專(zhuān)利名稱(chēng)：Fret測(cè)量方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)激光照射供體分子(第一分子)接收能量、能量從供體分子轉(zhuǎn)移到受體分子(第二分子)的FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer:蠻光共振會(huì)邑量轉(zhuǎn)移)的測(cè)量方法及裝置。具體來(lái)說(shuō)，涉及關(guān)于供體分子和受體分子的對(duì)，通過(guò)熒光測(cè)量?jī)蓚€(gè)分子之間的相互作用的FRET測(cè)量技術(shù)。
背景技術(shù)：
目前，作為醫(yī)療、制新藥、食品產(chǎn)業(yè)中后基因的相關(guān)技術(shù)，蛋白質(zhì)的功能分析變得越來(lái)越重要。特別是，為了分析細(xì)胞作用，需要研究活細(xì)胞中活體物質(zhì)的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)或低分子化合物之間的相互作用(結(jié)合、分離)。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象對(duì)活細(xì)胞中活體物質(zhì)的蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)或低分子化合物之間的相互作用進(jìn)行分析。對(duì)通過(guò)FRET現(xiàn)象產(chǎn)生的熒光進(jìn)行測(cè)量，由此能夠?qū)准{米波段中的分子間的相互作用進(jìn)行測(cè)量。例如，公開(kāi)了一種利用FRET發(fā)生時(shí)的供體分子的熒光壽命τ 和受體分子不存在時(shí)的供體分子的熒光壽命τ d求出表示從供體分子向受體分子的能量轉(zhuǎn)移程度的FRET效率的技術(shù)(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。在上述專(zhuān)利文獻(xiàn)1中FRET效率通過(guò)1 一 τ *d/ τ d求出。專(zhuān)利文獻(xiàn)1 特開(kāi)2007-240424號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
但是，上述FRET效率受到相對(duì)于供體分子濃度的受體分子濃度比例的影響，因此利用上述技術(shù)難以定量求出包含在細(xì)胞等的蛋白質(zhì)的相互作用的強(qiáng)度。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種不受相對(duì)于供體分子濃度的受體分子濃度比例的影響的情況下能夠定量進(jìn)行FRET測(cè)量的FRET測(cè)量方法及裝置。為了解決上述課題，本發(fā)明的FRET測(cè)量方法將激光照射在用第一分子和第二分子進(jìn)行標(biāo)記的測(cè)量樣品上，由此測(cè)量出能量從第一分子向第二分子轉(zhuǎn)移的FRET，其特征在于，包括如下步驟最短熒光壽命計(jì)算步驟，相對(duì)于第一分子濃度和第二分子濃度比不同的多個(gè)預(yù)先測(cè)量樣品計(jì)算出第一分子的熒光壽命，并計(jì)算出第一分子的熒光壽命的最小值； 照射步驟，將對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光照射在所述測(cè)量樣品上；測(cè)量步驟，測(cè)量所述測(cè)量樣品被所述激光照射而發(fā)出的熒光；第一分子熒光壽命計(jì)算步驟，利用所述測(cè)量步驟中被測(cè)量的熒光信號(hào)計(jì)算出第一分子的熒光壽命；FRET發(fā)生率計(jì)算步驟，利用在所述最短熒光壽命計(jì)算步驟中計(jì)算出的第一分子熒光壽命的最小值和計(jì)算出的所述第一分子熒光壽命，計(jì)算出所述測(cè)量樣品中的第一分子中發(fā)生FRET的第一分子的比例。另外，所述FRET發(fā)生率計(jì)算步驟優(yōu)選的是在所述FRET發(fā)生率計(jì)算步驟中進(jìn)一步利用第二分子不存在時(shí)的第一分子的熒光壽命求出所述比例。另外，本發(fā)明的FRET測(cè)量方法包括觀察矩陣計(jì)算步驟，在該步驟中從所述測(cè)量步驟中測(cè)量的熒光信號(hào)，計(jì)算出在所述照射步驟中用于求出第一分子被激光照射而發(fā)出的熒光信息和第二分子發(fā)出的熒光信息的矩陣，所述觀察矩陣計(jì)算步驟優(yōu)選包括第一步驟，利用對(duì)包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而測(cè)量的熒光信號(hào)求出所述矩陣成分的一部分；第二步驟，利用對(duì)包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而測(cè)量的熒光信號(hào)求出所述矩陣成分的一部分。另外，本發(fā)明的FRET測(cè)量方法優(yōu)選的是包括解離常數(shù)計(jì)算步驟，在該步驟中利用所述FRET發(fā)生率計(jì)算步驟中計(jì)算出的所述比例計(jì)算出表示第一分子和第二分子結(jié)合情況的解離常數(shù)。另外，計(jì)算所述第一分子熒光壽命的步驟優(yōu)選的是利用所述測(cè)量步驟中被測(cè)量的熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差計(jì)算出第一分子的熒光壽命。另外，在所述第一步驟中，利用對(duì)包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而測(cè)量的熒光信號(hào)的振幅、以及所述熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差，求出所述矩陣成分的一部分，在所述第二步驟中，利用對(duì)包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而測(cè)量的熒光信號(hào)的振幅、以及所述熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差，求出所述矩陣成分的一部分。另外，本發(fā)明的FRET測(cè)量方法包括第一分子濃度計(jì)算步驟，利用第一分子發(fā)出的熒光信息計(jì)算出第一分子的濃度；第二分子濃度計(jì)算步驟，利用第二分子發(fā)出的熒光信息計(jì)算出第二分子濃度；在所述解離常數(shù)計(jì)算步驟中優(yōu)選的是，利用在所述第一分子濃度計(jì)算步驟中計(jì)算出的第一分子濃度和在所述第二分子濃度計(jì)算步驟中計(jì)算出的第二分子濃度計(jì)算出所述解離常數(shù)。另外，為了解決上述課題，本發(fā)明的FRET測(cè)量裝置將激光照射在用第一分子和第二分子標(biāo)記的測(cè)量樣品上，由此測(cè)量出能量從第一分子向第二分子轉(zhuǎn)移的FRET，其特征在于，包括激光光源部，將對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光照射在所述測(cè)量樣品上；測(cè)量部， 測(cè)量所述測(cè)量樣品被所述激光照射而發(fā)出的熒光；熒光壽命計(jì)算部，利用所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)計(jì)算出第一分子熒光壽命；最短熒光壽命計(jì)算部，利用第一分子濃度和第二分子濃度比不同的多個(gè)預(yù)先測(cè)量樣品中的第一分子熒光壽命，計(jì)算出第一分子熒光壽命的最小值；FRET發(fā)生率計(jì)算部，利用在所述最短熒光壽命計(jì)算部中計(jì)算出的第一分子熒光壽命的最小值和在所述熒光壽命計(jì)算部中計(jì)算出的第一分子熒光壽命，計(jì)算出所述測(cè)量樣品中的第一分子中發(fā)生FRET的第一分子的比例。另外，所述FRET發(fā)生率計(jì)算部?jī)?yōu)選的是進(jìn)一步利用第二分子不存在時(shí)的第一分子的熒光壽命求出所述比例。另外，本發(fā)明的FRET測(cè)量裝置包括觀察矩陣計(jì)算部，在該步驟中從所述測(cè)量部中測(cè)量的熒光信號(hào)計(jì)算出用于求出在所述照射步驟中通過(guò)激光照射而第一分子發(fā)出的熒光的信息和第二分子發(fā)出的熒光的信息的矩陣，在所述觀察矩陣計(jì)算部，優(yōu)選的是，利用對(duì)包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而在所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)，求出所述矩陣成分的一部分，并且利用對(duì)包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而在所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)，求出所述矩陣成分的一部分。另外，本發(fā)明的FRET測(cè)量裝置優(yōu)選的是包括解離常數(shù)計(jì)算部，在該部中利用在所述FRET發(fā)生率計(jì)算部中計(jì)算出的所述比例計(jì)算出表示第一分子和第二分子的結(jié)合狀況的
解離常數(shù)。另外，所述熒光壽命計(jì)算部?jī)?yōu)選的是利用在所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差計(jì)算出第一分子的熒光壽命。另外，優(yōu)選的是，所述觀察矩陣計(jì)算部利用對(duì)包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光，用所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)的振幅以及所述熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差求出所述矩陣成分的一部分，并且利用對(duì)包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光，用所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)的振幅以及所述熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差求出所述矩陣成分的一部分。另外，優(yōu)選的是，本發(fā)明的FRET測(cè)量裝置包括第一分子濃度計(jì)算部，利用第一分子發(fā)出的熒光信息計(jì)算出第一分子的濃度；第二分子濃度計(jì)算部，利用第二分子發(fā)出的熒光信息計(jì)算出第二分子的濃度；所述解離常數(shù)計(jì)算部利用在所述第一分子濃度計(jì)算部計(jì)算出的第一分子濃度和在所述第二分子濃度計(jì)算部計(jì)算出的第二分子濃度計(jì)算出所述解離常數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的FRET測(cè)量方法以及裝置，在不受相對(duì)于供體分子的濃度的受體分子的濃度比的影響下能夠定量進(jìn)行FRET測(cè)量。


圖1為本發(fā)明的FRET測(cè)量裝置的一個(gè)實(shí)施方式的流式細(xì)胞儀的概略構(gòu)成圖；圖2為表示供體分子和受體分子的能量吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的一例的圖；圖3為表示圖1所示的流式細(xì)胞儀的測(cè)量部的一例的概略構(gòu)成圖；圖4為表示圖1所示的流式細(xì)胞儀的控制和處理部的一例的概略構(gòu)成圖；圖5為表示圖1所示的流式細(xì)胞儀的分析裝置的一例的概略構(gòu)成圖；圖6為表示FRET測(cè)量流程的一例的圖；圖7為表示FRET效率和α關(guān)系的圖；圖8為表示FRET發(fā)生時(shí)的熒光發(fā)光動(dòng)力學(xué)的模式圖；圖9為表示觀察矩陣的測(cè)量例的圖；圖10為測(cè)量最大FRET效率和最短熒光壽命的流程圖的一例；圖11為測(cè)量觀察矩陣的流程圖的一例；圖12為樣品測(cè)量的流程圖的一例。符號(hào)說(shuō)明10流式細(xì)胞儀12 樣品20 管道22回收容器30激光光源部
40、50測(cè)量部
51透鏡系統(tǒng)
52分色鏡
53、54帶通濾波器
55、56光電轉(zhuǎn)換器
100控制和處理部
110信號(hào)生成部
112振蕩器
114功率分配器
116、118放大器
120信號(hào)處理部
122、IM放大器
126相位差檢測(cè)部
130控制部
132低通濾波器
134放大器
136A/D轉(zhuǎn)換器
138系統(tǒng)控制部
150分析裝置
152CPU
154存儲(chǔ)器
156輸入輸出端口
158熒光壽命計(jì)算單元
160FRET效率計(jì)算單元
162最短熒光壽命計(jì)算單元
164FRET發(fā)生率計(jì)算單元
166觀察矩陣計(jì)算單元
168第一分子濃度計(jì)算單元
170第二分子濃度計(jì)算單元
172解離常數(shù)計(jì)算單元
200顯示器
具體實(shí)施例方式下面，對(duì)本發(fā)明的FRET測(cè)量方法和裝置進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。圖1為本發(fā)明的FRET測(cè)量裝置的一個(gè)實(shí)施方式的流式細(xì)胞儀10的概略構(gòu)成圖。本發(fā)明的流式細(xì)胞儀10例如將激光照射在由供體分子和受體分子標(biāo)記作為測(cè)量對(duì)象的活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的樣品12 (測(cè)量樣品)上，并測(cè)量樣品12發(fā)出的熒光。流式細(xì)胞儀10通過(guò)利用被測(cè)量的熒光信號(hào)求出在供體分子中發(fā)生FRET的供體分子的比例的κ FKET。 進(jìn)一步，流式細(xì)胞儀10除了 Kfket之外還求出供體分子的濃度、受體分子的濃度、解離常數(shù)K d的值。如圖1所示，流式細(xì)胞儀10包括管道20、激光光源部30、測(cè)量部40、50、控制和處理部100、分析裝置150。在管道20中，使形成高速流的鞘液與樣品12—起流動(dòng)。在管道20的出口處設(shè)置有回收樣品12的回收容器22。激光光源部30向樣品12照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光。通過(guò)向樣品12照射激光，供體分子和受體分子分別吸收能量。例如，供體分子為CFP (Cyan Fluorescent Protein)、受體分子為YFP (Yellow Fluorescent Protein)時(shí)，使用供體分子主要吸收能量的波長(zhǎng)為405ηπΓ450ηπι的激光。激光光源部30為例如半導(dǎo)體激光激光器。激光光源部 30發(fā)射的激光的輸出為例如5mW 100mW。在此，對(duì)激光光源部30照射的激光的波長(zhǎng)和供體分子以及受體分子吸收能量的波長(zhǎng)的關(guān)系、以及FRET的發(fā)生進(jìn)行說(shuō)明。圖2為表示供體分子為CFP、受體分子為YFP時(shí)的能量吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的圖。曲線A1為供體分子的能量吸收光譜，曲線A2為供體分子熒光發(fā)射光譜。另外，曲線B1 為受體分子的能量吸收光譜，曲線B2為受體分子的熒光發(fā)射光譜。如圖2所示，供體分子主要吸收能量的波段為405nnT450nm。另外，受體分子主要吸收能量的波段為470歷 530歷。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)供體分子和受體分子的距離為2nm以下時(shí)，通過(guò)激光照射供體分子吸收的能量的一部分通過(guò)庫(kù)倫相互作用向受體分子移動(dòng)。受體分子吸收通過(guò)庫(kù)倫相互作用從供體分子轉(zhuǎn)移的能量而被激發(fā)，由此發(fā)出熒光。該現(xiàn)象被稱(chēng)之為熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)。作為供體分子使用CFP，作為受體分子使用YFP時(shí)也發(fā)生FRET。即，通過(guò)庫(kù)倫相互作用能量從供體分子向受體分子轉(zhuǎn)移，由此受體分子被激發(fā)而發(fā)出熒光。進(jìn)一步，如圖2所示，供體分子的能量吸收光譜A1和受體分子的能量吸收光譜B1 部分重疊。因此，受體分子發(fā)出通過(guò)激光直接激發(fā)而導(dǎo)致的熒光。再返回圖1，測(cè)量部40按照夾著管道20與激光光源部30相對(duì)而置的方式配置。 測(cè)量部40包括光電轉(zhuǎn)換器，通過(guò)在測(cè)量點(diǎn)上通過(guò)的樣品12使激光發(fā)生前向散射，由此輸出樣品12通過(guò)測(cè)量點(diǎn)的檢測(cè)信號(hào)。從測(cè)量部40輸出的信號(hào)供給到控制和處理部100。從測(cè)量部40供給到控制和處理部100的信號(hào)作為通知樣品12通過(guò)管道20中的測(cè)量點(diǎn)的時(shí)間的觸發(fā)信號(hào)來(lái)使用。測(cè)量部50配置在通過(guò)測(cè)量點(diǎn)、相對(duì)于發(fā)射自激光光源部30的激光發(fā)射方向呈正交的平面和通過(guò)測(cè)量點(diǎn)、相對(duì)于管道20中的樣品12移動(dòng)方向呈正交的平面的交線上。測(cè)量部50包括光電倍增管或雪崩光電二極管等光電轉(zhuǎn)換器，以接收樣品在測(cè)量點(diǎn)被激光照射后所發(fā)出的熒光。在此，參照?qǐng)D3詳細(xì)說(shuō)明測(cè)量部50的構(gòu)成。如圖3所示，測(cè)量部50包括透鏡系統(tǒng) 51、分色鏡52、帶通濾波器53、54、光電轉(zhuǎn)換器55、56。透鏡系統(tǒng)51將樣品12發(fā)出的熒光進(jìn)行聚焦。分色鏡52按照將受體分子發(fā)出的熒光進(jìn)行透射、將供體分子發(fā)出的熒光反射的方式設(shè)定反射、透射波長(zhǎng)。帶通濾波器5354被設(shè)置在光電轉(zhuǎn)換器55、56的受光面的前面，帶通濾波器53、54 僅使具有規(guī)定波段的熒光透射。具體來(lái)說(shuō)，帶通濾波器53按照透射主要是供體分子發(fā)出熒光的波段(圖2中的由A表示的波段)的熒光的方式設(shè)定。另外，帶通濾波器M按照透射主要是受體分子發(fā)出熒光的波段(圖2中的由B表示的波段)的熒光的方式設(shè)定。在下面的說(shuō)明中，在圖2中由A表示的波段稱(chēng)之為“供體波段”，由B表示的波段稱(chēng)之為“受體波段”。另外，如圖2所示，表示供體分子的熒光發(fā)射光譜的曲線A2通過(guò)受體波段，表示受體分子的熒光發(fā)射光譜的曲線4通過(guò)供體波段。因此，在按照透射供體波段的熒光的方式設(shè)定的帶通濾波器53中，不僅透射供體分子發(fā)出的熒光，也少量地透射受體分子發(fā)出的熒光。同樣，在按照透射受體分子發(fā)出的熒光的方式設(shè)定的帶通濾波器M中，不僅透射受體分子發(fā)出的熒光，也少量地透射供體分子發(fā)出的熒光。如后面所述，分析裝置150利用觀察矩陣校正包含各波段上漏泄的熒光的熒光信號(hào)，并求出供體分子發(fā)出的熒光的信息和受體分子發(fā)出的熒光的信息。光電轉(zhuǎn)換器55、56將所接收的光轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。光電轉(zhuǎn)換器55、56為包括例如光電倍增管的傳感器。光電轉(zhuǎn)換器55、56所接收的熒光比強(qiáng)度調(diào)制的激光相位滯后。因此， 光電轉(zhuǎn)換器陽(yáng)、56接收具有相對(duì)于強(qiáng)度調(diào)制的激光的相位差信息的光信號(hào)，并將其轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。從光電轉(zhuǎn)換器陽(yáng)、56輸出的信號(hào)(熒光信號(hào))供給到控制和處理部100。在此，參照?qǐng)D4詳細(xì)說(shuō)明控制和處理部100的構(gòu)成。如圖4所示，控制和處理部 100包括信號(hào)生成部110、信號(hào)處理部120、控制部130。信號(hào)生成部110生成用于將激光強(qiáng)度進(jìn)行時(shí)間調(diào)制的調(diào)制信號(hào)。調(diào)制信號(hào)為例如規(guī)定頻率的正弦波信號(hào)，被設(shè)定為IOMHflOOMHz的范圍的頻率。信號(hào)生成部110包括振蕩器112、功率分配器114、放大器116、118。通過(guò)振蕩器 112生成的調(diào)制信號(hào)通過(guò)功率分配器114分成后供給到激光光源部30和信號(hào)處理部120。 信號(hào)生成部110將調(diào)制信號(hào)供給到信號(hào)處理部120，這是因?yàn)槿绾笏?，作為測(cè)量相對(duì)于調(diào)制信號(hào)的熒光信號(hào)的相位差的參照信號(hào)來(lái)使用。另外，調(diào)制信號(hào)作為用于調(diào)制激光光源部 30發(fā)射的激光振幅的信號(hào)使用。信號(hào)處理部120利用從光電轉(zhuǎn)換器55、56輸出的熒光信號(hào)，抽樣樣品12發(fā)出的熒光的信息。樣品12發(fā)出的熒光信息為例如與熒光強(qiáng)度相關(guān)的信息或與熒光壽命相關(guān)的信息。信號(hào)處理部120包括放大器122、124、相位差測(cè)量器126。放大器122、IM將從光電轉(zhuǎn)換器55、56輸出的信號(hào)進(jìn)行放大，將被放大的信號(hào)輸出至相位差檢測(cè)器126。相位差檢測(cè)器1 針對(duì)從光電轉(zhuǎn)換器55、56輸出的各熒光信號(hào)檢測(cè)出相對(duì)于調(diào)制信號(hào)的相位差。相位差檢測(cè)器1 包括未圖示的IQ混頻器。IQ混頻器通過(guò)將參照信號(hào)和熒光信號(hào)相乘來(lái)計(jì)算出包含熒光信號(hào)的cos成分(實(shí)數(shù)部)和高頻成分的處理信號(hào)。另外， IQ混頻器通過(guò)將參照信號(hào)的相位位移90度后的信號(hào)和熒光信號(hào)的相乘來(lái)計(jì)算出包含熒光信號(hào)的sin成分(虛數(shù)部)和高頻成分的處理信號(hào)?？刂撇?30按照信號(hào)生成部110生成具有規(guī)定頻率的正弦波信號(hào)的方式控制信號(hào)生成部110。另外，控制部130從通過(guò)信號(hào)處理部所輸出的包含熒光信號(hào)的cos成分和sin 成分的處理信號(hào)中去除高頻成分而求出熒光信號(hào)的cos成分和sin成分?？刂撇?30包括低通濾波器132、放大器1!34、A/D轉(zhuǎn)換器136、系統(tǒng)控制器138。低通濾波器132從信號(hào)處理部輸出的包含熒光信號(hào)的cos成分、sin成分和高頻成分的信號(hào)中去除高頻成分。放大器134對(duì)通過(guò)低通濾波器132去除高頻成分的信號(hào)的熒光信號(hào)的cos成分、sin成分的處理信號(hào)進(jìn)行放大，并將其輸出至A/D轉(zhuǎn)換器136。A/D轉(zhuǎn)換器136將對(duì)熒光信號(hào)的cos成分、sin成分的處理信號(hào)進(jìn)行取樣，并供給至分析裝置150。系統(tǒng)控制器 138接收將從測(cè)量部40輸出的觸發(fā)信號(hào)的輸入。另外，系統(tǒng)控制器138控制振蕩器112和 A/D轉(zhuǎn)換器136。分析裝置150從熒光信號(hào)的cos成分(實(shí)數(shù)部)、sin成分(虛數(shù)部)的處理信號(hào)計(jì)算出熒光壽命、FRET效率、最短熒光壽命、FRET發(fā)生率、觀察矩陣、供體分子的濃度、受體分子的濃度、解離常數(shù)等。分析裝置150是在計(jì)算機(jī)上使規(guī)定程序啟動(dòng)的裝置。圖5為表示分析裝置150的概略構(gòu)成圖。如圖5所示，分析裝置150包括CPU152、存儲(chǔ)器154、輸入輸出端口 156、熒光壽命計(jì)算單元158、FRET效率計(jì)算單元160、最短熒光壽命計(jì)算單元162、FRET發(fā)生率計(jì)算單元164、觀察矩陣計(jì)算單元166、第一分子濃度計(jì)算單元168、第二分子濃度計(jì)算單元170、 解離常數(shù)計(jì)算單元172。另外，在分析裝置150上連接有顯示器200。CPU152為設(shè)置在計(jì)算機(jī)上的運(yùn)算處理器。CPU152實(shí)質(zhì)地執(zhí)行熒光壽命計(jì)算單元 158、FRET效率計(jì)算單元160、最短熒光壽命計(jì)算單元162、FRET發(fā)生率計(jì)算單元164、觀察矩陣計(jì)算單元166、第一分子濃度計(jì)算單元168、第二分子濃度計(jì)算單元170、解離常數(shù)計(jì)算單元172的各種計(jì)算。存儲(chǔ)器巧4包括R0M，存儲(chǔ)有通過(guò)在計(jì)算機(jī)上執(zhí)行來(lái)形成熒光壽命計(jì)算單元158、 FRET效率計(jì)算單元160、最短熒光壽命計(jì)算單元162、FRET發(fā)生率計(jì)算單元164、觀察矩陣計(jì)算單元166、第一分子濃度計(jì)算單元168、第二分子濃度計(jì)算單元170、解離常數(shù)計(jì)算單元 172的程序；RAM，存儲(chǔ)通過(guò)這些單元計(jì)算的處理結(jié)果或從輸入輸出端口 156供給的數(shù)據(jù)。輸入輸出端口 156用于接收提供自控制部130的熒光信號(hào)的cos成分(實(shí)數(shù)部)、 sin成分(虛數(shù)部)的值的輸入。另外，輸入輸出端口 156將通過(guò)各單元計(jì)算出的處理結(jié)果輸出到顯示器200上。顯示器200顯示通過(guò)各單元求出的各種信息或處理結(jié)果等。熒光壽命計(jì)算單元158利用通過(guò)測(cè)量部50測(cè)量的熒光信號(hào)計(jì)算出供體分子的熒光壽命。例如，熒光壽命計(jì)算單元158從由控制部130供給的熒光信號(hào)的cos成分以及sin 成分的值求出相對(duì)于調(diào)制信號(hào)的熒光信號(hào)的相位差。另外，熒光壽命計(jì)算單元158利用所求出的相位差計(jì)算出供體分子的熒光壽命、受體分子的熒光壽命。具體來(lái)說(shuō)，熒光壽命計(jì)算單元158通過(guò)將相位差的tan成分用調(diào)制信號(hào)的角頻率相除來(lái)計(jì)算熒光壽命。熒光壽命由被激光照射而發(fā)出的熒光成分為一次滯后系統(tǒng)的弛豫響應(yīng)時(shí)的熒光弛豫時(shí)間常數(shù)表示。進(jìn)一步，熒光壽命計(jì)算單元158計(jì)算出后述的受體分子不存在時(shí)的供體分子的熒光壽命τ D、FRET發(fā)生時(shí)的供體分子的平均熒光壽命τ \、受體分子的熒光壽命τ Α。FRET效率計(jì)算單元160利用在熒光壽命計(jì)算單元158計(jì)算出的受體分子不存在時(shí)的供體分子的熒光壽命td、FRET發(fā)生時(shí)的供體分子的熒光壽命τ *D，計(jì)算出表示根據(jù)FRET 的能量轉(zhuǎn)移程度的FRET效率Ε*。具體來(lái)說(shuō)，F(xiàn)RET效率計(jì)算單元160計(jì)算由后述的式(14) 規(guī)定的FRET效率Ε*。最短熒光壽命計(jì)算單元162計(jì)算作為FRET效率Ε*的最大值的最大FRET效率Emax。 如后述，F(xiàn)RET效率E*根據(jù)由式(16)定義的活細(xì)胞中的供體分子的濃度Cd[M]和受體分子的濃度Ca[M]之比α進(jìn)行變化。最短熒光壽命計(jì)算單元162利用FRET效率計(jì)算單元160 相對(duì)于多個(gè)α計(jì)算出的FRET效率Ε*的結(jié)果，計(jì)算出最大FRET效率^liaxtl另外，如后述的式(18)所示，如果最大FRET效率^iax被定下來(lái)，則作為供體分子的熒光壽命的最小值的最短熒光壽命τ Dmin也被定下來(lái)，最短熒光壽命計(jì)算單元162利用計(jì)算出的最大FRET效率^liax計(jì)算出最短熒光壽命τΜη。FRET發(fā)生率計(jì)算單元164計(jì)算出被后述的式(7)定義、且在活細(xì)胞中的供體分子中與受體分子結(jié)合、且發(fā)生FRET的供體分子的比例kfket。具體來(lái)說(shuō)，F(xiàn)RET發(fā)生率計(jì)算單元 164利用受體分子不存在時(shí)的供體分子的熒光壽命td、FRET發(fā)生時(shí)的供體分子的熒光壽命 τ V最短熒光壽命τΜη計(jì)算出kfket。更加具體地說(shuō)，F(xiàn)RET發(fā)生率計(jì)算單元164根據(jù)后述的式(49)計(jì)算出κ FEETO另外，F(xiàn)RET效率E*、最大FRET效率& 、供體分子的熒光壽命、、FRET發(fā)生時(shí)的供體分子的熒光壽命τ\、最短熒光壽命τΜη之間存在由后述的式(14)、式(18)所示的關(guān)系。因此，F(xiàn)RET發(fā)生率計(jì)算單元164適當(dāng)?shù)乩脻M足式(14)、式(18)的關(guān)系的相互等價(jià)的
物理量能夠計(jì)算出kfket。觀察矩陣計(jì)算單元166計(jì)算出被后述的式(31)定義的觀察矩陣。具體來(lái)說(shuō)，對(duì)僅體現(xiàn)供體分子的樣品、僅體現(xiàn)受體分子的樣品照射激光，利用所測(cè)量的熒光信號(hào)的結(jié)果，通過(guò)后述的式(40)至式(43)計(jì)算出觀察矩陣。通過(guò)觀察矩陣計(jì)算單元166計(jì)算出的觀察矩陣通過(guò)校正透射供體波段的熒光信號(hào)以及透射受體波段的熒光信號(hào)，被用于求出供體分子發(fā)出的熒光信息、以及受體分子發(fā)出的熒光信息。第一分子濃度計(jì)算單元168利用供體分子發(fā)出的熒光信息，計(jì)算出作為活細(xì)胞的樣品12中的供體分子的濃度。具體來(lái)說(shuō)，第一分子濃度計(jì)算第一 168根據(jù)后述的式(15)計(jì)算出供體分子的濃度。第二分子濃度計(jì)算單元170利用受體分子發(fā)出的熒光信息，計(jì)算出作為活細(xì)胞的樣品12中的受體分子的濃度。具體來(lái)說(shuō)，第二分子濃度計(jì)算單元170根據(jù)后述的式(52)計(jì)算出受體分子的濃度。解離常數(shù)計(jì)算單元172計(jì)算出被后述的式(19)定義的、且作為供體分子和受體分子的結(jié)合強(qiáng)度相關(guān)的參數(shù)的解離常數(shù)Kd。具體來(lái)說(shuō)，解離常數(shù)計(jì)算單元172利用FRET發(fā)生率計(jì)算單元164計(jì)算出的κ FKET、第一分子濃度計(jì)算單元168計(jì)算出的供體分子的濃度、第二分子濃度計(jì)算單元170計(jì)算出的受體分子的濃度，計(jì)算出解離常數(shù)Kd。更加具體地說(shuō)，解離常數(shù)計(jì)算單元172根據(jù)后述的式(20)或者式(21)計(jì)算出解離常數(shù)Kd。〈FRET測(cè)量方法的概要〉下面，說(shuō)明在FRET測(cè)量中所使用的各種常數(shù)。圖6為表示FRET測(cè)量方法的一例的圖。如圖6所示，首先，在第一的預(yù)先測(cè)量中測(cè)量最大FRET效率Emax和最短熒光壽命τΜη。另外，在第二的預(yù)先測(cè)量中測(cè)量觀察矩陣。 接著，在作為主測(cè)量的樣品測(cè)量中測(cè)量作為在活細(xì)胞的測(cè)量樣品中的供體分子中發(fā)生FRET 的供體分子的比例的kfket。接著，利用所測(cè)量的Kfket測(cè)量表示供體分子和受體分子的結(jié)合情況的解離常數(shù)Kd。首先，說(shuō)明激光的輸出和被該激光激發(fā)的熒光分子電子數(shù)的關(guān)系。如果將單位時(shí)間且單位體積激發(fā)的熒光分子的電子數(shù)設(shè)為NJlAi3S],則根據(jù)朗伯比爾定律(Lambert-Beer), N0 如下表示。[數(shù)1]N0 = JlA(1-10-EC1)/V (1)在此，JL[l/m2s]表示激光的單位面積、單位時(shí)間的能量(光子數(shù))、A[m2]表示激光照射的面積，ε [1/Mm]表示熒光分子的摩爾吸光系數(shù)、C[M]表示熒光分子的濃度、1 [m]表示光路長(zhǎng)度，V[m3]表示激光照射的物體的體積。熒光分子的濃度非常低時(shí)，式(1)可以接近于如下。[數(shù)2]N0 = InlO · Jl e C (2)另外，如果將激光波長(zhǎng)表示為λ [m]、輸出表示為P[W]，則下面的關(guān)系成立。[數(shù)3]JlA = P λ /hc (3)在此，h[J· s]為普朗克常數(shù)、c[m/s]為光速度。假設(shè)激光的截面形狀為橢圓形、強(qiáng)度分布為二維高斯分布。此時(shí)，直徑為Dc[m]的圓形的活細(xì)胞通過(guò)被激光照射而受到的平均功率Jex[l/m2s]由下述式表示。[數(shù)4]
權(quán)利要求
1.一種FRET測(cè)量方法，將激光照射在用第一分子和第二分子進(jìn)行標(biāo)記的測(cè)量樣品上，并測(cè)量能量從第一分子朝向第二分子轉(zhuǎn)移的FRET，其特征在于，該測(cè)量方法包括如下步驟最短熒光壽命計(jì)算步驟，對(duì)于第一分子濃度和第二分子濃度之比不同的多個(gè)預(yù)先測(cè)量樣品，計(jì)算出第一分子的熒光壽命，并計(jì)算出第一分子的熒光壽命的最小值；照射步驟，將對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光照射在所述測(cè)量樣品上；測(cè)量步驟，測(cè)量所述測(cè)量樣品被所述激光照射而發(fā)出的熒光；第一分子熒光壽命計(jì)算步驟，利用所述測(cè)量步驟中被測(cè)量的熒光信號(hào)計(jì)算出第一分子的熒光壽命；FRET發(fā)生率計(jì)算步驟，利用在所述最短熒光壽命計(jì)算步驟中計(jì)算出的第一分子熒光壽命的最小值和計(jì)算出的所述第一分子熒光壽命，計(jì)算出所述測(cè)量樣品中的第一分子中發(fā)生 FRET的第一分子的比例。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FRET測(cè)量方法，其特征在于，在所述FRET發(fā)生率計(jì)算步驟中，進(jìn)一步利用第二分子不存在時(shí)的第一分子的熒光壽命求出所述比例。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的FRET測(cè)量方法，其特征在于，該方法包括觀察矩陣計(jì)算步驟，在該步驟中從所述測(cè)量步驟中測(cè)量的熒光信號(hào)，計(jì)算出用于求出通過(guò)在所述照射步驟中被激光照射而第一分子發(fā)出的熒光信息和第二分子發(fā)出的熒光信息的矩陣，所述觀察矩陣計(jì)算步驟包括第一步驟，利用對(duì)包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而測(cè)量的熒光信號(hào)，求出所述矩陣成分的一部分；第二步驟，利用對(duì)包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而測(cè)量的熒光信號(hào)，求出所述矩陣成分的一部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的FRET測(cè)量方法，其特征在于，該方法包括解離常數(shù)計(jì)算步驟，在該步驟中利用所述FRET發(fā)生率計(jì)算步驟中計(jì)算出的所述比例計(jì)算出表示第一分子和第二分子結(jié)合情況的解離常數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的FRET測(cè)量方法，其特征在于，在所述第一分子熒光壽命計(jì)算步驟中，利用在所述測(cè)量步驟中測(cè)量的熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差，計(jì)算出第一分子的熒光壽命。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的FRET測(cè)量方法，其特征在于，在所述第一步驟中，利用對(duì)包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而測(cè)量的熒光信號(hào)的振幅、以及所述熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差，求出所述矩陣成分的一部分；在所述第二步驟中，利用對(duì)包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而測(cè)量的熒光信號(hào)的振幅、以及所述熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差，求出所述矩陣成分的一部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的FRET測(cè)量方法，其特征在于，該方法包括第一分子濃度計(jì)算步驟，利用第一分子發(fā)出的熒光信息計(jì)算出第一分子的濃度；第二分子濃度計(jì)算步驟，利用第二分子發(fā)出的熒光信息計(jì)算出第二分子濃度；在所述解離常數(shù)計(jì)算步驟中，利用在所述第一分子濃度計(jì)算步驟中計(jì)算出的第一分子濃度和在所述第二分子濃度計(jì)算步驟中計(jì)算出的第二分子濃度計(jì)算出所述解離常數(shù)。
8.—種FRET測(cè)量裝置，將激光照射在用第一分子和第二分子標(biāo)記的測(cè)量樣品上，由此測(cè)量出能量從第一分子朝向第二分子轉(zhuǎn)移的FRET，其特征在于，包括激光光源部，將對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光照射在所述測(cè)量樣品上； 測(cè)量部，測(cè)量所述測(cè)量樣品被所述激光照射而發(fā)出的熒光； 熒光壽命計(jì)算部，利用所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)計(jì)算出第一分子熒光壽命； 最短熒光壽命計(jì)算部，利用第一分子濃度和第二分子濃度比不同的多個(gè)預(yù)先測(cè)量樣品中的第一分子熒光壽命，計(jì)算出第一分子熒光壽命的最小值；FRET發(fā)生率計(jì)算部，利用在所述最短熒光壽命計(jì)算部中計(jì)算出的第一分子熒光壽命的最小值和在所述熒光壽命計(jì)算部中計(jì)算出的第一分子熒光壽命，計(jì)算出所述測(cè)量樣品中的第一分子中發(fā)生FRET的第一分子的比例。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的FRET測(cè)量裝置，其特征在于，所述FRET發(fā)生率計(jì)算部是進(jìn)一步利用第二分子不存在時(shí)的第一分子的熒光壽命求出所述比例。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的FRET測(cè)量裝置，其特征在于，該裝置包括觀察矩陣計(jì)算部，從所述測(cè)量部中測(cè)量的熒光信號(hào)計(jì)算出用于求出所述測(cè)量樣品被激光照射而第一分子發(fā)出的熒光信息和第二分子發(fā)出的熒光信息的矩陣，在所述觀察矩陣計(jì)算部，利用對(duì)包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而在所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)，求出所述矩陣成分的一部分，并且利用對(duì)包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而在所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)，求出所述矩陣成分的一部分。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10任一項(xiàng)所述的FRET測(cè)量裝置，其特征在于，包括解離常數(shù)計(jì)算部，在該部中利用在所述FRET發(fā)生率計(jì)算部中計(jì)算出的所述比例計(jì)算出表示第一分子和第二分子的結(jié)合狀況的解離常數(shù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至11所述的FRET測(cè)量裝置，其特征在于，所述熒光壽命計(jì)算部利用在所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差計(jì)算出第一分子的熒光壽命。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的FRET測(cè)量裝置，其特征在于，在所述觀察矩陣計(jì)算部， 利用對(duì)包含第一分子但不包含第二分子、且第一分子的濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而在所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)的振幅以及所述熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差求出所述矩陣成分的一部分，并且利用對(duì)包含第二分子但不包含第一分子、且第二分子的濃度不同的多個(gè)樣品照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光而在所述測(cè)量部測(cè)量的熒光信號(hào)的振幅以及所述熒光信號(hào)和調(diào)制所述激光的調(diào)制信號(hào)的相位差求出所述矩陣成分的一部分。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的FRET測(cè)量裝置，其特征在于，該裝置包括第一分子濃度計(jì)算部，利用第一分子發(fā)出的熒光信息計(jì)算出第一分子的濃度； 第二分子濃度計(jì)算部，利用第二分子發(fā)出的熒光信息計(jì)算出第二分子的濃度； 所述解離常數(shù)計(jì)算部利用在所述第一分子濃度計(jì)算部計(jì)算出的第一分子濃度和在所述第二分子濃度計(jì)算部計(jì)算出的第二分子濃度計(jì)算出所述解離常數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種FRET測(cè)量方法及裝置，能夠求出在標(biāo)記作為測(cè)量對(duì)象的活細(xì)胞的蛋白質(zhì)的供體分子中與受體分子結(jié)合且發(fā)生FRET的供體分子的比例，其中，對(duì)于第一分子的濃度和第二分子的濃度比不同的多個(gè)預(yù)先測(cè)量樣品，計(jì)算出第一分子的熒光壽命，并計(jì)算出第一分子的熒光壽命的最小值；照射對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了時(shí)間調(diào)制的激光，并測(cè)量出測(cè)量樣品被激光照射而發(fā)出的熒光；利用所測(cè)量的熒光信號(hào)，計(jì)算出第一分子的熒光壽命；利用第一分子的熒光壽命的最小值和所計(jì)算出的第一分子的熒光壽命，計(jì)算出測(cè)量樣品中的第一分子中發(fā)生FRET的第一分子的比例。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102597746SQ20108004265
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者中田成幸, 星島一輝, 林弘能 申請(qǐng)人:三井造船株式會(huì)社