專利名稱：表征細(xì)胞重編程的方法及其應(yīng)用的制作方法
表征細(xì)胞重編程的方法及其應(yīng)用I.相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2009年7月31日提交的，名為“表征細(xì)胞重編程的方法及其應(yīng)用 (Methods to Characterize Cell Reprogramming and Uses Thereof)，，的美國臨時申請序列號61/230398和2009年8月3日提交的，名為“表征細(xì)胞重編程的方法及其應(yīng)用 (Methods to Characterize Cell Reprogramming and Uses Thereof)，，的美國臨時申甫序列號61/230，801的權(quán)益。II.背景公開的方法基于無標(biāo)記生物傳感器細(xì)胞途徑和功能概況分析方法來全面表征干細(xì)胞和細(xì)胞重編程。對于研究和醫(yī)學(xué)治療，例如通過骨髄移植治療白血病和相關(guān)的骨/血液癌癥，干細(xì)胞因其多功能性而具有吸引力。雖然最近10年在干細(xì)胞和細(xì)胞重編程中取得許多進(jìn)展，但仍難以有效而可靠地表征干細(xì)胞和細(xì)胞重編程，特別是在誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的產(chǎn)生中，干細(xì)胞分化期間(狀態(tài)和途徑(即，譜系))以及在重編程細(xì)胞和其相應(yīng)的人細(xì)胞之間進(jìn)行比較有困難。本文公開了利用生物傳感器表征細(xì)胞和iPS以及將它們彼此比較的方法。在ー些實(shí)例中，所述生物傳感器可以是無標(biāo)記的?？蓪PS細(xì)胞的質(zhì)量和性質(zhì)與胚胎干細(xì)胞(ES) 比較?？刹捎盟_的方法表征干細(xì)胞和iPS分化的途徑和階段。還可利用不同類型的胚胎和重編程干細(xì)胞以及衍生自干細(xì)胞的細(xì)胞，將生物傳感器用于藥物篩選?；跓o標(biāo)記細(xì)胞的試驗(yàn)通常利用生物傳感器監(jiān)測活細(xì)胞中配體誘導(dǎo)的應(yīng)答。生物傳感器通常利用轉(zhuǎn)換器，例如光學(xué)、電學(xué)、量熱、聲學(xué)、磁力等轉(zhuǎn)換器將與生物傳感器接觸的細(xì)胞中的分子識別事件或配體誘導(dǎo)改變轉(zhuǎn)換成可定量的信號。III.概述本文公開的方法基于無標(biāo)記生物傳感器細(xì)胞途徑和功能概況分析方法來全面表征干細(xì)胞和細(xì)胞重編程。本文還公開了篩選介導(dǎo)和控制細(xì)胞命運(yùn)，特別是增強(qiáng)衍生自干細(xì)胞(Es、成人干細(xì)胞和iPS細(xì)胞)的神經(jīng)元細(xì)胞功能的小分子的方法。本文提供的方法采用無標(biāo)記共振波導(dǎo)光柵生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)來表征干細(xì)胞和通過胚胎和誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞重編程衍生的細(xì)胞以及測定干細(xì)胞分化途徑和階段。本文還提供測定原代細(xì)胞及其通過胚胎和誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞重編程衍生的相應(yīng)細(xì)胞之間差異的方法。本文還提供表征通過胚胎和誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞重編程衍生的細(xì)胞體系和利用這些細(xì)胞體系篩選藥物的方法。本文還提供篩選能介導(dǎo)干細(xì)胞和誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞分化和控制細(xì)胞命運(yùn)的小分子的方法。IV.附圖簡述


圖1顯示無標(biāo)記生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)以表征細(xì)胞重編程的流程圖。圖2顯示無標(biāo)記生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)篩選介導(dǎo)細(xì)胞重編程和控制細(xì)胞命運(yùn)的小分子的流程圖。圖3顯示無標(biāo)記生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)表征通過干細(xì)胞重編程衍生的細(xì)胞及其相應(yīng)細(xì)胞(例如，原代細(xì)胞或細(xì)胞系)的流程圖。圖4顯示ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞系(ReN細(xì)胞)分化成多巴胺能神經(jīng)元的原位分化方案的流程圖。圖5顯示層粘連蛋白包被的Epic 生物傳感器微板上，分化過程中的ReN細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡才目位對比圖像(light microscopic phase contrast image)。圖6顯示神經(jīng)元祖干細(xì)胞重編程形成的神經(jīng)元細(xì)胞體系的熒光圖像。ReN細(xì)胞分化成多巴胺能神經(jīng)元，并用4種不同標(biāo)志物染色(A) β III-微管蛋白(神經(jīng)元的標(biāo)志物)， (B) GFAP (星形細(xì)胞的標(biāo)志物)，(C)Ol (少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物)，(D)酪氨酸羥化酶(多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志物)，Φ) β III-微管蛋白(神經(jīng)元的標(biāo)志物)和(F)酪氨酸羥化酶和 bill-微管蛋白染色之間的重疊。利用相應(yīng)的抗體進(jìn)行染色。圖7顯示利用神經(jīng)元細(xì)胞體系的無標(biāo)記RWG生物傳感器進(jìn)行多巴胺受體概況分折，所述細(xì)胞體系通過人神經(jīng)元祖細(xì)胞重編程產(chǎn)生。(A) 16微摩爾的D2激動劑PD12897的 DMR信號；(B) 16微摩爾的Dl激動劑A68930的DMR信號；(C) 128微摩爾的非選擇性多巴胺受體激動劑多巴胺的DMR信號；和⑶多巴胺的劑量應(yīng)答。(A-C)中還包括陰性對照的DMR 信號(即，僅加入試驗(yàn)緩沖液后細(xì)胞體系的應(yīng)答)。圖8顯示表征人干細(xì)胞(例如，ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞系)的重編程階段和譜系的生物傳感器多檢測點(diǎn)細(xì)胞概況分析方法的代表性例子。(A)ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞附著于兩個不同表面層粘連蛋白包被的和組織培養(yǎng)處理的生物傳感器表面；(B-D) 3個不同時間點(diǎn)的1 微摩爾多巴胺的DMR信號(B)細(xì)胞附著于層粘連蛋白包被生物傳感器表面后3小時；(C)未分化條件下，層粘連蛋白包被表面上培養(yǎng)4天后；和(D)分化條件下培養(yǎng)10天后。(B-D)中還包括相應(yīng)條件下陰性對照的DMR信號(即，僅加入試驗(yàn)緩沖液后細(xì)胞體系的應(yīng)答)。圖9顯示表征人干細(xì)胞(例如，ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞系)的重編程階段和譜系的生物傳感器細(xì)胞概況分析方法的代表性例子。(A-L)與未分化的ReN細(xì)胞相比，用一組標(biāo)志物物刺激后衍生自ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞系的分化的和成熟的神經(jīng)元細(xì)胞體系的 DMR 信號(A)乙酰膽堿(10 μ Μ) ； (B)腺苷(10 μ Μ) ； (C)ATP (10 μ Μ) ； (D)精胺(10 μ Μ) ； (E) 強(qiáng)啡肽(dynorphin)A(lO μ Μ) ； (F)內(nèi)皮肽 1 (10 μ Μ) ； (G)神經(jīng)肽Β-23 (ΝΡΒ-23，10 μ Μ) ； (H) 食欲素(orexin)A(lOyM) ； (I) SFLLR-酰胺(10 μ Μ) ； (J) UDP (10 μ Μ) ； (K)神經(jīng)肽(10 μ Μ) 和(L)血管活性腸肽(10 μ Μ)。未分化和分化ReN細(xì)胞之間各配體的DMR信號差異可用作 ReN細(xì)胞譜系分化成多巴胺能神經(jīng)元的讀出值。圖10顯示表征人干細(xì)胞(例如，ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞系)的重編程階段和譜系的生物傳感器細(xì)胞概況分析方法的代表性例子。(A-F)與未分化的ReN細(xì)胞相比，用一組標(biāo)志物物刺激后衍生自ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞系的分化的和成熟的神經(jīng)元細(xì)胞體系的 DMR 信號(A) ADP(IOyM) ； (B)多巴胺(1 μ Μ) ； (C) GABA (10 μ Μ) ； (D)阿皮林(Apelin) (10 μ Μ) ； (E) α-黑素細(xì)胞-刺激激素(10 μ Μ)；和(F)血小板生長因子(10μΜ)ο未分化和分化ReN細(xì)胞之間各配體的DMR信號差異可用作ReN細(xì)胞譜系分化成多巴胺能神經(jīng)元的
讀出值。圖11顯示表征人干細(xì)胞(例如，ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞系)的重編程階段和譜系的生物傳感器細(xì)胞概況分析方法的代表性例子。(A-H)與未分化的ReN細(xì)胞相比，用一組標(biāo)志物物刺激后衍生自ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞系的分化的和成熟的神經(jīng)元細(xì)胞體系的DMR信號㈧血管緊張素II (10 μ M) ； (B)高血糖素樣肽(USyM) ； (C)溶血磷脂酸 (10 μ Μ) ； (D)神經(jīng)牽張素(neurotein) (10 μ Μ) ； (E)P 物質(zhì)(10 μ Μ) ； (F)酪胺(10 μ Μ) ； (G) UTP (10 μ Μ)；和(H)硬骨魚緊張肽(urotensin) (10μΜ)ο未分化和分化ReN細(xì)胞之間各配體的DMR信號差異可用作ReN細(xì)胞譜系分化成多巴胺能神經(jīng)元的讀出值。圖12顯示表征人干細(xì)胞(例如，ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞系)的重編程階段和譜系的生物傳感器細(xì)胞概況分析方法的代表性例子。(A-F)與未分化的ReN細(xì)胞相比，用一組標(biāo)志物物刺激后衍生自ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞系的分化的和成熟的神經(jīng)元細(xì)胞體系的 DMR 信號(A) 8-CPT-2-Me-cAMP (10 μ Μ) ； (B)毛喉素(10 μ Μ) ； (C) MAS-7 (10 μ Μ)； Φ)740Υ-Ρ(10μΜ) ； (E) L783281(10yM)；禾ロ (F)PMA(IOyM) 未分化和分化 ReN 細(xì)胞之間各配體的DMR信號差異可用作ReN細(xì)胞譜系分化成多巴胺能神經(jīng)元的讀出值。V.詳述下面參考附圖(若有的話)詳細(xì)描述本發(fā)明的各種實(shí)施方式。述及各種實(shí)施方式不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明范圍僅受所附權(quán)利要求書的范圍的限制。此外，本說明書中列出的任何實(shí)施例并非限制性的，而僅是列出要求保護(hù)的本發(fā)明的許多可能實(shí)施方式中的一些。定義1. A除非上下文中另有明確說明，在說明書和權(quán)利要求書中所用的単數(shù)形式“一個”、 “ー種”和“該”等術(shù)語包括復(fù)數(shù)形式。因此，例如述及“ー種HiC(蛋白激酶C)激活劑”包括兩種或更多此類激活劑的混合物，等等。2.縮寫可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的縮寫(例如，“h”或“hr”表示小吋、“g”或“gm” 表示克、“mL”表示毫升、“ rt”表示室溫、“ nm”表示納米以及“Μ”表示摩爾等縮寫)。3.約對本發(fā)明實(shí)施方式的描述中利用“約”來修飾，例如，組合物中成分的量、濃度、體積、エ藝溫度、エ藝時間、產(chǎn)率、流速、壓カ等數(shù)值，及其范圍，“約”指數(shù)值量中可能發(fā)生的改變，例如，用于制備化合物、組合物、濃縮物或使用制劑所用的常規(guī)測量和操作過程所致；這些過程中的偶然性誤差所致；用來實(shí)施所述方法的起始材料或成分的生產(chǎn)、來源或純度的差異所致；和類似因素。術(shù)語“約”還包括由于具有特定初始濃度或混合物的組合物或制劑的陳化而改變的量，以及由于混合或加工具有特定初始濃度或混合物的組合物或制劑而改變的量。無論是否受術(shù)語“約”修飾，所附權(quán)利要求書均包括這些量的等同形式。4. “整個細(xì)胞組和針對標(biāo)志物組”短語“整個細(xì)胞組和針對標(biāo)志物組”是指檢測某分子作用于ー組細(xì)胞中各細(xì)胞的一級概況以及該分子調(diào)節(jié)標(biāo)志物組的調(diào)節(jié)概況的系統(tǒng)過程。對于標(biāo)志物/細(xì)胞配對，所述過程首先從檢測分子獨(dú)立作用各類細(xì)胞的ー級概況開始，然后檢測同一細(xì)胞內(nèi)有該分子存在下某標(biāo)志物的ニ級概況。術(shù)語“針對”專門用于表示分子調(diào)節(jié)標(biāo)志物誘導(dǎo)的生物傳感器應(yīng)答的能力。5. “另ー時期，，“另ー時期”或“延長的時期”等術(shù)語是在一個時期后或一次處理后連續(xù)發(fā)生的時期。所述時期可以有很大不同，從10分鐘到1小吋、2小吋、4小吋、8小吋、24小吋、2天、5 天、10天、20天或30天。6.抗多巴胺抗體“杭-多巴胺抗體”或任何其它“所抗物質(zhì)”的抗體(本文專門公開了對各組合物和制品的抗體)指結(jié)合相關(guān)“所抗物質(zhì)”的抗體。因此，例如杭-多巴胺抗體是結(jié)合多巴胺的抗體。公開的抗體是任何動物，例如小鼠、大鼠和靈長類，如人的單克隆、多克隆以及人源化、嵌合和工程改造抗體。7.試驗(yàn)試驗(yàn)等術(shù)語指測定某物質(zhì)，如分子或細(xì)胞的特征的分析，例如受ー種或多種外源刺激如配體或標(biāo)志物刺激后，細(xì)胞的光學(xué)或生物阻抗應(yīng)答的存在、缺乏、量、程度、動力學(xué)、 動態(tài)學(xué)或類型。細(xì)胞對刺激的應(yīng)答產(chǎn)生生物傳感器信號可以是試驗(yàn)。8.測定應(yīng)答“測定應(yīng)答”等術(shù)語表示采用某種方式表征應(yīng)答。例如，如果某分子與細(xì)胞接觸，可以利用生物傳感器測定接觸該分子后該細(xì)胞的應(yīng)答。9.附著“附著”、“粘附”、“固定化”等術(shù)語通常指，例如，表面修飾物質(zhì)、相容劑 (compatibilizer)、細(xì)胞、候選配體分子和本發(fā)明的類似實(shí)體通過，例如物理吸附、化學(xué)結(jié)合等過程或其組合而固定或固著在某表面上。具體而言，“細(xì)胞附著”、“細(xì)胞粘附”等術(shù)語指細(xì)胞與表面的相互作用或結(jié)合，例如通過培養(yǎng)、或與細(xì)胞錨定材料、相容劑(如纖連蛋白、 膠原、層粘連蛋白、明膠、聚賴氨酸等)、或兩者相互作用?！百N壁細(xì)胞”、“固定化細(xì)胞”等術(shù)語指保持與基材外表面結(jié)合、固定于其上或有某種接觸的細(xì)胞、細(xì)胞系或細(xì)胞體系，例如原核或真核細(xì)胞。此類細(xì)胞在培養(yǎng)后能承受或經(jīng)受清洗和培養(yǎng)基交換過程而保持附著，該過程是很多細(xì)胞試驗(yàn)的先決條件。10.生物傳感器生物傳感器等術(shù)語指用于檢測分析物的裝置，其組合了生物組件和理化檢測器組件。生物傳感器通常由三部分組成生物組件或元件(例如組織、微生物、病原體、細(xì)胞、或其組合)、檢測器元件(以理化方式，如光學(xué)、壓電、電化學(xué)、熱學(xué)或磁力工作)和與兩種組件關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)換器。生物組件或元件可以是，例如，活細(xì)胞、病原體或其組合。在各實(shí)施方式中，光學(xué)生物傳感器可包括將活細(xì)胞、病原體、或其組合中的分子識別或分子刺激事件轉(zhuǎn)化成可量化信號的光轉(zhuǎn)換器。11.生物傳感器指數(shù)“生物傳感器指數(shù)”等術(shù)語是由生物傳感器數(shù)據(jù)的集合構(gòu)成的指數(shù)。生物傳感器指數(shù)可以是生物傳感器概況，例如一級概況、或ニ級概況的集合。所述指數(shù)可包含任何類型的數(shù)據(jù)。例如，概況指數(shù)可以只包括N-DMR數(shù)據(jù)點(diǎn)，它可以是P-DMR數(shù)據(jù)點(diǎn)、或二者，或者它可以是阻抗數(shù)據(jù)點(diǎn)。它可以是與概況曲線相關(guān)的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)。12.生物傳感器概況“生物傳感器概況”等術(shù)語指用某分子刺激后，利用生物傳感器獲得的活性概況。13.生物傳感器應(yīng)答“生物傳感器應(yīng)答”、“生物傳感器輸出信號”、“生物傳感器信號”等術(shù)語指具有細(xì)胞的傳感器系統(tǒng)對細(xì)胞應(yīng)答的任何反應(yīng)。生物傳感器將細(xì)胞應(yīng)答轉(zhuǎn)換成可量化的傳感器應(yīng)答。生物傳感器應(yīng)答是由光學(xué)生物傳感器，例如包含光子晶體生物傳感器的RWG或sra測得的刺激后光學(xué)應(yīng)答，或是由電學(xué)生物傳感器測得的刺激后細(xì)胞的生物阻抗應(yīng)答，或是由聲學(xué)生物傳感器測定的刺激后細(xì)胞的聲學(xué)應(yīng)答。由于生物傳感器應(yīng)答與刺激后的細(xì)胞應(yīng)答直接相關(guān)，在本發(fā)明的各實(shí)施方式中，生物傳感器應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答可互換使用。14.生物傳感器信號“生物傳感器信號”等術(shù)語指刺激后由細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生，由生物傳感器測得的細(xì)胞信號。15.生物傳感器表面生物傳感器表面等詞語是其上可具有培養(yǎng)的細(xì)胞的生物傳感器的任何表面。生物傳感器表面可經(jīng)組織培養(yǎng)處理，或者胞外基質(zhì)物質(zhì)(例如，纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原等) 包被或經(jīng)合成材料(例如，聚賴氨酸)包被。16.細(xì)胞細(xì)胞等術(shù)語指外部以半透膜為界的、小的、通常為微觀量的原生質(zhì)，任選包括ー個或多個核和各種其它細(xì)胞器，能獨(dú)自或與其它類似物質(zhì)相互作用執(zhí)行生命的所有基本功能，并形成能獨(dú)立起作用的活性物質(zhì)的最小結(jié)構(gòu)單元，包括合成細(xì)胞構(gòu)建物、細(xì)胞模型體系和類似的人工細(xì)胞體系。細(xì)胞可包括不同的細(xì)胞類型，例如與特定疾病相關(guān)的細(xì)胞、特定來源的細(xì)胞類型、 與特定靶標(biāo)相關(guān)的細(xì)胞類型、或與特定生理功能相關(guān)的細(xì)胞類型。細(xì)胞還可以是天然細(xì)胞、 工程改造細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、永生化細(xì)胞、原代細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、成人干細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞或干細(xì)胞衍生的細(xì)胞。人體由約210種已知的不同細(xì)胞類型構(gòu)成。考慮到細(xì)胞的制備(例如工程改造、 轉(zhuǎn)化、永生化、或新鮮分離自人體)和獲取細(xì)胞的來源(例如不同年齢或不同疾病階段的人體等)，細(xì)胞類型幾乎是無限的。17.細(xì)胞培養(yǎng)“細(xì)胞培養(yǎng)”指原核或者真核細(xì)胞在受控條件下生長的過程?！凹?xì)胞培養(yǎng)”不單指培養(yǎng)衍生自多細(xì)胞真核生物的細(xì)胞，特別是動物細(xì)胞，也指培養(yǎng)復(fù)雜組織和器官。18.細(xì)胞命運(yùn)“細(xì)胞命運(yùn)”等術(shù)語指細(xì)胞定型的分化狀態(tài)或重編程狀態(tài)。19.細(xì)胞命運(yùn)測定“細(xì)胞命運(yùn)測定”等術(shù)語指細(xì)胞按照確定的細(xì)胞分化途徑重編程。細(xì)胞不可逆地定型為特定狀態(tài)。20.細(xì)胞組“細(xì)胞組”等術(shù)語指包括至少兩類細(xì)胞的組。所述細(xì)胞可以是本文公開的任何類型或組合。21.細(xì)胞體系“細(xì)胞體系”等術(shù)語是具有多于ー類細(xì)胞的一組細(xì)胞。不同類型的細(xì)胞可以在生理學(xué)或病理生理學(xué)上彼此相關(guān)。例如，細(xì)胞體系可以由“多巴胺能細(xì)胞、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的分化神經(jīng)元”構(gòu)成。22.細(xì)胞途徑概況分析“細(xì)胞途徑概況分析”等術(shù)語指獲得細(xì)胞的至少ー種概況，其是細(xì)胞中特定信號傳導(dǎo)途徑的信息。該方法可利用本文所述任何工具或工具的組合以便產(chǎn)生無標(biāo)記生物傳感器概況，例如產(chǎn)生ー級概況。23.細(xì)胞概況分析“細(xì)胞概況分析”等術(shù)語指獲得細(xì)胞的至少ー種概況，其是細(xì)胞的信息。該方法可利用本文所述任何工具或工具的組合以便產(chǎn)生無標(biāo)記生物傳感器概況，例如產(chǎn)生ニ級概況。24.檢測點(diǎn)“檢測點(diǎn)”等術(shù)語是生物傳感器試驗(yàn)期間實(shí)施某行為，例如獲得概況的任何點(diǎn)。“檢測點(diǎn)n”等術(shù)語指η個檢測點(diǎn)。“第一”、“第二”、“第三”檢測點(diǎn)等指后續(xù)或不同的檢測點(diǎn)。25.檢測點(diǎn)一級概況“檢測點(diǎn)概況”等術(shù)語，例如檢測點(diǎn)一級概況指在檢測點(diǎn)，例如時間點(diǎn)或條件點(diǎn)或其附近獲得的，作用于細(xì)胞的分子概況。26.細(xì)胞附著概況“細(xì)胞附著概況”等術(shù)語指細(xì)胞附著于具有特定表面化學(xué)特性的生物傳感器期間獲得的概況。優(yōu)選在將細(xì)胞置于生物傳感器的0. 1、0. 5、0. 7、1、2、3、4、5、10、20分鐘內(nèi)獲得
附著概況。27.候選重編程分子“候選重編程分子”是某種分子，其可以是調(diào)節(jié)、介導(dǎo)或調(diào)控細(xì)胞或干細(xì)胞重編程的分子。28.細(xì)胞重編程概況分析“細(xì)胞重編程概況分析”等術(shù)語指在一組條件下獲得細(xì)胞上的生物傳感器概況，所述條件是或可以是細(xì)胞重編程。29.細(xì)胞背景“細(xì)胞背景”等術(shù)語是具有特定狀態(tài)的細(xì)胞類型。例如，不同類型的細(xì)胞具有不同的細(xì)胞背景(例如，細(xì)胞受體的差異表達(dá)或組成)。類型相同，但狀態(tài)不同的細(xì)胞也具有不同的細(xì)胞背景?？赏ㄟ^培養(yǎng)(例如，細(xì)胞周期停滯或増殖或靜息狀態(tài))或處理(例如，不同藥理學(xué)試劑處理的細(xì)胞)實(shí)現(xiàn)同一類型細(xì)胞的不同狀態(tài)。30.細(xì)胞過程細(xì)胞過程等術(shù)語指在細(xì)胞內(nèi)或通過細(xì)胞發(fā)生的過程。細(xì)胞過程的例子包括但不限干増殖、凋亡、壞死、分化、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、極性改變、遷移或轉(zhuǎn)化。31.細(xì)胞應(yīng)答“細(xì)胞應(yīng)答”等術(shù)語指細(xì)胞對刺激的任何反應(yīng)。
32.細(xì)胞靶標(biāo)“細(xì)胞靶標(biāo)”等術(shù)語指能通過外部刺激改變活性的生物聚合物，例如蛋白質(zhì)或核酸。最常見的細(xì)胞靶標(biāo)是蛋白質(zhì)，例如酶、激酶、離子通道和受體。33.組分公開了用于制備所公開組合物的組分和本文所述方法中使用的組合物本身。本文公開了這些和其它的材料，應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)公開這些材料的組合、子集、相互作用、組等，但未明確公開具體述及這些分子各種不同的單獨(dú)和共同組合以及排列組合吋，在本文中專門考慮和描述了其中的每ー種。因此，如果公開了ー類分子A、B和C以及公開了ー類分子D、E 和F和分子組合的實(shí)例A-D，則即使沒有単獨(dú)述及每ー種，每ー種單獨(dú)且共同視為有意義的組合，A-E、A-F、B-D、B-E、B_F、C_D、C-E和C-F視作公開。同樣，還公開這些組合的任意子集或組合。因此，例如，應(yīng)認(rèn)為已公開了亞組A-E、B-F和C-E。此概念適用于本申請的所有方面，包括但不限于制造和使用所公開組合物的方法中的步驟。因此，如果存在可進(jìn)行的各種附加步驟，應(yīng)當(dāng)理解可通過所公開方法的任一特定實(shí)施方式或?qū)嵤┓绞浇M合來進(jìn)行各附加步驟。34.化合物和組合物化合物和組合物在本領(lǐng)域具有標(biāo)準(zhǔn)意義。應(yīng)當(dāng)理解，在任何情況下，具體名稱，例如分子、物質(zhì)、標(biāo)志物、細(xì)胞或試劑，都公開了包含這些名稱、由其組成、和基本由其組成的組合物。因此，當(dāng)使用具體名稱標(biāo)志物時，應(yīng)當(dāng)理解還公開了包含該標(biāo)志物，由該標(biāo)志物組成、或基本由該標(biāo)志物組成的組合物。適當(dāng)時，無論何處給出了具體名稱，應(yīng)當(dāng)理解也公開了該名稱的化合物。例如，如果公開了特定生物材料，例如PI3K激活劑，化合物形式的PI3K 激活劑也被公開。35.包含在本說明書的描述和權(quán)利要求中，詞語“包含”和該詞語的其它形式，如“含有”和 “包括”表示“包括但不限干”并且不打算排除例如其它添加剤、組分、整數(shù)或步驟。36.基本上由…組成在各實(shí)施方式中，“基本上由…組成”指例如表面組合物、在本發(fā)明的生物傳感器、 制品、裝置、或設(shè)備表面上制備或使用表面組合物、制劑或組合物的方法，還可包括權(quán)利要求中列出的組分或步驟，加上不實(shí)質(zhì)性影響本發(fā)明組合物、制品、設(shè)備及其制備和使用方法的基本新型特性的其它組分或步驟，如所選的特定反應(yīng)物、特定添加劑或成分、特定試劑、 特定細(xì)胞或細(xì)胞系、特定表面調(diào)節(jié)劑或表面條件、特定候選配體、或類似結(jié)構(gòu)、材料或過程變量?？蓪?shí)質(zhì)性影響本發(fā)明組分或步驟的基本特性或可賦予本發(fā)明不良特征的項目包括例如，細(xì)胞對生物傳感器表面的親和カ降低、刺激對細(xì)胞表面受體或胞內(nèi)受體的親和カ異常、 對候選配體或類似刺激的應(yīng)答的不規(guī)則或相反細(xì)胞活性，等等特征。37.表征表征等術(shù)語指收集關(guān)于物質(zhì)，如配體、分子、標(biāo)志物或細(xì)胞的任何特性的信息，例如獲得配體、分子、標(biāo)志物或細(xì)胞的概況。38.接觸接觸等術(shù)語表示，如果至少兩種事物，例如分子、細(xì)胞、標(biāo)志物、至少ー種化合物或組合物、或至少兩種組合物、或這些中的任一種與ー種或多種制品或機(jī)器之間可能有分子相互作用，則使之相互靠近從而能發(fā)生分子相互作用。例如，接觸指將至少兩種組合物、分子、制品或事物接觸，即，它們接近以混合或碰觸。例如，如果有組合物溶液A和培養(yǎng)的細(xì)胞 B并將組合物溶液A傾倒在培養(yǎng)的細(xì)胞B上，則組合物溶液A與細(xì)胞培養(yǎng)B接觸。配體接觸細(xì)胞會把配體帶到細(xì)胞以確保細(xì)胞能接近配體。應(yīng)當(dāng)理解本文公開的任何事物可與任何其它事物接觸。例如，可以使細(xì)胞接觸標(biāo)志物或分子、生物傳感器等。39.對照術(shù)語對照或“對照水平”或“對照細(xì)胞”等術(shù)語定義為度量變化的標(biāo)準(zhǔn)，例如不對對照施以實(shí)驗(yàn)，而是測定整套參數(shù)，或者對照依據(jù)處理前或處理后的水平。它們或與測試平行進(jìn)行，或者在之前或之后進(jìn)行，或者它們可以是預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)。例如，對照可以指對象或客體或制劑在平行實(shí)驗(yàn)中處理的實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，除了省去受測過程或試劑或變量，該結(jié)果用作判斷實(shí)驗(yàn)效果的比較標(biāo)準(zhǔn)。因此，可利用對照測定過程或試劑或變量等的相關(guān)效果。 例如，如果研究測試分子對細(xì)胞的作用，可以a)簡單地記錄該分子存在下的細(xì)胞特征，b) 進(jìn)行a，然后還記錄添加具有已知活性或無活性的對照分子或?qū)φ战M合物(例如，試驗(yàn)緩沖溶液(載體))的作用，再比較測試分子與対照的作用。在某些情況中，一旦進(jìn)行對照，所述對照可用作標(biāo)準(zhǔn)，不必再次進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)，而在另一些情況中，要作比較時每次應(yīng)平行進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。40.確定的途徑“確定的途徑”等術(shù)語是特定途徑，例如Gq途徑、(is途徑、Gi途徑、EGFR(表皮生長因子受體)途徑、PII途徑、EPAC (由CAMP直接激活的交換蛋白質(zhì))途徑或H(C(蛋白激酶 C)途徑。41.檢測檢測等術(shù)語指本發(fā)明的設(shè)備和方法發(fā)現(xiàn)或感應(yīng)分子誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答和區(qū)分對不同分子的感應(yīng)應(yīng)答的能力。42.決定因素“決定因素”等術(shù)語指調(diào)節(jié)或介導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)的物質(zhì)、化合物或分子。43.分化術(shù)語“分化”等術(shù)語指譜系約定(lineage commitment)的發(fā)育過程。“譜系”或“通路”指細(xì)胞發(fā)育的途徑，其中前體或祖細(xì)胞經(jīng)歷漸進(jìn)的生理改變，從而變?yōu)榫哂刑卣餍怨δ艿闹付?xì)胞類型(例如，神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞后內(nèi)皮細(xì)胞)。分化分階段進(jìn)行，藉此細(xì)胞逐漸變得更加專門化直至它們完全成熟，這也稱為“終末分化”?！敖K末分化的細(xì)胞”是定型為特定譜系并且達(dá)到分化的最終階段的細(xì)胞(即，完全成熟的細(xì)胞)。44.直接作用(候選藥物分子或任何其它分子、化合物或組合物)“直接作用”等術(shù)語指候選藥物分子作用于細(xì)胞的結(jié)果。45. DMR 指數(shù)"DMR指數(shù)”等術(shù)語是由DMR數(shù)據(jù)集合構(gòu)成的生物傳感器指數(shù)。46. DMR 應(yīng)答"DMR應(yīng)答”等術(shù)語指采用光學(xué)生物傳感器的生物傳感器應(yīng)答。DMR指動態(tài)物質(zhì)再分布或動態(tài)細(xì)胞物質(zhì)再分布。P-DMR是正DMR應(yīng)答，N-DMR是負(fù)DMR應(yīng)答，RP-DMR是恢復(fù)P-DMR應(yīng)答。47. DMR 信號“DMR信號”等術(shù)語指光學(xué)生物傳感器測得，由刺激后的細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生的細(xì)胞信號。48.多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)劑“多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)劑”等術(shù)語指保護(hù)神經(jīng)元免遭多巴胺毒性的任何物質(zhì)，例如分子。本文公開了其實(shí)例。49.候選藥物分子藥物候選分子等術(shù)語是測試其用作藥物或藥效團(tuán)的能力的測試分子。該分子可視為先導(dǎo)分子。50.早期培養(yǎng)物早期培養(yǎng)物等術(shù)語是培養(yǎng)期間的細(xì)胞相對狀態(tài)，常與其細(xì)胞周期狀態(tài)或復(fù)制時間相關(guān)。早期培養(yǎng)物是少于或等于細(xì)胞倍增時間的時期內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物。51.功效功效等術(shù)語指在理想或最優(yōu)條件下產(chǎn)生所需大小的作用的能力。這些條件區(qū)分了功效和效カ相關(guān)概念，后者涉及現(xiàn)實(shí)條件下的改變。功效是受體占用和在分子、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)水平啟動應(yīng)答的能力之間的關(guān)系。52.胚胎干細(xì)胞和相關(guān)術(shù)語a)干細(xì)胞“干細(xì)胞”等術(shù)語指非終末分化的細(xì)胞，其能體內(nèi)或離體増殖，例如基本上永生化， 還能分化成其它細(xì)胞類型。其可分化成在分離其的組織中存在的某些分化的、定型的、不成熟的、祖細(xì)胞或成熟細(xì)胞類型，或者極大差別的細(xì)胞類型，例如衍生自相同前體細(xì)胞，如造血細(xì)胞的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，或者甚至分化成與獲得干細(xì)胞的組織完全不同的組織中任何階段的細(xì)胞類型。例如，血液干細(xì)胞可變成腦細(xì)胞或肝細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞可變成血細(xì)胞，從而干細(xì)胞改變它們的潛能。b)全能干細(xì)胞和全能性全能干細(xì)胞等術(shù)語是這樣ー種干細(xì)胞，其可通過至少10次倍増，在一些情況中明顯更長，例如20、30、50或更多次倍増，在一些情況中，看來無限地分裂，其還能分化成所有 3種胚層，中胚層、內(nèi)胚層和外胚層衍生細(xì)胞。所述全能干細(xì)胞的具體例子是胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞和誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞。在明顯情況中，全能干細(xì)胞可在動物模型中形成畸胎瘤?！叭苄浴钡刃g(shù)語指細(xì)胞具有分化成3種胚層中任一個的潛能，即，內(nèi)胚層(內(nèi)胃襯里、胃腸道、肺)、中胚層(肌肉、骨、血、泌尿生殖)或外胚層(表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。全能細(xì)胞可產(chǎn)生任何胎兒或成人細(xì)胞類型。C)胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)術(shù)語“胚胎干細(xì)胞”(EQ等術(shù)語指從胚泡階段胚胎分離和培養(yǎng)的全能細(xì)胞。ES細(xì)胞是全能的-分化成三種主要胚層的所有衍生物的能力外胚層、內(nèi)胚層和中胚層。不給予分化刺激時(即，體外成長時)，細(xì)胞通過多次細(xì)胞分裂維持全能性。胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是衍生自胚泡階段胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的全能細(xì)胞。ES細(xì)胞是全能的。不給予分化刺激時 (即，體外成長時)，ES細(xì)胞通過多次細(xì)胞分裂維持全能性。它們的塑性和潛在的無限自我更新能力使得ES細(xì)胞成為發(fā)育和疾病建模以及開發(fā)細(xì)胞替代療法的有力工具。這些細(xì)胞經(jīng)廣泛研究和表征。實(shí)際上，ES細(xì)胞慣常用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。ES細(xì)胞顯示體外分化成幾種細(xì)胞類型，包括淋巴前體(Potocnik等·，1994，EMBO J.，第13卷(22) :527483)和神經(jīng)細(xì)胞。利用許多階段特異性標(biāo)志物，例如階段特異性胚胎標(biāo)志物3和4 (SSEA-3和SSEA-4)、 高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81及堿性磷酸酶(Andrews等.，1984，Hybridoma，第3 卷347 361 ；Kannagi 等·，1983，EMBO J.，第 2 卷2355 2361 ；Fox 等·，1984，Dev. Biol.， 第 103 卷263 266 ；Ozawa 等.，1985，Cell. Differ.，第 16 卷:169 173)表征 ES 細(xì)胞。d)誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞(ire)是通過誘導(dǎo)某些基因的“強(qiáng)迫”表達(dá)，或直接遞送重編程蛋白，或用小分子刺激而人工衍生自非全能干細(xì)胞(例如，成纖維細(xì)胞)，通常是成人體細(xì)胞的ー類全能干細(xì)胞。據(jù)信，iPS細(xì)胞是功能上相當(dāng)?shù)呐咛ジ杉?xì)胞和其它全能干細(xì)胞。此外，iPS細(xì)胞具有的某些干細(xì)胞基因和蛋白質(zhì)的基因表達(dá)、染色質(zhì)甲基化模式、倍增時間、胚狀體形成、畸胎瘤形成、存活嵌合體形成和潛力及分化能力相似。根據(jù)所用的方法，重編程成人細(xì)胞以獲得ipse能引起極大風(fēng)險，從而其在人體中的應(yīng)用受限。例如，利用慢病毒載體能導(dǎo)致基因組中的切入性突變，或者引入原癌基因(例如，C-Myc)作為重編程因子之一能賦予所得細(xì)胞癌性。示范性iPS細(xì)胞描述于Takahashi等.，(2007)，Cell，131 =861-872, 或 Yu 等·，(2007)，Science, 318 :1917_1920。e)多能干細(xì)胞和多能性“多能干細(xì)胞和多能性”等術(shù)語指這樣ー種細(xì)胞，其具有產(chǎn)生多個，但有限數(shù)量的譜系細(xì)胞的潛能。多能干細(xì)胞的例子是造血細(xì)胞-可發(fā)育成幾類血細(xì)胞，但不能發(fā)育成，例如腦細(xì)胞或其它類型細(xì)胞的血液干細(xì)胞。多能性的潛能低于全能性。f)祖細(xì)胞術(shù)語“祖細(xì)胞”等術(shù)語指這樣ー種細(xì)胞，其在受控和/或限定條件下會分化成給定表型的細(xì)胞。因此，成骨祖細(xì)胞是在為下述定型和分化建立的條件下培養(yǎng)時，定型成成骨細(xì)胞譜系并最終形成骨組織的祖細(xì)胞。祖細(xì)胞僅能分裂有限次數(shù)。g)自我更新“自我更新”等術(shù)語指細(xì)胞分裂產(chǎn)生ー個(不對稱分裂)或兩個(對稱分裂)子細(xì)胞的過程，所述子細(xì)胞具有與母細(xì)胞不可區(qū)分的發(fā)育潛能。自我更新涉及増殖和未分化狀態(tài)的維持。h)未分化狀態(tài)“未分化狀態(tài)”等術(shù)語指其中細(xì)胞沒有指定的細(xì)胞類型的細(xì)胞狀態(tài)。干細(xì)胞在分化成指定細(xì)胞類型之前處于未分化狀態(tài)。i)單能性“單能性”等術(shù)語指細(xì)胞僅發(fā)育/分化成一類組織/細(xì)胞類型的能力。單能細(xì)胞僅可自我更新成同一類型的細(xì)胞。人的單能細(xì)胞的例子是皮膚細(xì)胞。j)成人干細(xì)胞成人干細(xì)胞也稱為體干細(xì)胞，其是未分化的細(xì)胞，胚胎發(fā)育后在體內(nèi)普遍可見，通過細(xì)胞分裂倍増來補(bǔ)充瀕死細(xì)胞并使得受損組織再生。成人干細(xì)胞還能無限分裂或自我更新，產(chǎn)生其所源自的器官的所有細(xì)胞類型，從而可能自少數(shù)細(xì)胞再生整個器官。然而，與全能的ES細(xì)胞不同，成人干細(xì)胞是譜系局限性的(即，多能的)-產(chǎn)生幾類不同細(xì)胞類型(例如，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元)的后代的能力。一般通過其組織來源指代大多數(shù)成人干細(xì)胞 (間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪衍生的干細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞等)。然而，可能存在單能自我更新干細(xì)胞，即，局限于產(chǎn)生単一細(xì)胞類型的細(xì)胞。此外，全能成人干細(xì)胞是罕見的，數(shù)量通常很少但可在包括臍帶血在內(nèi)的許多組織中找到。成人干細(xì)胞治療已成功地應(yīng)用多年，通過骨髓移植來治療白血病和相關(guān)的骨/血液癌癥。成人干細(xì)胞還用于獸醫(yī)學(xué)以便治療馬的肌腱和韌帶損傷。k)重編程或細(xì)胞重編程“重編程或細(xì)胞重編程”等術(shù)語指改變或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的分化狀態(tài)的過程。細(xì)胞可以在重編程之前先部分或終末分化。重編程包括體細(xì)胞的分化狀態(tài)完全逆轉(zhuǎn)成全能狀態(tài)。在示范性的一面，重編程是完全的，其中體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞。然而，重編程可以是部分的，例如逆轉(zhuǎn)為任何較低的分化狀態(tài)。例如，終末分化的細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成較低分化狀態(tài)的細(xì)胞，如多能細(xì)胞。1)干細(xì)胞分化和重編程干細(xì)胞分化在多個階段發(fā)生，可導(dǎo)致多種途徑(S卩，譜系)。為確保自我更新，干細(xì)胞經(jīng)歷兩類細(xì)胞分裂。對稱分裂產(chǎn)生賦予了干細(xì)胞特定的兩個相同子細(xì)胞。另ー方面，不對稱分裂僅產(chǎn)生ー個干細(xì)胞和ー個具有有限自我更新潛能的祖細(xì)胞。祖細(xì)胞可先經(jīng)幾輪細(xì)胞分裂，最終分化成成熟細(xì)胞。例如，許多原代人造血細(xì)胞產(chǎn)生接受不同細(xì)胞命運(yùn)和/或顯示不同增殖動力學(xué)特征的子細(xì)胞。對稱和不對稱分裂之間的分子差異可能在于子細(xì)胞之間細(xì)胞膜蛋白(例如⑶53、⑶62L/L-選擇蛋白、⑶63/lamp-3和⑶71/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)的差
升隔1 °其它理論是干細(xì)胞因其特定小生境中的環(huán)境信號而維持未分化。當(dāng)它們離開該小生境或不再接受那些信號，干細(xì)胞即分化。對果蠅卵巣的研究鑒定到信號dpp和阻止卵巣干細(xì)胞分化的粘附連接。還可利用分子，特別是小分子調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化和細(xì)胞重編程。重編程涉及隨著接合子發(fā)育成成人的細(xì)胞分化期間發(fā)生的核酸修飾(例如，甲基化)、染色質(zhì)凝聚、表遺傳改變、基因組印記等的至少ー些可遺傳模式的改變，例如逆轉(zhuǎn)。重編程不同于簡單地維持已經(jīng)是全能的細(xì)胞的已有未分化狀態(tài)或是維持已經(jīng)是多能細(xì)胞的細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞)的已有但低于完全的分化狀態(tài)。重編程也不同于促進(jìn)已經(jīng)是全能或多能的細(xì)胞的自我更新或増殖，雖然本發(fā)明的組合物和方法也可用于此類目的。m)干細(xì)胞和細(xì)胞重編程的表征雖然過去數(shù)十年中干細(xì)胞和細(xì)胞重編程取得許多進(jìn)展，但仍難于有效和可靠地表征干細(xì)胞和細(xì)胞重編程，特別是iPS細(xì)胞的產(chǎn)生、干細(xì)胞分化階段和途徑以及重編程細(xì)胞和它們各自的人細(xì)胞之間的差異。許多表征方法與利用特異性標(biāo)志物的顯微鏡成像相關(guān)， 常檢測單一細(xì)胞事件，包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、生長特性(例如，倍增時間、有絲分裂活性)、 特異性干細(xì)胞標(biāo)志物(例如，細(xì)胞表面抗原性標(biāo)志物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、 TRA-2-49/6E和 Nanog)、特異性干細(xì)胞基因(例如，0ct_3/4、Sox2、Nanog、GDF3、REXl、FGF4、 ESG1、DPPA2、DPPA4和hTERT)、特異性蛋白質(zhì)(例如，未分化干細(xì)胞的端粒酶和多巴胺能神經(jīng)元譜系的β III-微管蛋白、酪氨酸羥化酶、AADC, DAT、ChAT, LMXlB和MAP2，和心肌細(xì)胞譜系的IM^MEFZaMYI^A.MYHC^和NKX2. 5)、或多-細(xì)胞器官形成(例如，形成畸胎瘤，其是含有衍生自3種胚層-內(nèi)胚層、中胚層和外胚層-的組織的多譜系腫瘤，或者由有絲分裂活性和分化hESC的核心與所有三種胚層的完全分化細(xì)胞的外圍構(gòu)成的胚狀體)。53.高匯合細(xì)胞匯合等術(shù)語指細(xì)胞在培養(yǎng)基上或其中的覆蓋或増殖情況。由于多類細(xì)胞能經(jīng)歷細(xì)胞接觸抑制，高匯合表示培養(yǎng)的細(xì)胞在組織培養(yǎng)表面或生物傳感器表面達(dá)到高覆蓋率 (> 90%)，對于細(xì)胞在培養(yǎng)基中的生長有明顯限制。相反，低匯合(例如，40-60%的匯合) 表示對于培養(yǎng)基內(nèi)/上的細(xì)胞生長無甚或沒有限制，可假定它們處于生長階段。54.更高和抑制及類似詞語術(shù)語更高、提高、提升或升高等術(shù)語或這些術(shù)語的變形指提高到基礎(chǔ)水平以上，例如與對照相比。術(shù)語低、更低、減少、降低或縮減等術(shù)語或這些術(shù)語的變形是指降低到基礎(chǔ)水平以下，例如與對照相比。例如，在向細(xì)胞內(nèi)添加分子例如激動劑或拮抗劑之前或未添加吋，基礎(chǔ)水平是正常體內(nèi)水平。抑制或抑制形式等術(shù)語指降低或阻遏。55. “有分子存在下““有分子存在下“等術(shù)語指將培養(yǎng)的細(xì)胞接觸或暴露于該分子。所述接觸或暴露可以在細(xì)胞接觸刺激之前、或同時發(fā)生。56.指數(shù)指數(shù)等術(shù)語是數(shù)據(jù)的集合。例如，指數(shù)可以是具有一種或多種調(diào)節(jié)概況的列表、表格、文件、或目錄。應(yīng)當(dāng)理解，可以由任何數(shù)據(jù)組合生成指數(shù)。例如，DMR概況可以有P-DMR、 N-DMR和RP-DMR?？梢圆捎猛暾母艣r數(shù)據(jù)、P-DMR數(shù)據(jù)、N-DMR數(shù)據(jù)、RP-DMR數(shù)據(jù)、或其中的任意點(diǎn)、或這些或其它數(shù)據(jù)的組合生成指數(shù)。指數(shù)是任何此類信息的集合。通常，比較指數(shù)吋，所述指數(shù)類似于數(shù)據(jù)，即，P-DMR到P-DMR數(shù)據(jù)。57. “重編程細(xì)胞狀態(tài)的指示劑”“指示劑”等術(shù)語是進(jìn)行指示的事物。具體地說，“重編程細(xì)胞狀態(tài)的指示劑”表示某種事物，例如與未分化干細(xì)胞的相應(yīng)重編程細(xì)胞的一組分子的生物傳感器概況相比，該未分化干細(xì)胞的同一組分子的生物傳感器概況的差異或相似性，這種差異或相似性可解讀為重編程細(xì)胞具有與這些分子相互作用的相似或不同的功能受體，因此表明重編程細(xì)胞的狀態(tài)?；蛘?，還可利用一組已知調(diào)節(jié)劑的DMR指數(shù)作為細(xì)胞及其重編程細(xì)胞之間，或重編程細(xì)胞及其各自人天然細(xì)胞之間的相似性或差異的指示劑。58.已知的調(diào)節(jié)劑已知調(diào)節(jié)劑等術(shù)語是對至少ー種已知靶標(biāo)具有已知親和カ的調(diào)節(jié)劑。例如，已知調(diào)節(jié)劑可以是干細(xì)胞重編程抑制劑或細(xì)胞重編程增強(qiáng)性的，例如Wnt3蛋白。59.已知調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)“已知調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)”等術(shù)語是由已知調(diào)節(jié)劑的收集數(shù)據(jù)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)。例如，已知調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)可以由作用于細(xì)胞組(包括干細(xì)胞、其各自重編程細(xì)胞及其各自天然細(xì)胞)的已知調(diào)節(jié)劑的概況和已知調(diào)節(jié)劑針對標(biāo)志物組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，每組標(biāo)志物針對細(xì)胞組中的某種細(xì)胞。60.已知調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)“已知調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)”等術(shù)語是由已知調(diào)節(jié)劑的收集數(shù)據(jù)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)。例如，已知調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)可以由作用于細(xì)胞組的已知調(diào)節(jié)劑的概況和已知調(diào)節(jié)劑針對標(biāo)志物組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，每組標(biāo)志物針對細(xì)胞組中的某種細(xì)胞。61.已知分子已知分子等術(shù)語是藥理學(xué)/生物學(xué)/生理學(xué)/病理生理學(xué)活性已知的分子，其精確作用模式可以已知或未知。62.文庫文庫等術(shù)語是集合。文庫可以是本文公開的任何事物的集合。例如，它可以是指數(shù)的集合，指數(shù)文庫；它可以是概況的集合，概況文庫；或者它可以是DMR指數(shù)的集合，DMR 指數(shù)文庫；它還可以是分子的集合，分子文庫；它可以是細(xì)胞的集合，細(xì)胞文庫；它可以是標(biāo)志物的集合，標(biāo)志物文庫；文庫可以是，例如隨機(jī)或非隨機(jī)的，確定或不確定的。例如，公開了已知調(diào)節(jié)劑的DMR指數(shù)文庫或生物傳感器指數(shù)文庫。63.配體配體等術(shù)語是能與生物分子結(jié)合并形成復(fù)合物以便用于生物學(xué)目的的物質(zhì)或組合物或分子。生物系統(tǒng)中含有配體及其靶分子之間實(shí)際的不可逆共價連接。配體與受體的結(jié)合改變了化學(xué)構(gòu)象，即，受體蛋白質(zhì)的三維形狀。受體蛋白的構(gòu)象狀態(tài)決定受體的功能狀態(tài)。結(jié)合的趨勢或強(qiáng)度稱為親和力。配體包括底物、阻斷劑、抑制劑、激活劑和神經(jīng)遞質(zhì)。放射性配體是放射性同位素標(biāo)記的配體，而熒光配體是熒光標(biāo)記的配體；兩者都可視為配體， 常用作受體生物學(xué)或生物化學(xué)研究中的示蹤劑。配體和調(diào)節(jié)劑可互換使用。64.標(biāo)志物標(biāo)志物等術(shù)語是在生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)中產(chǎn)生信號的配體。所述信號還必須是至少ー種特異性細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑和/或至少ー種特異性靶標(biāo)介導(dǎo)的至少ー種特異性細(xì)胞過程的特征。所述信號可以是陽性、或陰性、或任何組合(例如振蕩)。干細(xì)胞特異性標(biāo)志物是干細(xì)胞的標(biāo)志物，特別考慮了本文公開的任何特定干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，例如全能干細(xì)胞標(biāo)志物。類似地，重編程細(xì)胞特異性標(biāo)志物是重編程細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。產(chǎn)生不同 DMR指數(shù)并反映細(xì)胞環(huán)境或背景差異的任何已知調(diào)節(jié)劑或分子也可用作表征細(xì)胞及其重編程細(xì)胞的標(biāo)志物。65.標(biāo)志物組“標(biāo)志物組”等術(shù)語指包括至少兩種標(biāo)志物的組。標(biāo)志物可以針對不同途徑、同一途徑、不同靶標(biāo)或者甚至同ー靶標(biāo)。66.標(biāo)志物生物傳感器指數(shù)“標(biāo)志物生物傳感器指數(shù)”等術(shù)語是由對標(biāo)志物收集的數(shù)據(jù)產(chǎn)生的生物傳感器指數(shù)。例如，標(biāo)志物生物傳感器指數(shù)可以由作用于細(xì)胞組，包括干細(xì)胞、其各自的重編程細(xì)胞及其各自的天然細(xì)胞的標(biāo)志物概況，和該標(biāo)志物針對標(biāo)志物組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，各組標(biāo)志物針對細(xì)胞組中的某種細(xì)胞。67.標(biāo)志物DMR指數(shù)“標(biāo)志物DMR指數(shù)”等術(shù)語是由對標(biāo)志物收集的數(shù)據(jù)產(chǎn)生的生物傳感器DMR指數(shù)。 例如，標(biāo)志物DMR指數(shù)可以由作用于細(xì)胞組，包括干細(xì)胞、其各自的重編程細(xì)胞及其各自的天然細(xì)胞的標(biāo)志物概況，和該標(biāo)志物針對標(biāo)志物組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，各組標(biāo)志物針對細(xì)胞組中的某種細(xì)胞。68.材料
材料是成為物理客體的組成(化學(xué)的、生物化學(xué)的、生物的、或混合的)的有形部分。69.培養(yǎng)基培養(yǎng)基是可在其中培養(yǎng)細(xì)胞的任何培養(yǎng)基。生長培養(yǎng)基是微生物或細(xì)胞可在其中生長的物品。70.調(diào)節(jié)對于調(diào)節(jié)，或其形式，表示提高、降低、或維持通過細(xì)胞靶標(biāo)介導(dǎo)的細(xì)胞活性。應(yīng)當(dāng)理解，在使用這些詞語中的一個時，也公開了其可以是比對照提高了，例如，l^d^uo^、 20%、50%、100%、500%、或 1000%，或可以是比對照降低了，例如，1%、5%、10%、20%、 50%、或 100%。71.調(diào)節(jié)DMR信號“調(diào)節(jié)DMR信號”等術(shù)語指對分子刺激起反應(yīng)而使得細(xì)胞的DMR信號或概況改變。72.調(diào)節(jié)概況“調(diào)節(jié)概況”等術(shù)語是有分子存在下標(biāo)志物的ニ級概況和沒有任何分子存在下標(biāo)志物的一級概況之間的比較。例如，可以通過從ニ級概況中扣除一級概況或從ー級概況中扣除ニ級概況或?qū)ⅴ思壐艣r對ー級概況標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行比較。73.調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)劑等術(shù)語是控制細(xì)胞靶標(biāo)活性的分子，例如配體。它是結(jié)合細(xì)胞靶標(biāo)，例如靶蛋白的信號調(diào)節(jié)分子。74.調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)“調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)”等術(shù)語是由對調(diào)節(jié)劑收集的數(shù)據(jù)，例如DMR數(shù)據(jù)產(chǎn)生的生物傳感器指數(shù)。例如，調(diào)節(jié)劑生物傳感器指數(shù)可由作用于細(xì)胞組，包括干細(xì)胞、其各自的重編程細(xì)胞及其各自的天然細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑概況構(gòu)成。75.調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)“調(diào)節(jié)劑DMR指數(shù)”等術(shù)語是由對調(diào)節(jié)劑收集的數(shù)據(jù)產(chǎn)生的DMR指數(shù)。例如，調(diào)節(jié)劑 DMR指數(shù)可以由作用于細(xì)胞組，包括干細(xì)胞、其各自的重編程細(xì)胞及其各自的天然細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑概況，和調(diào)節(jié)劑針對標(biāo)志物組的調(diào)節(jié)概況構(gòu)成，各組標(biāo)志物針對細(xì)胞組中的某種細(xì)胞。76.分子調(diào)節(jié)指數(shù)“分子調(diào)節(jié)指數(shù)”等術(shù)語是顯示分子調(diào)節(jié)作用于細(xì)胞組的標(biāo)志物組的生物傳感器輸出信號的能力的指數(shù)。通過把有分子存在下，標(biāo)志物刺激后細(xì)胞應(yīng)答的特定生物傳感器輸出信號參數(shù)根據(jù)沒有任何分子存在下的參數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化而產(chǎn)生調(diào)節(jié)指數(shù)。77.分子本文所用的術(shù)語“分子”等術(shù)語指以化學(xué)分子或有確定分子量的分子形式存在的生物或生物化學(xué)或化學(xué)實(shí)體。不論其大小，分子等術(shù)語是化學(xué)、生物化學(xué)或生物分子。許多分子是稱為有機(jī)分子(含有碳原子等，通過共價鍵連接的分子)的類型，但ー 些分子不含碳(包括簡單的分子氣體，例如分子氧和更復(fù)雜的分子例如一些硫基聚合物)。 通用術(shù)語“分子”包括分子的許多描述性分類或分組，例如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、類固醇、有機(jī)藥物、小分子、受體、抗體和脂質(zhì)。適當(dāng)?shù)臅r候，由于所述方法應(yīng)用于分子亞組，本文采用這些更具描述性的術(shù)語(其中很多，例如“蛋白質(zhì)”，其本身描述了多組重疊的分子)中的ー個或多個，而這些分子仍可代表通用類別“分子”和指定的亞類(例如蛋白質(zhì))。除非明確指出，“分子“ー詞包括特定的分子及其鹽，例如藥學(xué)上可接受的鹽。78.分子指數(shù)“分子指數(shù)”等術(shù)語是涉及分子的指數(shù)。79.分子混合物分子混合物等術(shù)語是指含有至少兩種分子的混合物。所述兩種分子可以是但不限干，結(jié)構(gòu)不同(即對映異構(gòu)體)、或組成不同(例如，蛋白質(zhì)同種型、糖形式、或含不同聚乙ニ 醇(PEG)修飾的抗體)、或結(jié)構(gòu)和組成不同(例如未純化的天然提取物、或未純化的合成化合物)。80.分子處理的細(xì)胞分子處理的細(xì)胞等術(shù)語是已暴露于分子的細(xì)胞。81.多檢測點(diǎn)概況分析“多檢測點(diǎn)概況分析”等術(shù)語表示獲得細(xì)胞重編程過程中，某細(xì)胞在多余一個時間點(diǎn)或條件下的生物傳感器概況。82.不連續(xù)方式的多檢測點(diǎn)概況分析“不連續(xù)方式的多檢測點(diǎn)概況分析”等術(shù)語表示在毗鄰兩點(diǎn)的概況分析之間，細(xì)胞應(yīng)維持在細(xì)胞重編程的預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下。83.天然細(xì)胞天然細(xì)胞是未經(jīng)人工遺傳工程改造(S卩，過表達(dá)靶標(biāo)或敲除靶標(biāo))的任何細(xì)胞。天然細(xì)胞可以是原代細(xì)胞、永生化細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或干細(xì)胞。84.標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)化等術(shù)語表示，例如調(diào)整數(shù)據(jù)、或概況、或應(yīng)答以消除至少ー個共有變量。85.任選“任選的”或“任選地”等術(shù)語表示隨后描述的事件或情形可以發(fā)生或不發(fā)生，而且該描述包括事件或情形發(fā)生的實(shí)例和不發(fā)生的實(shí)例。例如，短語“組合物可任選包含組合” 是指組合物可以包含不同分子的組合或不包含組合，從而說明書包括了組合和不存在組合 (例如組合中各成員)。86.或本文所用的詞語“或”等術(shù)語表示特定列表中的任何成員，還包括該列表中成員的任意組合。87.組組等術(shù)語是預(yù)定的ー組樣本(細(xì)胞或途徑)?？梢詮奈膸熘羞x取樣本來產(chǎn)生組。 組可以是ー組標(biāo)志物、一組生物傳感器表面、一組檢測點(diǎn)、一組一級概況等。88. pH緩沖試驗(yàn)溶液pH緩沖試驗(yàn)溶液是經(jīng)緩沖具有生理pH(pH通常為7. 1)的任何溶液。89.淘選淘選等術(shù)語指篩選存在一種或多種受體或細(xì)胞靶標(biāo)的ー種或多種細(xì)胞。90. “時期”“時期”指代表時間推移的任何期間。例如，1秒、1分鐘、1小吋、1天和1周的時
91.陽性對照“陽性對照”等術(shù)語是顯示能產(chǎn)生數(shù)據(jù)集合的數(shù)據(jù)收集條件的對照。92.效能效能等術(shù)語是以產(chǎn)生給定強(qiáng)度效應(yīng)所需量表述的分子活性量度。效能和親和カ與功效成比例。親和カ是藥物分子與受體結(jié)合的能力。93. 一級概況“ー級概況”等術(shù)語指當(dāng)分子接觸細(xì)胞時產(chǎn)生的生物傳感器應(yīng)答或生物傳感器輸出信號或概況。通常，在將原始細(xì)胞應(yīng)答對凈零生物傳感器信號(即基線)標(biāo)準(zhǔn)化以后獲得ー級概況。94.原代細(xì)胞“原代細(xì)胞”等術(shù)語是未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或視作細(xì)胞系的細(xì)胞。95.概況概況等術(shù)語指對組合物，例如細(xì)胞收集的數(shù)據(jù)。如本文所述，概況可以從無標(biāo)記的生物傳感器收集。概況分析指獲得概況的行為。本文公開了，例如細(xì)胞途徑概況分析、原始附著概況分析、時間點(diǎn)概況分析，各自指代所述特定相關(guān)類型的概況或概況分析。96.出版物整篇申請中引用了各種出版物。這些出版物的內(nèi)容通過引用全文納入本申請中以便更完整地描述本申請所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。對于公開的參考文獻(xiàn)中包含的、在所引用語句中討論的材料，這些參考文獻(xiàn)各自也明確通過引用納入本文。97.脈沖刺激試驗(yàn)“脈沖刺激試驗(yàn)”等術(shù)語可用于細(xì)胞僅在極短時間(例如，數(shù)秒、或數(shù)分鐘)期間暴露于分子的情況。該脈沖刺激試驗(yàn)可用于研究作用于細(xì)胞/靶標(biāo)的分子的動力學(xué)特性，及其對標(biāo)志物誘導(dǎo)的生物傳感器信號的影響?？梢栽谔砑臃肿雍蟮慕o定時間用液體操作裝置將分子溶液簡單替換成細(xì)胞試驗(yàn)緩沖液進(jìn)行脈沖刺激試驗(yàn)。98.靜息靜息等術(shù)語指處于靜止、平靜、休息、休眠、不活躍的狀態(tài)。靜息可指細(xì)胞周期中的細(xì)胞(^期；或者靜息是不分裂的細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞靜息定義為各種抗有絲分裂信號，例如促分裂原(例如生長因子)去除、接觸抑制和附著喪失誘導(dǎo)的可逆生長/増殖停滯。99.范圍在本文中，范圍可以表述為始于“約”某一具體數(shù)值開始和/或止干“約”另一具體數(shù)值。表述此類范圍時，另ー種實(shí)施方式包括始于某一具體數(shù)值和/或止于另一具體數(shù)值。類似地，利用前綴“約”將數(shù)值表達(dá)為近似值時，應(yīng)該理解，該具體數(shù)值構(gòu)成另ー實(shí)施方式。還應(yīng)理解，各范圍的端點(diǎn)是有意義的，而不論與另一端點(diǎn)相關(guān)還是獨(dú)立于該另一端點(diǎn)。 還應(yīng)理解，本文公開了許多數(shù)值，除了該數(shù)值本身，各數(shù)值也都公開為“約”具體值。例如，如果公開了數(shù)值“10”，那么也公開了“約10”。還應(yīng)理解，當(dāng)數(shù)值公開為“小于或等干”該數(shù)值吋，也公開了如技術(shù)人員適當(dāng)理解的“大于或等干”該數(shù)值和數(shù)值之間可能的范圍。例如， 如果公開數(shù)值“10”，則也公開了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。還應(yīng)理解，通篇申請，提供了許多不同格式的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)代表終點(diǎn)和起點(diǎn)以及這些數(shù)據(jù)點(diǎn)的任意組合的范圍。例如，如果公開了具體數(shù)據(jù)點(diǎn)“ 10”和具體數(shù)據(jù)點(diǎn)“ 15”，應(yīng)理解，可以認(rèn)為公開了大干，大于或等干，小干，小于或等干，以及等于“ 10”和“ 15”，以及在10-15之間。還應(yīng)理解， 還公開了兩個具體単位之間的各単位。例如，如果公開了 10和15，則也公開了 11、12、13和 14。100.受體受體等術(shù)語是包埋在細(xì)胞的質(zhì)膜或胞質(zhì)內(nèi)的，可以結(jié)合移動信號傳導(dǎo)(或“信號”)的蛋白分子。與受體結(jié)合的分子稱為“配體”，可以是肽(例如神經(jīng)遞質(zhì))、激素、藥物或毒素，當(dāng)發(fā)生此類結(jié)合吋，受體發(fā)生的構(gòu)象變化通常啟動細(xì)胞應(yīng)答。但是，ー些配體只是阻斷受體而不誘導(dǎo)任何應(yīng)答(例如拮抗剤)。配體誘導(dǎo)的受體變化導(dǎo)致生理變化，這構(gòu)成配體的生物學(xué)活性。101.相應(yīng)細(xì)胞“相應(yīng)細(xì)胞”等術(shù)語是在功能(即，生理學(xué)功能)上等價的細(xì)胞。對于衍生自干細(xì)胞的心肌細(xì)胞的例子，其相應(yīng)細(xì)胞應(yīng)是原代心肌細(xì)胞。102.應(yīng)答應(yīng)答等術(shù)語是指對任何刺激的任何反應(yīng)。103. “強(qiáng)效生物傳感器信號”“強(qiáng)效生物傳感器信號”指生物傳感器信號的幅度顯著超過噪音水平或陰性對照應(yīng)答(例如3xU0x,20xU00x或IOOOx)。陰性對照應(yīng)答通常是添加試驗(yàn)緩沖溶液(即載體)后細(xì)胞的生物傳感器應(yīng)答。噪音水平是不額外添加任何溶液時細(xì)胞的生物傳感器信號。值得注意的是，在添加任何溶液前，細(xì)胞總是被溶液覆蓋。104. “強(qiáng)效 DMR 信號，，“強(qiáng)效DMR信號”等術(shù)語指“強(qiáng)效生物傳感器信號”的DMR形式。105.樣品樣品等術(shù)語表示如本文所述作試驗(yàn)的動物、植物、真菌等；天然產(chǎn)物、天然產(chǎn)物提取物等；動物的組織或器官；細(xì)胞(對象內(nèi)、或直接取自對象、或在培養(yǎng)物中維持的細(xì)胞或來自培養(yǎng)細(xì)胞系的細(xì)胞)；細(xì)胞裂解物(或裂解物的部分)或細(xì)胞提取物；或含有衍生自細(xì)胞或細(xì)胞材料的ー種或多種分子(例如多肽或核酸)的溶液。樣品還可以是含有細(xì)胞或細(xì)胞組分的任何體液或分泌物(例如，但不限于血液、尿液、糞便、唾液、淚液、膽汁)。106. ニ級概況“ニ級概況”等術(shù)語是有分子存在下，細(xì)胞對標(biāo)志物起反應(yīng)的生物傳感器應(yīng)答或生物傳感器輸出信號。ニ級概況可以用作分子調(diào)節(jié)標(biāo)志物誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答或生物傳感器應(yīng)答的能力的指示劑。107.含血清的培養(yǎng)基含血清的培養(yǎng)基等詞語是含有血清(例如，胎牛血清)的任何細(xì)胞培養(yǎng)基。胎牛血清是血液凝結(jié)后留下的血漿部分，在該過程中血漿蛋白纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白并維持在凝塊中。胎牛血清來自在屠宰場，通過密閉系統(tǒng)靜脈穿刺從未出生的牛胎兒通過取得的血液。胎牛血清(FBS)是最廣泛使用的血清，因?yàn)樗目贵w含量低并含有更多的生長因子，從而能應(yīng)用于許多不同領(lǐng)域。FBS用于培養(yǎng)真核細(xì)胞。108.血清消耗培養(yǎng)基
血清消耗培養(yǎng)基是不含血清的任何細(xì)胞培養(yǎng)基。109. “短期”“短期”等術(shù)語是通常短于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下細(xì)胞復(fù)制的時期。110.信號傳導(dǎo)途徑“確定的途徑”等術(shù)語是從接收信號(例如外源配體)到細(xì)胞應(yīng)答(例如細(xì)胞靶標(biāo)表達(dá)提高)的細(xì)胞途徑。在一些情況中，配體與受體結(jié)合導(dǎo)致的受體激活與細(xì)胞對配體的應(yīng)答直接偶聯(lián)。例如，神經(jīng)遞質(zhì)GABA能激活作為離子通道一部分的細(xì)胞表面受體。GABA與神經(jīng)元上GABA A受體的結(jié)合打開了作為受體一部分的氯選擇性離子通道。GABA A受體激活使帶負(fù)電的氯離子移動進(jìn)入神經(jīng)元從而抑制神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位的能力。然而，對于許多細(xì)胞表面受體，配體-受體相互作用不與細(xì)胞應(yīng)答直接相關(guān)。在配體對細(xì)胞行為的最終生理效應(yīng)產(chǎn)生之前，激活的受體必須首先與細(xì)胞內(nèi)的其它蛋白質(zhì)相互作用。通常，一系列的數(shù)個相互作用細(xì)胞蛋白質(zhì)的行為在受體激活后被改變。由受體激活誘導(dǎo)的整套細(xì)胞變化稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理或途徑。信號傳導(dǎo)途徑可以較簡單或相當(dāng)復(fù)雜。111.相似性和指數(shù)相似性“指數(shù)相似性”等術(shù)語表示針對分子的兩種指數(shù)、或至少三種指數(shù)之間基于指數(shù)的模式和/或評分矩陣的相似性的術(shù)語。評分矩陣與其對應(yīng)物密切相關(guān)，例如在相應(yīng)細(xì)胞中不同分子的ー級概況的簽名，和不同分子對某標(biāo)志物的調(diào)節(jié)概況的性質(zhì)和百分比。例如，給予更相似的特征更高的分?jǐn)?shù)，給予不相似的特征較低或負(fù)的分?jǐn)?shù)。因?yàn)榉肿诱{(diào)節(jié)指數(shù)只有三種調(diào)節(jié)類型，正、負(fù)和中性，相似性矩陣相對簡単。例如，樣品矩陣給正調(diào)節(jié)指定評分+1， 負(fù)調(diào)節(jié)指定評分-1，中性調(diào)節(jié)指定評分0。或者，對具有不同水平的一種調(diào)節(jié)類型可以給予不同分?jǐn)?shù)。例如，可相應(yīng)給予 10%、20%、30%、40%、50%、60%、100%、200% 等正調(diào)節(jié)評分為 +1、+2、+3、+4、+5、+6、 +10、+20。相反，對于負(fù)調(diào)節(jié)，可以給予相似但相反的評分。根據(jù)該方法，圖IOC顯示了酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrph0Stin)51針對標(biāo)志物組的調(diào)節(jié)指數(shù)，表明已知的EGFR抑制劑酪氨酸磷酸化抑制劑51差異性調(diào)節(jié)不同標(biāo)志物誘導(dǎo)的生物傳感器應(yīng)答在A549細(xì)胞中， 吡那地爾(0% )、聚(IC) (+5% )、PMA(-6% )、SLIGKV-酰胺(0% )、毛喉素(-23% )、組胺(+6% )；和在靜息A431細(xì)胞中，腎上腺素(-68% )、畑酸(+4% )、EGF(P_DMR，-36% )、 EGF(N-DMR, -5 % )和組胺(-16 0Z0 )。因此，HA1077調(diào)節(jié)指數(shù)的協(xié)同評分可以指定為 (0,0. 5、-0. 6、0、-2. 3,0. 6、0、-6. 8,0. 4、-3. 6、-0. 5、-1. 6)。一旦產(chǎn)生分子指數(shù)，可將該分子指數(shù)與已知調(diào)節(jié)劑文庫比較以測定感興趣分子的作用模式。從酪氨酸磷酸化抑制劑51的生物傳感器指數(shù)，可以得出酪氨酸磷酸化抑制劑51顯示多重藥理學(xué)特性 (polypharmacology)的結(jié)論，因?yàn)樗米鱁GFR抑制劑(抑制A431中EGF誘導(dǎo)的DMR信號)， 還用作PDE4抑制劑(抑制A431中的腎上腺素和組胺應(yīng)答，以及A549中的毛喉素應(yīng)答)。 除了指示某分子的藥理學(xué)特性的DMR指數(shù)，分子DMR指數(shù)還可用于區(qū)分不同類型細(xì)胞的細(xì)胞背景。112.細(xì)胞饑餓細(xì)胞饑餓等術(shù)語指在細(xì)胞培養(yǎng)期間驅(qū)動細(xì)胞進(jìn)入靜息的過程。在細(xì)胞培養(yǎng)期間去除細(xì)胞培養(yǎng)基中的促分裂原(例如，血清或生長因子)是細(xì)胞饑餓的最常用手段。促分裂原去除可與其它手段(例如，接觸抑制)聯(lián)用。
113.物質(zhì)物質(zhì)等術(shù)語是指任何物理客體。材料是物質(zhì)。分子、配體、標(biāo)志物、細(xì)胞、蛋白質(zhì)和 DNA可視作物質(zhì)。機(jī)器或物品應(yīng)視作由物質(zhì)組成，而本身不視作物質(zhì)。114.同步細(xì)胞同步細(xì)胞等術(shù)語指細(xì)胞群，其中微量滴定板ー個孔中的大多數(shù)細(xì)胞處于同一狀態(tài) (例如，同一細(xì)胞周期(如Gtl或ら))。同步細(xì)胞等術(shù)語還可指操控細(xì)胞周圍的環(huán)境或細(xì)胞的生長條件，從而產(chǎn)生其中大多數(shù)細(xì)胞處于同一細(xì)胞周期階段的細(xì)胞群。115.穩(wěn)定用于藥物組合物吋，術(shù)語“穩(wěn)定”等術(shù)語在本領(lǐng)域一般理解為表示在特定保存條件下，在給定時期內(nèi)的活性成分損失低于一定量，通常為10%。認(rèn)為組合物穩(wěn)定所需要的時間是相對各產(chǎn)品的用途而言的，并由生產(chǎn)所述產(chǎn)品、保持以便質(zhì)控和檢查、運(yùn)輸?shù)脚l(fā)商或直接到消費(fèi)者在其最終使用前被再次保存等商業(yè)化實(shí)踐所決定。包括數(shù)月時間的安全因子， 藥物的最短產(chǎn)品壽命一般是一年，優(yōu)選超過18個月。本文所用術(shù)語“穩(wěn)定”參考了這些市場現(xiàn)實(shí)情況和在不難獲得的環(huán)境條件，例如2°C _8°C冷藏條件下保存與運(yùn)輸產(chǎn)品的能力。116.對象全文使用的對象等術(shù)語指個體。因此，“對象”可以包括，例如家養(yǎng)的動物，如貓、狗等，牲畜(例如，牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、實(shí)驗(yàn)動物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和哺乳動物、非人哺乳動物、靈長類動物、非人靈長類動物、嚙齒動物、鳥、爬行動物、兩棲動物、魚和任何其它動物。一方面，對象是哺乳動物，例如靈長類動物或人。對象可以不是人。117.懸浮細(xì)胞“懸浮細(xì)胞”指優(yōu)選在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)期間細(xì)胞不附著或粘著基材表面的細(xì)胞或細(xì)胞系。然而，懸浮細(xì)胞通常可以通過化學(xué)(例如共價結(jié)合、或抗體-細(xì)胞表面受體相互作用)、或物理方式(例如，由于重力作用力沉降到包埋了生物傳感器的孔底部)與生物傳感器表面接觸。因此，懸浮細(xì)胞也可用于生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)。118.測試分子測試分子等術(shù)語是在獲得該測試分子一些信息的方法中使用的分子。測試分子可以是未知分子或已知分子。119.處理的組織培養(yǎng)物“處理的組織培養(yǎng)物”等術(shù)語指在制備條件下預(yù)處理細(xì)胞培養(yǎng)平板的過程(例如， 等離子體處理并作進(jìn)ー步滅菌或不作進(jìn)ー步滅菌)。120.時間檢測點(diǎn)或時間點(diǎn)“時間檢測點(diǎn)或時間點(diǎn)”等術(shù)語指細(xì)胞培養(yǎng)期間，操控或表征細(xì)胞培養(yǎng)的事件。例如，“時間檢測點(diǎn)”可以是將分子或物質(zhì)加入細(xì)胞培養(yǎng)物或利用無標(biāo)記生物傳感器表征細(xì)胞培養(yǎng)的事件。細(xì)胞培養(yǎng)期間可以有數(shù)個“時間檢測點(diǎn)”。121.處理處理等術(shù)語至少可以兩種方式使用。首先，處理等術(shù)語可以指對對象采取的給藥或行為，從而操控對象。其次，處理等術(shù)語可以指將任何兩種事物，例如任何兩種或多種物質(zhì)，如分子和細(xì)胞混合在一起。這種混合把至少兩種物質(zhì)匯集到一起，從而它們之間可發(fā)生接觸。例如，“處理細(xì)胞以達(dá)到高度匯合”表示照料或操控細(xì)胞以便它們在表面上達(dá)到高度匯合。當(dāng)處理等術(shù)語用于患有疾病的對象時，并不意味治愈或甚至例如癥狀的減輕。當(dāng)治療等術(shù)語與處理等術(shù)語聯(lián)用吋，其表示潛在疾病的癥狀減輕，和/或引起癥狀的ー種或多種潛在的細(xì)胞、生理、或生化誘因或機(jī)理減輕。應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的減輕是相對疾病的狀態(tài)而言，包括疾病的分子狀態(tài)，而不僅指疾病的生理狀態(tài)。122.觸發(fā)觸發(fā)等術(shù)語指引起或啟動事件，例如應(yīng)答的行為。123.超高匯合超高匯合等術(shù)語指細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時具有至少99%匯合的細(xì)胞群。124.未知分子未知分子等術(shù)語是具有未知生物學(xué)/藥理學(xué)/生理學(xué)/病理生理學(xué)活性的分子。125.數(shù)值組分、成分、添加剤、細(xì)胞類型、標(biāo)志物等方面的公開的具體和優(yōu)選數(shù)值及其范圍僅用于說明；它們不排除其它限定的數(shù)值或限定范圍內(nèi)的其它數(shù)值。本發(fā)明的組合物、設(shè)備和方法包括具有本文所述的任何數(shù)值或數(shù)值的任何組合、具體數(shù)值、更具體數(shù)值和優(yōu)選數(shù)值的那些組分、設(shè)備和方法。因此，所公開方法、組合物、制品和機(jī)器的組合方式可以包含本文討論的各種組分、步驟、分子和組合物等，或由它們組成、或基本由它們組成。例如，它們可用于表征本文定義的分子，包括配體的方法；本文定義的產(chǎn)生指數(shù)的方法；或本文定義的藥物發(fā)現(xiàn)方法。126.弱貼壁細(xì)胞“弱貼壁細(xì)胞”是指細(xì)胞培養(yǎng)期間與基材表面相互作用、結(jié)合或接觸較弱的細(xì)胞、 細(xì)胞系或細(xì)胞體系，例如原核或真核細(xì)胞。然而，這些類型的細(xì)胞，例如人胚胎腎(HEK)細(xì)胞通過清洗或培養(yǎng)基交換等物理干擾方式從基材表面解離。無標(biāo)記細(xì)胞試驗(yàn)無標(biāo)記細(xì)胞試驗(yàn)常利用生物傳感器監(jiān)測活細(xì)胞中化合物誘導(dǎo)的應(yīng)答。所述化合物可以是天然產(chǎn)生或合成的、純化或未純化的混合物。生物傳感器常利用轉(zhuǎn)換器，例如光學(xué)、 電學(xué)、熱量、聲學(xué)、磁力等轉(zhuǎn)換器將與生物傳感器接觸的細(xì)胞中的分子識別事件或配體誘導(dǎo)的改變轉(zhuǎn)化成可定量的信號。這些無標(biāo)記生物傳感器可用于涉及表征分子復(fù)合物如何隨時間形成和解離的分子相互作用分析，或用于涉及表征細(xì)胞對刺激如何起反應(yīng)的細(xì)胞應(yīng)答分折?？捎糜诒景l(fā)明方法的生物傳感器包括但不限干，光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)，如表面等離振子共振(SPR)和共振波導(dǎo)光柵(RWG)生物傳感器，包括光子晶體生物傳感器，共振鏡、橢圓計， 和電學(xué)生物傳感器系統(tǒng)，如生物阻抗系統(tǒng)。可利用公開的方法、組合物和機(jī)器表征分化狀態(tài)經(jīng)歷改變的細(xì)胞。如果細(xì)胞，例如細(xì)胞培養(yǎng)物處于分裂和増殖中，細(xì)胞可處于同一分化水平或狀態(tài)，向分化増加進(jìn)展或向分化降低進(jìn)展。如本文所述，如果細(xì)胞向分化増加或降低進(jìn)展，則細(xì)胞發(fā)生重編程。這種重編程狀態(tài)通過時間改變或條件改變而發(fā)生?？刹捎霉_的方法、組合物和機(jī)器獲得細(xì)胞重編程狀態(tài)上時間改變或條件改變中的任何單一點(diǎn)或多點(diǎn)組的無標(biāo)記生物傳感器輸出結(jié)果，例如一級概況、ニ級概況、調(diào)節(jié)指數(shù)等。此外，對于不處于重編程狀態(tài)，但處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞，例如全能或多能干細(xì)胞，可采用所述方法、組合物和機(jī)器獲得本文所述的無標(biāo)記生物傳感器結(jié)果。公開了監(jiān)測細(xì)胞重編程過程的方法。例如，重編程方法包括干細(xì)胞分化。這些類型的方法通常涉及多檢測點(diǎn)，常利用一組或多組標(biāo)志物。標(biāo)志物也可以是任何事物，無需具有某些特異性。還公開了表征重編程細(xì)胞的性質(zhì)和質(zhì)量的方法。這些類型的方法通常利用ー組標(biāo)志物，但不涉及多檢測點(diǎn)。公開了比較未分化細(xì)胞、其相應(yīng)細(xì)胞及其重編程細(xì)胞的其它方法。這些類型的方法通常利用一組標(biāo)志物，涉及不同類型細(xì)胞的比較。公開的方法也設(shè)計用于測定干細(xì)胞(即，全能干細(xì)胞、子干細(xì)胞)的神經(jīng)元細(xì)胞分化譜系，例如神經(jīng)元分化?？筛倪M(jìn)所有公開的方法以便用作篩選方法來篩選，例如介導(dǎo)細(xì)胞重編程(包括干細(xì)胞分化或其它公開的活性)的分子，例如篩選加強(qiáng)所需重編程細(xì)胞產(chǎn)物功能的分子。本文公開了采用無標(biāo)記共振波導(dǎo)光柵生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)表征干細(xì)胞和通過胚胎及誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞重編程衍生的細(xì)胞，及測定干細(xì)胞分化途徑和階段的方法。具體地說，公開的方法涉及細(xì)胞重編程期間，在多檢測點(diǎn)的細(xì)胞應(yīng)答概況分析。如圖1所示，未分化的干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞與生物傳感器接觸。立即記錄細(xì)胞附著概況來表征預(yù)定一組表面上(例如，層粘連蛋白包被的、纖連蛋白包被的、天然束槍包被的(natural beam gun coated)、細(xì)胞粘附肽包被的、組織培養(yǎng)處理的，等等)的細(xì)胞附著行為。隨后，可在細(xì)胞重編程期間，在多個時間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑概況分析，例如細(xì)胞附著于生物傳感器表面后3小吋，細(xì)胞分化啟動后3天，細(xì)胞分化后10天和分化細(xì)胞達(dá)到成熟之吋。細(xì)胞培養(yǎng)期間，多檢測點(diǎn)概況分析可進(jìn)行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50或100次?？刹捎貌贿B續(xù)方式進(jìn)行此類多檢測點(diǎn)概況分析；即，毗鄰兩點(diǎn)的概況分析之間，細(xì)胞應(yīng)維持在預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下?？稍诮o定的生物傳感器內(nèi)，或在生物傳感器陣列內(nèi)或生物傳感器亞組內(nèi)進(jìn)行不同時間點(diǎn)的不同概況分析。例如，在384孔生物傳感器微量滴定板內(nèi)，具有細(xì)胞的生物傳感器亞組用于初始附著概況分析，而具有細(xì)胞的第二組生物傳感器用于給定時間點(diǎn)的細(xì)胞途徑概況分析，具有細(xì)胞的第三組生物傳感器用于另ー時間點(diǎn)的概況分析，等等。 類似地，可利用ー批生物傳感器微量滴定板；其中至少ー個微量滴定板用于ー種測試。對于細(xì)胞途徑概況分析，細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在預(yù)定表面上(例如，層粘連蛋白包被表面)，從而可采用不同時間點(diǎn)之間的比較來表征指定培養(yǎng)條件下細(xì)胞重編程的途徑和階段。本文還公開了篩選能介導(dǎo)干細(xì)胞和誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞分化并控制細(xì)胞命運(yùn)的小分子的方法。如圖2所示，未分化的干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞與一組生物傳感器表面接觸。立即記錄附著概況來表征預(yù)定一組表面上(例如，層粘連蛋白包被的、纖連蛋白包被的、天然束槍包被的、細(xì)胞粘附肽包被的、組織培養(yǎng)處理的，等等)的細(xì)胞附著行為?；蛘?，未分化的干細(xì)胞或干細(xì)胞-樣細(xì)胞與預(yù)定的生物傳感器表面接觸。然后，在沒有或有分子存在下培養(yǎng)細(xì)胞?？稍诩?xì)胞培養(yǎng)期間的特定時間，或多個時間點(diǎn)將所述分子引入細(xì)胞。例如，細(xì)胞培養(yǎng)期間，可引入分子1、2、3、4、5、10、15或20次。生物傳感器可用于表征細(xì)胞培養(yǎng)期間不同時間檢測點(diǎn)的細(xì)胞應(yīng)答概況。生物傳感器可以是無標(biāo)記生物傳感器。在分化期間的任何時間檢測點(diǎn)，利用一組標(biāo)志物表征細(xì)胞重編程的階段。如果與多種細(xì)胞培養(yǎng)物相比，暴露于分子的細(xì)胞培養(yǎng)物具有不同細(xì)胞應(yīng)答概況，則該分子可分類為決定因素。
本文還公開了測定原代細(xì)胞(或天然細(xì)胞)和通過胚胎及誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞重編程衍生的其相應(yīng)細(xì)胞之間差異的方法。如圖3所示，衍生自干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞的重編程或分化細(xì)胞與一組生物傳感器表面接觸。立即記錄細(xì)胞附著概況來表征預(yù)定一組表面上 (例如，層粘連蛋白包被的、纖連蛋白包被的、天然束槍包被的、細(xì)胞粘附肽包被的、組織培養(yǎng)處理的，等等)的細(xì)胞附著行為。記錄附著概況是任選的步驟。隨后，在標(biāo)準(zhǔn)條件下連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一段時間，從而細(xì)胞達(dá)到所需匯合以便利用無標(biāo)記生物傳感器作細(xì)胞概況分析。 培養(yǎng)結(jié)束吋，用一組標(biāo)志物分析細(xì)胞概況以表征重編程細(xì)胞的功能。同吋，立即表征相應(yīng)細(xì)胞(例如，原代細(xì)胞或無需增殖或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系)在與分化細(xì)胞相同的表面上的細(xì)胞附著行為。隨后，在標(biāo)準(zhǔn)條件下連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一段時間，從而細(xì)胞達(dá)到所需匯合以便利用無標(biāo)記生物傳感器作細(xì)胞概況分析。在原代和各細(xì)胞培養(yǎng)物之間進(jìn)行細(xì)胞應(yīng)答概況比較。比較結(jié)果用作重編程細(xì)胞的質(zhì)量和性質(zhì)的指示劑。原代和各細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞應(yīng)答概況非常相似或相同表明重編程細(xì)胞的質(zhì)量和性質(zhì)與原代細(xì)胞非常接近。原代和各細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答概況不同表明重編程細(xì)胞的質(zhì)量和性質(zhì)與原代細(xì)胞不同?？稍诩?xì)胞培養(yǎng)期間的數(shù)個時間檢測點(diǎn)進(jìn)行比較。例如，細(xì)胞培養(yǎng)期間，可進(jìn)行1、2、3、4、5、10、15或20次比較。本文還公開了在生物傳感器微量滴定板上將干細(xì)胞原位分化成分化細(xì)胞的方法。 如圖3所示，該方法包括(1)用UV臭氧新鮮清潔生物傳感器微量滴定板，隨后作乙醇處理； (2)用含有細(xì)胞附著分子(例如，胞外基質(zhì)蛋白層粘連蛋白)的溶液覆蓋生物傳感器孔給定的時間；C3)除去額外的溶液，用緩沖液洗滌生物傳感器微量滴定板；(4)然后將培養(yǎng)基中的干細(xì)胞施加于各孔作細(xì)胞接種；( 然后在未分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞一段時間；和(6) 然后用不含生長因子的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞來除去生長因子，從而干細(xì)胞經(jīng)歷分化；和(7)分化所需時間后，檢測細(xì)胞。本文還公開了表征通過胚胎及誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞重編程衍生的細(xì)胞體系，和利用這些細(xì)胞體系篩選藥物的方法。干細(xì)胞或干細(xì)胞-樣細(xì)胞可在受控方式(例如，基因操控、 環(huán)境控制)經(jīng)歷分化，從而形成多類細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞體系。此類細(xì)胞體系對于藥物發(fā)現(xiàn)有明顯優(yōu)勢。例如，祖干細(xì)胞可分化成至少三類細(xì)胞構(gòu)成的神經(jīng)元細(xì)胞體系多巴胺能神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞(圖4和圖5所示例的)。例如，可首先表征和分析多細(xì)胞類型構(gòu)成的體系來進(jìn)行藥物篩選。將藥物加入該體系。暴露于藥物后，表征并分析細(xì)胞。體系中的改變表明藥物影響至少ー種細(xì)胞類型。可鑒定ー種或多種特定的細(xì)胞類型以便進(jìn)一步測定作為藥物的潛在靶標(biāo)。可利用生物傳感器進(jìn)行該體系的表征。生物傳感器可以是無標(biāo)記生物傳感器。本文還公開了利用高分辨率光學(xué)生物傳感器成像系統(tǒng)，例如表面等離振子成像、 共振波導(dǎo)光柵成像、或共振鏡成像、或橢圓計成像來表征通過胚胎及誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞重編程衍生的細(xì)胞體系或混合細(xì)胞群的方法。本文還公開了利用高頻獲取生物傳感器系統(tǒng)，例如高頻生物傳感器系統(tǒng)分析快速細(xì)胞應(yīng)答(例如，通過干細(xì)胞重編程衍生的心肌細(xì)胞跳動)概況的方法。本文還公開了增強(qiáng)通過干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞重編程衍生的神經(jīng)細(xì)胞的無標(biāo)記生物傳感器應(yīng)答的方法。具體地說，所述方法利用抗多巴胺抗體來螯合神經(jīng)細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中的多巴胺。公開的方法還在分化期間利用小分子預(yù)處理衍生的神經(jīng)細(xì)胞以加強(qiáng)多巴胺應(yīng)答。小分子包括但不限于多巴胺神經(jīng)元保護(hù)劑，例如類固醇雌ニ醇?？稍诩?xì)胞分化期間的不同階段(増殖或分化期)引入此類多巴胺神經(jīng)元保護(hù)劑，例如17β_雌ニ醇。本文還公開了分析成人干細(xì)胞變成全能狀態(tài)和成人體細(xì)胞變成全能干細(xì)胞的重編程過程的概況的方法。公開的方法還涉及篩選上述調(diào)節(jié)和控制這些細(xì)胞命運(yùn)的分子。本文公開了重編程干細(xì)胞，例如全能干細(xì)胞、誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、成人干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞，如ReNcell VM的方法。本文公開了測定原代細(xì)胞和通過全能干細(xì)胞重編程衍生的其相應(yīng)細(xì)胞之間差異的方法。本文公開了表征通過胚胎和誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞重編程衍生的細(xì)胞體系，和利用這些細(xì)胞體系篩選藥物的方法。還公開了篩選可介導(dǎo)干細(xì)胞和誘導(dǎo)型全能干細(xì)胞分化并控制細(xì)胞命運(yùn)的小分子的方法。公開的方法中，可在給定的生物傳感器內(nèi)，或在生物傳感器陣列內(nèi)或生物傳感器亞組內(nèi)進(jìn)行不同時間點(diǎn)的不同概況分析。例如，在384孔生物傳感器微量滴定板內(nèi)，具有細(xì)胞的生物傳感器亞組用于初始附著概況分析，而具有細(xì)胞的第二組生物傳感器用于給定時間點(diǎn)的細(xì)胞途徑概況分析，具有細(xì)胞的第三組生物傳感器用于另ー時間點(diǎn)的概況分析，等等。對于細(xì)胞途徑概況分析，細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在預(yù)定表面上(例如，層粘連蛋白包被表面)，從而可采用不同時間點(diǎn)之間的比較來表征指定培養(yǎng)條件下細(xì)胞重編程的途徑和階段。公開的方法包括獲得未分化細(xì)胞，使該未分化細(xì)胞附著于無標(biāo)記生物傳感器系統(tǒng)的生物傳感器表面，培養(yǎng)附著的細(xì)胞直至第一檢測點(diǎn)，獲得標(biāo)志物的第一檢測點(diǎn)ー級概況。公開的方法還包括培養(yǎng)附著的細(xì)胞直至第二檢測點(diǎn)，和獲得標(biāo)志物的第二檢測點(diǎn) ー級概況。此外，方法中加入第三、第四或η個檢測點(diǎn)和相伴行為(η個或任何亞組)。公開的方法包括獲得分化的細(xì)胞，使該分化的細(xì)胞附著于生物傳感器表面，培養(yǎng)附著的細(xì)胞直至第一檢測點(diǎn)，直至達(dá)到所需匯合，獲得標(biāo)志物的第一檢測點(diǎn)一級概況，獲得相應(yīng)細(xì)胞，使該相應(yīng)細(xì)胞附著于生物傳感器表面，培養(yǎng)該相應(yīng)細(xì)胞直至第一檢測點(diǎn)，和獲得生物傳感器細(xì)胞信號傳導(dǎo)特征。公開的方法包括獲得分化的細(xì)胞，使該分化的細(xì)胞附著于生物傳感器表面，培養(yǎng)附著的細(xì)胞直至第一檢測點(diǎn)，獲得某標(biāo)志物的第一檢測點(diǎn)ー級概況，獲得相應(yīng)細(xì)胞，使該相應(yīng)細(xì)胞附著于生物傳感器表面，培養(yǎng)該相應(yīng)細(xì)胞直至第一檢測點(diǎn)，獲得該標(biāo)志物的第一檢測點(diǎn)ー級概況。公開的方法還包括獲得生物傳感器表面的細(xì)胞附著第一概況，其中在附著后的10 小時、9小時、8小時、7小時、6小時、5小時、4小時、3小時、2小時、1小時、0. 5小時、0. 2小
時或0. 1小時內(nèi)獲得所述附著概況，還包括為ー組生物傳感器表面重復(fù)步驟a和b，獲得該組生物傳感器表面中各生物傳感器表面的細(xì)胞附著概況，包括為ー組檢測點(diǎn)η重復(fù)步驟c 和d，從而產(chǎn)生一組檢測點(diǎn)η —級概況，還包括溫育分子、未知分子、候選藥物分子或候選重編程分子與細(xì)胞，然后獲得ー級概況，還包括在多于ー個時間點(diǎn)溫育該分子、該未知分子、 該候選藥物分子或該候選重編程分子與該細(xì)胞并獲得各時間點(diǎn)的ー級概況，還包括利用一組標(biāo)志物表征該細(xì)胞并產(chǎn)生各標(biāo)志物的一組ー級概況，或本文公開的這些或任何其它特征的任何組合。
公開的方法還包括產(chǎn)生多于ー個時間點(diǎn)或細(xì)胞的一組條件下各標(biāo)志物的ー級概況，還包括產(chǎn)生溫育分子、未知分子、候選藥物分子或候選重編程分子對于ー組標(biāo)志物中各標(biāo)志物的ニ級概況，其中在各檢測點(diǎn)產(chǎn)生各標(biāo)志物的ー級概況，其中生物傳感器表面包含層粘連蛋白、組織培養(yǎng)處理的生物傳感器表面、纖連蛋白、天然束槍(natural beam gun), 細(xì)胞粘附肽、組織培養(yǎng)處理，其中所述第一檢測點(diǎn)在附著后的3小時或不到、3天或不到、7 天或不到、10天或不到，開始分化吋，分化后，或成熟前，其中所述第二檢測點(diǎn)在附著后的3 小時或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到，其中所述第三檢測點(diǎn)在附著后的3小時或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到，其中所述第一檢測點(diǎn)在附著后的3小時或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到，開始分化吋，分化期間，或分化成熟后，其中細(xì)胞信號傳導(dǎo)表征包括利用標(biāo)志物，或這些或本文公開的任何其它特征的任何組合。還公開的方法中所述標(biāo)志物組包含一組標(biāo)志物乙酰膽堿、腺苷、ATP、精胺、 強(qiáng)啡肽A、內(nèi)皮肽1、神經(jīng)肽B-23 (NPB-23)、食欲素A、SFLLR-酰胺、UDP、神經(jīng)肽、血管活性腸肽、ADP、多巴胺、GABA、阿皮林、α-黑素細(xì)胞-刺激激素、血小板生長因子、血管緊張素II、高血糖素樣肽、溶血磷脂酸、神經(jīng)牽張素、P物質(zhì)、酪胺、UTP、硬骨魚緊張肽 II、8-CPT-2-Me-cAMP、毛喉素、MAS_7、740Y_P、L783281 和 PMA，其中標(biāo)志物的濃度是 0. 0005 μ Μ-1000 μ Μ、0· 01 μ Μ-100 μ Μ、0· 1 μ Μ-50 μ Μ、0· 1 μ M-IO μ Μ、1 μ M-IO μ Μ、 0. 001 μ M-IO μ Μ，其中所述標(biāo)志物組包括選自以下的一組標(biāo)志物G蛋白-偶聯(lián)受體激動劑、受體酪氨酸激酶激動劑、激酶激活劑、酶激活劑、酶抑制劑和受體激動劑，它們的ー級概況用作未分化細(xì)胞的重編程細(xì)胞的性質(zhì)和質(zhì)量的指示劑，其中所述標(biāo)志物組包含選自以下的一組標(biāo)志物G蛋白-偶聯(lián)的受體激動劑、受體酪氨酸激酶激動劑、激酶激活劑、酶激活劑、酶抑制劑和受體激動劑，它們的一級概況用作未分化細(xì)胞、其重編程細(xì)胞和其相應(yīng)細(xì)胞中差異的指示劑，其中所述標(biāo)志物組包含已知調(diào)節(jié)劑，其DMR指數(shù)用作未分化細(xì)胞的重編程細(xì)胞的性質(zhì)和質(zhì)量的指示劑，其中標(biāo)志物組包含一組已知調(diào)節(jié)劑，其DMR指數(shù)用作未分化細(xì)胞、其重編程細(xì)胞和其相應(yīng)細(xì)胞中差異的指示劑，其中所述標(biāo)志物組選自乙酰膽堿、 腺苷、ATP、精胺、強(qiáng)啡肽A、內(nèi)皮肽1、神經(jīng)肽B-23、食欲素A、SFLLR-酰胺、UDP、神經(jīng)肽、血管活性腸肽、ADP、多巴胺、GABA、阿皮林、α -黑素細(xì)胞_刺激激素、血小板生長因子、血管緊張素II、高血糖素樣肽、溶血磷脂酸、神經(jīng)牽張素、P物質(zhì)、酪胺、UTP、硬骨魚緊張肽II、 8-CPT-2-Me-cAMP、毛喉素、MAS_7、740Y_P、L783281和PMA，其中對于干細(xì)胞或祖干細(xì)胞的神經(jīng)元細(xì)胞分化譜系，標(biāo)志物組選自乙酰膽堿、腺苷、ATP、精胺、強(qiáng)啡肽A、內(nèi)皮肽1、神經(jīng)肽B-23、食欲素A、SFLLR-酰胺、UDP、神經(jīng)肽、血管活性腸肽、ADP、多巴胺、GABA、阿皮林、 α -黑素細(xì)胞-刺激激素、血小板生長因子、血管緊張素II、高血糖素樣肽、溶血磷脂酸、神經(jīng)牽張素、P物質(zhì)、酪胺、UTP、硬骨魚緊張肽II、8-CPT-2-Me-cAMP、毛喉素、MAS_7、740Y_P、 L783281和PMA，其中EPAC-PII途徑的下調(diào)或改變指示了干細(xì)胞或祖干細(xì)胞的神經(jīng)元細(xì)胞分化譜系，其中PKC途徑的下調(diào)或改變指示了干細(xì)胞或祖干細(xì)胞的神經(jīng)元細(xì)胞分化譜系， 其中選自Dl受體、NPY受體、食欲素A受體、阿片類物質(zhì)受體、毒蕈堿受體和P2Y受體的神經(jīng)元細(xì)胞-相關(guān)GPCR的功能信號傳導(dǎo)指示了干細(xì)胞或祖干細(xì)胞的神經(jīng)元細(xì)胞分化譜系，或這些或本文公開的任何其它特征的任何組合。還公開了，其中進(jìn)行多檢測點(diǎn)概況分析，其中所述多檢測點(diǎn)概況分析以不連續(xù)方式進(jìn)行，其中無標(biāo)記生物傳感器是表面等離振子共振系統(tǒng)(SPR)、RWG生物傳感器系統(tǒng)、阻抗系統(tǒng)、高分辨率光學(xué)生物傳感器成像系統(tǒng)、共振鏡成像系統(tǒng)、橢圓計成像系統(tǒng)、高頻獲取生物傳感器系統(tǒng)，其中所述相應(yīng)細(xì)胞包括原代細(xì)胞、永生化細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，還包括比較重編程細(xì)胞及其相應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答概況，還包括依據(jù)細(xì)胞應(yīng)答概況鑒定細(xì)胞，還包括細(xì)胞體系，其中所述細(xì)胞體系包含多于ー種分化的細(xì)胞類型，其中所述細(xì)胞體系包含多巴胺能神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞體系通過全能或多能干細(xì)胞重編程產(chǎn)生，或者這些或本文公開的任何其它特征的任何組合。還公開了以下方法，其中所述相應(yīng)細(xì)胞包括原代細(xì)胞、永生化細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，還包括比較未分化細(xì)胞、其重編程細(xì)胞及其相應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答概況，還包括依據(jù)細(xì)胞應(yīng)答概況鑒定細(xì)胞，還包括多于ー類衍生自干細(xì)胞或祖干細(xì)胞的細(xì)胞組成的細(xì)胞體系，還包括通過生物傳感器表面上干細(xì)胞或祖干細(xì)胞原位分化獲得的細(xì)胞體系，其中產(chǎn)生重編程細(xì)胞，其中所述重編程細(xì)胞包括神經(jīng)細(xì)胞，還包括溫育該細(xì)胞與抗多巴胺抗體，還包括溫育該細(xì)胞與多巴胺神經(jīng)元保護(hù)劑，其中所述多巴胺神經(jīng)元保護(hù)劑包括類固醇雌ニ醇，其中所述類固醇包括17 β-雌ニ醇，其中所述類固醇雌ニ醇在增殖階段引入，其中所述類固醇雌 ニ醇在分化階段引入，其中所述類固醇雌ニ醇在分化細(xì)胞成熟后引入，或者這些或本文公開的任何其它特征的任何組合。還公開了以下方法，其中監(jiān)測某細(xì)胞重編程為全能干細(xì)胞，其中將某分子施加于該細(xì)胞以測定該分子是否介導(dǎo)該細(xì)胞重編程，其中將某分子施加于該細(xì)胞以測定該分子重編程該細(xì)胞，其中生物傳感器表面包括多孔板，其中所述多孔板包括96或384或1536個孔，或者這些或本文公開的任何其它特征的任何組合。所述標(biāo)志物可以是上述標(biāo)志物的任何亞組。生物傳感器127. SPR 和系統(tǒng)表面等離振子共振(SPR)依靠棱鏡把覆蓋入射角范圍的楔形偏振光導(dǎo)入裝有導(dǎo)電金屬膜(例如金)的平面玻璃基材上以激發(fā)表面等離子體。所產(chǎn)生的漸消波與金層中的游離電子云相互作用并被吸收，從而產(chǎn)生電荷密度波(即，表面等離子體)并導(dǎo)致反射光強(qiáng)度減弱。產(chǎn)生該最低強(qiáng)度的共振角與傳感器表面相對面上接近金層的溶液的折射率呈函數(shù)關(guān)系。通常經(jīng)與泵和微通道相連的微流體引入化合物。128. RffG生物傳感器和系統(tǒng)共振波導(dǎo)光柵(RWG)生物傳感器可包括，例如基材(如玻璃)、含包埋光柵的波導(dǎo)薄膜和細(xì)胞層。RWG生物傳感器借助衍射光柵，采用共振偶聯(lián)將光引入波導(dǎo)，從而導(dǎo)致在溶液-表面界面產(chǎn)生全內(nèi)反射，進(jìn)而在界面產(chǎn)生電磁場。這ー電磁場本質(zhì)是漸消的，表示它從傳感器表面指數(shù)衰減；它衰減到初始值的Ι/e的距離稱為貫穿深度，它與具體RWG生物傳感器的設(shè)計呈函數(shù)關(guān)系，但通常在約200nm。該類生物傳感器利用此類漸消波表征傳感器表面或其附近的細(xì)胞層的配體誘導(dǎo)變化。RWG儀器可以根據(jù)角度漂移或波長漂移測量細(xì)分為不同系統(tǒng)。在波長漂移測量中， 采用具有恒定角度的覆蓋入射波長范圍的偏振光照射波導(dǎo)，特定波長的光偶聯(lián)入波導(dǎo)并沿其放大?；蛘?，在角度漂移儀器中，用単色光照射傳感器并測量光的共振偶聯(lián)角度。共振條件受與生物傳感器表面直接接觸的細(xì)胞層影響(例如細(xì)胞融合、附著和狀態(tài))。當(dāng)配體或分析物與活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞靶標(biāo)(例如，GPCR、激酶)相互作用吋，細(xì)胞層內(nèi)局部折射率的任何變化可以檢測為共振角(或波長)的漂移。C0rning EpiC 系統(tǒng)利用RWG生物傳感器進(jìn)行無標(biāo)記生化或細(xì)胞試驗(yàn)(康寧公司，康寧，紐約州)。所述Epic 系統(tǒng)由RWG平板讀數(shù)計和SBS (生物分子篩選學(xué)會)標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板組成。平板讀數(shù)計的檢測器系統(tǒng)利用集成光纖測量入射光的波長漂移，該漂移是細(xì)胞內(nèi)配體誘導(dǎo)變化所致。一系列照射-檢測頭以線形方式排列，從而能同時采集384孔微板的列中各孔的反射光譜。掃描整塊板使得各傳感器被多次訪問，每列依次訪問。收集入射光的波長用于分析。所述儀器可包括溫控單元以盡可能減少溫度波動導(dǎo)致的入射波長偽漂移。測得的應(yīng)答代表細(xì)胞群的平均應(yīng)答。通過自帶(on-board)移液管或外部液體處理器引入化合物。129.電學(xué)生物傳感器和系統(tǒng)電學(xué)生物傳感器由基材(例如，塑料)、電極和細(xì)胞層組成。在該電檢測方法中，在基材上排列的小金電極上培養(yǎng)細(xì)胞，并按時跟蹤系統(tǒng)的電阻杭。阻抗是對細(xì)胞層電導(dǎo)率變化的量度。通常，在電極或電極陣列上施加定頻或變頻的小恒定電壓，隨時間監(jiān)測流經(jīng)電路的電流。配體誘導(dǎo)的電流變化提供了細(xì)胞應(yīng)答的量度。1984年首次實(shí)現(xiàn)用于全細(xì)胞感測的阻抗測量。自此，阻抗測量應(yīng)用于研究廣泛的細(xì)胞事件，包括細(xì)胞附著和擴(kuò)展、細(xì)胞微動、細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞死亡。經(jīng)典阻抗系統(tǒng)因使用小檢測電極和大參比電極而導(dǎo)致的試驗(yàn)變異性高。為克服該變異性，最新一代的系統(tǒng)，例如CellKey系統(tǒng)(MDS賽科斯(MDS Sciex)，加利福尼亞州南舊金山)和RT-CES(ACEA生物科學(xué)公司(ACEA Biosciences he.)，加利福尼亞州圣迭戈)利用具有微電極陣列的集成電路。通過自帶移液管引入化合物。130.高空間分辨率生物傳感器成像系統(tǒng)光學(xué)生物傳感器成像系統(tǒng)，包括SI3R成像系統(tǒng)、橢圓計成像系統(tǒng)和RWG成像系統(tǒng)， 提供高空間分辨率，優(yōu)選用于本發(fā)明方法中。例如，SPRimager II(GWC技術(shù)公司)采用棱鏡偶聯(lián)SPR，以固定入射角測量SPR，用CCD相機(jī)收集反射光。記錄表面的變化作為反射率變化。因此，sra成像同時收集陣列中所有元件的測量值。最近，康寧公司還公開了依據(jù)RWG生物傳感器的掃頻波長光學(xué)查詢系統(tǒng)以供成像應(yīng)用。該系統(tǒng)中，利用快速可調(diào)諧激光源照射傳感器或微孔板形式的RWG生物傳感器陣列。 可以通過檢測激光波長掃描時傳感器反射的光能與時間的函數(shù)關(guān)系構(gòu)建傳感器光譜，用計算機(jī)化共振波長查詢模型分析所測數(shù)據(jù)得到固定有受體或細(xì)胞層的生物傳感器的空間解析圖像。使用圖像傳感器自然生成基于成像的查詢方案。無需移動部件即可獲得ニ維無標(biāo)記圖像?；蛘?，還可利用具有橫向磁力或ρ-偏振光TMtl模式的Corning Epic 角度查詢系統(tǒng)。該系統(tǒng)由發(fā)射系統(tǒng)和基于CCD相機(jī)的接收系統(tǒng)組成，發(fā)射系統(tǒng)產(chǎn)生光束陣列使其中各光束以約200 μ m χ 3000 μ m或200 μ m χ 2000 μ m的維度照射RWG傳感器，接收系統(tǒng)用于記錄從這些傳感器反射光束的角度變化。借助分光器和衍射光學(xué)鏡片的組合獲得排列的光束。該系統(tǒng)每3秒最多能同時取樣49個傳感器(7x7孔傳感器陣列)。或者，還可利用掃描波長查詢系統(tǒng)。該系統(tǒng)中，利用覆蓋恒定角度入射波長范圍的偏振光照射并掃描波導(dǎo)光柵生物傳感器，可同時記錄各位置的反射光。通過掃描，也可以獲得生物傳感器的高分辨率圖像。在所有備選方案中，通過自帶移液管或外部液體處理器引入化合物。
無標(biāo)記生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)表明活細(xì)胞中配體誘導(dǎo)的動態(tài)質(zhì)量再分布(DMR)信號通過細(xì)胞靶標(biāo)介導(dǎo)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)由下游信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的空間和時間動力學(xué)特性編碼。信號傳導(dǎo)活性的時間動力學(xué)特性與空間梯度偶聯(lián)能在刺激后引導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答。實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞信號傳導(dǎo)的整合(如果實(shí)現(xiàn)的話)能提供用于理解細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)的相關(guān)信息。光學(xué)生物傳感器包括共振波導(dǎo)光柵(RWG)生物傳感器，它們顯示了與細(xì)胞物質(zhì)動態(tài)再分布相關(guān)的生理學(xué)相關(guān)和整合細(xì)胞應(yīng)答，從而為研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)提供非侵入性手段。所有光學(xué)生物傳感器的共同點(diǎn)在于它們能測量傳感器表面或其附近的局部折射率改變。原則上，幾乎所有光學(xué)生物傳感器都適用于細(xì)胞感測，因?yàn)樗鼈兡芾脻u消波表征細(xì)胞內(nèi)配體誘導(dǎo)的改變。漸消波是電磁場，由光在溶液-表面界面的全內(nèi)反射產(chǎn)生，它通常延伸到溶液內(nèi)很短的距離(約數(shù)百納米)，其特征深度稱為貫穿深度或感測容積。近來，開發(fā)出理論和數(shù)學(xué)模型描述活細(xì)胞中對配體刺激起反應(yīng)測得的光學(xué)信號的參數(shù)和特性。這些模型基于3層波導(dǎo)系統(tǒng)與已知細(xì)胞生物物理特性的結(jié)合，其將配體誘導(dǎo)的光學(xué)信號與受體介導(dǎo)的數(shù)個細(xì)胞過程聯(lián)系起來。由于生物傳感器測量入射光照射區(qū)域細(xì)胞的平均應(yīng)答，利用高匯合細(xì)胞層以獲得最佳試驗(yàn)結(jié)果。由干與生物傳感器的短貫穿深度相比細(xì)胞尺寸較大，傳感器配置考慮非傳統(tǒng)三層系統(tǒng)基材、具有光柵結(jié)構(gòu)的波導(dǎo)膜和細(xì)胞層。因此，配體誘導(dǎo)的有效折射率(即，測得的信號)改變可以與細(xì)胞層底部的折射率該變直接成比例(ー級形式)ΔΝ = S(C) Anc(I)其中S (C)為對細(xì)胞層的靈敏度，Δη。為生物傳感器感測的配體誘導(dǎo)細(xì)胞層局部折射率改變。由于細(xì)胞內(nèi)給定體積的折射率主要由生物分子，如蛋白質(zhì)的濃度決定，Δη?？梢约俣ㄅc配體誘導(dǎo)的局部細(xì)胞靶標(biāo)濃度或感測體積內(nèi)的分子組件濃度改變直接成比例?？紤]到從傳感器表面延伸的漸消波的指數(shù)衰減性質(zhì)，配體誘導(dǎo)的光學(xué)信號受下式支配
“Zlj- "zHiAiV = S(C)^AC,嚴(yán)ご 一 e 叫
丨L 」(2)其中，AZc為進(jìn)入細(xì)胞層的貫穿深度，α為特定折射増量(蛋白質(zhì)為約0. 18/mL/ g)，Zi為質(zhì)量再分布發(fā)生的距離，和d是細(xì)胞層內(nèi)片層的假想厚度。在此，細(xì)胞層在豎直方向上分成等間距的片層。方程式2表明配體誘導(dǎo)的光學(xué)信號是離傳感器表面不同距離的質(zhì)量再分布的加合，各自對總應(yīng)答的貢獻(xiàn)不等。此外，就波長或角度漂移而言，測得的信號主要對發(fā)生在傳感器表面垂直方向上的質(zhì)量再分布敏感。因?yàn)槠鋭討B(tài)本質(zhì)，也稱為動態(tài)質(zhì)量再分布(DMR)信號。細(xì)胞依靠多種細(xì)胞途徑或機(jī)制加工、編碼和整合接收的信息。與利用光學(xué)生物傳感器特異性測量分析物與蛋白靶標(biāo)結(jié)合的親和カ分析不同，活細(xì)胞更復(fù)雜和動態(tài)。為研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)，可以將細(xì)胞與生物傳感器的表面接觸，這能通過細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)。這些培養(yǎng)的細(xì)胞可以通過三類接觸附著在生物傳感器表面焦點(diǎn)接觸、貼近接觸和胞外基質(zhì)接觸，其中每種具有離開表面的特征性間隔距離。根據(jù)細(xì)胞類型以及生物傳感器表面的表面化學(xué)特性，細(xì)胞能采用這些接觸類型中的ー種或多種來附著于生物傳感器表面。 因此，基礎(chǔ)細(xì)胞膜常位距離表面約lO-lOOnm。這些生物傳感器能感測細(xì)胞的底部部分。，細(xì)胞表現(xiàn)出表面依賴性附著和増殖。為獲得可靠的細(xì)胞試驗(yàn)，需要包被生物傳感器表面以增強(qiáng)細(xì)胞粘著和増殖。另ー方面，表面特性能直接影響細(xì)胞生物學(xué)特性。例如，表面結(jié)合的配體能影響細(xì)胞的應(yīng)答，而基材的機(jī)械順應(yīng)性同樣影響，其決定了在細(xì)胞施加的作用力下基材如何變形。與培養(yǎng)條件(時間、血清濃度、匯合度等)綜合來看， 不同表面和不同條件得到的細(xì)胞狀態(tài)可能不同。因此，開發(fā)生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)必需尤其當(dāng)心控制細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞是相對尺寸較大(通常在數(shù)十微米范圍內(nèi))的動態(tài)物體。在組織培養(yǎng)中通過在亞細(xì)胞分辨率的延時顯微鏡(time lapse microscopy)以及納米水平的生物阻抗測量觀察到，即使沒有刺激，細(xì)胞也不斷經(jīng)歷微動-細(xì)胞結(jié)構(gòu)的動態(tài)移動和重塑。在未刺激條件下，用RWG生物傳感器檢測細(xì)胞一般得到幾乎為凈零的DMR應(yīng)答。這部分是因?yàn)楣鈱W(xué)生物傳感器的空間分辨率低，這是由激光點(diǎn)的尺寸大和偶聯(lián)光的傳播長度長決定的。激光點(diǎn)的尺寸決定所研究區(qū)域的尺寸-通常一次只能追蹤ー個分析點(diǎn)。因此， 生物傳感器通常測量位于光入射區(qū)域的細(xì)胞大群體的平均應(yīng)答。雖然細(xì)胞在單細(xì)胞水平經(jīng)歷微動，檢測的細(xì)胞的大群體產(chǎn)生平均為凈零的DMR應(yīng)答。此外，已知在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)， 胞內(nèi)大分子高度有序且空間局限于適當(dāng)位點(diǎn)。蛋白質(zhì)的定位受嚴(yán)密控制以便細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與其適當(dāng)伴侶相互作用的特異性和效率，在空間上隔開蛋白質(zhì)激活和失活機(jī)制，因而決定了特異性蛋白質(zhì)功能和應(yīng)答。因此，在未刺激條件下，在感測體積內(nèi)細(xì)胞的局部質(zhì)量密度可以達(dá)到平衡狀態(tài)，從而導(dǎo)致凈零光學(xué)應(yīng)答。值得注意的是，檢測的細(xì)胞常在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)了一段時間，使得大多數(shù)細(xì)胞剛好完成ー個分裂周期。活細(xì)胞具有感測和應(yīng)答外源信號的精確能力。以前認(rèn)為細(xì)胞信號傳導(dǎo)通過線性途徑起作用，環(huán)境信號觸發(fā)線性反應(yīng)鏈，從而產(chǎn)生單個明確的應(yīng)答。然而，累積的研究顯示對細(xì)胞外界刺激的應(yīng)答遠(yuǎn)要復(fù)雜。顯然，細(xì)胞接收的信息加工并編碼成信號傳導(dǎo)蛋白的磷酸化和拓?fù)湟莆坏膹?fù)雜時間和空間模式。蛋白質(zhì)空間和時間靶向到適當(dāng)位點(diǎn)對于調(diào)節(jié)蛋白-蛋白相互作用的特異性和效率至關(guān)重要，因此決定了細(xì)胞信號傳導(dǎo)和應(yīng)答的時機(jī)和強(qiáng)度。關(guān)鍵的細(xì)胞決策，例如細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞周期檢測點(diǎn)和凋亡，取決于激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的精確時間控制和相對空間分布。因此，通過細(xì)胞靶標(biāo)例如G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)介導(dǎo)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)常以有序且受調(diào)節(jié)的方式進(jìn)行，并由ー系列空間和時間事件組成，其中很多導(dǎo)致細(xì)胞的局部質(zhì)量密度該變或局部細(xì)胞物質(zhì)再分布。當(dāng)這些該變或再分布在感測體積內(nèi)發(fā)生吋，可以利用光學(xué)生物傳感器直接實(shí)時跟蹤。因此，得到的DMR信號是活細(xì)胞的新型生理學(xué)應(yīng)答，含有活細(xì)胞中配體-受體配對的體系細(xì)胞生物學(xué)信息，DMR信號含有作用于活細(xì)胞的配體的體系細(xì)胞藥理學(xué)信息。VI.實(shí)施例a)材料與方法(1)材料多巴胺、A68930、PD128907,GABA, ADO、肥大細(xì)胞脫粒肽(mastoparan)、乙酰膽堿、SKF83566購自密蘇里州圣路易斯的托克カ斯公司(Tocris, St. Louis, M0)。神經(jīng)肽 B (NPB-23)、食欲素Α、強(qiáng)啡肽Α、神經(jīng)肽Y、SFLLR-酰胺和內(nèi)皮素-I購自賓夕法尼亞州金戈夫普魯西亞的BC公司(BaChem，King of Prussia, PA)。Epic 384生物傳感器微孔板購自紐約州康寧市的康寧公司。
(2)滅菌和包被EPIC 384孔板各EPIC板經(jīng)UV照射6分鐘，然后作70%乙醇洗滌，維持在組織培養(yǎng)罩中。第二天，用磷酸緩沖鹽水(PBQ洗滌平板兩次，將DMEM/F 12配制的20 μ 1 20 μ g/ml層粘連蛋白(Sigma L2020，lmg/ml，圣路易斯，密蘇里州)加入各孔，37°C在CO2孵育箱中溫育5小吋。 除去層粘連蛋白溶液后，用PBS洗滌包被孔1次，將含有3000個細(xì)胞的50 μ 1維持培養(yǎng)基加入各孔以進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)。(3)細(xì)胞培養(yǎng)在層粘連蛋白包被的Τ75組織培養(yǎng)燒瓶中(康寧，紐約)，用含有20ng/mL FGF-2 和20ng/mL EGF(加利福尼亞州特姆庫拉的密理博公司(Millipore, Temecula, CA))的 ReNcell NSC維持培養(yǎng)基(加利福尼亞州特姆庫拉的密理博公司)常規(guī)培養(yǎng)加利福尼亞州特姆庫拉的密理博公司的ReNcell VM人神經(jīng)祖細(xì)胞(ReN細(xì)胞)。對于未分化細(xì)胞的維持和生長，每天更換培養(yǎng)基。37°C，在95%空氣/5% CO2的加濕氣氛下維持培養(yǎng)的細(xì)胞。利用加利福尼亞州特姆庫拉的密理博公司的Accutase 每周傳代細(xì)胞一次。對于利用Epic進(jìn)行的細(xì)胞試驗(yàn)，通常采用約3x IO3個細(xì)胞/孔，在50微升對應(yīng)培養(yǎng)基中將未分化細(xì)胞接種在層粘連蛋白新鮮包被的生物傳感器微孔板中，37°C，空氣/5% CO2的氣氛下溫育。第二天，除去各孔的培養(yǎng)基，替換成不含F(xiàn)GF-2和EGF的新鮮ReNcell NSC維持培養(yǎng)基來啟動分化。每2-3天更換新鮮的ReNcell NSC維持培養(yǎng)基，共10天。試驗(yàn)時所有細(xì)胞的匯合度為約95%到100%。(4)免疫細(xì)胞化學(xué)在層粘連蛋白包被的384-孔Epic微孔板上生長和/或分化后，除去培養(yǎng)基，用冷的4%低聚甲醛/PBS固定細(xì)胞15分鐘，然后作兩次PBS洗滌。室溫下，透化處理細(xì)胞，用PBS 配制的5%普通山羊血清(NGS，載體實(shí)驗(yàn)室(Vector labs) ),0. 3% TritonX-IOO封閉2小吋。對于表面的染色，利用少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，01，ー種不可滲透的封閉溶液(PBS配制的普通山羊血清(NGS，載體實(shí)驗(yàn)室))。利用1 1000的小鼠單克隆抗體檢測β III-微管蛋白(密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma)，抗-GFAP家兔多克隆抗體以1 5000 (DAKO) 使用，抗-01以1 500使用，杭-酪氨酸羥化酶(TH)以1 250(加利福尼亞州特姆庫拉的密理博公司)使用。4°C，溫育ー抗過夜。用PBS洗滌兩次后，室溫下，用溶解于含 NGS的PBS的過濾Alexa染料偶聯(lián)山羊抗-小鼠488(1 250 ；分子探針公司(Molecular ftObes))或Alexa染料偶聯(lián)山羊杭-家兔568(1 2500 ；分子探針公司)處理1. 5小時。 用PBS洗滌細(xì)胞，用IOmM Hoechst 33342(西格瑪公司)復(fù)染4分鐘，然后再作PBS洗滌。(5)細(xì)胞附著試驗(yàn)對于細(xì)胞附著試驗(yàn)，將未分化的ReNcell VM細(xì)胞重懸在HBSS (lx Hanks平衡鹽溶液，加上20mM Hepes,pH 7. 1)或維持培養(yǎng)基中，終濃度為6x IO5個細(xì)胞/毫升，轉(zhuǎn)移入384 孔聚丙烯化合物儲存板。另外制備化合物來源板以供該試驗(yàn)的第二步驟。與此同時，用層粘連蛋白新鮮包被生物傳感器微孔板或不作包被，用D-PBS洗滌。除去D-PBS后向各孔中加入25 μ 1 HBSS或維持培養(yǎng)基。然后在讀數(shù)計系統(tǒng)中溫育生物傳感器微孔板、細(xì)胞來源板和化合物來源板2小吋。細(xì)胞在試驗(yàn)前手工重懸在化合物板中。記錄生物傳感器微孔板中所有生物傳感器的基線波長，校正為零。隨后，連續(xù)記錄2-10分鐘以建立基線，利用自帶液體處理器將25微升細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移入生物傳感器板。進(jìn)行細(xì)胞附著并記錄3小吋。對于第ニ步驟，溫育后，記錄細(xì)胞試驗(yàn)微孔板中所有生物傳感器的基線波長并校正為0。然后，連續(xù)記錄2-10分鐘以建立基線，并確保細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)態(tài)。隨后，利用自帶液體處理器將10μ 1化合物溶液移入細(xì)胞試驗(yàn)板來觸發(fā)細(xì)胞應(yīng)答。(6)光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)和細(xì)胞試驗(yàn)利用Epic 波長查詢系統(tǒng)(紐約州康寧的康寧公司)進(jìn)行全細(xì)胞感測。該系統(tǒng)由溫度控制單元、光學(xué)檢測單元和用機(jī)器人的自帶液體操作單元組成。所述檢測單元以集成光纖為核心，能以約15秒的時間間隔對細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行動力學(xué)測量。利用自帶液體操作單元引入化合物溶液(即，移液)。RffG生物傳感器能檢測傳感器表面附近的局部折射率的微小變化。由于細(xì)胞內(nèi)局部折射率與生物質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)，分子復(fù)合物)的密度及其分布呈函數(shù)關(guān)系，生物傳感器利用其漸消波非侵入性地檢測天然細(xì)胞內(nèi)配體誘導(dǎo)的動態(tài)質(zhì)量再分布。漸消波延伸入細(xì)胞井隨距離呈指數(shù)衰減，從而產(chǎn)生約150納米的特征感測容積，提示通過受體激活介導(dǎo)的任何光應(yīng)答僅代表漸消波取樣的細(xì)胞部分的平均值。受體激活下游的許多細(xì)胞事件的集合決定配體誘導(dǎo)DMR的動力學(xué)特性和幅度。對于生物傳感器細(xì)胞試驗(yàn)，用HBSS (lx Hanks平衡鹽溶液，加上20mM Hepes, pH 7. 1)稀釋保存的濃縮溶液制得化合物溶液，轉(zhuǎn)移到384孔聚丙烯化合物儲存板以制備化合物源板。當(dāng)進(jìn)行兩步試驗(yàn)吋，分別制備兩個化合物源板。與此同時，細(xì)胞用HBSS洗滌兩次并維持在40 μ 1 HBSS中以制備細(xì)胞試驗(yàn)板。然后將細(xì)胞試驗(yàn)板和化合物源板在讀數(shù)計系統(tǒng)中溫育。溫育后，記錄細(xì)胞試驗(yàn)微孔板中所有生物傳感器的基線波長并校正為0。然后， 連續(xù)記錄2-10分鐘以建立基線，并確保細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)態(tài)。隨后，利用自帶液體處理器將10μ 1 化合物溶液移入細(xì)胞試驗(yàn)板來觸發(fā)細(xì)胞應(yīng)答。所有研究在受控溫度(觀で)下進(jìn)行。進(jìn)行至少兩組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，各組至少重復(fù)進(jìn)行三次。(7)光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)和細(xì)胞試驗(yàn)b)實(shí)施例1 在生物傳感器表面形成衍生自干細(xì)胞的神經(jīng)元細(xì)胞體系干細(xì)胞和干細(xì)胞衍生細(xì)胞不僅可用于再生醫(yī)學(xué)，還在藥物發(fā)現(xiàn)中起重要作用。目前藥物的高消耗率是健康護(hù)理體系的嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。許多人相信，這種無效而昂貴的藥物開發(fā)問題可通過更加精確地展示實(shí)際人類疾病的疾病模型來改正，從而能更好地理解潛在的機(jī)理及獲得和驗(yàn)證有效而安全的藥物。原則上，人胚胎干(ES)或iPS細(xì)胞可用于該目的。ES 細(xì)胞可得自患有特定疾病的患者，可建立方案指導(dǎo)疾病特異性ES細(xì)胞變成在該疾病中受影響的各類細(xì)胞。此類疾病相關(guān)細(xì)胞應(yīng)能促進(jìn)更具預(yù)測性的藥物發(fā)現(xiàn)和毒性研究。此外， 依據(jù)細(xì)胞體系的方法還對提高藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)方法的效率有顯著益處，從而能降低成本。干細(xì)胞或干細(xì)胞樣細(xì)胞可分化成由多類細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞體系。因此，此類細(xì)胞體系可通過干細(xì)胞重編程獲得，從而提供優(yōu)秀的藥物檢驗(yàn)和發(fā)現(xiàn)結(jié)果。密理博公司的可商品化購得的祖干細(xì)胞系ReNcell VM細(xì)胞用于在生物傳感器表面上將此類細(xì)胞原位重編程為神經(jīng)元細(xì)胞體系。ReNcell VM細(xì)胞系是源自發(fā)育人腦的腹側(cè)中腦區(qū)域(ventral mesencephalic region)的人神經(jīng)干細(xì)胞系，通過myc原癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)使之永生化。除了能分化成幾類神經(jīng)元細(xì)胞，該細(xì)胞系還提供穩(wěn)定的表型和基因型。ReNcell VM 系因其自我更新能力和在功能分化后的多種潛能而表征為NSC。由于其myc永生化轉(zhuǎn)導(dǎo)，可在無血清培養(yǎng)基中在層粘連蛋白上將ReNcell VM系培養(yǎng)成單層培養(yǎng)物，而不喪失生物學(xué)能力或產(chǎn)生核型異常。Myc能驅(qū)動和維持干細(xì)胞的自我更新和増殖，因而阻止分化和分化相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)改變直至需要吋。因此，ReNcell VM是藥物發(fā)現(xiàn)和研究應(yīng)用的理想、標(biāo)準(zhǔn)化、 體外、基于人的平臺。如圖4所示，用層粘連蛋白新鮮包被康寧384孔Epic生物傳感器微孔板，所述層粘連蛋白是能使得干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的胞外基質(zhì)蛋白。利用自動移液管將ReNcell VM細(xì)胞加入層粘連蛋白包被的生物傳感器表面。培養(yǎng)一天后，去除生長因子啟動細(xì)胞分化；即， 除去各孔的培養(yǎng)基并換以不含F(xiàn)GF-2和EGF的新鮮ReNcell NSC維持培養(yǎng)基。每2_3天更換新鮮的ReNcell NSC維持培養(yǎng)基，持續(xù)10天。培養(yǎng)結(jié)束時，采用多種標(biāo)志物免疫染色來表征得到的細(xì)胞。如圖5所示，細(xì)胞培養(yǎng)和分化過程中ReNcell經(jīng)歷形態(tài)改變；隨著細(xì)胞分化，越來越多的細(xì)胞變長。形態(tài)改變中的這些進(jìn)展表明Epic 層粘連蛋白包被微孔板上的 ReNcell原位分化經(jīng)歷數(shù)個階段。再如圖6所示，ReNcell VM細(xì)胞分化成至少由三類細(xì)胞構(gòu)成的神經(jīng)元細(xì)胞體系 多巴胺能神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。少突膠質(zhì)細(xì)胞的存在通過表面少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物01染色證明。通過GFAP染色證明有星形細(xì)胞存在，通過β III-微管蛋白和酪氨酸羥化酶雙重染色證明有多巴胺能神經(jīng)元存在。c)實(shí)施例2 利用Epic 系統(tǒng)表征通過ReNcell神經(jīng)干細(xì)胞祖細(xì)胞重編程得到的神經(jīng)元細(xì)胞體系生長因子(EGF和reF-幻除去后，ReNcell易在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件下分化成神經(jīng)元。根據(jù)特異性多巴胺能標(biāo)志物的免疫染色研究(圖7所示例的)以及蛋白質(zhì)組和基因組研究(參見密理博的產(chǎn)品相關(guān)信息)，得到的神經(jīng)元具有功能性多巴胺能特征。然而，對于重編程神經(jīng)元細(xì)胞體系中內(nèi)源性受體的功能沒有直接報道。因此，利用Epic 系統(tǒng)表征所得細(xì)胞體系中內(nèi)源性多巴胺受體的DMR概況。如圖7所示，用以下三種多巴胺受體激動劑刺激后，分化的ReNcell細(xì)胞產(chǎn)生少量但可重現(xiàn)的DMR信號強(qiáng)效D3/D2受體激動劑 PDU8907、強(qiáng)效選擇性Dl受體激動劑A68930和非選擇性多巴胺受體激動劑多巴胺。然而， 這三種激動劑誘導(dǎo)的DMR信號在細(xì)節(jié)特征上不同，更有趣的是，多巴胺應(yīng)答接近PD128907 和A68930DMR信號之和。這些結(jié)果表明A68390觸發(fā)分化細(xì)胞中內(nèi)源性Dl受體特異性的DMR 信號，而PD 128907激活另一內(nèi)源性多巴胺受體(可能是D2受體)，該劑量的多巴胺能激活 D 1和D2受體。實(shí)際上，Dl和D2特異性拮抗劑的追蹤藥理學(xué)研究均證實(shí)此類情況(數(shù)據(jù)未顯示)。分化細(xì)胞的多巴胺劑量依賴性應(yīng)答產(chǎn)生了其它證據(jù)。如圖7D所示，多巴胺導(dǎo)致雙相依賴性DMR信號，將刺激后50分鐘的幅度對多巴胺濃度制圖。低劑量下(く 4000nM)， 多巴胺導(dǎo)致類似于A68930誘導(dǎo)的DMR信號。然而，高劑量下，多巴胺誘導(dǎo)的DMR信號接近 A68390和PD129807信號的簡單之和。這表示神經(jīng)元細(xì)胞或干細(xì)胞或干細(xì)胞祖細(xì)胞重編程衍生的細(xì)胞體系中功能性和內(nèi)源性多巴胺受體的第一無標(biāo)記概況。d)實(shí)施例3 利用Epic 系統(tǒng)表征干細(xì)胞分化的神經(jīng)元譜系的方法對于干細(xì)胞的許多關(guān)注涉及它們在細(xì)胞替代治療中的應(yīng)用；然而，干細(xì)胞還能改變發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證治療劑的方式?？芍苽湓诟鞣N疾病中受影響的人ES細(xì)胞的分化細(xì)胞，可在培養(yǎng)皿中進(jìn)行預(yù)測性毒性檢驗(yàn)和治療劑研究。第一歩需要采用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)，通過重編程(去分化)成人體細(xì)胞來分離患者的疾病-特異性的ES細(xì)胞系，或利用轉(zhuǎn)錄因子的混合物產(chǎn)生iPS細(xì)胞。還感興趣的是鑒定驅(qū)動成人體細(xì)胞重編程的其它蛋白質(zhì)或小分子。在 SMA和亨廷頓病的情況中，可從用于胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)的人胚胎獲得疾病特異性ES細(xì)胞。然后，人ES細(xì)胞培養(yǎng)分化成在感興趣疾病中受影響(例如，帕金森病中的黑質(zhì) DA神經(jīng)元或亨廷頓病中的中棘神經(jīng)元)或與毒性檢驗(yàn)相關(guān)(心臟細(xì)胞和肝細(xì)胞)的細(xì)胞類型。需要驅(qū)動ES細(xì)胞分化以產(chǎn)生能治療性用于細(xì)胞替代治療的細(xì)胞(例如，治療I型糖尿病的胰腺β細(xì)胞)。分化篩選本身也能產(chǎn)生調(diào)節(jié)參與疾病的途徑(Hedgehog、Wnt、BMP，等等)的候選治療劑或調(diào)節(jié)細(xì)胞増殖的化合物。自從1981年建立了小鼠ES細(xì)胞以及1998年建立了人ES細(xì)胞，ES細(xì)胞増殖和分化技術(shù)中取得了許多進(jìn)展。在過去10年，報道了數(shù)種方法來控制ES細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞。 依據(jù)所需的神經(jīng)細(xì)胞類型，各方法有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，并可誘導(dǎo)CNS內(nèi)不同區(qū)域身份的神經(jīng)組織的分化。ES細(xì)胞可分化成稱為胚狀體的漂浮凝聚物，其在有血清存在下培養(yǎng)并包括衍生自所有三個胚層的細(xì)胞。相反，采用無血清、無飼養(yǎng)細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，ES細(xì)胞可選擇性分化成外胚層。分化干細(xì)胞的最成功方案依賴于對控制胚胎發(fā)育中細(xì)胞正常分化的胞外信號和基因調(diào)節(jié)因子的了解。誘導(dǎo)分化的信號通常由涉及酶活性，例如磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化的酶活性或此類活性的逆轉(zhuǎn)的胞內(nèi)途徑介導(dǎo)。這些酶功能導(dǎo)致調(diào)節(jié)(轉(zhuǎn)錄)因子的表達(dá)或活性改變，進(jìn)而控制細(xì)胞的分化狀態(tài)。由于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑常由胞外蛋白質(zhì)配體(生長因子)激活，利用基于此類蛋白質(zhì)的材料的區(qū)域開始引發(fā)干細(xì)胞分化。神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)是設(shè)計和發(fā)現(xiàn)神經(jīng)變性疾病(例如，帕金森病、亨廷頓病和阿爾茨海默病)的新方法的有力研究工具。NSC的自我更新能力和多能性使得它們極具吸引力作為治療神經(jīng)學(xué)疾病的療法和科研實(shí)驗(yàn)室的有力工具。該項研究中利用ReNcell VM細(xì)胞。 該細(xì)胞系是永生化的干細(xì)胞系。生長因子的存在阻止了細(xì)胞的分化，這種細(xì)胞缺乏神經(jīng)元表型。相反，除去生長因子后，如預(yù)計那樣發(fā)生分化(圖5和圖6)?？衫眯螒B(tài)學(xué)標(biāo)志物檢測神經(jīng)元，但隨著電壓門控通道的產(chǎn)生伴有電生理學(xué)成熟作用，從而產(chǎn)生動作電位。分化后，免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)志物鑒定到中腦衍生的細(xì)胞系分化成多巴胺能神經(jīng)元。在未分化狀態(tài)中，ReNcell VM是巢蛋白陽性，靜息膜電位約為_60mV，但不顯示任何電壓激活的電導(dǎo)。分化后，根據(jù)免疫組織學(xué)特征ReNcell VM形成神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。這些分化的細(xì)胞是電生理學(xué)功能性神經(jīng)元，顯示是多巴胺能神經(jīng)元。功能檢驗(yàn)很重要，因?yàn)樯窠?jīng)元標(biāo)志物的免疫學(xué)表征顯示其不一定反映功能性。Piper等.(Piper，D. R等.，免疫細(xì)胞化學(xué)和生理學(xué)表征培養(yǎng)的人神經(jīng)前體群 (Immunocytochemical and physiological characterization οι a population οι cultured human neural precursors). J. Neurophysiol. 2000，84，534-548) i正陰月臺 JLttj 生NSC分化成具有各種配體和電壓門控通道的神經(jīng)元。然而，它們不是完全功能性的，因?yàn)殡妷阂蕾囆遭c通道的密度不足以產(chǎn)生動作電位。另ー項研究利用人胎兒腦組織培養(yǎng)物發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。在不含血清的條件下，胚胎干細(xì)胞分化成含酪氨酸羥化酶(TH)的細(xì)胞， 它們顯示釋放多巴胺并具有一定的神經(jīng)元電學(xué)特性，但仍未記錄到動作電位。這些細(xì)胞顯示在6-羥基多巴胺損傷的大鼠腦中體內(nèi)存活。谷氨酸能(Glutamaterigic)和GABA 能(GABAergic)神經(jīng)元還可以在確定的條件下從人胎兒前腦分化。這些研究明確證明配體門控應(yīng)答，但未討論激發(fā)動作電位的能力。相反，Perrier等(Perrier，A, L等.，從人胚胎干細(xì)胞衍生中腦多巴胺神經(jīng)元(Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells). Proc Natl Acad Sci U S A 2004，101，12543—12548)利用飼養(yǎng)層共培養(yǎng)介導(dǎo)胚胎干細(xì)胞變成能激發(fā)動作電位的多巴胺能神經(jīng)元。另ー成功的方法由mi等.(Wu，P等.，從植入成年大鼠的胎兒人神經(jīng)干細(xì)胞區(qū)域特異性產(chǎn)生膽堿能神經(jīng)元 (Region specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat) · Nat Neurosci 2002，5，1271—1278)開發(fā)，其中用成纖維細(xì)胞生長因子、肝素和層粘連蛋白的混合物預(yù)處理胎兒hNSC，然后進(jìn)行數(shù)天分化產(chǎn)生可靠激發(fā)動作電位的膽堿能神經(jīng)元。因此，關(guān)于從人胚胎干細(xì)胞或胎兒衍生干細(xì)胞獲得完全功能性神經(jīng)元的報道甚少。此外，利用許多胎兒衍生hNSC的進(jìn)ー步限制是它們在培養(yǎng)時的死亡卓。由于細(xì)胞分化對于諸如培養(yǎng)基、生長因子和表面涂層等培養(yǎng)條件敏感，得到的重編程細(xì)胞可極為不同，例如階段不同、譜系不同。因此，開發(fā)非侵入性細(xì)胞概況分析方法以表征干細(xì)胞和干細(xì)胞樣細(xì)胞的重編程階段和譜系。如圖8所示，本發(fā)明包括用生物傳感器在細(xì)胞重編程期間的多個檢測點(diǎn)，包括成熟階段進(jìn)行細(xì)胞概況分析。結(jié)果顯示，ReNcell細(xì)胞在組織培養(yǎng)處理或?qū)诱尺B蛋白包被的生物傳感器表面產(chǎn)生不同附著行為。在層粘連蛋白包被的表面上，細(xì)胞傾向于停滯在擴(kuò)散期(即，在初始沉積和擴(kuò)散相之間有等待期(約15 分鐘))，而在組織培養(yǎng)處理表面，等待期非常短(<2分鐘)(圖8A)。不同成熟細(xì)胞(例如，衍生自干細(xì)胞的心臟細(xì)胞、血細(xì)胞、腦細(xì)胞、胰腺細(xì)胞或皮膚細(xì)胞)的此類表面依賴性精細(xì)特征可能更明顯。多巴胺是存在于哺乳動物腦中的主要鄰苯ニ酚胺神經(jīng)遞質(zhì)，其在腦中負(fù)責(zé)各種功能，包括運(yùn)動、神經(jīng)內(nèi)分泌分泌、認(rèn)知和情緒。多巴胺還在外周系統(tǒng)中起作用，其在外周系統(tǒng)中調(diào)節(jié)血管張力、腎臟功能、心血管功能、激素分泌、鄰苯ニ酚胺釋放和胃腸蠕動。根據(jù)預(yù)測的跨膜拓?fù)鋵W(xué)特性和功能及藥理學(xué)特性，多巴胺受體分成5個多巴胺受體亞型，還可分成兩類Dl-樣(Dl和D5)和D2-樣(D1、D3和D4)受體。多巴胺傳遞失調(diào)導(dǎo)致各種病癥，例如帕金森病、圖雷特綜合征、精神分裂癥和高催乳素血癥。因此，多巴胺用作探査干細(xì)胞分化中多巴胺能神經(jīng)元譜系的標(biāo)志物。多巴胺DMR信號是細(xì)胞階段依賴性的(圖8B到D)。對于ReNcell細(xì)胞，附著于生物傳感器表面后3小吋，多巴胺觸發(fā)小但重現(xiàn)的DMR信號，表明 ReNcell祖細(xì)胞中存在內(nèi)源性多巴胺受體(可能是D2受體)(圖8B)。細(xì)胞維持在富含生長因子的培養(yǎng)基中4天吋，多巴胺觸發(fā)不同的DMR信號(圖8C)，經(jīng)證實(shí)是內(nèi)源性D2受體激活所致(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，分化和成熟后10天，分化的細(xì)胞對多巴胺起反應(yīng)的DMR信號不同，內(nèi)源性Dl受體有額外貢獻(xiàn)(圖8D和7)。這些結(jié)果表明功能Dl受體及其光學(xué)生物傳感器應(yīng)答可用作干細(xì)胞分化的神經(jīng)元譜系的標(biāo)志物。然而，由于多巴胺受體還在許多不同類型的細(xì)胞中表達(dá)，包括非神經(jīng)元細(xì)胞，單用多巴胺或其它選擇性Dl受體激動劑不足以作為干細(xì)胞分化的神經(jīng)元譜系的確認(rèn)標(biāo)志物。 因此，可利用標(biāo)志物組作此類測定。結(jié)果總結(jié)在圖9-12中。這些標(biāo)志物包括內(nèi)源性G蛋白-偶聯(lián)受體、酶、激酶的激動劑，等等。圖9總結(jié)的結(jié)果顯示了分化ReN細(xì)胞的特異性的標(biāo)志物組，包括毒蕈堿受體激動劑乙酰膽堿、腺苷受體激動劑腺苷、P2Y受體激動劑ATP、親代謝性谷氨酸鹽受體激動劑精胺、阿片類物質(zhì)受體激動劑強(qiáng)啡肽A、內(nèi)皮縮血管肽受體激動劑內(nèi)皮縮血管肽1、GPR7和8激動劑神經(jīng)肽B-23 (NPB-23)、食欲素受體激動劑食欲素A、蛋SFLLR-酰胺、P2Y激動劑UDP、NPY受體激動劑神經(jīng)肽Y和VIP受體激動劑血管活性腸肽。可利用這些標(biāo)志物或它們相當(dāng)?shù)募觿┑娜魏谓M合測定重編程神經(jīng)元細(xì)胞的階段和質(zhì)量。圖10顯示了未分化和分化ReN細(xì)胞的非特異性的標(biāo)志物組，包括P2Y激動劑ADP、 多巴胺受體激動劑多巴胺、GABA受體激動劑GABA、阿皮林受體激動劑阿皮林、MCH受體激動劑α-黑素細(xì)胞-刺激激素和PAF受體激動劑血小板生長因子。這些激動劑可用作標(biāo)志物組來產(chǎn)生分子DMR指數(shù)，這些指數(shù)進(jìn)而可用于顯示細(xì)胞及其重編程細(xì)胞之間的差異。圖11顯示了未分化細(xì)胞的特異性的標(biāo)志物組，包括ATII受體血管緊張素II、GLP 受體激動劑高血糖素樣肽、LPA受體激動劑溶血磷脂酸、NTS受體激動劑神經(jīng)牽張素、NKA受體激動劑P物質(zhì)、痕量胺受體激動劑酪胺、P2Y激動劑UTP和UTII受體激動劑硬骨魚緊張肽II。這些標(biāo)志物還可用于測定重編程神經(jīng)元細(xì)胞的階段和質(zhì)量。圖12顯示的標(biāo)志物組可用于測定通常是任何細(xì)胞重編程的ReN細(xì)胞的神經(jīng)元分化期間改變的可能途徑。這些標(biāo)志物包括EPAC激活劑8-CPT-2-Me-cAMP、腺苷酸環(huán)化酶激活劑毛喉素、Galpha蛋白激活劑MAS-7、Pi;3K激活劑740Y-P、胰島素受體激活劑L783281和非選擇性PKC激活劑佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)。參考文獻(xiàn)1. Trantham-Davinson H ^ . The Journal of Neuroscience,2004-24 (47) 10652-106592. Donato R 等· BMC Neuroscience, 2007,8 :363. Rashid AJ 等· PNAS，2OO7, Vol :104, N2 :654-6594. US2008887809A Fang, Y. ,Ferrie,A. Μ. ,Fontaine, N. Μ. ,Yuen, P. K.禾ロ Lahiri， J. “光學(xué)生物傳感器和細(xì)胞(Optical biosensors and cells)”5. Takahashi 等.，(2007)，Cell，131 :861_872，或6. Yu 等，(2007)，Science，318 1917-1920。
權(quán)利要求
1.一種方法，包括a.獲得未分化的細(xì)胞，b.將所述未分化的細(xì)胞附著于無標(biāo)記生物傳感器系統(tǒng)的生物傳感器表面上，c.培養(yǎng)所述附著的細(xì)胞直至第一檢測點(diǎn)，d.獲得某標(biāo)志物的第一檢測點(diǎn)一級概況。
2.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括a.培養(yǎng)所述附著的細(xì)胞直至第二檢測點(diǎn)，b.獲得所述標(biāo)志物的第二檢測點(diǎn)一級概況。
3.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括a.培養(yǎng)所述附著的細(xì)胞直至第三檢測點(diǎn)，b.獲得所述細(xì)胞的第三檢測點(diǎn)一級概況。
4.一種方法，包括a.獲得分化的細(xì)胞，b.將所述分化的細(xì)胞附著于生物傳感器表面上，c.培養(yǎng)所述附著的細(xì)胞直至第一檢測點(diǎn)，d.獲得某標(biāo)志物的第一檢測點(diǎn)一級概況，e.獲得相應(yīng)細(xì)胞，f.將所述相應(yīng)細(xì)胞附著于生物傳感器表面上，g.培養(yǎng)所述相應(yīng)細(xì)胞直至第一檢測點(diǎn)，h.獲得所述標(biāo)志物的第一檢測點(diǎn)一級概況。
5.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括獲得所述生物傳感器表面的細(xì)胞附著一級概況。
6.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述附著概況在附著后不到10 小時、9小時、8小時、7小時、6小時、5小時、4小時、3小時、2小時、1小時、0. 5小時、0. 2小時或0. 1小時獲得。
7.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括對一組生物傳感器表面重復(fù)步驟a和b和獲得該組生物傳感器表面中各生物傳感器表面的細(xì)胞附著概況。
8.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，包括對一組檢測點(diǎn)η重復(fù)步驟 c和d，產(chǎn)生一組檢測點(diǎn)η —級概況。
9.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括溫育分子、未知分子、候選藥物分子或候選重編程分子與細(xì)胞，然后獲得某標(biāo)志物的一級概況。
10.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括在多于一個時間點(diǎn)溫育所述分子、所述未知分子、所述候選藥物分子或所述候選重編程分子與所述細(xì)胞，和獲得各時間點(diǎn)的某標(biāo)志物的一級概況。
11.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括利用一組標(biāo)志物表征所述細(xì)胞和產(chǎn)生各標(biāo)志物的一組一級概況。
12.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括在多于一個時間點(diǎn)或所述細(xì)胞的一組條件下產(chǎn)生各標(biāo)志物的一級概況。
13.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括產(chǎn)生溫育分子、未知分子、候選藥物分子或候選重編程分子對于一組標(biāo)志物中各標(biāo)志物的二級概況。
14.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，在各檢測點(diǎn)產(chǎn)生各標(biāo)志物的一級概況。
15.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述生物傳感器表面包括層粘連蛋白、組織培養(yǎng)處理的生物傳感器表面、纖連蛋白、天然束槍、細(xì)胞粘附肽、組織培養(yǎng)處理的。
16.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一檢測點(diǎn)在附著后的3 小時或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到，開始分化時，分化期間，或分化成熟后。
17.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述第二檢測點(diǎn)在附著后的3 小時或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到。
18.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述第三檢測點(diǎn)在附著后的3 小時或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到。
19.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，細(xì)胞信號傳導(dǎo)表征包括利用標(biāo)志物。
20.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)志物組包括選自以下的一組標(biāo)志物G蛋白-偶聯(lián)受體激動劑、受體酪氨酸激酶激動劑、激酶激活劑、酶激活劑、 酶抑制劑和受體激動劑，它們的一級概況用作未分化細(xì)胞的重編程細(xì)胞的性質(zhì)和質(zhì)量的指示劑。
21.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)志物組包括選自以下的一組標(biāo)志物G蛋白-偶聯(lián)受體激動劑、受體酪氨酸激酶激動劑、激酶激活劑、酶激活劑、 酶抑制劑和受體激動劑，它們的一級概況用作未分化細(xì)胞、其重編程細(xì)胞及其相應(yīng)細(xì)胞中差異的指示劑。
22.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)志物組包含已知調(diào)節(jié)劑，其DMR指數(shù)用作未分化細(xì)胞的重編程細(xì)胞的性質(zhì)和質(zhì)量的指示劑。
23.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，標(biāo)志物組包含一組已知調(diào)節(jié)劑，其DMR指數(shù)用作未分化細(xì)胞、其重編程細(xì)胞和其相應(yīng)細(xì)胞中差異的指示劑。
24.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)志物組選自乙酰膽堿、腺苷、ATP、精胺、強(qiáng)啡肽A、內(nèi)皮肽1、神經(jīng)肽B-23、食欲素A、SFLLR-酰胺、UDP、神經(jīng)肽、 血管活性腸肽、ADP、多巴胺、GABA、阿皮林、α -黑素細(xì)胞_刺激激素、血小板生長因子、血管緊張素II、高血糖素樣肽、溶血磷脂酸、神經(jīng)牽張素、P物質(zhì)、酪胺、UTP、硬骨魚緊張肽II、 8-CPT-2-Me-cAMP、毛喉素、MAS-7、740Y-P、L783281 和 PMA。
25.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，對于干細(xì)胞或祖干細(xì)胞的神經(jīng)元細(xì)胞分化譜系，所述標(biāo)志物組選自乙酰膽堿、腺苷、ATP、精胺、強(qiáng)啡肽A、內(nèi)皮肽1、神經(jīng)肽B-23、食欲素A、SFLLR-酰胺、UDP、神經(jīng)肽、血管活性腸肽、ADP、多巴胺、GABA、阿皮林、 α -黑素細(xì)胞-刺激激素、血小板生長因子、血管緊張素II、高血糖素樣肽、溶血磷脂酸、神經(jīng)牽張素、P物質(zhì)、酪胺、UTP、硬骨魚緊張肽II、8-CPT-2-Me-cAMP、毛喉素、MAS_7、740Y_P、 L783281 和 PMA。
26.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，EPAC-PII途徑的下調(diào)或改變是干細(xì)胞或祖干細(xì)胞的神經(jīng)元細(xì)胞分化譜系的指示劑。
27.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，PKC途徑的下調(diào)或改變是干細(xì)胞或祖干細(xì)胞的神經(jīng)元細(xì)胞分化譜系的指示劑。
28.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，選自Dl受體、NPY受體、食欲素A受體、阿片類物質(zhì)受體、毒蕈堿受體和P2Y受體的神經(jīng)元細(xì)胞-相關(guān)GPCR的功能信號傳導(dǎo)是干細(xì)胞或祖干細(xì)胞的神經(jīng)元細(xì)胞分化譜系的指示劑。
29.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，進(jìn)行多檢測點(diǎn)概況分析。
30.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述多檢測點(diǎn)概況分析以不連續(xù)方式進(jìn)行。
31.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述無標(biāo)記生物傳感器是表面等離振子共振系統(tǒng)(SPR)、RWG生物傳感器系統(tǒng)、阻抗系統(tǒng)、高分辨率光學(xué)生物傳感器成像系統(tǒng)、共振鏡成像系統(tǒng)、橢圓計成像系統(tǒng)、高頻獲取生物傳感器系統(tǒng)。
32.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述相應(yīng)細(xì)胞包括原代細(xì)胞、 永生化細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。
33.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括比較未分化細(xì)胞、其重編程細(xì)胞及其相應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答概況。
34.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括依據(jù)細(xì)胞應(yīng)答概況鑒定細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括細(xì)胞體系，所述細(xì)胞體系由衍生自干細(xì)胞或祖干細(xì)胞的多于一類細(xì)胞構(gòu)成。
36.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括通過生物傳感器表面上干細(xì)胞或祖干細(xì)胞的原位分化獲得的細(xì)胞體系。
37.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞體系包含多巴胺能神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。
38.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞體系通過全能或多能干細(xì)胞重編程產(chǎn)生。
39.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生重編程細(xì)胞。
40.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述重編程細(xì)胞包括神經(jīng)細(xì)胞。
41.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括溫育所述細(xì)胞與抗多巴胺抗體。
42.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，還包括溫育所述細(xì)胞與多巴胺神經(jīng)元保護(hù)劑。
43.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述多巴胺保護(hù)劑包括類固
44.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述類固醇包括17β-雌
45.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述類固醇雌二醇在增殖階段引入。
46.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述類固醇雌二醇在分化相引入。
47.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述類固醇雌二醇在分化細(xì)胞成熟后引入。
48.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，對細(xì)胞重編程為全能干細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測。
49.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，將分子施加于所述細(xì)胞以測定所述分子是否介導(dǎo)所述細(xì)胞重編程。
50.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述生物傳感器表面包括多孔板。
51.如權(quán)利要求1-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述多孔板包括96或384或 1536個孔。
全文摘要
公開了無標(biāo)記生物傳感器和利用這些傳感器觀察干細(xì)胞和分析干細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞的方法。
文檔編號G01N33/50GK102549430SQ201080043012
公開日2012年7月4日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者F·韋里耶, S·K·派, 方曄 申請人:康寧股份有限公司