專利名稱：抗癌劑感受性的判定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于判定作為對象的患者的癌對于欲使用的抗癌劑是否具有治療反應性的抗癌劑感受性判定標記及其應用。
背景技術：
抗癌劑，有烷基化劑、鉬制劑、代謝拮抗劑、抗癌性抗生素、抗癌性植物生物堿等種類。這些抗癌劑中，根據癌的種類不同，有時顯示效果，有時不顯示效果。但是，已知即使是認為有效的種類的癌，也因各個患者而異有時顯示效果，有時不顯示效果。這種抗癌劑對于各個患者的癌是否顯示效果稱為抗癌劑感受性。奧沙利鉬(SP-4-2)_[(lR，2R)-環(huán)己烷_1，2_ 二胺-κ N，κ N，][乙二酸絡(2-)-κ O1, κ O2]怕((SP-4-2)-[(lR，2R)-cyclohexane-l，2-diamine-K N， κ N，][ethanedioato(2-)-K O1, κ O2]platinum, IUPAC)是第3代鉬配位化合物類抗惡性腫瘤藥。據認為，其作用機理與先前的藥劑順鉬(⑶DP)和卡鉬(CBDCA)同樣，通過與DNA堿基形成交聯(lián)而導致DNA合成抑制、蛋白合成抑制，但奧沙利鉬(L-OHP)即使對于CDDP和CBDCA無效的大腸癌而言也表現(xiàn)出抗腫瘤效果，表現(xiàn)出和以往的鉬配位化合物類抗惡性腫瘤藥不同的抗腫瘤譜。美國已經在2004年1月承認其與氟尿嘧啶(5-FU)/左亞葉酸鹽(LV)的并用作為轉移性結腸-直腸癌的第一線治療，在日本，在2005年4月在國民健康保險的藥價中也收載了對于“不能切除治愈的晚期、復發(fā)的結腸-直腸癌”，其與左亞葉酸鹽和氟尿嘧啶的靜脈內持續(xù)給藥法的并用(F0LF0X4法)。對于晚期復發(fā)大腸癌的治療而言，在二十世紀90年代前半葉之前一直采用的5-FU/LV療法的生存率是10 12個月，與此相對，加入了奧沙利鉬的FOLFOX療法的生存期為19. 5個月，達到幾乎2倍。并且，在2009年8月，相同的通過與左亞葉酸鹽和氟尿嘧啶的靜脈內持續(xù)給藥法的并用所進行的“結腸癌中的術后輔助化學療法”追加了效能、效果，是能夠在大腸癌患者中擴大使用并能夠期待有益性的藥劑。但是，盡管如此，F(xiàn)OLFOX療法對于晚期復發(fā)的大腸癌發(fā)揮的效率也僅為50%左右，換言之，意味著接受治療的患者中有半數得不到效果。另外，因奧沙利鉬的使用而導致中性粒細胞減少癥，此外呈現(xiàn)高頻率的末梢神經損傷，盡管這些并不是致死的副作用，但都是導致難以繼續(xù)治療的因素。因此，在治療開始前，利用能夠預測可以期待效果的患者(反應)和不能期待效果的患者(無反應)而早期診斷治療反應性的生物標記，就能夠實現(xiàn)有效性和安全性高的化學療法。關于對鉬類藥物的化學療法的感受性/耐性因子的報告有很多，但是這些多是以順鉬為對象的，對于結構、功能上相關聯(lián)的奧沙利鉬的治療反應性，認為主要與下述1) 3)等相關，作為在以大腸癌患者為對象的奧沙利鉬+5-FU并用療法中的治療反應性和預后預測因素，正在進行與1) 3)相關的研究。1)奧沙利鉬引起損傷的DNA的切除、修復能力的增強、2)在細胞內的奧沙利鉬(活性體)的失活(解毒)、3)奧沙利鉬的細胞內積蓄量的降低。
關于1)，對于在核苷酸切除修復(nucleotide excision r印air :NER)中發(fā)揮重要作用的切除修復交叉互補基因1 (Excision repair cross-complementing group 1,ERCC1)而言，有報告腫瘤內ERCCl的基因表達量是預后因素(非專利文獻1)，對于作為ERCCl的單核苷酸多態(tài)性(SNP)之一的C118T而言，有報告具有C/C純合子的患者比具有至少1個以上的T等位基因的患者具有良好的生存率(非專利文獻幻。有報告在著色性干皮病基因 D (xeroderma pigmentosum D，XPD，也作為 ERCC2 已知)中，伴有 Lys751Gln 的氨基酸突變的遺傳多態(tài)性與腫瘤縮小率和生存期相關(非專利文獻2、；3)。有報告報告了 X射線修復交叉互補基因 1 (X-ray repair cross-complementing group 1，XRCC 1)的伴有Arg399Gln的氨基酸突變的遺傳多態(tài)性與腫瘤縮小效果的關系，其中，該X射線修復交叉互補基因1編碼據認為在堿基切除修復(base excision repair :BER)中與有效修復因暴露于烷基化劑等形成的DNA單鏈切斷的蛋白質相關(非專利文獻4)，但是有報告，根據以同一個患者為對象的后續(xù)分析，其對臨床預后沒有影響(非專利文獻幻。盡管據認為DNA錯配修復(DNA mismatch repair 匪R)也參與對順鉬的感受性下降，但是有報告，在體外(invitro)的研究中，MMR不參與由奧沙利鉬導致的DNA損傷部位的修復(非專利文獻5)。關于2、，谷胱苷肽硫轉移酶(Glutathione-S-transferase，GST)是承擔解毒、代謝的第II相反應的酶之一，通過催化DNA鉬加成物與谷胱苷肽形成抱合體而將藥劑失活。有報告在GST亞型中，GSTPl在大腸癌中的表達量增高，伴隨I lel05Val的氨基酸突變的遺傳多態(tài)性與生存期相關(生存期中間值I le/I Ie為7. 9個月、I le/Val為13. 3個月、Val/Val為Μ. 9個月)(非專利文獻6)。關于3)，有報告在使用培養(yǎng)細胞進行的研究中，有機陽離子轉運體(OCTs)與奧沙利鉬向細胞內輸送和感受性相關(非專利文獻7)，此外，也有報告ΑΤΡ7Α、ΑΤΡ7Β等與銅或重金屬的輸送相關的轉運蛋白與感受性的相關(非專利文獻8、9)。但是，關于它們的表達與奧沙利鉬治療反應性的關聯(lián)，尚未進行臨床研究。在以接受了 F0LF0X療法的晚期大腸癌患者為對象的最近的臨床研究中，報告了ERCCl的遺傳多態(tài)性(Asnll8Asn)和XPD的遺傳多態(tài)性(Lys751Gln)獨立地與無進展生存期(ΡΕ)相關，但對于GSTPl (Ilel05Val)而言，沒有發(fā)現(xiàn)與PFS的關聯(lián)，而確認與奧沙利鉬誘發(fā)神經毒性關聯(lián)的傾向(非專利文獻10)。在體外(in vitro)研究中，關于鉬配位化合物類的先前藥劑順鉬的耐性相關因素有大量報告，關于奧沙利鉬，也報告了與FAS/FASL、Bcl-xL等凋亡相關因素的關聯(lián)(非專利文獻11、12)。但是，除了奧沙利鉬因癌種類而異而表現(xiàn)出與順鉬不同的治療反應性以外，癌細胞對于擔負奧沙利鉬的細胞損傷活性的鉬DNA加成物的細胞應答幾乎尚未闡明，能夠預測對于使用奧沙利鉬的化學療法的治療反應性的明確的生物標記尚未確立。氟尿嘧啶，是1957年開發(fā)的氟化嘧啶類抗癌劑，現(xiàn)在為消化器官癌化學療法的基本藥劑。進入癌細胞的氟尿嘧啶通過下述作用機理發(fā)揮殺細胞效果，即，主要通過活性代謝物一磷酸氟代脫氧尿苷(fluorodeoxyuridine-5’ -monophosphate, FdUMP)引起胸苷酸合酶(thymidylate synthase, TS)抑制，從而引起DNA合成抑制，此外，通過作為相同的活性代謝物的5-氟尿苷三磷酸(5-fluorouridine triphosphate, FUTP)引起RNA功能抑制等。對于氟化嘧啶類抗癌劑的治療反應性的預測，至今為止進行了很多研究，特別是對作為氟尿嘧啶的分解酶的雙氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidine dehydrogenase,DPD)和作為活性代謝物的標的酶胸苷酸合酶(thymidylate synthase,TS)的報告很多。有報告在氟尿嘧啶異化代謝的限速酶DPD高表達的腫瘤中表現(xiàn)為氟尿嘧啶耐性(非專利文獻13)，但是使用臨床檢測體的驗證報告并不多。對于TS表達而言，有報告指出不論采用酶活性、蛋白質水平還是RNA水平等的測定方法，其多寡均為氟化嘧啶類抗癌劑的治療效果決定因子(非專利文獻14、15)。但是，這些所有的報告中，沒有得到必然一致的結果，并且不知道在治療早期預測對氟尿嘧啶的治療反應性的明確的生物標記。此外，也有報告，在氟尿嘧啶耐性的轉移性大腸癌患者中，腫瘤內ERCCl和TS的mRNA表達量是5-FU/L-0HP并用療法的治療反應性預測因子(非專利文獻16)。但是最近，在以晚期大腸癌患者為對象的化學療法的治療反應性生物標記相關的大規(guī)模臨床試驗(F0⑶S Trial)的報告中，ERCCl不是5-FU/L-0HP并用療法的有意義的效果預測因子，只有I型拓撲異構酶(Topoisomerase-1，Topol)顯示了弱的關聯(lián)性(非專利文獻17)。這表示尚未確立能夠可靠發(fā)現(xiàn)可以期待由5-FU/L-0HP并用療法帶來高治療效果的患者的生物標記。并且，通常，癌化學療法的治療療程是長期進行的，在治療過程中，對抗癌劑感受性的經時監(jiān)控能夠判斷是否繼續(xù)治療，不僅從患者負擔和降低副作用方面出發(fā)，而且從醫(yī)療經濟的觀點出發(fā)也是有用的。為了實現(xiàn)預測各個患者的治療反應性并早期診斷，選擇適宜的藥劑和治療方法進行“個別化治療”，確立能夠進行5-FU、L-OHP和5-FU/L-0HP并用時的效果預測或治療反應性的早期診斷的生物標記是當務之急?，F(xiàn)有技術文獻非專利文獻非專利文獻1 J. Clin. Oncol. 19，4298-4304(2001)非專利文獻2 :Br. J. Cancer 91,344-354(2004)非專利文獻3 :Cancer Res 61，8654-8658 (2001)非專利文獻4 Anticancer Res. 21,3075-3079(2001)非專利文獻5 =Cancer Res. 56，4881-4886 (1996)非專利文獻6 :J. Natl. Cancer Inst. 94，936-942 (2002)非專利文獻7 =Cancer Res. 66，8847-8857 (2006)非專利文獻8 :Mol. Pharmacol. 66，25-32 (2004)非專利文獻9 :Clin. Cancer Res. 10，4661-4669 (2004)非專利文獻10 :J. Clin. Oncol. 25，1247-1254(2007)非專利文獻11 :Clin. Cancer Res. 11,4770-4774(2005)非專利文獻12 J. Biol. Chem. 279,46113-46121(2004)非專利文獻 13 =European Journal of Cancer 2004 ；40 :939-950.非專利文獻 14 =Cancer Treatment Reviews 2002 ；28 :27-47非專利文獻15 :J Clin Oncol 2004 ；22 :529-536非專利文獻16 :J Clin Oncol 2001 ；19 :4298-4304非專利文獻17 J Clin Oncol 2008 ；26 :2690-2698.

發(fā)明內容
發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠判別各個患者的治療反應性的抗癌劑感受性判定標記和利用其的新的癌癥治療方法。用于解決課題的方法為此，本發(fā)明的發(fā)明人培養(yǎng)人癌細胞株，使用表面增強激光解析電離飛行時間型質量分析儀(SELDI-TOF MS)對藥劑暴露后的細胞內蛋白質的經時表達變化進行網羅式分析，由此，進行抗癌劑感受性判定標記的探索。對于對5-FU、L-0HP、和兩者并用(5-FU/L-0HP)表現(xiàn)出高感受性、低感受性的2種人大腸癌細胞，暴露于5-FU單劑、L-OHP單劑、5-FU/L-0HP并用，研究藥劑暴露后的細胞內蛋白質的經時表達變化。其結果，在5-FU暴露后，發(fā)現(xiàn)在高感受性細胞中細胞內觀察到表達水平上升的峰，該峰發(fā)現(xiàn)是在質量分析儀中，本體或其片段是作為m/z 5300 MOO的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 6130 6230的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 7000 7080的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 7840 7920的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 17100 17270的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z18290 18470的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 24660 M750的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z35980 36四0的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 9100 9200的峰被檢測出的蛋白質、鈣結合蛋白質S100A10。同樣，在L-OHP暴露后，發(fā)現(xiàn)在高感受性細胞和低感受性細胞中觀察到細胞內表達水平的不同的經時變化的峰，該峰發(fā)現(xiàn)是在質量分析儀中，本體或其片段是作為m/z5300 MOO的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 6130 6230的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 7000 7080的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 7840 7920的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 12440 12560的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 17100 17270的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 18290 18470的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 24660 24750的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z35980 36290的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 9100 9200的峰被檢測出的蛋白質。在5-FU/L-0HP并用暴露后，發(fā)現(xiàn)在高感受性細胞和低感受性細胞中觀察到細胞內表達水平的不同的經時變化的峰，該峰發(fā)現(xiàn)是在質量分析儀中，本體或其片段是作為m/ζ 5300 MOO的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 6130 6230的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 7000 7080的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 7840 7920的峰被檢測出的蛋白質、m/z 8920 9000的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 1M40 12560的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 17100 17270的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 18290 18470的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 24660 M750的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 35980 36290的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 9100 9200的峰被檢測出的蛋白質、鈣結合蛋白質 S100A10。此外，在高感受性細胞和低感受性細胞中，發(fā)現(xiàn)藥劑暴露前的細胞內表達水平不同的峰，該峰發(fā)現(xiàn)是在質量分析儀中，本體或其片段是作為m/z 6130 6230的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 17100 17270的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 8650 8750的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 11760 11890的峰被檢測出的蛋白質。基于上述發(fā)現(xiàn)進一步進行研究，結果發(fā)現(xiàn)如果測定來自癌癥患者機體的試樣中的該蛋白質的濃度，就能夠判定該癌癥患者的癌相對于5-FU、L-0HP、或者5-FU/L-0HP的并用療法是否具有感受性，此外，如果以這些物質的表達改變?yōu)橹笜耍湍軌蜻M行抗癌劑感受性增強劑的篩選，而且，如果并用該抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑，就能夠大幅提高該抗癌劑的治療效果，由此完成本發(fā)明。即，本發(fā)明提供一種抗癌劑感受性判定標記，其包含選自在質量分析儀中，本體或其片段是作為m/z 5300 MOO的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質A)、作為m/z6130 6230的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質B)、作為m/z 7000 7080的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質C)、作為m/z 7840 7920的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質D)、m/z 8920 9000的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質Ε)、作為m/ζ 12440 12560的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質G)、作為m/z 17100 17270的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質H)、作為m/z 18290 18470的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質I)、作為m/z 24660 M750的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質J)、作為m/z 35980 36四0的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質K)、作為m/z 8650 8750的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質L)、作為m/z 9100 9200的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質M)、和作為m/z 11760 11890的峰被檢測出的蛋白質(以下，稱為蛋白質N)中的蛋白質。此外，本發(fā)明提供一種抗癌劑感受性判定標記，所述抗癌劑包括氟尿嘧啶或其鹽、或氟尿嘧啶或其鹽與奧沙利鉬或其鹽的組合，該癌劑感受性判定標記包含鈣結合蛋白質S100A10(以下，稱為蛋白質F)。此外，本發(fā)明提供一種抗癌劑感受性的判定方法，其特征在于，測定檢測體中的上述蛋白質A N。此外，本發(fā)明提供一種用于實施抗癌劑感受性判定方法的試劑盒，其特征在于，包含用于測定檢測體中的上述蛋白質A N的方案。此外，本發(fā)明提供一種以上述蛋白質A N的表達改變?yōu)橹笜说目拱﹦└惺苄栽鰪妱┑暮Y選方法。此外，本發(fā)明提供一種通過上述篩選方法得到的抗癌劑感受性增強劑。此外，本發(fā)明提供一種含有上述抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑的組合的癌治療用組合物。此外，本發(fā)明提供用于判定抗癌劑感受性的上述蛋白質A N。發(fā)明的效果使用本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記，能夠在治療開始前或治療開始早期適宜判定各個患者的抗癌劑感受性，結果能夠選擇治療效果高的抗癌劑。而且，能夠避免沒有效果的抗癌劑的使用，因此能夠避免不必要的副作用。此外，使用抗癌劑的治療周期長，因此，通過在治療過程中在每個治療療程中判定抗癌劑感受性，就能夠經時地評價該癌對抗癌劑的感受性，能夠判定是否應該繼續(xù)治療。其結果，能夠防止沒有治療效果的抗癌劑的繼續(xù)給藥所帶來的癌的進展、副作用的增大，從而能夠減輕患者的負擔，削減醫(yī)療費用。此外，使用該標記，就能夠篩選增強抗癌劑感受性的藥劑，如果并用作為其對象的抗癌劑和抗癌劑感受性增強劑，就能夠大幅提高癌治療效果。本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記的測定試劑，作為抗癌劑感受性判定試劑是有用的。


圖 1 為表示 HCTl 16 和 DLD-1 中，對 5_FU、L-0HP、5-FU/L_0HP 并用的生存率(％ )的圖。圖2為表示HCT116和DLD-I中，5-FU、L-0HP、5-FU/L_0HP并用暴露后的蛋白質A的細胞內水平的經時變化的圖。圖3為表示HCTl 16和DLD-I中，5_FU、L-OHP、5-FU/L_0HP并用暴露后的蛋白質B的細胞內水平的經時變化的圖。圖4為表示HCTl 16和DLD-1中，5_FU、L-0HP、5-FU/L_0HP并用暴露后的蛋白質C的細胞內水平的經時變化的圖。圖5為表示HCTl 16和DLD-1中，5_FU、L-0HP、5-FU/L_0HP并用暴露后的蛋白質D的細胞內水平的經時變化的圖。圖6為表示HCTl 16和DLD-I中，5-FU/L-0HP并用暴露后的蛋白質E的細胞內水平的經時變化的圖。圖7為表示HCTl 16和DLD-1中，5_FU、L-0HP、5-FU/L_0HP并用暴露后的蛋白質F的細胞內水平的經時變化的圖。圖8為表示HCT116和DLD-1中，L-0HP、5-FU/L_0HP并用暴露后的蛋白質G的細胞內水平的經時變化的圖。圖9為表示HCTl 16和DLD-I中，5_FU、L-OHP、5-FU/L_0HP并用暴露后的蛋白質H的細胞內水平的經時變化的圖。圖10為表示HCT116和DLD-I中，5-FU、L-0HP、5-FU/L_0HP并用暴露后的蛋白質I的細胞內水平的經時變化的圖。圖11為表示HCT116和DLD-I中，5-FU、L-0HP、5-FU/L_0HP并用暴露后的蛋白質J的細胞內水平的經時變化的圖。圖12為表示HCT116和DLD-I中，5-FU、L-0HP、5-FU/L_0HP并用暴露后的蛋白質K的細胞內水平的經時變化的圖。圖13為表示HCTl 16和DLD-I中，使用蛋白質印跡法檢測出S100A10的圖。圖14為表示HCT116和DLD-I中，5-FU、L-0HP、5-FU/L_0HP并用暴露后的蛋白質M的細胞內水平的經時變化的圖。
具體實施例方式本發(fā)明中的抗癌劑感受性判定標記為蛋白質A N，更詳細而言，在表面增強激光解析電離飛行時間型質量分析儀(SELDI-TOF MS)中，使用陽離子交換芯片，在pH4. 5的條件下，分別在質量分析儀中，本體或其片段是作為m/z 5300 MOO的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質A)、本體或其片段是作為m/z 6130 6230的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質B)、本體或其片段是作為m/z 7000 7080的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質C)、本體或其片段是作為m/z 7840 7920的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質D)、本體或其片段是作為m/z8920 9000的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質E)、本體或其片段是作為m/z 11020 11120的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質F)、本體或其片段是作為m/z 12440 12560的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質G)、本體或其片段是作為m/z 17100 17270的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質H)、本體或其片段是作為m/z 18290 18470的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質I)、本體或其片段是作為m/z24660 M750的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質J)、本體或其片段是作為m/z 35980 36四0的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質K)、本體或其片段是作為m/ζ 8650 8750的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質L)、本體或其片段是作為m/z 9100 9200的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質M)、本體或其片段是作為m/z 11760 11890的峰被檢測出的蛋白質(蛋白質N)。如后述的實施例所示，蛋白質F判定為鈣結合蛋白質S100A10。S100A10作為具有鈣結合EF-hand基序的SlOO蛋白質家族的一員已知。由于還已知S100A10自身的二聚體與膜聯(lián)蛋白A2(膜聯(lián)蛋白-2(Annexin-2)、膜聯(lián)蛋白II (Armexin II)、脂皮質蛋S II(Lipocortin II)、依鈣結合蛋白 I 重鏈(Calpactin I heavy Chain)、嗜鉻粒結合蛋白-8(Chromobindin-8)、p36、蛋白 I (Protein I)、胎盤抗凝蛋白類 IV (Placentalanticoagulant protein IV)、PAP-IV)的二聚體形成異四聚體，所以，膜聯(lián)蛋白A2也和S100A10同樣，存在能夠作為抗癌劑感受性的判定標記使用的可能性。蛋白質A C、F、H K，如后述的實施例所示，使用SELDI-TOF MS研究培養(yǎng)癌細胞的細胞內蛋白質的表達，結果，5-FU暴露后，在對5-FU為低感受性的DLD-I中，觀察到細胞內水平的上升。另一方面，在對5-FU高感受性的HCT116中，沒有觀察到明顯的變化。因此，蛋白質A C、F、H K作為抗癌劑感受性判定標記，特別是5-FU的抗癌劑感受性判定標記是有用的。蛋白質D、M，如后述的實施例所示，5-FU暴露后，在對5_FU為高感受性的HCT116中，觀察到細胞內水平的降低。另一方面，在對5-FU低感受性的DLD-I中，沒有觀察到明顯的變化。因此，蛋白質D、M作為抗癌劑感受性判定標記，特別是5-FU的抗癌劑感受性判定標記是有用的。蛋白質A C、G K，如后述的實施例所示，L-OHP暴露后，在對L-OHP低感受性的DLD-I中，觀察到細胞內水平的上升。另一方面，在對L-OHP高感受性的HCT116中，沒有觀察到顯著地變化。因此，蛋白質A C、G K作為抗癌劑感受性判定標記，特別是L-OHP的抗癌劑感受性判定標記是有用的。此外，在本發(fā)明者的在先申請(W02009/96196號國際公開小冊子)中已經闡明，蛋白質F(鈣結合蛋白質S100A10)能夠作為L-OHP的抗癌劑感受性判定標記，本次的實驗也得到同樣的結果。蛋白質D、M，如后述的實施例所示，在L-OHP暴露后，在對L-OHP高感受性的HCTl 16中，觀察到細胞內水平的降低。另一方面，在L-OHP低感受性的DLD-I中，沒有觀察到顯著變化。因此，蛋白質D、M作為抗癌劑感受性判定標記，特別是L-OHP的抗癌劑感受性判定標記是有用的。蛋白質A C、F、H K，如后述的實施例所示，在5-FU/L-0HP并用暴露后，在對5-FU/L-0HP并用低感受性的DLD-I中，觀察到細胞內水平的上升。另一方面，在對5-FU/L-OHP并用高感受性的HCT116中，沒有觀察到顯著變化。因此，蛋白質A C、F、H K作為抗癌劑感受性判定標記，特別是5-FU/L-0HP并用時的抗癌劑感受性判定標記是有用的。如前所述，已知蛋白質F作為L-OHP的抗癌劑感受性判定標記是有用的，但該蛋白質F作為5-FU/L-0HP并用時的抗癌劑感受性標記有用是本發(fā)明首次得到的見解。蛋白質E、G，如后述的實施例所示，在5-FU/L-0HP并用暴露后，在對5-FU/L-0HP高感受性的HCT116中，觀察到細胞內水平的上升。另一方面，在對5-FU/L-0HP并用低感受性的DLD-I中，沒有觀察到顯著的變化。因此，蛋白質E、G作為抗癌劑感受性判定標記，特別是5-FU/L-0HP并用時的抗癌劑感受性判定標記是有用的。蛋白質D、M，如后述的實施例所示，在5-FU/L-0HP并用暴露后，在對5-FU/L-0HP并用高感受性的HCT116中，觀察到細胞內水平的降低。另一方面，在對5-FU/L-0HP并用低感受性的DLD-I中，沒有觀察到顯著的變化。因此，蛋白質D、M作為抗癌劑感受性判定標記，特別是5-FU/L-0HP并用時的抗癌劑感受性判定標記是有用的。蛋白質B、H、L、N，如后述的實施例所示，在對5_FU、L-OHP、5-FU/L_0HP并用均為高感受性的HCT116中，藥劑暴露前(非暴露時)的細胞內水平，與對上述藥劑均為低感受性的DLD-I比較，顯示有意義的高值。因此，蛋白質B、H、L、N作為抗癌劑感受性判定標記，特別是5-FU、L-0HP、5-FU/L-0HP并用時的抗癌劑感受性判定標記是有用的。作為本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記的對象的抗癌劑，沒有特別限定，例如，可以舉出奧沙利鉬、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異磷酰胺(ifosfamide)、噻替哌(thiotepa)、美法侖(melphalan)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴餅(procarbazine)、替莫唑月安(temozolomide)、Jl質 白(cisplatin)、卡 白(carboplatin)、奈達 白(nedaplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氟尿嘧啶(f luorouracil)、替加氟/尿嘧啶(tegaful/uracil)、脫氧氟尿苷(doxif luridine)、替加氟/吉美拉M / # ii M (tegaful/gimeracil/oteracil) > -f^ J^ ftk (capecitabine) > H H Ifi苷(cytarabine)、依諾他濱(enocitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、6_ 巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、氟達拉濱(fuludarabin)、噴司他汀(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、尹圣基月尿(hydroxyurea)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin) >佐柔比星(daunorubicin)、依達比星(idarubicine)、口比柔比星(pirarubicin)、米托惠酉昆(mitoxantrone)、M1 柔比星(amurubicin)、方文線菌素 D (actinomycin D)、f専來霉素(bleomycine)、派來霉素(ρ印leomycin)、絲裂霉素C(mytomycin C)、阿柔比星(aclarubicin)、凈司他丁 (zinostatin)、長春新堿(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春堿(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、紫杉酉享(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、伊立替康(irinotecan)、伊立替康活性代謝物(SN-38)、托泊替 M (nogitecan, topotecan)、{衣 ^ 泊 1^f (etoposide) ^ jM M M (prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、來曲唑(Ietrozole)、利妥昔(rituximab)、伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、達沙替尼(dasatinib)、帕尼單抗(panitumumab)、門冬酰胺酶(asparaginase)、維甲酸(tretinoin)、三氧化二石串(arsenic trioxide)、或它們的鹽、或它們的活性代謝物等。其中，優(yōu)選氟化嘧啶類抗癌劑、鉬配位化合物類抗癌劑，特別優(yōu)選氟尿嘧啶、奧沙利鉬或者它們的鹽。進而，在氟尿嘧啶或其鹽、奧沙利鉬或其鹽的并用劑中能夠適宜地利用。
在使用本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記判定抗癌劑感受性時，測定檢測體中的蛋白質A N即可。在此，作為檢測體，可以列舉來自患有癌的被檢驗者(癌患者)機體的試樣，例如，可以列舉血液、血清、血漿、癌組織活檢樣本、癌摘除手術標本、便、尿、腹水、胸水、腦脊液、痰等，但特別優(yōu)選血清。另外，作為本發(fā)明對象的癌，可以列舉以喉癌為代表的唇、口腔和喉癌、以食道癌、胃癌、結腸-直腸癌等為代表的消化器官癌、以肺癌為代表的呼吸器官和胸腔內臟器官癌、骨及關節(jié)軟骨癌、皮膚的惡性黑色素瘤、鱗狀細胞癌及其它皮膚癌、以間皮瘤為代表的間皮和軟組織癌、以乳腺癌、子宮癌、卵巢癌為代表的女性性器官癌、以前列腺癌為代表的男性性器官癌、以膀胱癌為代表的尿路癌、以腦腫瘤為代表的眼、腦和中樞神經系統(tǒng)癌、甲狀腺和其它內分泌腺癌，以非何杰金氏淋巴瘤和淋巴細胞性白血病為代表的淋巴組織、造血組織和關聯(lián)組織癌、以及以這些癌為原發(fā)病灶的轉移組織的癌等，但特別是能夠對胃癌和結腸-直腸癌適合地利用。檢測體中的蛋白質A N的測定方法，例如能夠通過SELDI-TOF MS、免疫學測定方法等測定。在此，利用SELDI-TOF MS的測定可以采用后述的實施例中記載的方法進行。另外，在免疫學測定法中，優(yōu)選使用抗蛋白質A N的抗體的免疫學測定法。所使用的抗蛋白質A N的抗體既可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。更具體而言，例如，可以列舉放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析、發(fā)光免疫分析、免疫沉降法、免疫比濁法、蛋白質印跡、免疫染色、免疫擴散法等，但優(yōu)選蛋白質印跡或酶免疫分析，特別優(yōu)選蛋白質印跡、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay :ELISA)(例如，夾心醇聯(lián)免疫分析，sandwich ELISA)。對于蛋白質A C、F、H K而言，當作為對象的抗癌劑為5_FU時，判定對抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前和給藥后的來自癌癥患者機體的試樣中的這些蛋白質濃度，當抗癌劑給藥前后蛋白質的濃度上升時，能夠判定該癌癥沒有抗癌劑感受性，當與抗癌劑給藥前相比，在給藥后蛋白質濃度沒有變化或者降低時，能夠判定該癌癥具有抗癌劑感受性。即，蛋白質A C、F、H K的濃度在給藥后早期的階段中，當具有判定為比規(guī)定的標準濃度低的濃度時，能夠判定該癌對于作為對象的抗癌劑具有感受性，因此，能夠作為用于對能夠期待治療效果的患者繼續(xù)積極治療的標記使用。此外，給藥后早期的階段中，當蛋白質A C、F、H K的濃度判斷為比規(guī)定的標準濃度高時，能夠判定該癌對于作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對于作為對象的抗癌劑沒有感受性時，當對于作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待其藥效，在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續(xù)給藥時，存在癌的進展、副作用增大的危險。這樣，本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應性，還能夠作為用于避免不能期待藥效的抗癌劑的繼續(xù)給藥所引起的癌的進展和副作用增大的標記使用。對于蛋白質A C、G K而言，當作為對象的抗癌劑為L-OHP時，此外，對于蛋白質A C、F、H K而言，當作為對象的抗癌劑為5-FU/L-0HP并用時，能夠與上述同樣判定對于抗癌劑的感受性。對于蛋白質D、M而言，當作為對象的抗癌劑為5-FU時，在判定對于抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前和給藥后的來自癌癥患者機體的試樣中的這些蛋白質濃度，當抗癌劑給藥前后蛋白質的濃度降低時，能夠判定該癌癥具有抗癌劑感受性，當與抗癌劑給藥前相比，給藥后蛋白質濃度沒有變化或者上升時，能夠判定該癌癥沒有抗癌劑感受性。艮口，蛋白質D、M的濃度在給藥后早期的階段中，當判定為比規(guī)定的標準濃度低時，能夠判定該癌對于作為對象的抗癌劑具有感受性，因此，能夠作為用于對能夠期待治療效果的患者繼續(xù)積極治療的標記使用。此外，給藥后早期的階段中，當蛋白質D、M的濃度判斷為比規(guī)定的標準濃度高時，能夠判定該癌對于作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對于作為對象的抗癌劑沒有感受性時，當對于作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待其藥效，在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續(xù)給藥時，存在癌的進展、副作用增大的危險。這樣，本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應性，還能夠作為用于避免不能期待藥效的抗癌劑的繼續(xù)給藥所引起的癌的進展和副作用增大的標記使用。對于蛋白質D、M而言，當作為對象的抗癌劑為L-OHP時，此外，當作為對象的抗癌劑為5-FU/L-0HP并用時，能夠與上述同樣判定對于抗癌劑的感受性。對于蛋白質E、G而言，當作為對象的抗癌劑為5-FU/L-0HP時，判定對抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前和給藥后的來自癌癥患者機體的試樣中的這些蛋白質濃度，當抗癌劑給藥前后蛋白質的濃度上升時，能夠判定該癌癥具有抗癌劑感受性，當與抗癌劑給藥前相比，在給藥后蛋白質濃度沒有變化或者降低時，能夠判定該癌癥沒有抗癌劑感受性。即，蛋白質E、G的濃度在給藥后早期的階段中，當判定為比規(guī)定的標準濃度高時，能夠判定該癌對于作為對象的抗癌劑具有感受性，因此，能夠作為用于對能夠期待治療效果的患者繼續(xù)積極治療的標記使用。此外，給藥后早期的階段中，當蛋白質E、G的濃度判斷為比規(guī)定的標準濃度低時，能夠判定該癌對于作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對于作為對象的抗癌劑沒有感受性時，當對于作為對象的抗癌劑沒有感受性時，不能期待其藥效，在將這種不能期待藥效的抗癌劑繼續(xù)給藥時，存在癌的進展、副作用增大的危險。這樣，本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記不僅能夠判定抗癌劑治療反應性，還能夠作為用于避免不能期待藥效的抗癌劑的繼續(xù)給藥所引起的癌的進展和副作用增大的標記使用。對于蛋白質B、H、L、N而言，當作為對象的抗癌劑為5_FU、L-OHP、5-FU/L_0HP并用時，判定對抗癌劑的感受性時，測定抗癌劑給藥前來自癌癥患者機體的試樣中的這些蛋白質濃度，當這些蛋白質的濃度判斷為比規(guī)定的標準濃度低時，能夠判定該癌對于作為對象的抗癌劑沒有感受性。當對于作為對象的抗癌劑沒有感受性時，認為不能期待其藥效，而只能表現(xiàn)出抗癌劑的副作用，因此，本發(fā)明的抗癌劑感受性判定標記也能夠作為用于避免表現(xiàn)出不必要的副作用或者無效治療繼續(xù)進行所引起的癌的進展和副作用增大的標記使用。此外，當這些蛋白質的濃度判斷為比規(guī)定的標準濃度高時，能夠判定該癌對于作為對象的抗癌劑具有感受性，因此，能夠作為用于將能夠期待治療效果的患者積極選出的標記使用O其中，對于蛋白質B、H而言，作為抗癌劑給藥中的標記，當與抗癌劑給藥前相比，給藥后的蛋白質濃度沒有變化或者降低時，能夠判定該癌具有抗癌劑感受性，作為抗癌劑給藥前的標記，當判定為比規(guī)定的標準濃度低時，能夠判定該癌沒有抗癌劑感受性。由于在抗癌劑的給藥中或者抗癌劑給藥前，作為標記所發(fā)揮的作用不同，因此優(yōu)選留意這一點進行使用。在實施本發(fā)明的抗癌劑感受性的判定方法時，優(yōu)選使用含有用于測定檢測體中的蛋白質A N的方案的試劑盒。該試劑盒中，包含蛋白質A N的測定試劑、測定試劑的使用方法、以及用于判定抗癌劑感受性有無的基準等。該基準包括蛋白質A N的標準濃度、判定為高的濃度、判斷為低的濃度、對測定結果產生影響的主要原因和其影響程度等，這些濃度能夠針對每個作為對象的抗癌劑進行設定。使用該基準，能夠如前所述進行判定。對于蛋白質A D、F、H K、M而言，如果以這些蛋白質的表達改變，具體而言以表達抑制為指標，就能夠篩選抗癌劑感受性增強劑。即，在體外(in vitro)或體內(in vivo),抑制蛋白質A D、F、H K、M表達的物質，增強抗癌劑感受性。例如，在體外(in vitro),各種癌細胞株中，在抗癌劑的存在下使蛋白質的濃度降低的物質，是增強該抗癌劑感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。此外，在體內(in vivo)，在荷癌癥動物中，在抗癌劑給藥前后，使蛋白質的濃度降低增強的物質，是增強該抗癌劑的感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。對于蛋白質A D、G K、M而言，當作為對象的抗癌劑為L-OHP時，或者，對于蛋白質A D、F、H K、M而言，當作為對象的抗癌劑為5-FU/L-0HP并用時，也能夠與上述同樣進行抗癌劑感受性增強劑的篩選。對于蛋白質E、G而言，當作為對象的抗癌劑為5-FU/L-0HP并用時，如果以這些蛋白質的表達改變，具體而言以表達上升為指標，就能夠篩選抗癌劑感受性增強劑。即，在體外(in vitro)或體內(in vivo)，使蛋白質E、G的表達上升的物質，增強抗癌劑感受性。例如，在體外(in vitro)，各種癌細胞株中，在抗癌劑的存在下使蛋白質的濃度上升的物質，是增強該抗癌劑感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。此外，在體內(in vivo)，在荷癌癥動物中，在抗癌劑給藥前后，使蛋白質的濃度上升增強的物質，是增強該抗癌劑的感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。對于蛋白質B、H、L、N而言，當作為對象的抗癌劑為5_FU、L-OHP、5-FU/L_0HP并用時，如果以這些蛋白質的表達改變，具體而言以表達上升為指標，就能夠篩選抗癌劑感受性增強劑。即，在體外(in vitro)或體內(in vivo)，使蛋白質的表達上升的物質，增強抗癌劑感受性。例如，在體外(in vitro)，各種癌細胞株中，在抗癌劑不存在下使蛋白質的濃度上升的物質，是增強該抗癌劑感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。此外，在體內(invivo)，在荷癌癥動物中，在抗癌劑給藥前，使蛋白質的濃度上升增強的物質，是增強該抗癌劑的感受性的物質(抗癌劑感受性增強劑)。如果并用這樣得到的抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑，就能夠大幅提升該抗癌劑的治療效果。作為組合抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑的方式，可以是包含這些成分兩者的一種組合物，也可以是各自分別的制劑的組合。此外，也可以將這些成分分別以各自的給藥方式給藥。作為在此使用的作為對象的抗癌劑，與前述同樣，例如，可以舉出奧沙利鉬、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異磷酰胺(ifosfamide)、噻替哌(thiot印a)、美法侖(melphalan)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴胼(procarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、順鉬(cisplatin)、卡 白(carboplatin)、奈達 白(nedaplatin)、甲氛蝶吟(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、替加氟 / 尿嘧啶(tegaful/uracil)、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、替加氟/吉美拉西/奧替拉西(tegaful/gimeracil/oteracil)、卡培他濱(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、依諾他濱(enocitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、6_ 巰基口票呤(6_mercaptopurine)、氟達拉濱(fuludarabin)、噴司他汀(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、羥基脲(hydroxyurea)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、佐柔比星(daunorubicin)、依達比M (idarubicine)、 口比柔比星(pirarubicin)、米托惠酉昆(mitoxantrone)、M1 柔比星(amurubicin)、方文線菌素 D (actinomycin D)、博來霉素(bleomycine)、派來霉素(ρ印leomycin)、絲裂霉素 C(mytomycin C)、阿柔比星(aclarubicin)、凈司他丁(zinostatin)、長春新堿(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春堿(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、伊立替康(irinotecan)、伊立替康活性代謝物(SN-38)、托泊替康(nogitecan，topotecan)、依托泊苷(etoposide)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、甲輕孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、來曲唑(Ietrozole)、禾丨J妥昔(rituximab)、伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、達沙替尼(dasatinib)、帕尼單抗(panitumumab)、門冬酰胺酶(asparaginase)、維甲酸(tretinoin)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、或它們的鹽、或它們的活性代謝物等。其中，優(yōu)選氟化嘧啶類抗癌劑、鉬配位化合物類抗癌劑，特別優(yōu)選氟尿嘧啶、奧沙利鉬或者它們的鹽。進而，在氟尿嘧啶或其鹽、奧沙利鉬或其鹽的并用劑中能夠適宜地利用。實施例接著，舉出實施例，更詳細的說明本發(fā)明。實施例1(1)方法(a)使用細胞2種人大腸癌細胞株(HCT-116、DLD-1)從ECACC獲得。培養(yǎng)在以下條件下進行，即，OlOOmm/Tissue Culture Dish (IWAKI)，培養(yǎng)基(D-MEM, 2mM Glutamine, 10 % FetalBovine Serum), 37°C, 5% C02。(b)藥劑氟尿嘧啶(5-FU)從Sigma公司購入，奧沙利鉬(L-OHP)散裝粉末從株式會社益力多本社獲得。(C) 5-FU、L-OHP 以及 5-FU 和 L-0HP 并用(5-FU/L-0HP)時的感受性評價使用2 種大腸癌細胞株 HCT116、DLD-1，通過 MTS assay (CellTiter96 AQueous0neSolution Cell Proliferation Assay, Promega)評價在藥劑暴露M小時后和48小時后的細胞生存率。藥劑暴露條件為，作為5-FU單劑，使用對照(Control) (O μ Μ)、0· 001 μ Μ、0·01μΜ、0· 1μΜ、1μΜ、3μΜ、10μΜ、30μΜ、100μΜ、1000μΜ、10000μΜ 這 11 個條件；作為L-OHP 單劑，使用對照(Control) (O μ Μ)、0· 001 μ Μ、0· 01 μ Μ、0· 1 μ Μ、0· 3 μ Μ、1 μ Μ、3 μ Μ、10μΜ、30μΜ、100μΜ、1000μΜ這11個條件。作為并用，使用分別向5-FU的2μΜ、10μΜ、30μΜ、100μΜ 這 4 個濃度，力卩 Λ L-OHP 的 0. 01 μΜ、0· 1 μ Μ、0· 3 μ Μ、1 μ Μ、3 μ Μ、10 μ Μ、30 μ Μ、100 μ MU000 μ M的9個濃度的36個條件，以及與各并用條件相同濃度的5-FU單劑4個條件和對照(Control) (0 μ Μ)。在感受性評價中，在1次試驗中，對各個細胞株、藥劑暴露時間、藥劑暴露條件，每次進行3個樣品的測定，用不同培養(yǎng)代數的細胞實施3次。以根據MTS assay的結果計算出的生存率為基礎進行分析。在判定有無并用效果時，比較并用時的生存率(viability)和與并用時使用的相同濃度的各藥劑在單劑暴露時的生存率，如果與雙方相比生存率有意義地下降，則判定具有并用效果。(d)藥劑暴露實驗基于上述(c)的結果，在暴露實驗中使用的藥劑濃度，作為5-FU+L-0HP的并用，為2 μ Μ+1 μ Μ、2 μ Μ+10 μ Μ、100 μ Μ+1 μ Μ、100 μ Μ+10 μ M這4種，作為與這些并用暴露時使用的相同濃度的各藥劑單獨暴露，5-FU為2μΜ、100μΜ，L-OHP為1 μ Μ、10 μ Μ，加上這些中沒有藥劑的對照(Control)全部9個條件，進行暴露實驗。藥劑暴露時間為暴露前(0小時)、4小時、12小時、24小時、48小時5種，在暴露結束的時刻計測細胞數，提取細胞內蛋白質。(e)細胞內蛋白質的提取從培養(yǎng)皿(dish)除去培養(yǎng)基，用冰冷的PBS中清洗3次，之后，以橡膠刮子剝離收集，將細胞懸液移到1. 5mL的微量離心管中。在4°C以1200 X g離心10分鐘，收集細胞，除去上清液之后，每1000萬個細胞數加入200 μ L的細胞溶解緩沖液(9mol/L Urea, 2% CHAPS,ImMDTT，蛋白酶抑制劑(Sigma))，在冰冷下進行超聲波破碎處理，之后，在4°C以16000Xg離心分離20分鐘，在液氮中急速凍結上清液，在分析前保存在_80°C。使用上清液的一部分進行蛋白質定量(DC Protein Assay Kit，Bio-Rad)。(f)用于蛋白質表達分析的樣品制備和蛋白質芯片的制作、細胞內蛋白質的表達分析用細胞溶解緩沖液(除去蛋白酶抑制劑)制備為2.5mg/mL，接著，以pH4.5的稀釋/清洗緩沖液(50mM sodium acetate buffer)(以下，稱為緩沖液)制備為0. 5mg/mL，將該樣品100 μ L供給以同樣的緩沖液進行過前處理的陽離子交換芯片陣列(CM10，Bio-Rad)的點，孵育1小時進行反應后，以緩沖液清洗3次，以milliQ水沖洗2次。風干后，將LOyL能量吸收分子(energy absorbing molecule，EAM :50 % ACN/0. 5 % TFA 溶液的芥子酸(sinapinic acid)飽和溶液)以每次0. 5 μ L分2次供給到各點，點表面干燥后，進行蛋白質芯片陣列的分析。蛋白質表達分析通過表面增強激光解析電離飛行時間型質量分析儀(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry :SELDI-T0F MS)進行。作為分析儀器，使用 ProteinChip Reader (ModelPCS4000 Personal Edition, Bio-Rad), ^t Mass Range 0 70000 Daltons> FocusMass 8000 Dalton、Energy 3000或4000nJ、每一個樣品合計洸5shots的條件下進行分析。Signal-to-noise ratio (S/N比)2以上的峰的提取和蛋白質表達比較分析使用CiphergenExpress Data Manager 3. 0 。(g)候補峰的選擇通過SELDI-T0F MS分析的結果，在S/N比2以上的條件下各樣品提取88 143個蛋白質峰。首先，通過CiphergenExpress Data Manager 3. 0做成峰簇。接著，挑選在各條
16件下，藥劑暴露后隨著時間而峰強度有意義地變化的峰、和各暴露時間(4、12、24、48小時)下隨著藥劑暴露條件而峰強度有意義地變化的峰。找出兩者都可檢測出的峰，即，確認了既隨著暴露時間而表達變化也隨著藥劑條件而表達變化的峰。(2)結果(a) HCT-116和DLD-1的藥劑感受性的評價以ΙΟΟμΜ的5-FU暴露48小時后的細胞生存率，HCTl 16為約M%，DLD-I為約49 %，確認DLD-I與HCTl 16相比為5-FU低感受性。以1 μ M的L-OHP暴露48小時后的細胞生存率，HCT116為約37 %，DLD-1為約82 %，確認DLD-1與HCT116相比為L-OHP低感受性。對于 5-FU/L-0HP 并用而言，5-FU 2 μ M+L-0HP 1 μ M 暴露 24 小時后，以及 5-FU100 μ M+L-0HP10 μ M暴露48小時后，在HCT116中，與各個單劑暴露后的細胞生存率相比，在并用時顯示為有意義的低細胞生存率，確認了并用效果，但在DLD-I中沒有確認有意義的并用效果。因此，確認HCT116對于5-FU/L-0HP并用為高感受性細胞，DLD-I為低感受性細胞(圖1)(b)蛋白質表達分析通過使用SELDI-TOF MS的蛋白質組分析方法，網羅式分析5_FU暴露、或者L-OHP暴露、或者5-FU/L-0HP并用暴露所伴隨的細胞內蛋白質的變動。利用(1)方法所示的方法進行分析，結果發(fā)現(xiàn)各藥劑暴露后顯示特征變動的以下蛋白質。(5-FU)對5-FU暴露后的細胞內蛋白質的經時變化進行分析的結果，(1)5_FU暴露后的細胞內水平，只在DLD-I中上升，或者與HCT116比較，在DLD-I中觀察到更大上升的峰(圖2、圖3、圖4(甲)、圖7(甲)、圖9、圖10、圖11(甲)、圖12) m/'τ5300 '5400(蛋白質Α)
m/7Z6130 '6230(蛋白質B)
m/7Z7000 -7080(蛋白質C)
m/7Z11020 ‘ 11120(蛋白質F)
m/7Z17100 ‘ 17270(蛋白質H)
m/7Z18290 ‘ 18470(蛋白質I)
m/7Z24660 ‘ M750(蛋白質J)
m/7Z35980 ‘ 36四0(蛋白質K)Q)5-FU暴露后，在HCT116觀察到細胞內水平降低的峰(圖5(丙)、圖14)· m/z 7840 7920(蛋白質 D)· m/z 9100 9200(蛋白質 M)(L-OHP)對L-OHP暴露后的細胞內蛋白質的經時變化進行分析的結果，(I)L-OHP暴露后的細胞內水平，只在DLD-I中上升，或者與HCT116比較，在DLD-I中觀察到更大上升的峰(圖2、圖3、圖4(乙)、圖7(乙)、圖8(甲)、圖9、圖10、圖11(丙)、圖12)· m/z 5300 MOO (蛋白質 A)· m/z 6130 6230(蛋白質 B)· m/z 7000 7080(蛋白質 C)· m/z 11020 11120(蛋白質 F)
m/z 12440 12560 (蛋白質 G) m/z 17100 17270 (蛋白質 H) m/z 18290 18470 (蛋白質 I) m/z 24660 24750 (蛋白質 J) m/z 35980 36290 (蛋白質 K)(2)L-0HP暴露后，在HCT116中觀察到細胞內水平降低的峰(圖5(甲)、圖14) m/z 7840 7920 (蛋白質 D) m/z 9100 9200 (蛋白質 M)(5-FU/L-0HP)對5-FU/L-0HP并用暴露后的細胞內蛋白質的經時變化進行分析的結果，(1)5-FU/L-0HP暴露后的細胞內水平，只在DLD-1中上升，或者與HCT116比較，在 DLD-1中觀察到更大上升的峰(圖2、圖3、圖4(丙)、圖7(丙)、圖9、圖10、圖11(乙)、圖 12)。
m/z 5300 5400 (蛋白質 A) m/z 6130 6230 (蛋白質 B) m/z 7000 7080 (蛋白質 C) m/z 11020 11120(蛋白質 F) m/z 17100 17270 (蛋白質 H) m/z 18290 18470 (蛋白質 I) m/z 24660 24750 (蛋白質 J) m/z 35980 36290 (蛋白質 K)(2)5-FU/L-0HP并用暴露后，在HCT116中觀察到細胞內水平上升的峰(圖6、圖 8(乙)) m/z 8920 9000 (蛋白質 E) m/z 12440 12560 (蛋白質 G)(3)5-FU/L_0HP并用暴露后，在HCT116中觀察到細胞內水平降低的峰(圖5(乙)、 圖14) m/z 7840 7920 (蛋白質 D) m/z 9100 9200 (蛋白質 M)(藥劑暴露前的細胞內水平)藥劑暴露前(非暴露時)的細胞內水平，與DLD-1比較，在HCT116中顯示有意義 的高值的峰 m/z 6130 6230 (蛋白質 B) m/z 8650 8750 (蛋白質 L) m/z 11760 11890 (蛋白質 N) m/z 17100 17270 (蛋白質 H)蛋白質B中的藥劑暴露前的細胞內水平，作為通過SELDI-T0FMS分析得到的峰強 度(yA)(平均值 土S. D.，n = 27)，在 HCT116 中為 55. 4±9. 2，在 DLD-1 中為 28. 9±6. 4， 同樣，蛋白質L在HCT116中為88. 2±2. 2，在DLD-1中為32. 1±1. 3，蛋白質N在HCT116中為 85. 1 士9. 3，在 DLD-I 中為 50. 6士6. 0，蛋白質 H在 HCT116 中為 15. 5士2. 1，在 DLD-1 中為3. 86士 1.34，上述任一個蛋白在HCT116中的藥劑暴露前(非暴露時)細胞內水平均顯示比DLD-I有意義的高值。實施例2對于在實施例1中發(fā)現(xiàn)的全部的峰，作為分子量已知的標準物質，使用insulinoxidized B chain(bovine)(m/z 3496. 94+1H)> Insulin(bovine)(m/z 5733. 51 + 1H)、Cytochrome c (equine)(m/z 12360. 96+1H) > Apomyoglobin (equine)(m/z 16952. 27+1H)、Aldorase (reabbit muscle) (m/z 39212.觀+ΙΗ)，使用夾持各目的峰的2種標準物質的分子量2點的分子量補正(internal calibration)進行m/z確認。其結果，實施例1中發(fā)現(xiàn)的峰分別確認是在m/z 5300 M00(蛋白質A)、m/z6130 6230(蛋白質B)、m/z 7000 7080(蛋白質 C)、m/z 7840 7920(蛋白質 D)、m/z 8920 9000 (蛋白質 Ε)、m/z 11020 11120(蛋白質 F)、m/z 1M40 12560 (蛋白質 G)、m/z 17100 17270 (蛋白質 H)、m/z18290 18470 (蛋白質 I)、m/z 24660 24750 (蛋白質 J)、m/z35980 36290 (蛋白質K) ,m/z 8650 8750(蛋白質 L)、m/z 9100 9200 (蛋白質 Μ)、m/z 11760 11890 (蛋白質N)之間檢測出的。實施例3對于在實施例1發(fā)現(xiàn)的全部峰，為了更詳細的研究其性質，對隨著pH變化的峰強度變化進行了研究。(1)方法(a)研究所使用的蛋白質芯片陣列和緩沖液條件對于陽離子交換芯片陣列(CM10，Bio-Rad)，使用pH3. 0 (50mM Glycine-HCLbuffer) > pH3.5 (50mM sodium acetate buffer)> pH4. 0 (50mM sodium acetate buffer)>pH4. 5(50mM sodium acetate buffer)>pH5. 0(50mM sodium acetate buffer)>pH5. 5(50mMsodium acetate buffer) > pH6.0 (50mM phosphate buffer) > pH6.5 (50mM phosphatebuffer) pH7. 0 (50mM phosphate buffer)、pH7. 5 (50mM phosphate buffer)、pH8. 0 (50mMTris-HCL buffer),pH8.5 (50mM Tris-HCL buffer),pH9.0 (50mM Glycine-NaOH buffer),pH9. 5 (50mM Glycine-NaOH buffer)、pH10. 0 (50mM Glycine-NaOH buffer)的 15種緩沖液。(b)用于使用CMlO芯片陣列進行分析的樣品制備和蛋白質芯片的制作和分析條件用于使用CMlO芯片陣列的分析的樣品制備和蛋白質芯片的制作，使用(a)的各緩沖液，按照實施例1的(1)方法的上述(f)為基準實施。(2)結果使用CMlO芯片陣列的分析中，能夠判斷觀察到峰強度降低的pH在該蛋白質的離子化喪失的等電點(pi)附近。其結果，在實施例1檢測出的峰的等電點(pi)推定· m/z 7000 7080 (蛋白質 C) ρΗ3· 5 6. 5· m/z 8920 9000 (蛋白質 Ε) ρΗ4· 0 7. 0‘ m/z 11020 11120(蛋白質 F)pH7. 0 8. 0‘ m/z 12440 12560(蛋白質 G)pH4. 5 7. 5‘ m/z 17100 17270 的(蛋白質 Η)ρΗ5· 0 8. 0
‘ m/z 1擬90 18470(蛋白質 Ι)ρΗ6· 5 9. 5‘ m/z 24660 24750(蛋白質 J)ρΗ3· 5 6. 5‘ m/z 35980 36290(蛋白質 K) ρΗ3· 0 6. 5‘ m/z 8650 8750(蛋白質 L)pH4. 5 7. 0‘ m/z 9100 9200(蛋白質 Μ) ρΗ4· 5 7. 5‘ m/z 11760 11890(蛋白質 N) ρΗ4· 5 7. 5相當于pi 附近。m/z 5300 MOO (蛋白質 A)、m/z 6130 6230 (蛋白質 B)、m/ζ 7840 7920(蛋白質D)的峰強度降低，pH不明確。實施例4對于在實施例1中發(fā)現(xiàn)的峰，基于實施例2和實施例3的信息，使用The ExPASyproteomics server 白勺 TagIdent tool (http://au. expasy. org/tools/tagident. html)進行數據庫檢索。其結果如下所示。[表 1]作為本體或其片段被檢測出的蛋白質
m/z 5, 3 0 0
4 O 0(蛋白質A)
(Un i P r ο
檢索結果蛋白質名KB/Sw i ss-Pη ηumber
Accessio
Putative inactivation escape 1protein. (015225), Cytochromeoxidase s u b u η i t 7 C, mitochonda 1 . (P 1 5 9 5 4), Bcta-defens inQ4QY3 8)， Putativeis — related proteiOcul ome d i n. (Q9 Y5M6)
c
1 3 4.(spermatogenesη 7. (Q 6 W4 Z 2),
m/z 6, 13 0·
2 3 0 (蛋白質B)
Epidermal growth factor. (P 01133)， Metal lothione in-1 A. (P 04731),Metal lothionein — IG- (P 13640), 6 OS r i b ο s oma 1 protein L40. (P 62987)’ Be t a-de fens in 135. (Q 3 OKP 9), Keratin — associated protein 20—1.(Q3LI63)， Putative 6 0S r i b ο s oma1 protein L 3 9 - 1 ike 5. (Q 5 9 GN 2), 6OS r i b ο s oma 1 protein L-39 like.(Q 9 6 EH 5), Uncharaclerized protein C9o r f 7 0. (Q9 6 I N3), Putataive u!!characterized protein PRO 1617.(Q9P1J0), Uncharacter ized protein C 6 ο r f 1 2 3. (Q9 Y 6 Z 2)
m/ ζ 7,0 0 0'
0 8 0 (蛋白質C)
Guanine nucleotide — binding prot e i η G (I) /G (S) ZG (〇)s ubun i t g amma-7. (0 60262), Neutrophil-act iva t i η g .peptide 2 (1-6 3). (P 0 2 7 7 5),CCB pept ide. (P 05060), DNA- d i r e cted RNA polymerases I, II， andIII s u b un t RPABC4. (P 5 3 8 0 3), Uncharac ter ized protein C21or f90.(P 5 9 O 9 0), Putative uncharacter ized protein C 1 ο r f 1 3 4. (Q5 TE V 5),Putative uncharac ter ized protein LOC550643. (Q63Z42), Putativeuncharacter ized protein SNHGl2.
(Q9BXW3), Coil e d_c ο
domain — co
η t a i η i η g pro t e i η 72. (Q9 Y2S6)[表2]
2權利要求
1.一種抗癌劑感受性判定標記，其特征在于包含選自在質量分析儀中，本體或其片段是作為m/z 5300 MOO的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 6130 6230的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 7000 7080的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 7840 7920的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 8920 9000的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 12440 12560的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 17100 17270的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 18290 18470的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z24660 24750的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z35980 36290的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 8650 8750的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 9100 9200的峰被檢測出的蛋白質、和作為m/z 11760 11890的峰被檢測出的蛋白質中的蛋白質。
2.如權利要求1所述的抗癌劑感受性判定標記，其特征在于抗癌劑選自氟化嘧啶類抗癌劑和鉬配位化合物類抗癌劑。
3.如權利要求1或2所述的抗癌劑感受性判定標記，其特征在于抗癌劑選自氟尿嘧啶、奧沙利鉬和它們的鹽。
4.如權利要求1或2所述的抗癌劑感受性判定標記，其特征在于抗癌劑是氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉬或其鹽的組合。
5.一種抗癌劑感受性的判定方法，其特征在于測定檢測體中的權利要求1 4中任一項所述的蛋白質。
6.如權利要求5所述的判定方法，其特征在于檢測體是來自患有癌的被檢驗者機體的試樣。
7.如權利要求5或6所述的判定方法，其特征在于檢測體是來自被投與了抗癌劑的患有癌的被檢驗者機體的試樣。
8.如權利要求5 7中任一項所述的判定方法，其特征在于抗癌劑選自氟化嘧啶類抗癌劑和鉬配位化合物類抗癌劑。
9.如權利要求5 8中任一項所述的判定方法，其特征在于抗癌劑選自氟尿嘧啶、奧沙利鉬和它們的鹽。
10.如權利要求5 8中任一項所述的判定方法，其特征在于抗癌劑是氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉬或其鹽的組合。
11.一種試劑盒，用于實施權利要求5 10中任一項所述的判定方法，其特征在于包含用于測定檢測體中的權利要求1 4中任一項所述的蛋白質的方案。
12.如權利要求11所述的試劑盒，其特征在于檢測體是來自患有癌的被檢驗者機體的試樣。
13.如權利要求11或12所述的試劑盒，其特征在于檢測體是來自被投與了抗癌劑的患有癌的被檢驗者機體的試樣。
14.如權利要求11 13中任一項所述的試劑盒，其特征在于抗癌劑選自氟化嘧啶類抗癌劑和鉬配位化合物類抗癌劑。
15.如權利要求11 14中任一項所述的試劑盒，其特征在于抗癌劑選自氟尿嘧啶、奧沙利鉬和它們的鹽。
16.如權利要求11 14中任一項所述的試劑盒，其特征在于抗癌劑是氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉬或其鹽的組合。
17.一種抗癌劑感受性增強劑的篩選方法，其特征在于以權利要求1 4中的任一項所述的蛋白質的表達改變作為指標。
18.如權利要求17所述的篩選方法，其特征在于抗癌劑選自氟化嘧啶類抗癌劑和鉬配位化合物類抗癌劑。
19.如權利要求17或18所述的篩選方法，其特征在于抗癌劑選自氟尿嘧啶、奧沙利鉬和它們的鹽。
20.如權利要求17或18所述的篩選方法，其特征在于抗癌劑是氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉬或其鹽的組合。
21.一種由權利要求17 20中任一項所述的方法得到的抗癌劑感受性增強劑。
22.—種癌治療用組合物，其特征在于含有權利要求21所述的抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑的組I=I O
23.如權利要求22所述的癌治療用組合物，其特征在于抗癌劑選自氟化嘧啶類抗癌劑和鉬配位化合物類抗癌劑。
24.如權利要求22或23所述的癌治療用組合物，其特征在于抗癌劑選自氟尿嘧啶、奧沙利鉬和它們的鹽。
25.如權利要求22或23所述的癌治療用組合物，其特征在于抗癌劑是氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉬或其鹽的組合。
26.一種抗癌劑的感受性判定標記，其特征在于包含鈣結合蛋白質S100A10，且包含氟尿嘧啶或其鹽、或氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉬或其鹽的組合。
27.一種抗癌劑感受性的判定方法，其特征在于測定檢測體中的權利要求26所述的鈣結合蛋白質S100A10。
28.如權利要求27所述的判定方法，其特征在于檢測體是來自患有癌的被檢驗者機體的試樣。
29.如權利要求27或觀所述的判定方法，其特征在于檢測體是來自被投與了抗癌劑的患有癌的被檢驗者機體的試樣。
30.一種試劑盒，用于實施權利要求27 四中任一項所述的判定方法，其特征在于包含用于測定檢測體中的權利要求26所述的鈣結合蛋白質S100A10的方案。
31.如權利要求30所述的試劑盒，其特征在于檢測體是來自患有癌的被檢驗者機體的試樣。
32.如權利要求30或31所述的試劑盒，其特征在于檢測體是來自被投與了抗癌劑的患有癌的被檢驗者機體的試樣。
33.一種抗癌劑感受性增強劑的篩選方法，其特征在于以權利要求26所述的鈣結合蛋白質S100A10的表達改變作為指標。
34.一種由權利要求33所述的方法得到的抗癌劑感受性增強劑。
35.一種癌治療用組合物，其特征在于含有權利要求34所述的抗癌劑感受性增強劑和作為感受性增強對象的抗癌劑的組I=I ο
全文摘要
本發(fā)明提供一種能夠判別各個患者的治療反應的抗癌劑感受性判定標記和利用其的新的癌癥治療方法。一種抗癌劑感受性判定標記，其包含選自在質量分析儀中，本體或其片段是作為m/z 5300～5400的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 6130～6230的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 7000～7080的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 7840～7920的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 8920～9000的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 12440～12560的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 17100～17270的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 18290～18470的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 24660～24750的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 35980～36290的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 8650～8750的峰被檢測出的蛋白質、作為m/z 9100～9200的峰被檢測出的蛋白質、和作為m/z 11760～11890的峰被檢測出的蛋白質、以及S100A10中的蛋白質。
文檔編號G01N33/68GK102597779SQ201080049208
公開日2012年7月18日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權日2009年10月30日
發(fā)明者杉本伸二, 生駒祐介, 西牟田章戶, 谷川原祐介, 鈴木哲也, 鈴木小夜 申請人:學校法人慶應義塾, 株式會社益力多本社