專利名稱：用于測定未加工和部分加工的a型神經(jīng)毒素的系統(tǒng)的制作方法
用于測定未加工和部分加工的A型神經(jīng)毒素的系統(tǒng)本發(fā)明涉及在神經(jīng)毒素生產(chǎn)過程中用于質(zhì)量控制和安全性的工具。特別地，其涉及用于測定在包含加工的和部分加工的和/或未加工的BoNT/A的溶液中的部分加工的和 /或未加工的神經(jīng)毒素A多肽(BoNT/A)的量的方法，所述方法包括步驟在允許所述抗體與所述部分加工和未加工的BoNT/A結(jié)合的條件下，將所述溶液的樣品與特異性結(jié)合部分加工和未加工的BoNT/A的捕獲抗體接觸，從而形成復(fù)合物，并確定形成的復(fù)合物的量，而復(fù)合物的量指示了所述溶液中的部分加工和/或未加工的BoNT/A的量。此外，本發(fā)明考慮了用于實施所述方法的裝置和試劑盒。肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)生產(chǎn)強力的神經(jīng)毒素，分別是肉毒梭菌毒素(BoNT)和破傷風(fēng)毒素(TeNT)。這些梭菌神經(jīng)毒素特異性結(jié)合神經(jīng)元細(xì)胞并且破壞神經(jīng)遞質(zhì)釋放。每種毒素都作為無活性的未加工的約150kDa 的單鏈蛋白質(zhì)合成。翻譯后加工涉及二硫鍵的形成和細(xì)菌蛋白酶的有限的蛋白水解作用 (切割)。活性神經(jīng)毒素由兩條鏈組成，約50kDa的N端輕鏈和約IOOkDa的C端重鏈，兩鏈通過二硫鍵連接。神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)上和功能上由3個結(jié)構(gòu)域組成，S卩，催化輕鏈、涵蓋了易位結(jié)構(gòu)域的重鏈的N端一半和含有單或多受體結(jié)合位點的重鏈的C端一半，參見Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188,39 ；Krieglstein 1991, Eur T Biochem 202,41 ；Krieglstein 1994，J Protein Chem 13，49。肉毒梭菌神經(jīng)毒素是作為分子復(fù)合物合成的，所述復(fù)合物包含150kDa神經(jīng)毒素蛋白和相關(guān)聯(lián)的無毒復(fù)合蛋白。復(fù)合物大小隨梭菌菌株而不同，而不同的神經(jīng)毒素血清型范圍從300kDa，至500kDa以上，至多達900kDa。這些復(fù)合物中的無毒復(fù)合物蛋白使神經(jīng)毒素穩(wěn)定，并保護其免受降解，參見Silberstein 2004,Pain Practice 4， S19-S260肉毒梭菌分泌命名為A至G的7種抗原性不同的神經(jīng)毒素血清型。所有的血清型與由破傷風(fēng)梭菌分泌的相關(guān)TeNT都是Si2+-內(nèi)切蛋白酶，其通過切割SNARE蛋白阻斷突觸的胞外分泌，參見Couesnon，2006，Microbiology, 152，759。CNT導(dǎo)致在肉毒中毒和破傷風(fēng)中所見的弛緩性肌肉麻痹，參見Fischer 2007, PNAS 104,10447。不論其毒性效應(yīng)，肉毒梭菌毒素復(fù)合物已在多種疾病中被用作治療劑。肉毒梭菌毒素A血清型(BoNT/A)于1989年在美國被批準(zhǔn)用于人用途，用于治療斜視、瞼痙攣和其他病癥，因而具有特別重要的意義。它作為BoNT/A蛋白制備物是可商購的，例如商標(biāo)名 BOTOX (Al lergan Inc)或商標(biāo)名DYSP0RT (Ipsen Ltd)。不含復(fù)合蛋白質(zhì)的改良的BoNT/A 制備物是可商購的，商標(biāo)名為XE0MIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)。出于治療應(yīng)用，將制備物直接注射入待治療的肌肉中。在生理PH下，毒素從蛋白質(zhì)復(fù)合物中釋放并且產(chǎn)生所需的藥理學(xué)作用。肉毒梭菌毒素的效應(yīng)只是暫時的，這是為何維持治療效果需要重復(fù)施用肉毒梭菌毒素的原因。梭菌神經(jīng)毒素弱化肌肉收縮并且是斜視、局限性肌張力障礙(包括頸肌張力障礙和良性自發(fā)性瞼痙攣)的有效療法。其還表現(xiàn)出緩解偏側(cè)面肌痙攣和局部痙攣，并且對廣泛的其他適應(yīng)證有效，例如胃腸道病癥、多汗癥和美容皺紋校正，見Jost 2007, Drugs 67， 669。
在生產(chǎn)梭菌神經(jīng)毒素的過程中，活性神經(jīng)毒素多肽的定性和定量測定以及質(zhì)量控制是特別重要的。目前可獲得的神經(jīng)毒素制備物除所需的活性(加工的或成熟的)神經(jīng)毒素以外，還包含不同量的未蛋白水解加工的前體和/或部分加工的神經(jīng)毒素多肽。未蛋白水解加工的前體或部分加工的神經(jīng)毒素多肽僅在少數(shù)氨基酸上不同于成熟的(活性的、加工的)神經(jīng)毒素多肽。因此，難以基于它們的化學(xué)和物理性質(zhì)定量地區(qū)分它們。另一方面， 總蛋白質(zhì)含量中的未蛋白水解加工的前體和/或部分加工的神經(jīng)毒素多肽的部分在此類制備物中可能仍然是顯著的，即，與制備物的比活相關(guān)。用于測定制備物中的總神經(jīng)毒素含量的測定是本領(lǐng)域普遍已知的。這些測定基于免疫 PCR 或夾心 ELISA(Lindstrom 2006，Clin Microbiol. Rev. 19(2) :298-314 ；Volland 2008，J Immunnol Methods 330(1-2) =120-129) 然而，如前所述，通過應(yīng)用這些測定總神經(jīng)毒素含量的技術(shù)不能夠測定不需要的部分加工的或未加工的神經(jīng)毒素的含量。因此，仍未有但非常需要用于測定制備物中的部分加工的或未加工的神經(jīng)毒素分子(特別是BoNT/A分子)的含量的手段和方法。因而，本發(fā)明涉及用于測定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A的溶液中部分加工的和/或未加工的神經(jīng)毒素A多肽(BoNT/A)的量的方法，所述方法包括步驟i)在允許所述抗體與所述部分加工和未加工的BoNT/A結(jié)合的條件下，將所述溶液的樣品與特異性結(jié)合部分加工和未加工的BoNT/A的捕獲抗體接觸，從而形成復(fù)合物，和ii)測定步驟i)中形成的復(fù)合物的量，而復(fù)合物的量表示所述溶液中的部分加工和/或未加工的BoNT/A的量，其中通過以下方法可獲得捕獲抗體，所述方法包括a)在允許形成捕獲復(fù)合物的條件下，將來自由包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列(TKSLDKGYNKA)的肽免疫原免疫過的動物的多克隆抗血清與下列捕獲肽SLD、LDK和 YNK接觸，其中所述捕獲復(fù)合物包含多克隆抗血清包含的非特異性抗體和捕獲肽；b)從多克隆抗血清中移除捕獲復(fù)合物；C)在允許形成包含上述肽和特異性地結(jié)合未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽的抗體的復(fù)合物的條件下，將多克隆抗血清與包含基本由SEQ ID NO 1組成的肽接觸；d)從抗血清中移除步驟C)中形成的復(fù)合物；和e)從所述復(fù)合物中釋放與未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明的方法可以完全或至少部分地受自動化輔助。此類自動化可包括機器人裝置，以及已實現(xiàn)了用于測定所述溶液中所述部分加工的和/或未加工的BoNT/A的量的合適算法的計算機系統(tǒng)。此外，本發(fā)明的方法可包括在步驟i)和ii)之前、之后或之間執(zhí)行的額外步驟。此類額外步驟一方面可包括樣品預(yù)處理步驟，洗滌或純化步驟，以及數(shù)據(jù)挖掘步驟。一方面，所述額外步驟包括在下文所附的實施例中說明的那些步驟。術(shù)語“部分加工的和未加工的神經(jīng)毒素A多肽(BoNT/A) ”在本文中使用時指尚未成熟(即尚未從單鏈前體加工成成熟雙鏈(dichain)多肽，或者僅部分加工的)的神經(jīng)毒素A血清型多肽。BoNT/A是肉毒梭菌神經(jīng)毒素的七種血清型中的一種。它作為單鏈前體分子生產(chǎn)，所述分子在翻譯后被蛋白水解加工。單鏈分子包含N端輕鏈、接頭肽和C端重鏈。在單鏈分子的蛋白水解加工過程中，切除了接頭肽，從而生成包含重鏈和輕鏈但缺少接頭肽的成熟雙鏈分子。因此，接頭肽的側(cè)面是兩個蛋白酶切割位點。因此，在蛋白水解激活的過程中，將出現(xiàn)部分加工的分子。這些部分加工的分子僅在側(cè)翼蛋白酶切割位點中的一個處被切割從而使得接頭肽仍然連接在輕鏈或重鏈上。出于本發(fā)明的目的，此類分子被稱為部分加工的BoNT/A多肽。作為合適的加工的結(jié)果，獲得了 “加工的BoNT/A”。所述加工的BoNT/A多肽表現(xiàn)出神經(jīng)毒素的生物學(xué)性質(zhì)特征，即，(a)結(jié)合受體，(b)內(nèi)化，(c)跨內(nèi)涵體膜進入細(xì)胞溶膠的輕鏈易位，和/或(d)對突觸小泡膜融合中涉及的蛋白質(zhì)的內(nèi)切蛋白水解切割。因此，加工的BoNT/A多肽在本文中有時被稱為活性的或成熟的神經(jīng)毒素多肽。一方面，生物學(xué)活性是由所有上述生物學(xué)性質(zhì)導(dǎo)致的。用于評估生物學(xué)活性的體內(nèi)測定包括小鼠LD50測定和離體小鼠偏側(cè)腸測定，如 Pearce 1994，Toxicol Appl Pharmacol 128 :69-77 禾P Dressier 2005, Mov Disord 20 1617-1619所描述。生物學(xué)活性通常表達為小鼠單位(MU)。如本文中使用的，IMU是在腹膜內(nèi)注射后殺死50%的指定小鼠群體的神經(jīng)毒素組分的量，即小鼠 i. p. LD50。在一方面，BoNT/A是從肉毒梭菌的Hall菌株獲得的，并且在另一方面，它具有如 Beecher 1997，J Protein Chem 16 :701-712 或 Krieglstein 1994，J Protein Chem 13 49-57中公開的結(jié)構(gòu)(即，氨基酸序列)。此外，BoNT/A的氨基酸和編碼核酸序列可見于 GenBank登錄號ABD6M72. 1或GI :89258592下或分別在SEQ ID NO :2或3中顯示。在接頭肽側(cè)面的蛋白酶切割位點一方面在氨基酸K438/T439和K448/A449之間。因而，接頭肽基本由氨基酸1^439至氨基酸K448組成。然而，本發(fā)明的方法還涵蓋了上述BoNT/A的變體。所述變體一方面是相比如SEQ ID N0:2所示的BoNT/A的氨基酸序列或由SEQ ID NO :3編碼的氨基酸序列具有包含至少一個氨基酸添加、替換和/或缺失的氨基酸序列的神經(jīng)毒素多肽。另一方面，變體神經(jīng)毒素包含與SEQ ID NO 2所示BoNT/A的氨基酸序列或由SEQ ID NO 3編碼的氨基酸序列至少40%相同的氨基酸序列。上述氨基酸序列顯示未加工的BoNT/A多肽的氨基酸序列。通過本文別處給出的切割位點和接頭肽的信息，能夠從上述序列推導(dǎo)相應(yīng)的部分加工的或加工的神經(jīng)毒素多肽的序列。在本發(fā)明的另一方面，變體BoNT/A多肽具有與SEQ ID NO 2 所示氨基酸序列或由SEQ ID NO :3的核苷酸序列編碼的氨基酸序列至少40%、至少50%、 至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同的氨基酸序列。如本發(fā)明所用相同指氨基酸序列的序列同一性，其中比對序列從而獲得最高的順序匹配。這能夠通過使用公開的技術(shù)或計算機程序編碼的方法來實現(xiàn)，例如 BLASTP、BLASTN、FASTA、Altschul 1990，J Mol Biol 215，403。在一方面，百分比同一性的值是對整個氨基酸序列計算的。技術(shù)人員可獲得基于多種算法的系列程序用于比較不同的序列。在本上下文中，Needleman和Wunsch，或Smith和Waterman的算法給出特別可靠的結(jié)果。為了進行序列比對，使用程序PileUp(1987，J Mol Evolution 25， 351 ；Higgins 1989CABI0S 5，151)或程序 Gap 和 BestFit (Needleman 1970，J Mol Biol 48 ；443 ；Smith 1981, Adv Appl Math 2，482)，所述程序是GCG 軟件包(Genetics Computer Group 1991，575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)的部分。在本發(fā)明的一個方面，以下列設(shè)置使用程序GAP對整個序列區(qū)測定上文以百分比(％ )所述的序列同一性值:Gap Weight :50, Length Weight :3, Average Match :10. 000 禾口 Average Mismatch 0. 000，除非另外說明，否則所述設(shè)置應(yīng)該一直用作序列比對的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置。將理解上述變體在本發(fā)明一方面將保留BoNT/A的至少一個生物學(xué)性質(zhì)，而在另一方面應(yīng)保留BoNT/A的所有生物學(xué)性質(zhì)。另一方面，可以想到部分加工的和未加工的變體 BoNT/A多肽能夠被本發(fā)明方法中應(yīng)用的抗體特異性結(jié)合。一方面，這能夠通過接頭肽中包含SEQ ID NO 1的肽序列的存在實現(xiàn)。在其他方面，BoNT/A的變體能夠是具有改良的或改變的生物學(xué)性質(zhì)的神經(jīng)毒素， 例如它們可包含就酶識別改良的切割位點，或者可就受體結(jié)合或任何其他上述性質(zhì)改良。一般而言，可預(yù)計可以修改本發(fā)明的方法，因為基礎(chǔ)的概念依賴于在神經(jīng)毒素多肽的輕鏈和重鏈之間存在至少一個切割位點，而切割位點的性質(zhì)和它們之間的特定氨基酸序列是無關(guān)緊要的，只要用于方法中的抗體能夠特異性識別部分加工的或未加工的神經(jīng)毒素多肽。因此，另一方面應(yīng)用變體神經(jīng)毒素，其中蛋白酶識別位點和/或在重鏈和輕鏈之間的接頭肽已被替換。將理解該方面待應(yīng)用的抗體將仍特異性地結(jié)合接頭肽或其表位。還在另一方面，通過例如核酸重組技術(shù)，能夠向其他的神經(jīng)毒素血清型的接頭肽中引入包含SEQ ID NO :1的BoNT/A的接頭肽，并且通過應(yīng)用本發(fā)明的方法能夠測定樣品中所述其他神經(jīng)毒素血清型的未加工的和部分加工的多肽的量。如本發(fā)明的方法所用，術(shù)語“量”涵蓋了多肽的絕對量、所述多肽的相對量或濃度， 以及與其相關(guān)或能夠源自它的任何值或參數(shù)。如本文所用術(shù)語“溶液”指含有成熟BoNT/A多肽和部分加工的和/或未加工的 BoNT/A多肽前體的任何溶劑系統(tǒng)。溶劑系統(tǒng)進一步包含溶劑。在本發(fā)明多種方面所涵蓋的溶劑是水、含水緩沖系統(tǒng)、有機溶劑和離子液。在本發(fā)明一個方面，其是含水溶劑系統(tǒng)。此外，除成熟的BoNT/A多肽和部分加工的或未加工的前體多肽和溶劑以外，溶劑系統(tǒng)也可包含其他分子，所述分子包括其他細(xì)菌多肽。在一方面，用于本發(fā)明方法的溶液將是細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物或從此類細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的部分純化的或純化的制備物。如本文所用術(shù)語“樣品”指將通過本發(fā)明的方法研究的所述溶液的部分。將理解樣品還將包含BoNT/A和部分加工的和/或未加工的BoNT/A前體。在本發(fā)明方法的一方面， 所述樣品具有預(yù)先確定的體積和/或預(yù)先確定的總蛋白質(zhì)含量。在其他方面，樣品可包含由外源供應(yīng)的分子標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)本發(fā)明方法使用的將溶液樣品與捕獲抗體接觸指將樣品包含的前述未加工的和/或部分加工的BoNT/A多肽與捕獲抗體物理相鄰使得允許物理和/或化學(xué)的相互作用。原則上允許特異性相互作用的合適條件是技術(shù)人員普遍已知的。所述條件依賴于用于本發(fā)明方法中的抗體和溶液，并能夠由技術(shù)人員在不費周折地調(diào)整。此外，技術(shù)人員還能夠不費周折地確定足以允許相互作用的時間。將理解所述時間依賴于執(zhí)行方法時的外源因素，例如溫度、溶劑組成、PH值等。此外，應(yīng)理解在本發(fā)明方法所述的接觸的單個步驟之間， 可實施洗滌步驟以獲得適合接觸的條件。例如，在步驟i)中形成復(fù)合物后，在向所述復(fù)合物應(yīng)用檢測劑之前，應(yīng)移除剩余的溶液。在本發(fā)明方法的一方面，在步驟i)過程中存在洗滌劑。因而，可以想象先于步驟 i)或在其過程中將向樣品添加洗滌劑。合適的洗滌劑包括離子型和非離子型洗滌劑。在一方面，洗滌劑是非離子型洗滌劑，而在另外的方面中，是Tween 20。
在本發(fā)明方法的一方面，所述洗滌劑存在的濃度是在0. 01% (ν/ν)至10% (ν/ν) 的范圍內(nèi)。在另一方面，所述濃度是在0.2% (ν/ν)至0.8% (ν/ν)的范圍內(nèi)或在0.3% (ν/ ν)至0.6% (ν/ν)的范圍內(nèi)，仍在另一個方面，濃度是0.5% (ν/ν) 0在本發(fā)明方法的另一方面，所述步驟i)中的條件包括磷酸緩沖的或tris緩沖的鹽溶液的存在。在一方面，所述鹽溶液包含濃度在150至350mM范圍內(nèi)的NaCl。還在另一方面，所述濃度是在200至300mM的范圍內(nèi)，而仍在另一方面，濃度是250mM。如本文所用術(shù)語“測定量”涉及以定量或半定量的方式測量絕對量，相對量或濃度。測量將基于步驟i)中形成的復(fù)合物的化學(xué)的、物理的或生物學(xué)的性質(zhì)進行?？芍苯踊蜷g接地測定所述復(fù)合物的所述量。在一方面，可以應(yīng)用與形成的復(fù)合物相互作用的檢測劑。檢測劑將包含或生成與所檢測的復(fù)合物的量相關(guān)的可檢測的標(biāo)記，并因而允許測定其量。在一方面，所述檢測劑結(jié)合復(fù)合物中存在的捕獲抗體或未加工的或部分加工的BoNT/ A。因此，在其他方面，檢測劑將是當(dāng)存在于步驟i)中形成的復(fù)合物中時，結(jié)合捕獲抗體或部分加工的或未加工的BoNT/A或二者的抗體、結(jié)合肽(例如，BoNT/A受體或其部分)、適配體或小分子化合物。在一方面，檢測劑包含可檢測的標(biāo)記。在一方面，可檢測的標(biāo)記具有熒光或化學(xué)發(fā)光性質(zhì)，并因而允許檢測劑的直接檢測。典型的熒光標(biāo)記包括熒光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德州紅(Texas Red)、熒光黃和Alexa染料(例如，Alexa568)。仍在另一方面， 標(biāo)記可以是放射性標(biāo)記。典型的放射性標(biāo)記包括35S、125I、32P、33P等。還在另一方面，檢測劑可以包含能夠生成可檢測信號的酶活性，例如通過底物轉(zhuǎn)化。一般地，此類酶可以是過氧化物酶(例如，辣根過氧化物酶)、螢火蟲螢光素酶或堿性磷酸酶。上述類型的標(biāo)記能夠與檢測劑直接偶聯(lián)(共價或非共價地)。除所述直接標(biāo)記外，在本發(fā)明方法的另一方面，可以間接地標(biāo)記檢測劑。所述間接標(biāo)記涉及活性劑的結(jié)合(共價或非共價地)，所述活性劑特異性地結(jié)合檢測劑并攜帶可檢測的標(biāo)記。此類活性劑可以是例如特異性結(jié)合檢測劑的二級(高階)抗體。在此類情況下二級抗體將被偶聯(lián)于可檢測的標(biāo)記。將理解還能夠額外使用其他更高階的抗體用于檢測檢測復(fù)合物。更高階的抗體通常用于增加信號。合適的更高階的抗體還可以包括可商購的標(biāo)記系統(tǒng)，例如鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)(Vector Laboratories, Inc.) ,Dako LSAB 2和LSAB +系統(tǒng)(標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素)，或DakoPAP系統(tǒng)(過氧化物酶抗過氧化物酶)。將理解由檢測劑包含或生成的可檢測標(biāo)記的量與復(fù)合物的量直接相關(guān)。復(fù)合物的量又與待測定的分子種類的量相關(guān)，即與樣品中存在的未加工的和/或部分加工的神經(jīng)毒素分子相關(guān)。此外，將理解樣品是溶液的代表性部分。因而，對樣品所測定的未加工的和/ 或部分加工的BoNT/A多肽的量表示存在于溶液中的量。在一方面，測定未加工的和部分加工的神經(jīng)毒素多肽的量也需要通過應(yīng)用具有預(yù)先確定的量的所述多肽的標(biāo)準(zhǔn)溶液校正方法。如何進行此類校正是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的。在一方面，通過應(yīng)用本發(fā)明的方法對在未加工的和/或部分加工的神經(jīng)毒素的預(yù)先確定的量中不同的兩個或更多個前述標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品進行若干次測定。因而，在本發(fā)明方法的一方面，所述步驟ii)包括與參照比較復(fù)合物的測定的量。 在一方面，參照是源自如上所述的兩個或更多個標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正曲線。作為比較的結(jié)果，能夠針對未加工和/或部分加工的BoNT/A多肽的預(yù)先確定的量分配測定的復(fù)合物的量。
能夠從表達蛋白酶切割位點中被突變的BoNT/A多肽前體的肉毒梭菌突變體獲得未加工的BoNT/A多肽。通過本領(lǐng)域普遍已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)能夠生成此類突變體。 此外，通過在大腸桿菌或缺少能夠通過蛋白水解切割激活BoNT/A的蛋白酶的其他細(xì)菌中重組地表達所述BoNT/A能夠獲得未加工的BoNT/A。在另一個方面，能夠突變?nèi)舛舅缶募?xì)菌細(xì)胞或其他表達系統(tǒng)以篩選具有顯著降低的或者甚至無蛋白酶活性的突變體，并因而僅生產(chǎn)未加工的神經(jīng)毒素。本發(fā)明的方法需要特異性結(jié)合部分加工的和未加工的BoNT/A多肽的捕獲抗體。 在一方面通過包括上述步驟a)至e)的上述方法此類抗體是可獲得的。在下文中進一步解釋本上下文中使用的術(shù)語。如本文所用術(shù)語“抗體”涵蓋了單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、人、人源化、靈長動物源化(primatized)，或嵌合的抗體、雙特異性抗體、合成抗體、化學(xué)或酶修飾的衍生物、任何所述抗體的片段或由天然存在的和/或化學(xué)修飾的核酸組成的適配體。所述抗體的片段包括F (ab' )2、F(ab)、Fv或scFv片段，或任何這類片段的化學(xué)或酶修飾的衍生物。 本發(fā)明的抗體將特異性結(jié)合由前述肽組成的表位，如果所述肽包含于部分加工的或未加工的神經(jīng)毒素多肽。術(shù)語“特異性結(jié)合”意指本發(fā)明的抗體不以顯著的程度與一般所述部分加工的或者所述未加工的神經(jīng)毒素多肽上，或者其他多肽上的其他表位交叉反應(yīng)。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的抗體不與所述活性的、完全加工的神經(jīng)毒素多肽交叉反應(yīng)。表位特異性是本發(fā)明抗體的重要特征。一方面，關(guān)于部分加工的或未加工的神經(jīng)毒素相對于加工的神經(jīng)毒素的抗體特異性將是至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %。通過多種普遍已知的技術(shù)(包括例如競爭研究或SDS PAGE的Western印跡分析)能夠測試特異性結(jié)合。 另一重要的特征是抗體的靈敏性。在本發(fā)明的一個方面，靈敏性將使得樣品所包含的加工的神經(jīng)毒素的至少70%、至少80%、至少90%、至少95%被結(jié)合。通過普遍已知的技術(shù)能夠測試靈敏性。通過使用常規(guī)實驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定對于每次測定的可操作的和優(yōu)化的測定條件。用于結(jié)合研究的常規(guī)技術(shù)包括放射免疫測定、ELISA、平衡透析、等溫微量量熱法、BIACORE 測定(表面等離振子共振，SPR)或其他表面吸收方法。原則上通過使用存在于傳感器表面上的固定化的抗原(配體)的結(jié)合研究可測定本發(fā)明抗體的結(jié)合特性(例如靈敏性)。將在移動相(即溶液)中提供待測試的抗體(分析物)。在一些情況下，抗原通過結(jié)合另一種稱為捕獲分子的固定化的分子而間接地附著在表面上。當(dāng)以不連續(xù)的脈沖將抗體注射到具有固定化的抗原的表面時，基本能夠分為3個階段(i)在樣品注射期間抗體與抗原的結(jié)合；(ii)在樣品注射期間的平衡或穩(wěn)定態(tài)，其中抗體結(jié)合的速率由自抗體-抗原復(fù)合物的解離平衡；(iii)在緩沖液流動期間抗體從表面解離。將理解備選地能夠用固定的待研究抗體和含有抗原的溶液作為流動相來實施此類測定。結(jié)合和解離階段提供了分析物-配體相互作用的動力學(xué)的信息(ka和kd，復(fù)合物形成和解離的速率，kd/ka = KD)。平衡相提供分析物-配體相互作用的親和力的信息(Kd)。本發(fā)明的抗體在本發(fā)明的一個方面具有小于0. 5 μ M的KD，在一個方面，具有小于0. 05 μ M的KD，而在另一個方面， 具有小于0. 02μΜ的KD。在一方面，本發(fā)明方法中待使用的抗體允許以高靈敏性和特異性檢測部分加工的和/或未加工的神經(jīng)毒素多肽，在一方面具有< 1000pg/mL、< 300pg/mL、< 100pg/mL的檢測限度，在一方面具有50至80pg/mL的檢測限度，還在另一方面具有69pg/mL的檢測限度。 在其他方面，檢測限度甚至可為< 30pg/mL、< 10pg/mL、< 3pg/mL，并且在一方面檢測限度為約或< lpg/mL。能夠通過使用以下方法生產(chǎn)本發(fā)明涉及的抗體，所述方法描述在例如Harlow和 Lane,"Antibodies,A Laboratory Manual，，,CSH Press,Cold Spring Harbor, 1988 中。單克隆抗體能夠按Kiihler 1975，Nature 256，495 和 Galfr61981，Meth Enzymol 73，3 中初始描述的技術(shù)來制備。所述技術(shù)包括將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與源自免疫哺乳動物的脾細(xì)胞融合。能夠通過本領(lǐng)域普遍已知的技術(shù)進一步改良抗體。例如，用于BIACORE 系統(tǒng)中的表面等離振子共振可用于增加與蛋白水解未加工的神經(jīng)毒素多肽內(nèi)的上述表位結(jié)合 ^vMMWiKW^^, Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7,97 ；Malmborg 1995, J. Immunol Methods 183,7。如上使用的術(shù)語“肽免疫原”指以允許在非人動物中引發(fā)免疫應(yīng)答的方式提供的具有如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的寡肽。在一方面，通過本領(lǐng)域已知的任何接頭或連接方法偶聯(lián)所述具有SEQID NO :1的肽與載體蛋白。在另一個方面，所述免疫原還包含KLH。在其他方面，通過接頭N_[ Y-馬來酰亞氨基丁酉先氧基]琥拍酉先亞胺酉旨(N-[gamma-maleimidobutyryloxy] succinimide ester, GMBS)，所述KLH與具有SEQ ID NO :1的肽相連。還在其他方面，通過半胱氨酸，并且一方面通過C端半胱氨酸，所述KLH與具有SEQ ID NO 1的肽通過接頭GMBS連接。如何通過接頭分子例如GMBS連接KLH和肽是本領(lǐng)域普遍已知的或描述在下文所附實施例中。在另一個方面，能夠使用卵清蛋白作為免疫原。所述卵清蛋白將通過接頭磺酸基琥珀酰亞氨基-4 (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)與半胱氨酸殘基交聯(lián)，一方面，與C端的半胱氨酸殘基交聯(lián)。在此方面，可以想象使用C端添加了上述半胱氨酸的由SQ ID NO 1的氨基酸X至Y組成的五肽。在另一個方面，非人動物是哺乳動物，在一個方面，是大鼠、小鼠、兔、綿羊或山羊。 在進行本發(fā)明的方法之前，使用上述的肽免疫原免疫將作為多克隆抗血清來源的非人動物。如何免疫非人動物是本領(lǐng)域普遍已知的并描述在下文所附實施例中。所述免疫的結(jié)果是非人動物將生產(chǎn)針對肽免疫原的多克隆抗體。通過多種技術(shù)能夠從非人動物獲得多克隆抗血清。在一個方面，通過本領(lǐng)域普遍已知的和下文所附實施例所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，從血液、血清或血漿中獲得。術(shù)語“多克隆抗血清”因而包括來自所述動物的純化的和部分純化的血清。此類多克隆抗血清是上述方法的起始材料。除與未加工的和部分加工的BoNT/A多肽特異性結(jié)合的需要的一種或多種抗體外，多克隆抗血清可包含不與未加工的和部分加工的BoNT/A多肽特異性結(jié)合的其他抗體。在允許形成包含多克隆抗血清中包含的非特異性抗體和捕獲肽的捕獲復(fù)合物的條件下，通過將所述多克隆抗血清與捕獲肽SLD、LDK和YNK接觸，并從多克隆抗血清中移除捕獲復(fù)合物，將這些不需要的、交叉反應(yīng)的抗體與需要的特異性抗體分離，從而獲得部分純化的多克隆抗血清。一方面，上述捕獲肽能夠以在下文所附實施例中公開的它們的衍生物的形式應(yīng)用于方法中。之后，將所述部分純化的多克隆抗血清與也具有如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的肽接觸。在一個方面，如本文別處詳細(xì)所述地將所述肽固定在載體上。作為所述接觸的結(jié)果，形成了肽和特異性抗體的復(fù)合物，所述復(fù)合物能夠隨后從剩余的多克隆血清中被移除。 然后能夠從移除的復(fù)合物中釋放特異性抗體。在本文的別處描述從此類復(fù)合物中釋放抗體的合適技術(shù)。在一個方面，用于獲得抗體的方法的步驟a)至e)是通過親和層析的手段進行的。 本發(fā)明使用的親和層析指基于分子對層析使用的固定相的不同的親和力，用于分離移動相中的分子的技術(shù)。在一個方面，所述技術(shù)指從固定的配體上選擇性吸收并隨后回收化合物。 在另一個方面，所述技術(shù)被設(shè)計用于蛋白質(zhì)和相關(guān)化合物的高度特異和有效的純化，使用珠狀和有孔基質(zhì)上的恰當(dāng)?shù)倪x擇性配體，用于結(jié)合隨后能夠在溫和的條件下回收的靶化合物。所述技術(shù)基于高度特異性的相互作用，例如抗原和抗體之間、酶和底物之間，或者受體和配體之間的相互作用。在另一個方面，按柱層析實施所述親和層析。在一個方面，上文詳細(xì)表征的親和層析是免疫吸附層析和、疏水相互作用層析(HIC)、逆相層析，并且在另一個方面，是應(yīng)用結(jié)合活性劑的免疫親和層析，所述結(jié)合活性劑在另一方面是本發(fā)明的抗體。在一個方面，本文涉及的固定相由上述活性劑作為固體基質(zhì)組成。在一個方面，所述活性劑與偶聯(lián)在固體基質(zhì)上的多肽載體結(jié)合，并在另一個方面，與偶聯(lián)在固體基質(zhì)上的蛋白A結(jié)合。為了實施本發(fā)明的方法，能夠把捕獲抗體與固體支持物共價或非共價地偶聯(lián)。此類固體支持物的材料是本領(lǐng)域普遍已知的，并且尤其包括可商購的多糖基質(zhì)，所述多糖基質(zhì)選自瓊脂糖凝膠(s印harose)、交聯(lián)葡聚糖凝膠(s印hadex)；瓊脂糖、s印hacell、微晶纖維素(micro-cellulose)和藻酸珠(alginate-bead)、多肽基質(zhì)、聚苯乙烯珠、膠乳珠、磁珠、金屬膠體顆粒、玻璃、塑料和/或硅芯片和表面、硝酸纖維素帶、膜、片、duracytes、反應(yīng)托盤的孔和壁、塑料管。在本發(fā)明的一個方面，所述固體支持物由Y放射過的聚苯乙烯制成。根據(jù)所預(yù)計的用途，所述固體支持物可包括在分隔的瓶中，或是分隔的瓶的形式。備選地，固體支持物可包括在多孔板中，或是多孔板的形式。取決于固體支持物，在本發(fā)明的方法中應(yīng)用固體支持物之前，可能必須進行封閉步驟，以封閉固體支持物上對肽和蛋白質(zhì)的自由結(jié)合位點。本發(fā)明的方法有利地允許特異性的測定BoNT/A前體分子，即，未加工的，單鏈 BoNT/A和/或部分加工的BoNT/A。這些前體分子通常是應(yīng)用于治療或美容目的的BoNT/ A制備物中不需要的污染物。因而，其含量應(yīng)該被降低到最小的量。本發(fā)明的方法允許為 BoNT/A制備物的生產(chǎn)建立起有效的質(zhì)量控制和產(chǎn)品安全性管理。此外，當(dāng)生產(chǎn)BoNT/A制備物時，能夠監(jiān)控純化和/或加工步驟的效率。在本發(fā)明基礎(chǔ)的研究中，在山羊中使用與KLH 偶聯(lián)的接頭肽作為免疫原(抗接頭肽scBoNT/A血清)，產(chǎn)生針對未加工的肉毒梭菌A型神經(jīng)毒素(BoNT/A)的多克隆血清。即使在親和純化后，在SDS PAGE的Wfestern印跡分析中血清表現(xiàn)出對加工的BoNT/A的交叉反應(yīng)。經(jīng)驗證，交叉反應(yīng)取決于對存在于接頭肽，以及加工的BoNT/A的輕鏈和重鏈中的三肽(SLD、LDK和YNK)的識別。通過兩步親和層析純化第二批山羊免疫血清，移除交叉反應(yīng)的三肽抗體。第二抗接頭肽scBoNT/A血清在Western 印跡中沒有表現(xiàn)出針對加工的BoNT/A的交叉反應(yīng)性。在一方面，包括上述一般步驟的本發(fā)明的方法還包括下列特定步驟1)將通過上述方法獲得的捕獲抗體固定在固體支持物(例如，多孔板)上；2)通過洗滌移除未固定的捕獲抗體；
3)通過應(yīng)用合適的封閉緩沖液(見下文實施例)，封閉固體支持物上的自由的肽 /蛋白質(zhì)結(jié)合位點；4)通過洗滌移除封閉緩沖液；5)在允許形成捕獲復(fù)合物的條件下，應(yīng)用待分析的溶液的樣品或用于校正的標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品；6)通過洗滌移除未結(jié)合的樣品材料；7)在允許形成檢測復(fù)合物的條件下，應(yīng)用檢測劑(例如，第一和任選地，更高階的檢測抗體，所述抗體與酶(例如過氧化物酶)直接或間接地偶聯(lián))；8)通過洗滌移除未結(jié)合的檢測劑；9)測定檢測劑發(fā)出的檢測信號(例如，通過對檢測復(fù)合物應(yīng)用生色底物并通過確定光密度測量底物轉(zhuǎn)化)。然而，將理解，也能夠通過可源自上文的任何其他特定步驟實施本發(fā)明的方法。本發(fā)明還考慮了用于測定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的溶液中的部分加工的和/或未加工的神經(jīng)毒素A多肽(BoNT/A)的量的裝置，所述裝置包含i)包含如上所述的捕獲抗體的分析單元，其中所述分析單元允許所述溶液的樣品與所述捕獲抗體接觸，和ii)評估單元，其包含用于測定在分析單元中形成的復(fù)合物的量的讀數(shù)系統(tǒng)和允許基于所測定的復(fù)合物的量計算所述溶液中部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的量的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。如本文所用，術(shù)語“裝置”指這樣的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)至少包含前述布置的彼此有效連接以允許測定的分析單元和評估單元。在一方面，所述布置可以是具有上述固定的捕獲抗體的固體支持物，所述捕獲抗體可以如上所述存在于固體支持物上(例如以瓶的形式)， 從而允許溶液的樣品與捕獲抗體接觸。此外，在一方面，裝置可包含用于測定檢測復(fù)合物的量的讀數(shù)系統(tǒng)。取決于待用的檢測劑的種類，此類系統(tǒng)將包含生成的信號的檢測器。此外， 在一方面，單元還能夠包含用于處理從讀數(shù)系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)的基于計算機的算法。所述算法將允許計算需要的多肽的量。在一方面，這通過比較測量信號與校正標(biāo)準(zhǔn)以測定溶液或其樣品中存在的多肽的量來實現(xiàn)。此外，本發(fā)明涵蓋了用于測定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的溶液中的部分加工的和/或未加工的神經(jīng)毒素A多肽(BoNT/A)的量的包含如上所述的捕獲抗體的試劑盒。如本文所用術(shù)語“試劑盒” 一方面指上述捕獲抗體和檢測劑和/或一種或多種本文中別處示出的校正標(biāo)準(zhǔn)的集合。試劑盒的所述組分可以包裝或不包裝在一起。試劑盒的組分可以包含在分隔的瓶中(即，作為試劑盒的分隔的部分)或在單個瓶中提供。此外，應(yīng)理解，本發(fā)明的試劑盒是用于實踐本文上文中提及的方法的。在一方面，可以想象所有的組分都以即用(ready-to-use)的方式提供，用于實踐上文提及的方法。在其他方面，試劑盒含有進行所述方法的說明。說明能夠以紙或電子形式的用戶手冊來提供。例如，手冊可包括用于解釋當(dāng)使用本發(fā)明的試劑盒進行上述方法時獲得的結(jié)果的說明。在本發(fā)明試劑盒的方面，所述試劑盒還包含至少一種用于測定包含捕獲抗體和未加工和/或部分加工的BoNT/A多肽的復(fù)合物的量的檢測劑。本說明書引用的所有參考文獻都以其完整的公開內(nèi)容和本說明書中具體提及的公開內(nèi)容引入作為參考。
實施例實施例1 免疫原和抗體的牛成免疫原的生成1、接頭肽-免疫原I 通過外部供應(yīng)者生成具有序列NH2-TKSLDKGYNK-Cys-COOH的肽并然后通過接頭GMBS與載體-蛋白質(zhì)KLH偶聯(lián)。2、接頭肽-免疫原II :a)激活卵清蛋白將2. ISmg磺基-SMCC(磺基琥珀酰亞氨基-4 (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯)溶解在50 μ LDMSO中。之后，添加2.5ml 含有7. 5mg/ml卵清蛋白的卵清蛋白溶液(緩沖液5mM磷酸鈉；0. 9% NaCl)，并在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育溶液讓。使用PDlO柱實施緩沖液改變，在3. 5ml含有IOmM磷酸鈉；0. 9% NaCl的緩沖液中洗脫活化的卵清蛋白。b)將肽與卵清蛋白偶聯(lián)JfSmg的肽Ac-DKGYN-Cys-COOH溶解在250 μ L H2O和2. 5 μ L 500mM TCEP · HCl (三羧乙基)膦鹽酸鹽)中，之后用ImM NaOH中和。最后，添加活化的卵清蛋白，并在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育反應(yīng)混合物4. 4h。通過添加 IOmM半胱氨酸溶液，旋轉(zhuǎn)孵育lh，封閉剩余的反應(yīng)基團。使用IOmM磷酸鈉；0. 9% NaCl實施透析。免疫通過免疫獲得抗血清。1)抗接頭肽scBoNT/A-血清I 使用接頭肽-免疫原I作為免疫原，所述接頭肽-免疫原I通過接頭GMBS與載體-蛋白KLH偶聯(lián)。通過皮下注射接頭肽-免疫原I免疫兩只山羊，每只初始用溶解在弗氏佐劑中的300 μ g接頭肽-免疫原I，并最后用在不完全弗氏佐劑中的100 μ g接頭肽-免疫原I以2周的節(jié)律免疫4次。在49、63、77和84天后， 收集抗血清。使用第84天時最后一次放血所收集的血清來實施親和層析。2)抗接頭肽scBoNT/A-血清II 使用接頭肽-免疫原II作為免疫原，所述接頭肽-免疫原II通過接頭SMCC與載體-蛋白卵清蛋白偶聯(lián)。通過皮內(nèi)注射接頭肽-免疫原II免疫兩只兔子，每只初始用在弗氏佐劑中的300 μ g接頭肽-免疫原II，并最后用在 Montanide ISA 206中的150 μ g接頭肽-免疫原II以2周的節(jié)律免疫5次。分別使用第 60或110天時放血所收集的血清來實施親和層析。血清的兩步親和層析1、基質(zhì)的生成對于兩步親和層析，生成含有不同肽的兩種不同的超連接碘代乙
?；|(zhì)。一方面，交聯(lián)反應(yīng)肽SLD、LDK和YNK以下列肽的形式存在 Ac-ELDKYN-Cys-COOH (SEQ ID NO 4), NH2-NISLDL-Cys-COOH (SEQ ID NO 5)禾口 NH2-YYNKF-Cys-COOH(SEQ ID NO :6)，并使用下文給出的一般說明與基質(zhì)偶聯(lián)。另一方面， 以下列衍生物的形式Ac-TKSLDKGYNKA-Cys-C00H，使用下文給出的一般說明將接頭肽(SEQ ID NO 1)與基質(zhì)偶聯(lián)。一般說明
偶聯(lián)緩沖液50mM Tris、5mM EDTA-Na, pH 8. 5。制備體積等于所使用的 UltraLink Iodoacyl Gel 體積 20 倍的緩沖液。L-半胱氨酸HCl ；洗滌溶液ImM氯化鈉(NaCl)。可頂部和底部加帽的空的重力流動式或旋轉(zhuǎn)式柱子。制備肽或蛋白質(zhì)樣品用偶聯(lián)緩沖液溶解肽。與UltraLink Iodoacyl Gel 偶聯(lián)1、將底帽置于重力流動式柱上，加入需要量的UltraLink IodoacylGel漿，允許凝膠沉降15分鐘。2、通過添加緩沖液至凝膠床的頂部允許通過柱排出，從裝好的柱中排出液體并用 5倍凝膠床體積的偶聯(lián)緩沖液洗滌/平衡UltraLink IodoacylGel 不要讓凝膠床流干。3、放回底帽并添加已制備的含巰基的樣品。每ml的UltraLink Iodoacyl Gel
可應(yīng)用約Iml的樣品溶液。4、放回頂帽并在RT混合柱15分鐘。5、將柱豎直直立并在不混合的條件下RT孵育30分鐘。6、依次移除柱頂和底的帽并允許溶液排出。7、用3倍凝膠床體積的偶聯(lián)緩沖液洗滌柱子。封閉凝膠上的非特異性結(jié)合位點1、放回柱子的底帽。2、制備50mM L-半胱氨酸HCl的偶聯(lián)緩沖液的溶液并按每毫升凝膠Iml將該溶液添加到柱子中。3、放回頂帽并在RT混合15分鐘，然后在不混合的條件下RT孵育反應(yīng)另外30分鐘。2、兩步親和層析首先從血液中分離待純化的血清。對含有交叉反應(yīng)三肽的第一柱應(yīng)用粗制血清。 交叉反應(yīng)抗體結(jié)合三肽并因而從粗制血清中分離。對含有結(jié)合的接頭肽的第二柱應(yīng)用該第一柱的濾過物(flow-through)。接頭肽特異性抗體結(jié)合接頭肽并因而與可見于第二柱的第二濾過物中的粗制血清分離。通過用PBS緩沖液(0.5M NaCl)的高嚴(yán)格度洗滌，從柱中移除低親和力的抗接頭肽scBoNT/A抗體。隨后，洗脫并濃縮結(jié)合的高親和力的抗接頭肽 scBoNT/A抗體。該濃縮物對應(yīng)于所使用的抗接頭肽scBoNT/A血清。實施例2 測試和驗證抗體特異性試劑ELISA 包被緩沖液0.005M-1M Tris ；0. 9%NaCl，優(yōu)選0. OIM-0. 2M Tris ；0. 9%NaCl,pH =8. 5。捕獲抗體抗接頭肽scBoNT/A血清。封閉和抗體稀釋緩沖液在0. OlM磷酸鈉中的0. 5% -5% BSA ；0. 9% NaCl, pH = 7. 4。樣品緩沖液在0. 005M-1M 磷酸鈉中的 0. 5 % -5 % BSA ；0. 1-0. 5MNaCl ； 0. 01% -1% Tween 20，優(yōu)選在 0. 005-0. IM 磷酸鈉中的 1 % -3 % BSA ；0. 15M-0. 4M NaCl ；0. 05% -0. 5% Tween 20，pH = 7. 4。洗滌緩沖液0.OlM 磷酸鈉；0. 9% NaCl ；0. 05% Tween 20，pH = 7. 4。檢測抗體抗BoNT/A的單克隆抗體。二級抗體綴合了過氧化物酶的多克隆抗小鼠IgG(H&L)抗體的抗體。底物TMB，可商購。2、試劑 Western 印跡變性樣品緩沖液，可商購。SDS凝膠，可商購。MES電泳緩沖液(SDS PAGE)可商購。PVDF膜可商購。轉(zhuǎn)移緩沖液(Western印跡)可商購。樣品含雙鏈-BoNT/A和scBoNT/A的肉毒梭菌神經(jīng)毒素A。一級抗體抗接頭肽scBoNT/A血清。二級抗體綴合了堿性磷酸酶的多克隆驢抗山羊抗體IgG(H&L)。封閉和抗體稀釋緩沖液在0. 01M-0. IM Tris 中的 0. 5% ~5% BSA ；0. 9% NaCl, 0. 05% -5% Tween 20，pH = 7. 4。洗滌緩沖液0.01M-0. IM Tris ；0. 9% NaCl ；0. 05% ~5% Tween 20，pH = 7. 4。Tris 緩沖液0. 025M Tris, pH = 8. 0。底物BCIP/NBT，可商購。a)抗血清對于BoNT/B和BoNT/E的特異性為了測定抗血清對于BoNT/B和BoNT/ E的特異性，在ELISA中分析物質(zhì)的回收率。以100μ 1/孔的含有0.5yg抗接頭肽scBoNT/ A-血清/ml的包被緩沖液在室溫孵育微量滴定板1 并隨后用洗滌緩沖液洗滌3次。向微量滴定板中添加200 μ 1/孔的封閉溶液并在室溫孵育lh。把抗原scBoNT/A (在樣品緩沖液中系列稀釋；pg/ml濃度)用作校正標(biāo)準(zhǔn)，用100 μ 1/孔的校正標(biāo)準(zhǔn)孵育微量滴定板。分別在樣品緩沖液中稀釋BoNT/B或ΒοΝΤ/Ε，并以100 μ 1/孔的體積用于微量滴定板。兩種物質(zhì)都過量使用，使用200ng/ml的稀釋物。在37°C孵育樣品和標(biāo)準(zhǔn)池。用洗滌緩沖液洗滌微量滴定板3次。添加100 μ 1的檢測緩沖液/孔并在室溫孵育lh。然后，用洗滌緩沖液洗滌微量滴定板3次。隨后，用100 μ 1/孔的二級抗體在室溫進行孵育lh。然后用洗滌緩沖液洗滌微量滴定板3次。通過添加100 μ 1底物/孔開始檢測反應(yīng)。在室溫孵育30分鐘后，通過添加50 μ 1 2Μ 孔終止反應(yīng)并測定在450nm的吸光度。為了測定特異性，通過標(biāo)準(zhǔn)化計算BoNT/B 和BoNT/E的濃度。通過計算回收率，能夠測定抗接頭肽scBoNT/A對血清型B和E的特異性。回收率越低，交叉反應(yīng)越低，且血清對于scBoNT/A的特異性越好。b)抗接頭肽BoNT/A對于雙鏈BoNT/A的特異性為了測定抗血清對于活化的雙鏈 BoNT/A的特異性，通過Wfestern印跡實施免疫組織化學(xué)檢測。在還原條件下通過SDS-PAGE 根據(jù)它們的分子量，將NT樣品(scBoNT/A至少50ng，雙鏈BoNT/A取決于所使用的樣品)分離為scBoNT/A、LC和HC(雙鏈BoNT/A)。然后將蛋白質(zhì)印跡在PVDF膜上。用20ml封閉緩沖液在室溫封閉膜達lh。移除封閉緩沖液并添加20ml含0. 005 μ g/ml抗接頭肽scBoNT/ A血清的一級抗體溶液。在4°C孵育一級抗體過夜。移除含有抗體的溶液并用20ml洗滌緩沖液在37°C洗滌膜3次，30分鐘。隨后用20mL濃度為0. 4 μ g/ml的二級抗體在室溫孵育膜3小時。移除二級抗體溶液并用20ml洗滌緩沖液在37°C洗滌膜3次，30分鐘。此外，在室溫用20ml的25mM Tris緩沖液洗滌膜1次5分鐘。通過添加底物實施檢測反應(yīng)。孵育底物15分鐘并通過添加水終止顯色反應(yīng)。通過染色在150kDa的scBoNT/A帶測定特異性。當(dāng)僅檢測出150kDa的特異性帶而沒有在 IOOkDa(HC)和50kDa(LC)的雙鏈BoNT/A的特異性帶時,測定抗接頭肽的特異性。使用上述ELISA條件測定不同電荷的scBoNT/A含量，并與通過SDSPAGE測定的含量比較。結(jié)果顯示在下表中。表通過SDS PAGE 相對 ELISA 測定的 scBoNT/A
權(quán)利要求
1.用于測定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A的溶液中的部分加工的和/或未加工的神經(jīng)毒素A多肽(BoNT/A)的量的方法，所述方法包括步驟i)在允許所述抗體與所述部分加工和未加工的BoNT/A結(jié)合的條件下，將所述溶液的樣品與特異性結(jié)合部分加工和未加工的BoNT/A的捕獲抗體接觸，從而形成復(fù)合物，和 )測定步驟i)中形成的復(fù)合物的量，而復(fù)合物的量指示所述溶液中的部分加工和/ 或未加工的BoNT/A的量，其中通過以下方法可獲得捕獲抗體，所述方法包括a)在允許形成包含多克隆抗血清中包含的非特異性抗體和捕獲肽的捕獲復(fù)合物的條件下，將來自用包含如SEQ ID NO :1中所示氨基酸序列的肽免疫原免疫的動物的多克隆抗血清與下列捕獲肽SLD、LDK和YNK接觸；b)從多克隆抗血清中移除捕獲復(fù)合物；c)在允許形成包含上述肽和特異性結(jié)合未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽的抗體的復(fù)合物的條件下，將多克隆抗血清與包含SEQ ID NO 1的肽接觸；d)從抗血清中移除步驟c)中形成的復(fù)合物；和e)從所述復(fù)合物中釋放與未加工的或部分加工的神經(jīng)毒素多肽特異性結(jié)合的抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫原還包含KLH。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述KLH通過接頭Ν-[γ-馬來酰亞氨基丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)與具有SEQ ID NO 1的肽相連。
4.權(quán)利要求1至3的任一項的方法，其中步驟i)中的所述條件包括存在洗滌劑。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述洗滌劑是Tween20。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中所述洗滌劑以在0.01%(ν/ν)至10% (ν/ν)的范圍內(nèi)的濃度存在。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述濃度是在0.2%(ν/ν)至0.8% (ν/ν)的范圍內(nèi)或在 0. 3% (ν/ν)至 0.6% (ν/ν)的范圍內(nèi)。
8.權(quán)利要求1至7的任一項的方法，其中步驟i)中的所述條件包括存在磷酸緩沖的或 tris緩沖的鹽溶液。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述溶液包含濃度在150至350mM范圍內(nèi)的NaCl。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述濃度在200至300mM范圍內(nèi)。
11.權(quán)利要求1至10的任一項的方法，其中所述步驟ii)包括比較參照與復(fù)合物的量， 從而能夠針對未加工BoNT/A多肽的預(yù)先確定的量分配所測定的復(fù)合物的量。
12.用于測定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的溶液中的部分加工的和/或未加工的神經(jīng)毒素A多肽(BoNT/A)的量的裝置，所述裝置包含i)包含如權(quán)利要求1至3的任一項所述捕獲抗體的分析單元，其中所述分析單元允許所述溶液的樣品與所述捕獲抗體接觸，和 )評估單元，其包含用于測定在分析單元中形成的復(fù)合物的量的讀數(shù)系統(tǒng)和允許基于所測定的復(fù)合物的量計算所述溶液中部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的量的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。
13.用于測定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的溶液中的部分加工的和/或未加工的神經(jīng)毒素A多肽(BoNT/A)的量的試劑盒，其包含如權(quán)利要求1至3的任一項所述的捕獲抗體。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述試劑盒還包含至少一種用于測定包含捕獲抗體和未加工和/或部分加工的BoNT/A多肽的復(fù)合物的量的檢測劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及在神經(jīng)毒素生產(chǎn)過程中用于質(zhì)量控制和安全性的工具。特別是涉及用于確定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A的溶液中的部分加工的和/或未加工的肉毒梭菌神經(jīng)毒素A多肽(BoNT/A)的量的方法，包括步驟在允許所述抗體與所述部分加工和未加工的BoNT/A結(jié)合的條件下，將所述溶液的樣品與特異性結(jié)合部分加工和未加工的BoNT/A的捕獲抗體接觸，從而形成復(fù)合物，并確定形成的復(fù)合物的量，而復(fù)合物的量指示所述溶液中的部分加工和/或未加工的BoNT/A的量。此外，本發(fā)明考慮了用于執(zhí)行所述方法的裝置和試劑盒。
文檔編號G01N33/50GK102597769SQ201080047556
公開日2012年7月18日 申請日期2010年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日
發(fā)明者C·布林, H·V·泰勒, K-H·艾澤勒 申請人:莫茨制藥有限及兩合公司