專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)分子的方法
通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)分子的方法本發(fā)明涉及通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)或者甚至定量化學(xué)和/或生物實(shí)體(entity)的技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明的主題是通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)樣品中的至少ー種靶分子的新方法。質(zhì)譜法是用于分析和檢測(cè)多種類(lèi)型的分子的有力工具。通常，可以利用質(zhì)譜法以其分子量的函數(shù)而檢測(cè)可被電離的任何類(lèi)型的分子。根據(jù)待檢測(cè)分子的性質(zhì)，ー些質(zhì)譜技術(shù)可能更適合。通過(guò)非排他性實(shí)例，可提及的有使用用于分析非常大的分子(如聚苯乙烯)的MALDI-T0F(首字母縮寫(xiě)詞)型質(zhì)譜法(基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法)(D. Schriemer 和 L. Li，Analytical Chemistry, 1996,68 ；2721-2725)和使用用于定量檢測(cè)生物流體中的小分子的串聯(lián)質(zhì)量分析器的質(zhì)譜法(Hans H. Maurer, Analytical and Bioanalytical Chemistry,2007，388，1315-1325)。例如，文獻(xiàn)DE 10 2007 060669 Al、US 2005/063864A1 和 US 2005/211891 Al 描述了這些技術(shù)及其可能的組合。不管用于檢測(cè)的質(zhì)譜方法如何，檢測(cè)都包括將靶分子電離成“分子”離子的步驟和根據(jù)所獲得的分子離子的質(zhì)量對(duì)其進(jìn)行分離的步驟。因此，所有質(zhì)譜儀都包括i)電離源，旨在電離待分析樣品中存在的分子，即用以使這些分子帶正電荷或負(fù)電伺；ii)質(zhì)量分析器，旨在根據(jù)經(jīng)電離的分子或分子離子的質(zhì)量電荷比(m/z)對(duì)其進(jìn)行分離；iii)檢測(cè)器，如下文詳述的，旨在測(cè)定由分子離子直接產(chǎn)生或者由分子離子產(chǎn)生的離子所產(chǎn)生的信號(hào)。可進(jìn)行一次根據(jù)分子離子的m/z比對(duì)分子離子的分離(單質(zhì)譜法或MS)，或者可以進(jìn)行數(shù)個(gè)連續(xù)的MS分離。當(dāng)進(jìn)行兩個(gè)連續(xù)的MS分離時(shí)，將分析稱(chēng)為MS/MS或MS2。當(dāng)進(jìn)行三個(gè)連續(xù)的MS分離時(shí)，將分析稱(chēng)為MS/MS/MS或MS3，并且更常見(jiàn)地，當(dāng)進(jìn)行η個(gè)連續(xù)的MS 分離時(shí)，將分析稱(chēng)為MSn。在這些實(shí)施數(shù)個(gè)連續(xù)分離的技術(shù)中，在測(cè)定單個(gè)靶分子的情況下的SRM(選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè))模式，或者在測(cè)定數(shù)個(gè)靶分子的情況下的MRM(多反應(yīng)監(jiān)測(cè))模式是MS2分離的具體用途。類(lèi)似地，MRM3模式是通過(guò)MS/MS/MS分離的具體用途。在以單MS模式檢測(cè)的情況下，與待檢測(cè)的靶分子相關(guān)聯(lián)的是所獲得的分子離子的質(zhì)量/電荷比。在MS/MS模式檢測(cè)的情況下，與MS測(cè)定相比主要加入了兩個(gè)步驟，即(i)對(duì)分子離子進(jìn)行裂解(由此所述分子離子被稱(chēng)為前體離子)，由此產(chǎn)生被稱(chēng)為第1代碎片離子的離子；和(ii)根據(jù)稱(chēng)為第1代碎片離子的離子的質(zhì)量對(duì)其進(jìn)行分離。因此，與待檢測(cè)靶分子相關(guān)聯(lián)的是所產(chǎn)生的第1代碎片離子的質(zhì)量/電荷比。術(shù)語(yǔ)“第1代碎片離子”旨在表示在裂解步驟后由前體離子產(chǎn)生的離子，并且其質(zhì)量電荷比m/ ζ不同于前體離子。
無(wú)論如何，根據(jù)離子的m/z比在質(zhì)譜儀的檢測(cè)器上連續(xù)進(jìn)行目的離子的檢測(cè)。除了目的離子的檢測(cè)外，質(zhì)譜法還可以使得能定量測(cè)定目的樣品中的ー種或多種靶分子。質(zhì)譜法是有望能夠取代之前開(kāi)發(fā)的技木，尤其是取代ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)的蛋白測(cè)定技術(shù)。在多種已知的ELISA技術(shù)中，最廣泛使用的是“三明治反應(yīng)(sandwich reaction) ”。這需要針對(duì)目的蛋白的兩個(gè)抗體，其中一個(gè)與酶相連。本申請(qǐng)人(T.Fortin et al.，MCP, 2008 E-pub)和其他人(L.Anderson & C. Hunter，MCP，2006，573-588 ；H. Zhang et al. , MCP, 2007,64-71)已經(jīng)驗(yàn)證了在復(fù)雜流體中利用質(zhì)譜技術(shù)通過(guò)蛋白的蛋白水解肽而進(jìn)行的蛋白定量測(cè)定，其中所述蛋白水解肽通過(guò)利用酶消化目的蛋白而獲得并且是目的蛋白特異性的。MS2分離的某些應(yīng)用模式尤其適合于通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行的定量測(cè)定。SRM和MRM模式因此允許高靈敏度和高特異性的測(cè)定。這些MS2模式可以在三重四極桿型質(zhì)譜儀中實(shí)施。 SRM模式或者M(jìn)RM模式的原理是特異選擇前體離子，使其裂解，然后特異選擇ー種其碎片離子。對(duì)于此類(lèi)應(yīng)用，通常使用三重四極桿裝置或者三重四極桿串聯(lián)離子阱。在以MS3模式使用三重四極桿裝置的情況下，為了測(cè)定靶蛋白，第一四極桿Oil)使得能根據(jù)分子離子的質(zhì)量電荷比(m/z)對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾，所述分子離子對(duì)應(yīng)于在之前的裂解步驟獲得的待測(cè)蛋白所特有的蛋白水解肽。僅具有所尋求的蛋白水解肽的質(zhì)量電荷比(所述質(zhì)量電荷比被稱(chēng)為(m/z)》的肽被傳送至第二四極桿(q2)，并且發(fā)揮前體離子的作用，用于隨后的裂解。q2分析器使得能將質(zhì)量/電荷比為(HiA)1的肽裂解成第1代碎片離子。所述裂解通常通過(guò)q2中前體肽與惰性氣體(例如氮或氬)的碰撞而實(shí)現(xiàn)。第1代碎片離子被傳送至第三四極桿(Q3)，該第三四極桿根據(jù)特定的質(zhì)量電荷比 (所述比被稱(chēng)為(m/z)2)過(guò)濾第1代碎片離子。僅具有所尋求的蛋白水解肽所特有的碎片的質(zhì)量/電荷比(m/z)2的第1代碎片離子被傳送至檢測(cè)器以進(jìn)行定量。該操作模式在關(guān)系上具有雙重選擇性，一方面，是對(duì)于前體離子的選擇，另一方面，是對(duì)于第1代碎片離子的選擇。因此，SRM或MRM模式的質(zhì)譜法有利于定量。檢測(cè)器中所測(cè)定的由第1代碎片離子誘發(fā)的電流強(qiáng)度與第1代碎片離子的量成正比，第1代碎片離子的量自身與前體離子的量成正比，前體離子的量自身與待測(cè)定的蛋白質(zhì)的量成正比。因此，所測(cè)定的由第1代碎片離子誘發(fā)的電流量與待測(cè)定的蛋白質(zhì)的量成正比。盡管如此，仍有必要進(jìn)行校準(zhǔn)，以能夠使由第1代碎片離子誘發(fā)的電流量與第1代碎片離子的相應(yīng)量具有相關(guān)性，并最終與待測(cè)定的蛋白質(zhì)的量具有相關(guān)性?？稍诳梢砸訫S/MS 模式操作的不同質(zhì)譜模式下測(cè)定被稱(chēng)為“躍遷”的(m/zh和011ム)2對(duì)。在三重四極桿串聯(lián)離子阱類(lèi)型的裝置中，操作和分析模式可同于上文所示的傳統(tǒng)三重四極桿模式。或者，可然后以3D或者線(xiàn)性離子阱模式操作Q3四極桿。此離子阱允許數(shù)個(gè)第1代碎片離子(m/zh的選擇并逐步且在適當(dāng)時(shí)的連續(xù)排出以通過(guò)施加于阱的電壓變化對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，這引起阱內(nèi)射頻電壓變化并因此引起期望被逐個(gè)排出至檢測(cè)器以對(duì)其進(jìn)行定量的第1代碎片離子的共振。與ELISA測(cè)定法相比，質(zhì)譜測(cè)定法的優(yōu)勢(shì)在于開(kāi)發(fā)該測(cè)定法所用的成本和時(shí)間明顯減少，特別是在必須開(kāi)發(fā)ELISA測(cè)定所需的抗體的情況下更是如此。因此，這類(lèi)質(zhì)譜技術(shù)似乎是用于測(cè)定蛋白質(zhì)的可選方法，并且使得能例如更簡(jiǎn)單和更快速地證實(shí)測(cè)定由蛋白質(zhì)組分析的研究而鑒定為潛在標(biāo)記的眾多蛋白質(zhì)的臨床意義(S. Carr & L.Anderson，Clin. Cem. 2008，1749-1752)。通過(guò)質(zhì)譜法也可以對(duì)非常多的非蛋白分子進(jìn)行定量測(cè)定?？商峒暗挠袚诫s產(chǎn)品(M. Thevis & I SchSnzer, Analytical and Bioanalytical Chemistry,2007,388, 1351-1358)、環(huán)境中存在的污染物(M. Kuster, M. Lopez de Alda, D. Barcelo, Journal of chromatography A, 2009,1216 (3), 520-529)或者食品基質(zhì)(Pic0Y，F(xiàn)ont G，Ruiz MJ, Fernandez Μ, Mass spectrometry review, 2006, 25 (6), 917-960)的研究。由于質(zhì)譜法的靈敏度和特異性，其使得不僅能夠?qū)崿F(xiàn)遠(yuǎn)低于之前的分析方法(例如HPLC-UV)的檢測(cè)限， 并且還能夠簡(jiǎn)化萃取方法。如今，在電離源和界面方面的儀器進(jìn)展使得能分析之前通過(guò)氣相色譜分析的分子(例如雌激素)。并且在某些情況下，可能必需對(duì)整個(gè)分子家族或者甚至是數(shù)個(gè)分子家族進(jìn)行測(cè)定。因此，可以同時(shí)測(cè)定數(shù)百個(gè)化合物(J.Wang J，D. Leung，Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009，57 (6)，2162-73)，而這種測(cè)定目前通常在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室按常規(guī)進(jìn)行。盡管質(zhì)譜技術(shù)提供了優(yōu)勢(shì)，但由于逐個(gè)檢測(cè)所尋求的物質(zhì)，所尋求的分子的分析和檢測(cè)循環(huán)時(shí)間一般經(jīng)證明相對(duì)較長(zhǎng)。在這種情況下，本發(fā)明的目的在于提出一種通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)或者甚至測(cè)定分子的方法，該方法可以顯著降低通過(guò)質(zhì)譜法分析的檢測(cè)循環(huán)數(shù)。為此目的，本發(fā)明提出了通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)樣品中的至少ー種靶分子的新方法，其中a)通過(guò)至少一個(gè)電離裝置電離所述樣品的分子，從而獲得分子離子b)進(jìn)行以下步驟⑴和(ii)n次，η等于0、1、2、3或4:(i)在質(zhì)量分析器中根據(jù)所述靶分子選擇前述步驟中獲得的至少ー種離子，和(ii)在裂解單元(fragmentation cell)中裂解由此選擇的所述至少一種離子；c)在質(zhì)量分析器中捕獲當(dāng)η為0時(shí)在步驟a)中獲得的至少兩種不同離子或者當(dāng) η非0時(shí)在步驟b)中獲得的至少兩種不同離子，由此捕獲的所述至少兩種離子是所述靶分子的特征離子并且具有所述靶分子所特有的質(zhì)量電荷比m/z ；d)從所述質(zhì)量分析器中排出所捕獲的所述特征離子；以及e)通過(guò)檢測(cè)裝置檢測(cè)所排出的所述特征離子，所述方法的特征在干，所述特征離子在步驟d)中被同時(shí)排出且在步驟e)中被同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明人已經(jīng)證明，靶分子的多種特征離子的同時(shí)排出和檢測(cè)使得能顯著降低待處理的數(shù)據(jù)量并由此降低循環(huán)和分析時(shí)間。通過(guò)較短時(shí)間的分析循環(huán)，使得能連續(xù)檢測(cè)較多數(shù)量的不同分子。當(dāng)必須進(jìn)行多重測(cè)定時(shí)，這種能力尤其有益。此外，在進(jìn)行靶分子的定量測(cè)定吋，令人驚訝且尤其有益的是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，以m/z比表征的靶分子的多種特征離子的同時(shí)排出顯著改善了用于測(cè)定所檢測(cè)樣品中的目的分子的檢測(cè)信號(hào)的信噪比。此外，信噪比的這種改善還降低了該方法的定量限，特別是與已知的MRM方法相比更是如此。本發(fā)明的方法適合檢測(cè)可被電離的任何類(lèi)型的分子，而不管其性質(zhì)如何，并且尤其適合檢測(cè)肽、脂質(zhì)、糖脂、糖蛋白、核酸、代謝物、揮發(fā)性化合物、雌激素類(lèi)型的小分子等。
可實(shí)施本發(fā)明方法的樣品為可能包含靶分子的任何樣品。所述樣品可以為生物 (或者動(dòng)物、植物或人)來(lái)源。因此，所述樣品可對(duì)應(yīng)于生物流體樣品(例如全血、血清、血漿、尿、腦脊髓液、器官分泌物)、組織樣品或者分離細(xì)胞的樣品。該樣品可以以此使用或者可以在分析前通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法經(jīng)富集、萃取、濃縮、純化型的制備。所述樣品可以為エ業(yè)來(lái)源，即非窮舉實(shí)例為空氣樣品、水樣品、取自表面的樣品、成分或加工產(chǎn)品或食品來(lái)源的產(chǎn)品。在食物來(lái)源的樣品中，以非窮舉方式可提及的有乳產(chǎn)品(酸乳、乳酪) 樣品、肉樣品、魚(yú)樣品、蛋樣品、水果樣品、蔬菜樣品、水樣品或飲料(乳、果汁、蘇打等)樣品。這些食物來(lái)源的樣品還可以來(lái)自經(jīng)制備的菜肴或調(diào)味料。最后，食物樣品可源自動(dòng)物飼料，例如尤其是動(dòng)物膳食。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，尤其為了分析和檢測(cè)蛋白的蛋白水解肽，出于純化目的而對(duì)所述樣品進(jìn)行預(yù)處理。樣品的預(yù)處理對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的并且尤其可利用電泳或色譜技木。這些分離技術(shù)可以單獨(dú)使用或者彼此組合使用，以獲得多維分離。例如，如TJortin et al.，(見(jiàn)上文)，H. Keshishian et al.，(見(jiàn)上文)所述，可以通過(guò)組合離子交換色譜分離和反相色譜而使用多維色譜。在這些出版物中，色譜介質(zhì)可以為柱或者筒(固相萃取)。蛋白水解肽的電泳或色譜級(jí)分(或者一維或多維色譜的滯留時(shí)間)是各個(gè)肽特有的并且這些技術(shù)的實(shí)施由此使得能選擇待測(cè)定的蛋白水解肽。由此產(chǎn)生的此類(lèi)肽級(jí)分使得能提高隨后質(zhì)譜測(cè)定法的特異性。對(duì)肽進(jìn)行分級(jí)的電泳或者色譜技術(shù)的替代方式在于N-糖肽的特異性純化 (J. Stal-Zeng et al.，MCP，2007，1809-1817 和專(zhuān)利申請(qǐng) WO 2008/066629)。然而，此類(lèi)純化僅允許定量已經(jīng)歷N-糖基化型翻譯后修飾的肽。但事實(shí)上，并不是所有蛋白都經(jīng)歷糖基化，因此這限制了其使用。用于對(duì)肽進(jìn)行分級(jí)而進(jìn)行另ー個(gè)選擇在于免疫純化目的肽，例如通過(guò)親和層析對(duì)目的肽進(jìn)行免疫純化。該方法通過(guò)獲得僅含待分析肽的級(jí)分(和可能的ー些污染肽)而使得能大幅降低樣品的復(fù)雜度。被稱(chēng)為SISCAPA的此方法描述在L. Anderson et al.(見(jiàn)上文)和專(zhuān)利申請(qǐng)US 2004/0072251中。優(yōu)選地，不管所選擇和實(shí)施的本發(fā)明方法的變體如何，當(dāng)靶分子為蛋白的蛋白水解肽時(shí)，本發(fā)明的方法經(jīng)證明尤其有用和有利。在這種情況下，已經(jīng)對(duì)待分析的樣品進(jìn)行預(yù)處理以由初始樣品中存在的所有蛋白產(chǎn)生肽，從而將這些蛋白裂解為肽，例如，利用蛋白水解酶(蛋白酶)消化，或者通過(guò)化學(xué)試劑的作用而將這些蛋白裂解為肽。實(shí)際上，可以通過(guò)物理化學(xué)處理的方式，通過(guò)生物學(xué)處理的方式，或者通過(guò)組合所述兩種處理的方式，進(jìn)行蛋白裂解。在所述可使用的處理中，可提及的有用羥基尤其是用 H2O2進(jìn)行處理。用羥基的處理引起在蛋白的任意肽鍵上隨機(jī)發(fā)生肽鍵的斷裂。羥基的濃度決定進(jìn)行斷裂的數(shù)量和由此獲得的肽碎片的長(zhǎng)度。還可以使用其他化學(xué)處理，例如用溴化氰(CNBr)的處理，其中溴化氰特異性地在甲硫氨?；聂然鶊F(tuán)水平上裂解肽鍵。還能通過(guò)在1000°c加熱蛋白的三氟乙酸溶液而在天冬氨?；鶜埢缴线M(jìn)行部分酸裂解。無(wú)論如何，優(yōu)選通過(guò)酶促消化而處理蛋白質(zhì)。與物理化學(xué)處理相比，酶促消化提供給蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以較大的保護(hù)，并且較容易控制。術(shù)語(yǔ)“酶促消化”意在指一種或多種酶在合適的反應(yīng)條件下的單作用或組合作用。進(jìn)行蛋白水解的酶(被稱(chēng)為蛋白酶)在特定位點(diǎn)裂解蛋白。各蛋白酶通常識(shí)別總是在其中進(jìn)行相同裂解的氨基酸序列。某些蛋白酶識(shí)別單個(gè)氨基酸或兩個(gè)氨基酸的序列(在它們之間進(jìn)行切割)；其他蛋白酶僅識(shí)別較長(zhǎng)的序列。這些蛋白酶可為內(nèi)切蛋白酶或外切蛋白酶。在已知的蛋白酶中，可提及的有W02005/098071中描述的如下蛋白酶-特異性酶，例如，裂解Arg和Lys殘基的羧基上的肽鍵的胰蛋白酶，裂解賴(lài)氨酸的-CO基團(tuán)的肽鍵的內(nèi)溶素(endolysin)，水解芳香基(WnTyrWlTrp)的羧基上的肽鍵的糜蛋白酶，裂解芳香基(Phe、Tyr以及Trp)的NH2基團(tuán)的胃蛋白酶，以及裂解Glu殘基的羧基上的肽鍵的金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)V8菌株的V8蛋白酶；-非特異性酶，例如，源自嗜熱溶蛋白芽孢桿菌(Bacillusthermoproteolyticus) 的熱解素，其水解疏水氨基酸(Xaa-Leu，Xaa-IIe，Xaa-Phe)的NH2基團(tuán)的肽鍵；枯草菌溶素和鏈霉蛋白酶，它們是實(shí)際上水解所有鍵且可在受控反應(yīng)條件(酶濃度和反應(yīng)時(shí)間)下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為寡肽的細(xì)菌蛋白酶。幾種蛋白酶可以同時(shí)使用(如果它們的作用方式相客)或它們可順次使用。在本發(fā)明的情況中，優(yōu)選通過(guò)蛋白酶(例如胰蛋白酶)的作用進(jìn)行樣品的消化。這樣的處理步驟使得能將初始樣品中存在的以蛋白質(zhì)為代表的大分子轉(zhuǎn)化為將存在于目的樣品中的小分子肽。由此提高隨后質(zhì)譜法檢測(cè)的靈敏度。另外，對(duì)于給定靶蛋白來(lái)說(shuō)，所述處理步驟使得能產(chǎn)生數(shù)種蛋白水解肽，也稱(chēng)為報(bào)告肽。此外，各蛋白水解肽的特異性必須通過(guò)確保例如沒(méi)有其他蛋白質(zhì)包含相同的肽序列或沒(méi)有其他躍遷干擾而進(jìn)行驗(yàn)證。所述處理由此使得能提高獲得待測(cè)定蛋白質(zhì)特異性的 ー種或多種蛋白水解肽的可能性。各蛋白水解肽使得能通過(guò)獨(dú)立的測(cè)定方式來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)
オ了足里。另外，最普遍地，為了確保適于測(cè)定復(fù)雜流體(血液、血清、血漿、尿液、糞便、痰等)中數(shù)ng/ml濃度的蛋白質(zhì)的靈敏度和特異性，通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行的定量測(cè)定應(yīng)在消化步驟以及穿插于消化步驟前后的其他步驟之前，例如階段1 蛋白分級(jí)，以消除主要蛋白(非靶蛋白)，或通過(guò)如下任何合適的技術(shù)純化樣品電泳、色譜、免疫捕獲(Kulasingam et al.，J. Proteome Res.，2008，640-647)。然而， 后一種技術(shù)需要擁有或制備針對(duì)靶蛋白的特異性抗體，而要獲得該抗體花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)且成本高。另外，通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行的測(cè)定接下來(lái)的性能水平與抗體的質(zhì)量和特異性部分相關(guān)。階段2 變性、還原和封閉巰基官能團(tuán)；階段3:消化；階段4 肽分級(jí)；階段2使得能増加消化產(chǎn)率，并確保測(cè)定在再現(xiàn)性和穩(wěn)定性方面較強(qiáng)大。當(dāng)不需要大的靈敏度時(shí)，階段1和4是任選的(L.Anderson & C. Hunter，MCP，見(jiàn)上文)。相反， 當(dāng)需要大的靈敏度(數(shù)ng/ml)吋，它們是必需的。這已經(jīng)被TJortin et al.,(見(jiàn)上文)，H.Keshishian et al.，MCP，2007，2212-2229 和 V. Kulasingam et al.，J. Proteome Res.,2008,640-647, L.Anderson et al. , J. Proteome Res.，2004，235—2344 以及 US 2004/0072251所證實(shí)。此外，在質(zhì)譜法之前進(jìn)行肽色譜分離通過(guò)降低污染肽的數(shù)量而產(chǎn)生了額外的特異性水平(M-Duncan et al.，Proteomics，2009，9 1124-1127)。在本發(fā)明的方法中，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法實(shí)施電離步驟a)。 電離源使得能使分子氣化并使之電離。電離源可以以陽(yáng)性模式使用以研究陽(yáng)離子，或者以陰性模式使用以研究陰離子。存在數(shù)種類(lèi)型的電離源并且根據(jù)期望的結(jié)果和所分析的分子而使用。尤其可提及的有-電子電離(EI)，化學(xué)電離(Cl)和解吸電離(DCI)；-快原子轟擊(FAB)，亞穩(wěn)原子轟擊(MAB)或離子轟擊(SIMS，LSIMS)；-電感耦合等離子體(ICP)；-大氣壓化學(xué)電離(APCI)和大氣壓光電離(APPI)；-電噴射電離(ESI)；-基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)，表面增強(qiáng)激光解吸電離(SELDI)或硅上解吸/ 電離(DIOS)；-通過(guò)與亞穩(wěn)物質(zhì)的相互作用的電離-解吸(DART)。特別地，可以按照以下進(jìn)行電離將含靶分子的樣品引入至電離源，所述分子在此于氣態(tài)下電離，并因此被轉(zhuǎn)化為與起始分子對(duì)應(yīng)的分子離子。電離源使得能電離分子并獲得對(duì)應(yīng)于以液態(tài)存在的分子的分子離子，所述分子離子以陽(yáng)性模式具有ー個(gè)、兩個(gè)、甚至三個(gè)或更多額外的質(zhì)子且因此攜帶ー個(gè)、兩個(gè)、甚至三個(gè)或更多電荷。例如，在靶分子為蛋白吋，借助于以陽(yáng)性模式工作的電噴射型電離源，在靶蛋白分級(jí)后獲得的蛋白水解肽的電離導(dǎo)致具有ー個(gè)、兩個(gè)、甚至三個(gè)或更多個(gè)額外質(zhì)子并因此攜帯ー個(gè)、兩個(gè)、甚至三個(gè)或更多電荷的氣態(tài)多肽離子，并允許由液態(tài)變成氣態(tài)(feskell， Electrospray !principles and practise, J.Mass Spectrom. (1997)，32，677-688)。當(dāng)通過(guò)反相液相色譜預(yù)先對(duì)靶分子或所獲得的蛋白水解肽進(jìn)行分離時(shí)，該類(lèi)型的電離源特別合適。盡管如此，樣品中存在的分子的電離率仍可根據(jù)存在的不同分子的濃度和性質(zhì)而變化。 該現(xiàn)象導(dǎo)致本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基質(zhì)效應(yīng)。MALDI電離源使得能電離來(lái)自固態(tài)樣品的分子。在其中進(jìn)行本發(fā)明的方法的捕獲步驟b)的質(zhì)量分析器使得能根據(jù)離子的質(zhì)量/ 電荷比(m/z)來(lái)分離離子。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何質(zhì)量分析器。可提及的有低分辨率分析器、 四極桿0 、3D離子阱(IT)或者線(xiàn)性離子阱(LIT)型，和用于測(cè)定分析物的準(zhǔn)確質(zhì)量的高分辨率分析器和，尤其是使用與扇形電場(chǎng)偶聯(lián)的扇形磁場(chǎng)的高分辨率分析器，以及飛行時(shí)間(TOF)。根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選特征，步驟C)中使用的質(zhì)量分析器為離子阱。此類(lèi)離子阱具有允許根據(jù)離子的m/z比選擇離子還允許同時(shí)排出m/z比為目的靶分子特有的離子的優(yōu)勢(shì)。有利地，該離子阱可以為3D或線(xiàn)型。通過(guò)此離子阱的使用，通過(guò)射頻的方式使質(zhì)量電荷比m/z為靶分子特有的離子在離子阱中同時(shí)共振，從而進(jìn)行所述離子的排出。這些射頻通過(guò)離子阱組成電極的電源電壓的變化而發(fā)射?？梢圆捎?，例如包含待排出離子的所有射頻的寬帶射頻。所使用的射頻范圍可能對(duì)應(yīng)于疊加的一組射頻帶，在所述射頻帶組中的各射頻帶集中于待排出的離子的阱的特有震云カ頻率，或其宏運(yùn)云力(secular motion)的頻率(R. Ε. March, Int. J. Mass Spectrom.,1997,32 351.)。優(yōu)選地，各帶將對(duì)應(yīng)于集中于待排出離子的宏運(yùn)動(dòng)的特有頻率的射頻帶。因此獲得具有不同質(zhì)量電荷比m/z值的各種離子的同時(shí)排出。根據(jù)本發(fā)明方法的另ー個(gè)優(yōu)選特征，在排出和檢測(cè)具有靶分子特有的質(zhì)量電荷比 m/z的離子前，清空質(zhì)量分析器?？梢圆捎?，例如不含隨后將被排出的特征離子的射頻的寬帶射頻。所使用的射頻范圍將不含下述射頻帶組即，其中在所述射頻帶組中的各射頻帶集中于特征離子的宏運(yùn)動(dòng)的特有頻率。優(yōu)選地，各缺乏的射頻帶將對(duì)應(yīng)于集中于特征離子的宏運(yùn)動(dòng)的特有頻率的射頻帯。因此，除了所選擇的各種特征離子將隨后被排出外，獲得存在于質(zhì)量分析器中的所有離子的同時(shí)排出。本發(fā)明的方法可以是根據(jù)η值的MSn+1，η為對(duì)應(yīng)于裂解步驟的進(jìn)行次數(shù)的整數(shù)。因此，當(dāng)本發(fā)明的方法為單個(gè)MS吋，η為0，該方法沒(méi)有步驟b)并且包括以下步驟a)通過(guò)至少一個(gè)電離裝置電離樣品的分子，從而獲得分子離子；和c)在質(zhì)量分析器中捕獲步驟a)中獲得的至少兩種不同離子，由此捕獲的所述至少兩種離子是靶分子的特征離子并且具有所述靶分子特有的質(zhì)量電荷比m/z ；d)從所述質(zhì)量分析器排出所捕獲的所述特征離子；以及e)通過(guò)檢測(cè)裝置檢測(cè)所排出的所述特征離子，可以理解所述特征離子在步驟d)中被同時(shí)排出并且在步驟e)中被同時(shí)檢測(cè)。當(dāng)本發(fā)明的方法不是單個(gè)MS吋，η為1、2、3或4。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施變體，本發(fā)明的方法為MS/MS，從而使η為1并且步驟c)中捕獲的至少兩種不同的離子為第1代碎片離子。在這種情況下，本發(fā)明的方法包括以下步驟a)通過(guò)至少一個(gè)電離裝置電離樣品的分子，從而獲得分子離子；b)進(jìn)行以下步驟⑴和(ii) 1次(i)在質(zhì)量分析器中根據(jù)靶分子選擇前述步驟中獲得的被稱(chēng)為前體離子的至少ー 種離子，和(ii)在裂解単元中裂解由此選擇的所述至少ー種離子，從而產(chǎn)生至少兩種第1代碎片離子；c)在所述質(zhì)量分析器中捕獲步驟b)中獲得的至少兩種不同的離子，由此捕獲的所述至少兩種離子是靶分子的特征離子并且具有所述靶分子特有的質(zhì)量電荷比m/z ；d)從所述質(zhì)量分析器排出所捕獲的所述特征離子；以及e)通過(guò)檢測(cè)裝置檢測(cè)所排出的所述特征離子，可以理解所述特征離子在步驟d)中被同時(shí)排出并且在步驟e)中被同時(shí)檢測(cè)。在這種情況下，用于在步驟b)中根據(jù)質(zhì)量選擇離子的質(zhì)量分析器是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何質(zhì)量分析器，例如離子阱或者四極桿分析器。通過(guò)與諸如氬或氮的中性氣體(neutral gas)碰撞，通過(guò)強(qiáng)光源的方式、與電子或自由基碰撞、應(yīng)用電位差或者任何其他活化模式進(jìn)行的光激發(fā)或光解離，而進(jìn)行所選擇離子的裂解。離子的裂解在裂解単元中進(jìn)行，所述裂解単元為，例如也能夠?qū)崿F(xiàn)離子分離的三重四極桿型(L.Anderson & C. Hunter，MCP，2006，573-588)，或者離子阱型(B.Han & R. Higgs, Brief Funct Genomic Proteomic. 2008 S ??；7(5) :340- )，或者飛行時(shí)間(TOF) 類(lèi)型(K.-Y.Wang et al.，Anal Chem，2008，80 (16) 6159-6167)的模式。當(dāng)通過(guò)與諸如氮或氬的惰性氣體(inert gas)碰撞實(shí)施裂解吋，這可以在電場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行或僅通過(guò)在例如飛行時(shí)間管中使用電位差來(lái)進(jìn)行。電場(chǎng)的特性決定了裂解的強(qiáng)度和性質(zhì)。因此，在惰性氣體存在下應(yīng)用的電場(chǎng)(例如在四極桿中)決定了應(yīng)用于離子的碰撞能。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)該碰撞能進(jìn)行優(yōu)化，以根據(jù)所使用的光譜測(cè)定裝置而提高待測(cè)定的躍遷的靈敏度。通過(guò)舉例，在來(lái)自Applied Biosystems公司(Foster City，美國(guó))的AB SCIEX QTRAP 5500質(zhì)譜儀的q2中的碰撞能可能在5和180eV之間變化。相似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)碰撞步驟持續(xù)時(shí)間和例如離子阱中的激發(fā)能進(jìn)行優(yōu)化，以產(chǎn)生可能最敏感的測(cè)定。通過(guò)舉例，可使來(lái)自Applied Biosystems公司的AB SCIEX QTRAP5500質(zhì)譜儀的 Q3中的該持續(xù)時(shí)間(稱(chēng)為激發(fā)時(shí)間)在0. OlOms和50ms之間變化，使激發(fā)能在0和1 (任意単位)之間變化。根據(jù)另ー個(gè)變體，本發(fā)明的方法為MS/MS/MS，從而使η為2，并且在步驟c)中捕獲的至少兩種不同離子為第2代碎片離子。在這種情況下，本發(fā)明的方法包括以下步驟a)通過(guò)至少一個(gè)電離裝置電離樣品的分子，從而獲得分子離子；b)進(jìn)行以下步驟⑴和(ii)(i)在質(zhì)量分析器中根據(jù)靶分子選擇前述步驟中獲得的被稱(chēng)為前體離子的至少ー 種離子，和(ii)在裂解単元中裂解由此選擇的所述至少ー種離子，從而產(chǎn)生第1代碎片離子，然后(iii)在所述質(zhì)量分析器中根據(jù)所述靶分子選擇至少ー種第1代碎片離子，和(iv)在裂解単元中裂解由此選擇的所述至少ー種離子，從而產(chǎn)生至少兩種第2代碎片離子；c)在所述質(zhì)量分析器中捕獲步驟b)中獲得的至少兩種不同的第2代碎片離子，由此捕獲的所述至少兩種離子是所述靶分子的特征離子并且具有所述靶分子特有的質(zhì)量電 可比m/ ζ ；d)從所述質(zhì)量分析器排出所捕獲的所述特征離子；以及e)通過(guò)檢測(cè)裝置檢測(cè)所排出的所述特征離子，可以理解，所述特征離子在步驟d)中被同時(shí)排出并且在步驟e)中被同時(shí)檢測(cè)。在這種情況下，用于在步驟b)中根據(jù)質(zhì)量選擇離子的質(zhì)量分析器為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何質(zhì)量分析器，例如離子阱分析器，或者三重四極桿0ilq2Q3)串聯(lián)離子阱分折器，其與四極桿分析器的區(qū)別在于四極桿Q3以3D或者線(xiàn)性離子阱模式工作。當(dāng)本發(fā)明的方法利用串聯(lián)質(zhì)譜法(MS2、MS3、MS4或MS5)吋，由此可以使數(shù)個(gè)質(zhì)量分折器偶聯(lián)在一起。例如，第一分析器分離離子，碰撞單元使得能使離子裂解，而第二分析器分離碎片離子。ー些分析器，例如離子阱或FT-ICR本身包含數(shù)個(gè)分析器，并且使得能裂解離子并直接分析碎片。本發(fā)明的方法可尤其但不排他地應(yīng)用于所謂MRM3的光譜測(cè)定技木。利用此類(lèi)技木，三重四極桿串聯(lián)離子阱類(lèi)型的實(shí)驗(yàn)分析器構(gòu)造是最常使用的。這種質(zhì)譜法構(gòu)造顯示非常好的選擇性和良好的檢測(cè)靈敏度，這尤其對(duì)于復(fù)雜樣品(例如生物流體樣品)中蛋白的
良好量化非常重要。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，在MSn+1類(lèi)型中進(jìn)行分析并且η為1、2、3或4 -步驟b)中使用的質(zhì)量分析器是離子阱或者四極桿，-裂解單元為離子阱或四極桿。根據(jù)本發(fā)明的另ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，在除單個(gè)MS以外的模式中，在單個(gè)裝置(即離子阱)中進(jìn)行步驟b)和c)，則使所使用的材料簡(jiǎn)單化。通常，在本發(fā)明的方法中，還能設(shè)想并實(shí)施如下操作即，在排出離子阱中存在的污染離子前對(duì)于特定碎片離子進(jìn)行同時(shí)排出以及同時(shí)檢測(cè)。在這種情況下，采用不含隨后將被排出的特征離子的射頻的寬帶射頻波。所述方法還感興趣于根據(jù)最近發(fā)表的G. Cooks組[Q. Song et al. Anal. Chem. 2009，81，1833-1840]的裝置，用于在四極桿中同時(shí)傳送由同一分子的電離產(chǎn)生的m/ ζ值不同的分子離子。在這種情況下，可同時(shí)捕獲并裂解來(lái)自同一分子的兩種分子離子，從而同時(shí)排出由所述兩種分子離子的裂解產(chǎn)生的碎片離子。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行通過(guò)檢測(cè)而與靶分子關(guān)聯(lián)的特征離子的選擇。有利的是，這種選擇將產(chǎn)生盡可能靈敏、盡可能特異且在可重復(fù)性和可靠性方面盡可能強(qiáng)的測(cè)定法。在經(jīng)開(kāi)發(fā)用于選擇蛋白水解肽(m/zh和第1代碎片(m/z)2的方法中，所述選擇基本上基于反應(yīng)的靈敏度。進(jìn)ー步詳細(xì)的細(xì)節(jié)可參見(jiàn)，V. Fusaro et al.，Nature Biotech. 27 ;2009 ； 190-198。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用商業(yè)軟件，例如來(lái)自 Applied Biosystems 的 MIDAS 和 MRM Pilot 軟件或 MRMaid(J. Mead et al.，MCP, Nov 15,2008, E-pub)，以使得其能夠預(yù)測(cè)所有可能的躍遷對(duì)。他們還可使用由F. Desiere et al. (Nucleic Acids Res. 2006，Jan 1;34(數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào))D655_8)構(gòu)建的稱(chēng)為 PeptideAtlas的數(shù)據(jù)庫(kù)，以編輯由科學(xué)界描述的所有肽MRM躍遷。該P(yáng)印tideAtlas數(shù)據(jù)庫(kù)可在因特網(wǎng)上免費(fèi)獲得。對(duì)于非蛋白分子，還能使用諸如通過(guò)Applied Biosystems(美國(guó))公司的Cliquid軟件獲得的400種殺蟲(chóng)劑的庫(kù)的數(shù)據(jù)庫(kù)。在步驟e)選擇的特征離子的檢測(cè)按常規(guī)進(jìn)行，尤其是通過(guò)檢測(cè)器和處理系統(tǒng)進(jìn)行。所述檢測(cè)器收集所排出的離子并產(chǎn)生電信號(hào)(該電信號(hào)的強(qiáng)度取決于所收集的離子量)，然后擴(kuò)大該信號(hào)從而使其可被計(jì)算機(jī)處理。離子量越大，電流越高。由此獲得的電信號(hào)對(duì)應(yīng)于同時(shí)排出至檢測(cè)器的所有收集的離子。與檢測(cè)器組合的處理系統(tǒng)是傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其使得能分析和量化檢測(cè)器接收的信息(在這種情況下是所選擇的離子誘導(dǎo)的電流強(qiáng)度，該誘導(dǎo)電流的強(qiáng)度與靶分子的量成正比)。因此，可在同時(shí)排出和同時(shí)檢測(cè)后量化所檢測(cè)的特征離子，從而量化靶分子。為了能夠使所檢測(cè)的離子誘導(dǎo)的電流量與待測(cè)定靶分子的量相關(guān)聯(lián)，無(wú)論如何都需要校正。由此測(cè)定的電流強(qiáng)度可用作測(cè)定所存在的靶分子的量的定量檢測(cè)值，其特征在于其以mol/m3或kg/m3類(lèi)型的國(guó)際單位制(Si単位)來(lái)表示，或通過(guò)這些単位的倍數(shù)或因數(shù)，或通過(guò)SI単位的一般導(dǎo)數(shù)(usual derivatives)(包括其倍數(shù)或因數(shù))來(lái)表示。通過(guò)非限制性實(shí)例，諸如ng/ml或fmol/Ι的単位為表征定量檢測(cè)值的単位。
為此，在本發(fā)明的情況中，可實(shí)施通常用于質(zhì)譜法中的校準(zhǔn)。如TJortin et al.所述(見(jiàn)上文)，通常使用外標(biāo)或優(yōu)選使用內(nèi)標(biāo)來(lái)校準(zhǔn)MRM測(cè)定。當(dāng)靶分子為蛋白水解肽時(shí)，使得能測(cè)定目的蛋白，并且通過(guò)相對(duì)于待測(cè)定量已知的標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)校準(zhǔn)檢測(cè)到的信號(hào)而獲得定量檢測(cè)值與靶蛋白水解肽的量之間的相關(guān)性，以及接下來(lái)與靶蛋白的量之間的相關(guān)性?？赏ㄟ^(guò)校準(zhǔn)曲線(xiàn)的方式進(jìn)行校準(zhǔn)，例如通過(guò)連續(xù)注射不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白水解肽 (外標(biāo)法)或優(yōu)選使用重肽作為內(nèi)標(biāo)通過(guò)內(nèi)標(biāo)法獲得校準(zhǔn)曲線(xiàn)，例如根據(jù)下文詳細(xì)描述的 AQUA、QconCAT或PSAQ方法。術(shù)語(yǔ)“重肽”是指對(duì)應(yīng)于蛋白水解肽的肽，但其中1個(gè)或多個(gè)碳12 (12C)原子被碳13 (13C)取代，和/或ー個(gè)或多個(gè)氮H(14N)原子被氮15 (15N)取代。S. A. Gerber et al.(見(jiàn)上文)和專(zhuān)利申請(qǐng)US 2004/0229283中也推薦使用重肽作為內(nèi)標(biāo)(AQUA)。原則是人工合成具有包含重于常用天然同位素的同位素的氨基酸的蛋白水解肽。此類(lèi)氨基酸通過(guò)例如使用碳13 (13C)取代某些碳12 (12C)原子或通過(guò)使用氮15 (15N) 取代某些氮H(14N)原子而獲得。由此合成的人工肽(AQUA)與天然肽具有嚴(yán)格相同的物理化學(xué)特性(除了質(zhì)量較大外)。通常在質(zhì)譜測(cè)定之前，例如，在引起目的樣品的蛋白裂解的處理和在該處理步驟后獲得的肽的分級(jí)之間，以給定濃度將其添加至樣品。由此，在肽分級(jí)過(guò)程中，使AQUA肽與待測(cè)定的天然肽一起純化。因此，將兩種肽同時(shí)注射至質(zhì)譜儀中，用于測(cè)定。然后，它們?cè)陔婋x源中經(jīng)歷相同的電離率。天然肽與AQUA肽(其濃度已知)的峰面積的比較使得能計(jì)算天然肽的濃度并由此反過(guò)來(lái)計(jì)算待測(cè)定的蛋白質(zhì)的濃度。J. "Μ. Pratt et al. (Nat. Protoc. 2006,1 :1029-1043)已經(jīng)以名稱(chēng) QconCAT 推薦了 AQUA 技術(shù)的變體。該變體還描述在專(zhuān)利申請(qǐng)WO 2006/128492中。它是串接不同AQUA肽并產(chǎn)生重重組蛋白形式的人工多肽。所述重組蛋白是由包含重表位的氨基酸合成的。以該方式，能以較低成本獲得用于校準(zhǔn)數(shù)種蛋白的同時(shí)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。在導(dǎo)致蛋白質(zhì)裂解的處理開(kāi)始時(shí)、其上游和在蛋白質(zhì)分級(jí)、變性、還原和然后封閉所述蛋白的巰基官能團(tuán)的步驟(如果這些步驟存在的話(huà)) 前，添加QconCAT標(biāo)準(zhǔn)。QconCAT標(biāo)準(zhǔn)因此經(jīng)歷了導(dǎo)致所述蛋白與天然蛋白相同的白裂解的同一處理循環(huán)，使得能考慮導(dǎo)致蛋白裂解的處理步驟的產(chǎn)率。實(shí)際上，天然蛋白的處理，尤其是通過(guò)消化進(jìn)行的處理，可能是不完全的。在這種情況下，AQUA標(biāo)準(zhǔn)的使用會(huì)導(dǎo)致天然蛋白的量被低估。因此，為了絕對(duì)測(cè)定，考慮導(dǎo)致蛋白裂解的處理的產(chǎn)率是重要的。然而， V. Brun et al. (MCP，2007，2139-2149)已經(jīng)掲示，有時(shí)QconCAT標(biāo)準(zhǔn)并不準(zhǔn)確再現(xiàn)天然蛋白的處理(特別是通過(guò)消化進(jìn)行的處理)的產(chǎn)率，毫無(wú)疑問(wèn)這是由于QconCAT蛋白的不同三維構(gòu)象造成的。因此，V. Brun et al.(見(jiàn)上文)已經(jīng)推薦使用專(zhuān)利申請(qǐng)WO 2008/145763中所描述的被稱(chēng)為PSAQ的方法。在這種情況下，內(nèi)標(biāo)是重組蛋白，其與天然蛋白具有相同序列，但由重氨基酸合成。該合成是使用重氨基酸離體進(jìn)行的。該內(nèi)標(biāo)與天然蛋白具有嚴(yán)格相同的物理化學(xué)特性(除了質(zhì)量較大以外)。在蛋白分級(jí)步驟(如果該步驟存在的話(huà))開(kāi)始吋、 之前添加該內(nèi)標(biāo)。因此，所述內(nèi)標(biāo)在蛋白分級(jí)步驟過(guò)程中與天然蛋白一起純化，其表現(xiàn)了與天然蛋白相同的處理產(chǎn)率，特別是通過(guò)消化進(jìn)行的處理產(chǎn)率。如進(jìn)行肽分級(jí)步驟的話(huà)，裂解之后獲得的重肽還與天然肽一起純化。因此，將兩種肽同時(shí)注射至質(zhì)譜儀中，以進(jìn)行定量測(cè)定。它們?nèi)缓笤陔婋x源中經(jīng)歷相同的電離率。比較PSAQ方法中天然肽和參考肽的峰面積使得能在考慮測(cè)定方法所有步驟的同時(shí)計(jì)算待測(cè)定蛋白的濃度。在本發(fā)明的情況中，可以實(shí)施所有這些在質(zhì)譜測(cè)定中、特別是在MRM或MS測(cè)定中使用的技木，即AQUA、QconCAT或PSAQ或任何其他校準(zhǔn)技木，以進(jìn)行校準(zhǔn)。在通過(guò)質(zhì)譜分析多種生物溶液的情況下，由以下涉及本發(fā)明方法的三個(gè)示例性實(shí)施方式的描述體現(xiàn)本發(fā)明的方法及其優(yōu)勢(shì)。這些示例引用附圖，其中-

圖1代表實(shí)施例1中使用的第一批TP171蛋白的MS質(zhì)譜法；-圖2A代表實(shí)施例2中處理的女性血清中PSA蛋白濃度為200μ g/ml的樣品在 9. 08分鐘636. 8Th離子的MS2譜；-圖2B代表實(shí)施例2中處理的女性血清中PSA濃度為200μ g/ml的樣品在9. 08 分鐘的第1代碎片離子總體的色譜；-圖3A代表了實(shí)施例3中處理的女性血清中PSA濃度為1μ g/ml的樣品在11. 914 分鐘和12. 058分鐘之間由636. 8Th前體離子產(chǎn)生的第1代碎片472. 3Th的MS3譜；-圖加代表了實(shí)施例3中處理的女性血清中PSA濃度為1μ g/ml的樣品在11. 98 分鐘的第1代碎片離子總體的色譜。在下文描述的實(shí)施例中，利用Applied Biosystems (Foster City，美國(guó))公司的 AB Sciex QTRAPi 5500 LC/MS/MS三重四極桿離子阱分析裝置實(shí)施本發(fā)明的方法。^MM 1 ヰ+ 寸,屮會(huì)目胃さ白似屯肖。MSみ
近TP171重組蛋白是造成梅毒的病原因子梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum)的重組蛋白，具有SEQ ID No. 1的序列。SEQ ID No. 1 MRGSASFSSIPNGTYRATYQDFDENGWKDFLEVTFDGGKMVQVVYDYQHKEGRFKSQDADYHRVMYAS SGIGPEKAFRELADALLEKGNPEMVDWTGATVSSQSFRRLGAALLQSARRGEKEAIISRGSSKYKYHHHHHH。根據(jù)以下方法消化3批TP171重組蛋白-稀釋TP171溶液以獲得含終濃度為10μ g/ml的TP171重組蛋白的3ml50mM重碳酸鹽(pH = 8. 0)。-添加ニ硫蘇糖醇(DTT)，以獲得15mM的終濃度；-在60°C還原40分鐘；-將試管冷卻至室溫；-添加碘乙酰胺，以獲得25mM的終濃度；-在室溫和黑暗中進(jìn)行烷基化40分鐘；-以1/30的比例添加胰蛋白酶；-在37°C消化4小時(shí)；-添加DTT，以獲得IOmM的終濃度；-在60°C還原40分鐘；-將試管冷卻至室溫；-添加乙腈(ACN)和甲酸以使ACN的終濃度為10%，甲酸的終濃度為0.5%。以10 μ 1/分鐘的流速將所產(chǎn)生的樣品直接連續(xù)注射至AB Sciex QTRAP 5500質(zhì)譜儀的電離源中。僅以離子阱模式使用三重四極桿質(zhì)譜儀，從而使四極桿僅用于引導(dǎo)四極桿Q3的阱中的離子。本發(fā)明方法中使用的同時(shí)排出模式與EMS(增強(qiáng)型質(zhì)譜法)模式相比，區(qū)別在于在阱中進(jìn)行掃描以連續(xù)排出所有離子。所使用的其他儀器參數(shù)描述在下表1中。表 權(quán)利要求
1.通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)樣品中的至少ー種靶分子的方法，其中a)通過(guò)至少一個(gè)電離裝置電離所述樣品的分子，從而獲得分子離子；b)進(jìn)行以下步驟⑴和(ii)n次，η等于0、1、2、3或4；(i)在質(zhì)量分析器中根據(jù)所述靶分子選擇前述步驟中獲得的至少ー種離子，和( )在裂解単元中裂解由此選擇的所述至少一種離子；c)在所述質(zhì)量分析器中捕獲當(dāng)η為0時(shí)在步驟a)中獲得的至少兩種不同離子或者當(dāng) η非0時(shí)在步驟b)中獲得的至少兩種不同離子，由此捕獲的所述至少兩種離子是所述靶分子的特征離子并且具有所述靶分子特征性的質(zhì)量電荷比m/z ；d)從所述質(zhì)量分析器中排出所捕獲的所述特征離子；以及e)通過(guò)檢測(cè)裝置檢測(cè)所排出的所述特征離子，其特征在干，所述特征離子在步驟d)中被同時(shí)排出并在步驟e)中被同時(shí)檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在干，步驟c)中使用的所述質(zhì)量分析器為離子阱。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在干，所述離子阱為3D或者線(xiàn)型。
4.如權(quán)利要求2或3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，通過(guò)利用射頻的方式使具有所述靶分子特征性的質(zhì)量電荷比m/z的所述離子在所述離子阱中同時(shí)共振，進(jìn)行步驟d)中對(duì)于所述特征離子的排出。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，在捕獲所述特征離子之后并在排出和檢測(cè)所述特征離子之前，將步驟c)的所述質(zhì)量分析器中靶分子的非特征離子排空。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，η等于1、2、3或4，并且步驟b) 中使用的所述質(zhì)量分析器為離子阱或者四極桿分析器。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在干，所述裂解単元為離子阱。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在干，步驟b)和步驟c)在相同裝置，即離子阱中進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，η為1，并且步驟c)中捕獲的所述至少兩種離子為第1代碎片離子。
10.如權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，η為2，并且步驟C)中捕獲的所述至少兩種離子為第2代碎片離子。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，為了純化目的對(duì)所述樣品進(jìn)行預(yù)處理。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在干，所述靶分子為蛋白的蛋白水解肽，并且所述樣品已經(jīng)預(yù)處理以由目的蛋白產(chǎn)生肽。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在干，在同時(shí)排出和同時(shí)檢測(cè)后，對(duì)經(jīng)檢測(cè)的所述特征離子進(jìn)行定量從而對(duì)所述靶分子進(jìn)行定量，尤其是通過(guò)建立校準(zhǔn)曲線(xiàn)或者通過(guò)利用所述靶分子的類(lèi)似分子的內(nèi)標(biāo)法，對(duì)經(jīng)檢測(cè)的所述特征離子進(jìn)行定量從而對(duì)所述靶分子進(jìn)行定量。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)樣品中的至少一種靶分子的方法，其中a)電離所述樣品的分子；b)進(jìn)行以下步驟(i)和(ii)n次，n等于0、1、2、3或4(i)在質(zhì)量分析器中根據(jù)所述靶分子選擇前述步驟中獲得的至少一種離子，和(ii)在裂解單元中裂解由此選擇的離子；c)在質(zhì)量分析器中捕獲當(dāng)n為0時(shí)在步驟a)中獲得的至少兩種不同離子或者當(dāng)n非0時(shí)在步驟b)中獲得的至少兩種不同離子，由此捕獲的所述至少兩種離子具有所述靶分子特征的質(zhì)量電荷比m/z；d)從所述質(zhì)量分析器中排出所捕獲的特征離子；以及e)通過(guò)檢測(cè)裝置檢測(cè)所排出的所述特征離子，本發(fā)明的方法的特征在于，所述特征離子在步驟d)中被同時(shí)排出和在步驟e)中被同時(shí)檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102598204SQ201080042728
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者J-P·沙里耶, 唐吉·福爾坦, 熱羅姆·勒穆瓦納, 菲利普·迪古爾, 阿諾·薩爾瓦多 申請(qǐng)人:克洛德·貝納爾-里昂第一大學(xué), 國(guó)家科學(xué)研究中心, 生物梅里埃公司