實施方案中，所述反應(yīng)介質(zhì)含有一種或多種感興趣的酶，單獨或與一種或多種感興趣的多肽組I=I ο
在實施方案中，本公開提供了分析感興趣的酶和/或感興趣的多肽的高通量方法，包括下述步驟在含有指示劑成分的反應(yīng)介質(zhì)中在指示劑成分如熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解含有纖維素的生物質(zhì)；和檢測來自所述指示劑成分的信號， 其中所述信號的強度預(yù)示生物質(zhì)水解中感興趣的酶的質(zhì)量參數(shù)，且其中所述反應(yīng)混合物配置于包含至少兩個孔的多孔板。在實施方案中，所述反應(yīng)介質(zhì)含有一種或多種感興趣的酶， 單獨或與一種或多種感興趣的多肽組合。
在實施方案中，本公開提供了分析感興趣的酶和/或感興趣的多肽的高通量方法，包括下述步驟(a)將生物質(zhì)與指示劑成分如熒光化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/或感興趣的多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分如熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解所述含有纖維素的生物質(zhì)；和(d)檢測來自所述指示劑成分的信號，其中信號強度預(yù)示生物質(zhì)水解中感興趣的酶的質(zhì)量參數(shù)，且其中所述反應(yīng)混合物配置于包含至少兩個孔的多孔板。在實施方案中，本公開提供了確定感興趣的酶和/或感興趣的多肽是否影響纖維素水解的方法，所述方法包括下述步驟(a)將生物質(zhì)與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與適于纖維素水解的含有感興趣的酶和/或感興趣的多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分如熒光指示劑化合物會結(jié)合纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解所述含有纖維素的生物質(zhì)；和(d)確定水解反應(yīng)物是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶和/或感興趣的多肽影響纖維素水解。這些方法還可包括提供感興趣的多肽的步驟。合適的感興趣的酶的非限定性實例包括選自下組的酶(a)野生型外纖維二糖水解酶，野生型內(nèi)-1，4- β -葡聚糖酶，野生型外-1，4- β -葡糖苷酶，野生型纖維二糖酶或其組合；(b)突變的外纖維二糖水解酶，突變的內(nèi)-1，4_β -葡聚糖酶，突變的外-1， 4-β-葡糖苷酶，突變的纖維二糖酶或其組合；和(c)變體外纖維二糖水解酶，變體內(nèi)-1， 4- β -葡聚糖酶，變體外-1，4- β -葡糖苷酶，變體纖維二糖酶或其組合。感興趣的酶的其他非限定性實例包括這些野生型、突變體或變體酶的組合。感興趣的多肽亦可通過這些方法衡量。此外，這些方法亦可包括添加感興趣的多肽如具有纖維素分解增強活性的GH61多肽的步驟。在實施方案中，本公開提供了分析酶和/或多肽性能的方法，包括下述步驟(a) 將纖維素材料(例如木素纖維素材料)與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c) 在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解含纖維素的纖維素材料(例如木素纖維素材料)；和(d)檢測來自所述熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示由反應(yīng)介質(zhì)成分如酶和/或多肽成分水解的纖維素的量。酶性能的非限定性實例包括在木素纖維素水解中纖維素衰變的指標。合適的酶的非限定性實例包括選自下組的酶(a)野生型外纖維二糖水解酶，野生型內(nèi)-1，4- β -葡聚糖酶，野生型外-1， 4- β -葡糖苷酶，野生型纖維二糖酶或其組合；(b)突變的外纖維二糖水解酶，突變的內(nèi)-1， 4-β-葡聚糖酶，突變的外-1，4-β-葡糖苷酶，突變的纖維二糖酶或其組合；和(c)變體外纖維二糖水解酶，變體內(nèi)-1，4- β -葡聚糖酶，變體外-1，4- β -葡糖苷酶，變體纖維二糖酶或其組合。認為感興趣的肽和/或肽片段對于依照本公開的分析是合適的感興趣的組合物。在實施方案中，本公開提供了分析生物質(zhì)水解中纖維素衰變的方法，包括下述步驟在含有指示劑成分如熒光指示劑化合物的反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會結(jié)合纖維素的條件下水解含有纖維素的生物質(zhì)；和檢測來自熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示生物質(zhì)水解中感興趣的酶和/或感興趣的多肽的質(zhì)量參數(shù)。此類方法可在系統(tǒng)中進行。在實施方案中，本公開提供了分析生物質(zhì)水解中纖維素衰變的方法，包括下述步驟(a)將生物質(zhì)與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/或感興趣的多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(C)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會結(jié)合纖維素的條件下水解所述生物質(zhì)；和(d)檢測來自所述熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示生物質(zhì)水解中感興趣的酶和/或感興趣的多肽的質(zhì)量參數(shù)。此類方法可在系統(tǒng)中進行。
在實施方案中，本公開提供了確定感興趣的酶或多肽是否影響纖維素水解的方法，包括下述步驟(a)將纖維素材料與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與適于纖維素水解的含有感興趣的酶和/或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(C)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會改變纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解纖維素材料；和(d)確定所述水解反應(yīng)物是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶的纖維素分解活性，感興趣的多肽的纖維素分解增強活性，和/或由所述感興趣的酶和/或感興趣的多肽水解的纖維素的量。
在實施方案中，本公開提供了分析纖維素材料(例如木素纖維素材料如玉米秸稈)水解中的纖維素衰變的方法，包括下述步驟(a)將纖維素材料(例如木素纖維素材料)與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會結(jié)合于纖維素的條件下水解所述含有纖維素的纖維素材料；和(d)檢測來自所述熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示由感興趣的酶和/或感興趣的多肽水解的纖維素的量。
在實施方案中，本公開提供了用于衡量酶性能的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含至少一個反應(yīng)區(qū)，其中所述反應(yīng)區(qū)用于分析纖維素材料(例如木素纖維素)水解中的纖維素衰變，所述反應(yīng)區(qū)包含至少一個用于下述的孔(a)將纖維素材料與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/ 或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在指示劑成分如熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解含有纖維素的纖維素材料；和至少一個檢測器，其適于檢測來自所述熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示由含有任何感興趣的酶和/或感興趣的多肽的反應(yīng)介質(zhì)水解的纖維素的量。在一個系統(tǒng)實施方案中，檢測器位于反應(yīng)介質(zhì)之下，并位于反應(yīng)容器所處于的平板之下。
在實施方案中，本公開提供了用于衡量酶性能的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含至少一個反應(yīng)區(qū)，其中所述反應(yīng)區(qū)用于分析纖維素材料(例如木素纖維素)水解中的纖維素衰變，所述反應(yīng)區(qū)包含至少一個用于下述的孔在含有指示劑成分的反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分如熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解所述含有纖維素的纖維素材料；和至少一個檢測器，其適于檢測來自所述熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示由含有任何感興趣的酶和/或感興趣的多肽的反應(yīng)介質(zhì)水解的纖維素的量。在實施方案中，下述步驟(a)將纖維素材料與指示劑成分如熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物； (b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶的反應(yīng)介質(zhì)相接觸，發(fā)生在水解之前。然而，在實施方案中，涵蓋了可在水解完全之后添加指示劑成分。
指示劑成分
在實施方案中，依照本公開的方法將一種或多種指示劑成分以有效量添加至纖維素水解中以結(jié)合或染色水解反應(yīng)介質(zhì)中的纖維素。所述反應(yīng)介質(zhì)可含有待分析的一種或多種感興趣的酶和/或多肽，酶混合物，多肽混合物和/或酶和多肽的混合物。在實施方案中，依照本公開的方法將一種或多種指示劑成分以有效量添加至纖維素水解以指示一種或多種感興趣的酶和/或多肽的質(zhì)量參數(shù)。最優(yōu)地，僅纖維素凸顯于反應(yīng)介質(zhì)中，而指示劑化合物不凸顯其他反應(yīng)介質(zhì)成分。然而，在實施方案中，主要是纖維素凸顯于反應(yīng)介質(zhì)中，而少量其他成分亦由指示劑化合物凸顯。應(yīng)避免除了纖維素之外的反應(yīng)混合物的成分的背景凸顯，然而少量除了纖維素之外的其他成分的背景凸顯并不會使得本公開的方法不準確。依照本公開合適的指示劑成分的非限定性實例包括苯和聯(lián)苯的苯乙烯衍生物，芪衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2-羥喹啉或其混合物。這些指示劑成分可直接添加至水解中，或通過首先將纖維素材料如木素纖維素材料與指示劑成分相接觸以形成混合物。然后可將該混合物與含有感興趣的酶和/或多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸。在指示劑成分存在的情況下進行水解，如例如在反應(yīng)介質(zhì)中在所述指示劑成分會染色或結(jié)合纖維素的條件下水解含有纖維素的纖維素材料或木素纖維素材料。依照本公開使用所述指示劑成分，則來自剩余纖維素的信號可高至或強至來自未與依照本公開的指示劑成分接觸的剩余纖維素的信號的至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8 倍，至少9倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少100倍，至少 1000倍，或至少10，000倍。此外，剩余纖維素的指標可變佳或改善至未與依照本公開的指示劑成分接觸的水解反應(yīng)的至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍， 至少8倍，至少9倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少100倍， 至少1000倍，或至少10，000倍。例如，所述指標的改善可體現(xiàn)在較短時間進行測定。在實施方案中，依照本公開的方法將一種或多種指示劑成分以有效量添加至纖維素水解以指示水解中一種或多種感興趣的酶和/或多肽的質(zhì)量參數(shù)。因此，本公開的方法適于酶和/或多肽購買者檢查例如產(chǎn)物穩(wěn)定性和/或酶活性。而且，生產(chǎn)商可就品質(zhì)保障目的來檢查產(chǎn)物穩(wěn)定性和活性。在實施方案中，依照本公開的方法包括依照本公開以足以凸顯纖維素的量添加一種或多種熒光指示劑成分。在實施方案中，以足以使反應(yīng)介質(zhì)中的纖維素發(fā)熒光或凸顯的量添加熒光指示劑成分。供依照本公開使用的合適的熒光指示劑成分的非限定性實例包括苯和聯(lián)苯的苯乙烯衍生物，芪衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素， 2-羥喹啉或其混合物。這些化合物的許多化學(xué)結(jié)構(gòu)示于并描述于Harold J. McElhone的 Fluorescent Whitening Agents， Kirk-Qthmer Encyclopedia of Chemical Technology， 1994 (通過全文提述并入本文)。合適的芪衍生物的非限定性實例包括4，4’ - 二氨基芪_2，2’ - 二磺酸(4， 4' -diaminostilbene-2,2 ‘ -disulfonic acid)的雙三嗪基(bistriazinyl)衍生物。 其他芪衍生物包括對硝基甲苯鄰磺酸(p-nitro toluene ortho-sulfonic acid)和4， 4，- 二硝基芪 _2，2，- 二磺酸 4 ' -dinitro stilibene 2. 2 ‘ disulfonic acid)。 在實施方案中，二氨基芪類(diaminostilbenes)適于用作供依照本公開使用的熒光指示劑成分。二氨基芪類的非限定性實例包括4，4’ - 二 [4-苯胺基-6-二乙基) 氨基-S-三嗪-2-基氨基]-2，2，- 二磺酸(4,4 ‘ -bis[4-anilino-6-bis(2-ethyl) amino-s-triazin-2-ylamino]-2,2' -disulfonic acid)(焚光i曾亮齊[J 28 或 Calcofluor White M2R牌增亮劑，可從SIGMA-ALDRICH 獲得)，和/或BLANK0PH0R 牌增亮劑。4，4，-二 [4-苯胺基-6-二乙基)氨基_s_三嗪_2_基氨基]_2，2，-二磺酸可從SIGMA-ALDRICH 獲得，并具有如下所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種分析纖維素材料水解中纖維素的衰變的方法，包括在含有指示劑成分的反應(yīng)介質(zhì)中在指示劑成分會使得纖維素染色的條件下水解含纖維素的纖維素材料；和檢測來自所述指示劑成分的信號，其中所述信號的強度指示由感興趣的酶水解的纖維素的量。
2.權(quán)利要求1的方法，包括下述步驟(a)將纖維素材料與指示劑成分相接觸以形成混合物；和(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶的反應(yīng)介質(zhì)相接觸。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述指示劑成分是熒光指示劑化合物，包括熒光團，高波長熒光團，苯和聯(lián)苯的苯乙烯基衍生物，芪(stilbene)衍生物，吡唑啉，二(苯噁唑-2-基)衍生物，香豆素，2-羥喹啉(carbostyril)，或二氨基芪或其混合物。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述指示劑成分是4，4’_二 [4-苯胺基-6-二 O-乙基)氨基-S-三嗪-2-基氨基]_2，2，- 二磺酸。
5.權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中所述感興趣的酶包含一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和過氧化物酶。
6.權(quán)利要求1-5任一項的方法，包括下述步驟(a)將纖維素材料與指示劑成分相接觸以形成混合物；和(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述多肽是具有纖維素分解增強活性的GH61多肽。
8.一種確定感興趣的酶是否影響纖維素水解的方法，包括下述步驟在含有熒光指示劑化合物的反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會影響纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解纖維素材料；和確定水解反應(yīng)物是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶的纖維素分解活性，和/或由所述感興趣的酶水解的纖維素的量。
9.權(quán)利要求10的方法，在水解之前進一步包括下述步驟(a)將纖維素材料與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；和(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與適于纖維素水解的含有感興趣的酶的反應(yīng)介質(zhì)相接觸。
10.一種分析感興趣的酶和/或感興趣的多肽的高通量方法，包括下述步驟(a)將生物質(zhì)與熒光化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶和/或感興趣的多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解所述含有纖維素的生物質(zhì)；和(d)檢測來自所述熒光指示劑化合物的信號，其中信號強度預(yù)示生物質(zhì)水解中感興趣的酶和/或感興趣的多肽的質(zhì)量參數(shù)，且其中所述反應(yīng)混合物配置于包含至少兩個孔的多孔板。
11.一種確定感興趣的酶是否影響纖維素水解的方法，包括下述步驟(a)將生物質(zhì)與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與適于纖維素水解的含有感興趣的酶和/或感興趣的多肽的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(C)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會結(jié)合纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解所述含有纖維素的生物質(zhì)；和(d)確定水解反應(yīng)物是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶和/或感興趣的多肽影響纖維素水解。
12.—種分析酶性能的方法，所述方法包括下述步驟(a)將木素纖維素材料與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解含纖維素的木素纖維素材料；和(d)檢測來自所述熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示由所述酶水解的纖維素的量。
13.一種分析生物質(zhì)水解中纖維素衰變的方法，包括下述步驟(a)將生物質(zhì)與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會結(jié)合纖維素的條件下水解所述含有纖維素的生物質(zhì)；和(d)檢測來自所述熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示生物質(zhì)水解中感興趣的酶的質(zhì)量參數(shù)。
14.一種確定感興趣的酶是否影響纖維素水解的方法，包括下述步驟(a)將纖維素材料與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與適于纖維素水解的含有感興趣的酶的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會改變纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解所述纖維素材料；和(d)確定所述水解反應(yīng)物是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶的纖維素分解活性，和/或由所述感興趣的酶水解的纖維素的量。
15.一種分析木素纖維素水解中纖維素衰變的方法，包括下述步驟(a)將木素纖維素與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會結(jié)合纖維素的條件下水解含有纖維素的玉米秸稈；和(d)檢測來自所述熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示由所述酶水解的纖維素的量。
16.一種用于衡量酶性能的系統(tǒng)，包含至少一個反應(yīng)區(qū)，其中所述反應(yīng)區(qū)用于分析木素纖維素水解中的纖維素衰變，所述反應(yīng)區(qū)包含至少一個用于下述的孔(a)將木素纖維素材料與熒光指示劑化合物相接觸以形成混合物；(b)在步驟(a)同時或之后將所述混合物與含有感興趣的酶的反應(yīng)介質(zhì)相接觸；(c)在反應(yīng)介質(zhì)中在所述熒光指示劑化合物會使得纖維素染色的條件下水解所述含有纖維素的木素纖維素材料；和至少一個檢測器，其適于檢測來自所述熒光指示劑化合物的信號，其中所述信號的強度指示由所述酶水解的纖維素的量。
17.—種標準化用于確定生物樣品中目標纖維素的量的方法的方法，包括下述步驟(a)在反應(yīng)體積中測量樣品中目標纖維素的熒光強度；(b)確定不添加酶的底物的水解的平均熒光強度；和(c)通過將目標纖維素的熒光強度從未添加酶的水解反應(yīng)的平均強度減去來標準化目標纖維素測量。
18.—種標準化熒光強度數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括下述步驟(a)確定不添加酶的 PCS水解反應(yīng)的平均熒光強度；和(b)使用步驟(a)中確定的熒光強度標準化一種或多種第二水解反應(yīng)的熒光強度。
19.一種確定感興趣的酶和感興趣的多肽是否影響纖維素水解的方法，包括下述步驟在含有熒光指示劑化合物的反應(yīng)介質(zhì)中在熒光指示劑化合物會影響纖維素并產(chǎn)生指示纖維素存在的光信號的條件下水解纖維素材料；和確定水解的反應(yīng)物是否具有所需的光信號，其中所述所需的光信號指示感興趣的酶和感興趣的多肽的纖維素分解活性，和/或由所述感興趣的酶和感興趣的多肽水解的纖維素的量。
全文摘要
通過使用指示劑成分如熒光劑在纖維素材料水解過程中衡量感興趣的酶和/或多肽和/或混合物，導(dǎo)致酶和/或多肽的有效的高通量分析。還公開了用于除了分析其他之外，分析經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(PCS)水解的高通量測定。
文檔編號G01N33/50GK102498401SQ201080041334
公開日2012年6月13日 申請日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者K.麥克法蘭, M.馬爾滕 申請人:諾維信公司