專利名稱：用于評價早產(chǎn)風(fēng)險的生物標志物的鑒定和定量的制作方法
用于評價早產(chǎn)風(fēng)險的生物標志物的鑒定和定量相關(guān)申請的交叉引用該申請要求于2009年8月20日提交的美國臨時申請序列號61/253，503的優(yōu)先權(quán)。該申請通過引用以其整體就其全部教導(dǎo)結(jié)合到本文中。致謝導(dǎo)致本發(fā)明的研究部分地由國立衛(wèi)生研究所資助(經(jīng)費號為R21HD047319和U01HD050080)。在本發(fā)明中美國政府擁有一定權(quán)利。序列表的交叉引用用序列標識符號碼(SEQ ID NO)來引用本文描述的肽。SEQ ID NO在數(shù)字上對應(yīng)于序列標識符〈400>1、〈400>2等。用書寫的計算機可讀格式(CFR)表示的序列表通過引用 以其整體結(jié)合到本文中。背景早產(chǎn)影響全部孕婦的多于10%。其也是與新生兒相關(guān)的疾病和死亡的主要原因之一。與足月出生的嬰兒相比較，過早出生的嬰兒遭受40倍増加的新生兒死亡，并且對于主要醫(yī)學(xué)并發(fā)癥例如大腦性麻痹、慢性呼吸性疾病、失明和耳聾可處于顯著増加的風(fēng)險中。另夕卜，長期神經(jīng)和發(fā)育問題已在多達70%出生體重小于I. 5磅的兒童中得到確定。據(jù)估計，僅在美國，這些并發(fā)癥每年與數(shù)十億美元的直接費用和未實現(xiàn)的潛能有夫。盡管該問題的重要性，但關(guān)于體內(nèi)發(fā)生的什么導(dǎo)致早產(chǎn)和分娩，一直存在不確定性。雖然有效處理這些問題的能力由于存在關(guān)于早產(chǎn)(PTB)原因的不確定性而仍是有限的，但如果給予足夠的預(yù)警，醫(yī)學(xué)專業(yè)人員可采取醫(yī)療措施。如果ー個人可預(yù)測哪些孕婦有可能經(jīng)歷早產(chǎn)，則可給予可延遲或甚至預(yù)防早產(chǎn)的藥物。另外，激素衍生物已知可提高胎兒肺成熟度，并且如果盡早檢測到早產(chǎn)風(fēng)險，如果經(jīng)母親給予胎兒所述衍生物，則因此可減少與早產(chǎn)有關(guān)的主要并發(fā)癥之一。然而，目前似乎沒有辦法知道哪些孕婦處于出現(xiàn)該妊娠并發(fā)癥的風(fēng)險中。因此，ー個重要且未滿足的需要是制定用于早期檢測處于早產(chǎn)風(fēng)險中的母親的試驗程序。概述本文描述了用于評價懷孕受試者早產(chǎn)風(fēng)險的方法。這些方法包括檢測和定量來自受試者的生物樣品中與早產(chǎn)相關(guān)的第一生物標志物和第二生物標志物。亦詳述了可用于預(yù)測早產(chǎn)的生物標志物。本發(fā)明的優(yōu)點將在隨后的描述中部分地闡述，并且根據(jù)描述部分地將為清楚明了的，或者可通過實施下述方面而領(lǐng)會。下述優(yōu)點將通過在所附權(quán)利要求中所特別指出的元素和組合來實現(xiàn)和達到。應(yīng)理解的是，以上一般性描述和以下詳細描述兩者均僅為示例性和說明性的且不為限制性的。附圖簡述結(jié)合到該說明書并構(gòu)成該說明書的部分的


了下述幾個方面。圖I顯示對于第一生物標志物篩查的接受者操作曲線(receiver operatorcurve (ROC))。圖2顯示對于第一生物標志物和第二生物標志物篩查的生物樣品接受者操作曲線(ROC)。詳述在公開并描述本發(fā)明化合物、組合物和/或方法之前，應(yīng)理解的是，下述方面不限于特定化合物、合成方法或用途，因為這些當然可變化。還應(yīng)理解的是，本文使用的術(shù)語僅用于描述具體方面的目的而并非g在限制。在該說明書和隨后的權(quán)利要求書中，將提及許多術(shù)語，其將被限定具有以下含乂 必須指出的是，如說明書和所附權(quán)利要求中所用的，単數(shù)形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“所述”包括復(fù)數(shù)指示対象，除非上下文另外明確指明。因此，例如提及“生物標志物”包括兩種或更多種這樣生物標志物的混合物等。“任選的”或“任選地”意指隨后描述的事件或情形可發(fā)生或可不發(fā)生，并且所述描述包括其中事件或情形發(fā)生的情況和其中其不發(fā)生的情況。本文使用的“受試者”指處于早產(chǎn)風(fēng)險并受益于本文所述方法的孕婦。本文使用的“早產(chǎn)(preterm birth) ”包括在完全妊娠期之前嬰兒的分娩。例如，認為少于37周妊娠期嬰兒的分娩為早產(chǎn)。術(shù)語早產(chǎn)是提早分娩(preterm delivery)和提前分娩(premature delivery)的同義詞。本文使用的術(shù)語“生物標志物”可用于指以不同濃度存在于孕婦體內(nèi)并用于預(yù)測早產(chǎn)風(fēng)險的天然存在的生物分子。例如，生物標志物可為相對于未經(jīng)歷早產(chǎn)的受試者中相同生物標志物的量，以更高或更低量存在于處于早產(chǎn)風(fēng)險的受試者中的肽。生物標志物可包括除肽以外的其它分子包括小分子，例如但不限于生物胺和類固醇。本文使用的術(shù)語“肽”可用于指包含通過ー個氨基酸的羧基與另ー個氨基酸的α氨基連接的兩個或更多個氨基酸的天然或合成分子。肽不受長度限制，并且因此“肽”可包括多妝和蛋白質(zhì)。本文使用的術(shù)語“分離的”，就肽而言，如果物質(zhì)是天然存在的，則指的是已從其原始環(huán)境移出的物質(zhì)。例如，存在于活動物中的天然存在的肽是未分離的，但是從自然系統(tǒng)中的ー些或所有共存物質(zhì)中分離的相同肽是分離的。這樣分離的肽可為組合物的部分并且仍可被分離，因為所述組合物不是其自然環(huán)境的部分。“分離的”肽還包括合成的或經(jīng)重組DNA技術(shù)制備的物質(zhì)。本文使用的術(shù)語“特異性免疫反應(yīng)的”指的是可測量和可重現(xiàn)的特異性免疫反應(yīng)例如肽與抗體之間的結(jié)合，所述抗體決定生物樣品中或肽和其它生物制品的異源種群中肽的存在情況。術(shù)語“特異性免疫反應(yīng)的”可包括結(jié)構(gòu)形狀和表面特征的特異性識別。因此，在指定條件下，與特定肽特異性免疫反應(yīng)的抗體不以顯著量結(jié)合存在于樣品中的其它肽。多種免疫測定方式可用于測定與特定肽特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫測定被常規(guī)用于選擇與肽特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。參見例如Harlow和Lane (1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York(其通過引用結(jié)合到本文中)中的可用于測定特定免疫反應(yīng)性的免疫測定方式和條件。本文使用的術(shù)語“抗體”指的是與給定抗原特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白。術(shù)語“抗體”意欲包括任何同種型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的完整抗體及其片段。本文使用的“抗體”還包括抗體制劑。使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)，抗體可用可檢測標記來標記。標記可為放射性同位素、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、酶或酶輔因子或本領(lǐng)域已知的任何其它標記。在ー些方面，與目的肽結(jié)合的抗體可不被標記，但反而可通過與第一抗體特異性結(jié)合的經(jīng)標記第二抗體的結(jié)合來檢測。本文使用的術(shù)語“檢測”是指ー種或多種生物標志物例如肽及其它生物分子的不可檢測的、低的、正常的、或高血清濃度的定量測量。本文使用的術(shù)語“定量化”和“定量”可互換使用并且指測定樣品中物質(zhì)(例如生物標志物)的量或豐度(無論是相對還是絕對的)的方法。本文使用的術(shù)語“約”用于提供數(shù)值范圍端點的靈活性，條件是給定的值可為所述端點的“高一點”或“低一點”而不影響所需結(jié)果。 為了方便起見，本文使用的多個條目、結(jié)構(gòu)元素、組成元素和/或物質(zhì)可呈現(xiàn)在共同列表中。然而，這些列表應(yīng)解釋為好像列表的各成員各自確定為單獨且獨特的成員。因此，僅基于其在共同組中的呈現(xiàn)而沒有相反指明，所述列表中的單個成員不應(yīng)解釋為相同 列表中任何其它成員的實際等價物。本文中濃度、量及其它數(shù)值數(shù)據(jù)可用范圍格式來表達或呈現(xiàn)。應(yīng)理解所述范圍格式僅為了方便和簡潔起見而使用并因此應(yīng)靈活地解釋為不僅包括作為范圍界限明確列舉的數(shù)值，而且還包括所述范圍內(nèi)包括的所有單個數(shù)值或子范圍，好像每ー數(shù)值和子范圍被明確列挙。作為例證，“約I-約5”的數(shù)值范圍應(yīng)解釋為不僅包括明確列舉的約I-約5的值,而且還包括所指明范圍內(nèi)的單個值和子范圍。因此，包括在該數(shù)值范圍內(nèi)的為單個值例如2、3和4及子范圍例如1-3、2-4和3-5等，以及單獨地1、2、3、4和5。該同樣的原理適用于僅將一個數(shù)值列舉為最小或最大值的范圍。另外，不論所描述范圍或特性的寬度，所述解釋應(yīng)適用。本文描述了用于鑒定處于早產(chǎn)風(fēng)險中的懷孕受試者的方法。已鑒定了第一生物標志物和第二生物標志物，其可用于鑒定可處于早產(chǎn)風(fēng)險中的在妊娠早期-中期期間的懷孕受試者。所述標志物可使得能夠診斷區(qū)分早產(chǎn)與顯示類似癥狀的其它病況。盡早鑒定處于更大早產(chǎn)風(fēng)險中的受試者將具有相當大的價值，這樣可更密切地監(jiān)測受試者。當表明早產(chǎn)的第一生物標志物和第二生物標志物在受試者中可量化時，使用本文所述方法測試懷孕受試者可在懷孕期間的任何時間進行。例如，一方面，第一生物標志物和第二生物標志物可在約20周-約34周妊娠時測試。另ー方面，第一生物標志物和第二生物標志物可在約24周-約32周妊娠時測試。應(yīng)指出的是，這些范圍不應(yīng)視為限制，因為所述測試可在懷孕期間的任何時刻進行。相反地，提供這些范圍是為了表明其中所述測試最有可能在大多數(shù)受試者中進行的妊娠周期的時期。在鑒定處于早產(chǎn)風(fēng)險的受試者中有用的生物標志物包括各種肽和其它生物分子。用本文所述與早產(chǎn)發(fā)生率相關(guān)的技術(shù)和方法，已鑒定了某些肽和其它生物分子。這些肽和其它生物分子中一種或更多種的定量提供受試者早產(chǎn)風(fēng)險的一些指征(indication)，并因此可提供預(yù)防性治療的機會。應(yīng)指出的是，預(yù)測早產(chǎn)并發(fā)癥的任何生物標志物應(yīng)視為在本發(fā)明權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。然而，一方面，與早產(chǎn)并發(fā)癥相關(guān)的第一生物標志物或第二生物標志物的非限定性實例可包括經(jīng)發(fā)現(xiàn)與對照受試者(即未經(jīng)歷早產(chǎn)并發(fā)癥的孕婦)存在統(tǒng)計差異(p彡0. 01)和p (概率)值< 0. 02作為截斷的分子和肽。一方面，生物標志物包括第一生物標志物和第二生物標志物。在該方面，第一生物標志物可包括與早產(chǎn)有關(guān)的肽例如具有以下氨基酸序列或其任何組合的肽QLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ ID NO I)、NVHSAGAAGSRMNFRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ ID NO 2)、NVHSAGAAGSRM NFRPGVLSSRQLGLPGPPDVPDHAAYHPF(SEQ ID NO 3)。另ー方面，第ニ生物標志物可包括與早產(chǎn)有關(guān)的全長蛋白或蛋白質(zhì)的肽片段。該第二生物標志物可包括但不限于促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子α I型受體或其任何組合。在又另一方面，第二生物標志物包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子α I型受體或其任何組合。這些全長蛋白的序列可在www. ncbi. nlm. nih. gov得到。用于鑒定生物標志物的如在國際公布號WO 2008/079407(其通過引用以其整體結(jié)合到本文中用于該申請內(nèi)的所有目的)中公開的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可用于鑒定和定量用于評價懷孕受試者中早產(chǎn)風(fēng)險的生物標志物。一方面，用于測試懷孕受試者潛在早產(chǎn)的方法可包括與對照(即在不經(jīng)歷早產(chǎn)的孕婦中生物標志物的相對濃度或量)相比較，檢測存 在于生物樣品中與早產(chǎn)有關(guān)的第一和第二生物標志物組合的濃度或量的差異。一方面，蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)和方法可用于鑒定和定量第一和第二生物標志物。例如，本文可使用比較來自不同生物樣品的多個質(zhì)譜，在使用補償非生物差異的方法之后對量不同的質(zhì)量離子進行定位，分離并表征目的生物標志物。這樣的方法可包括分餾多個生物樣品中的每ー個以形成多個洗脫，在多個洗脫時間得到來自多個洗脫中每ー個的多個質(zhì)譜，并且找到生物樣品之間似乎量上不同的目的分子離子峰。方法可另外包括鑒定對應(yīng)于在生物樣品之間基本上一致的內(nèi)源性參考分子的質(zhì)譜參考峰，所述內(nèi)源性參考分子具有與目的峰基本上類似的洗脫時間和質(zhì)荷比，并且通過將目的峰標準化為內(nèi)源性參考分子的質(zhì)譜峰來補償每ー個生物樣品在多個洗脫之間的非生物變異。方法可進ー步包括實施碰撞誘導(dǎo)的裂解研究，所述研究使用多個碰撞能量中的每ー個，一次運行ー個并將所生成的許多碎片離子質(zhì)譜求和而不是平均化以形成単一的累積子碎片質(zhì)譜，并且使用子碎片質(zhì)譜以建立氨基酸序列數(shù)據(jù)，其然后用于鑒定對應(yīng)于単一比對的質(zhì)譜中目的峰的肽。另ー方面，含有第一和第二生物標志物的生物樣品可經(jīng)分餾以形成多個洗脫，在多個洗脫時間得到來自多個洗脫中每ー個的多個質(zhì)譜，并且鑒定對應(yīng)于多個洗脫中每ー個中洗脫的內(nèi)源性比對分子的質(zhì)譜比對峰。方法可進ー步包括通過比對來自多個洗脫中每ー個的質(zhì)譜比對峰而比對來自各洗脫的許多質(zhì)譜，將許多所比對的質(zhì)譜求和形成単一比對的質(zhì)譜，并且鑒定對應(yīng)于單一比對的質(zhì)譜中目的峰的肽。盡管考慮各種技術(shù)，但一方面比對許多質(zhì)譜可進ー步包括目視比對許多質(zhì)譜。另外，分餾存在于多個生物樣品中的多種生物分子中的每ー種可通過許多方法來實現(xiàn)，例如通過毛細管液相色譜(cLC)。用于檢測和定量本文所述第一和第二生物標志物的具體方法和參數(shù)在實施例中提供。用于檢測和定量本文所描述第一和第二生物標志物的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)利用對于用作內(nèi)部対照的所有血清為天然的分子，其可用于校正樣品加載、電離效率和質(zhì)譜儀靈敏度的差異。進ー步關(guān)于以上討論，如果在比較組之間峰可顯示量上相似，其被選為參考，在與候選生物標志物相同的洗脫窗口中來自柱的洗脫物在其質(zhì)荷比方面與候選生物標志物相似，并且足夠豐富，使得每ー個樣品將具有多于3倍噪聲水平的量。這里所描述的參考峰為與試樣處理、色譜加載、電離效率或儀器靈敏度波動相關(guān)但不是由于峰數(shù)量的生物差異的峰高或面積的定量校正。該參考稱為內(nèi)部定量對照。在其它方面，外部對照可用于促進生物標志物的定量。在該方面，可將已知量的化合物加入到生物樣品中以便可計算生物標志物與対照的比率。所述比率然后可與來自對照樣品的比率相比較以評價早產(chǎn)的風(fēng)險。如以上所描述的，包括SEQ ID NOs 1_3或其任何組合的第一生物標志物已被鑒定為早產(chǎn)的預(yù)測物(predictor)。內(nèi)部定量對照用于定量SEQ ID NOs 1_3。用于SEQ IDNO I (m/z 677)的參考(即內(nèi)部對照)對于其單同位素峰的+3荷電狀態(tài)具有673. 36的m/Z0中性母體質(zhì)量(neutral parent mass)為2017. 07質(zhì)量單位,并且色譜洗脫時間為15. 5分鐘。然而，假定洗脫時間將在不同日或伴隨更換柱稍微變化，將洗脫時間提供為其洗脫時間相對于內(nèi)部時間對照的分數(shù)(0. 9968，即其洗脫比內(nèi)部時間對照早其自身保留時間的
0.0032倍)和作為其洗脫時間與SEQ ID NO I (m/z 677)比較的分數(shù)(I. 0558，即其洗脫比生物標志物早其自身洗脫時間的0. 05286)。第二內(nèi)部定量對照用作SEQ ID NO 2 (m/z 857)和 SEQ ID NO 3 (m/z 860)的參考。參考分子的m/z在其+5荷電狀態(tài)為842. 39，中性母體質(zhì)量為4206. 07質(zhì)量單位。色譜洗脫 時間為約15. 8分鐘。然而，考慮到洗脫時間可變性，其洗脫時間更適當?shù)叵鄬τ趦?nèi)部時間對照和SEQ ID NO 2 (m/z 857)的洗脫時間來描述。關(guān)于內(nèi)部時間對照，內(nèi)部定量對照在內(nèi)部時間對照的洗脫之后洗脫為其自身洗脫時間0. 0159倍洗脫時間的因子(或時間對照標志物的1.0161的比率)。關(guān)于SEQ ID NO 2 (m/z 857)，內(nèi)部定量標志物在生物標志物之后實現(xiàn)其自身洗脫時間0. 0539倍的因子(或生物標志物洗脫時間的I. 0700的因子)。盡管各質(zhì)量可由洗脫時間(保留時間)確定，洗脫時間(保留時間)也可表示為內(nèi)部時間對照的函數(shù)。這通過生物標志物之前的時間標記與目的峰之后的時間標記之間的目的峰的相對位置來測定。認為該測定為Rf值。Rf值計算如下Rf =(生物標志物的洗脫時間-時間標記之前的洗脫時間)/ (時間標記之后的洗脫時間-時間標記之前的洗脫時間)。使用上述技術(shù)，包括SEQ ID NOs 1_3或其任何組合的第一生物標志物已被鑒定為早產(chǎn)的指示物(indicator)。關(guān)于第一生物標志物(即SEQ ID NOs 1-3或其任何組合)的鑒定和定量的具體細節(jié)在實施例中提供。對于SEQ ID NOs 1-3的另外結(jié)構(gòu)性質(zhì)在下文提供。SEQ ID NO 1，其為肽，在677具有質(zhì)量離子峰(m/z)，平均質(zhì)量為2026. 98道爾頓，平均洗脫時間為14. 30±0. 47分鐘，和Rf值為0. 535±0. 052。SEQ ID NO 2，其為肽，在857具有質(zhì)量離子峰(m/z)，平均質(zhì)量為4279. 25道爾頓，平均洗脫時間為17. 20±2. 04分鐘，和Rf值為0. 781 ±0. 086。SEQ ID NO 3，其為肽，在860具有質(zhì)量離子峰(m/z)，平均質(zhì)量為4295. 25道爾頓，平均洗脫時間為16. 13±1. 97分鐘，和Rf值為0. 695±0. 134。使用以上和在實施例中描述的技術(shù)，第二生物標志物，其包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子a I型受體或其任何組合，當與第一生物標志物(即SEQ ID NOs 1-3或其任何組合)結(jié)合時已被鑒定為早產(chǎn)的指示物。因此，提供了用于評價懷孕受試者潛在早產(chǎn)的方法。一方面，方法包括檢測來自受試者的生物樣品中與早產(chǎn)有關(guān)的本文所描述第一和第二生物標志物，其中所述第一生物標志物具有與序列(由SEQID NO I、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3表示的序列)相同或同源的氨基酸序列，和所述第二生物標志物包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子α I型受體或其任何組合。接著，對生物樣品中第一和第二生物標志物的豐度進行定量。在處理和分離之后第一和第二生物標志物的豐度作為也存在于生物樣品中用作內(nèi)部對照組的參考分子的函數(shù)得以測量。本文使用的術(shù)語“豐度”代表在給定質(zhì)譜中經(jīng)質(zhì)譜儀測量的特定質(zhì)量離子的數(shù)目或在代表完全洗脫區(qū)間的幾個質(zhì)譜中觀察到的特定質(zhì)量離子數(shù)目的總和。生物標志物豐度對該內(nèi)部對照的標準化減少非生物變異并提高在風(fēng)險預(yù)測中利用生物標志物的能力。換句話說，通過選擇在受試者之間以相對恒定的豐度存在于生物樣品中用于參考的分子，在生物樣品處理中的差異可經(jīng)校正，特別是當比較在不同日實施且可經(jīng)長的時間期間展開的運行吋。這樣，依所涉及的特定生物標志物而定，生物標志物的相對豐度可變化。因此可對于每ー個生物標志物/參考比率建立特定截斷值使得高于或低于一定值的生物標志物峰值豐度與參考峰值豐度的比率可為早產(chǎn)風(fēng)險顯著増加的預(yù)測。對于潛在早產(chǎn)的測試也可通過比較來自受試者具有表明正常分娩的已知豐度的那些相同生物標志物的生物樣品中第一和第二生物標志物的豐度來實現(xiàn)。一方面，如果第 一生物標志物為單獨的SEQ ID NO I或與SEQ ID NOs 2和3的任何組合的SEQ ID NO 1，如果受試者具有所測量的SEQ ID NO I豐度為小于至少22周妊娠的對照豐度的約50%，那么可發(fā)生早產(chǎn)。另ー方面，如果受試者具有所測量的單獨SEQ ID NO I或與SEQ ID NOs2和3組合的SEQ ID NO I的豐度為小于至少22周妊娠的對照豐度的約30%，那么可發(fā)生早產(chǎn)。在又另一方面，如果受試者具有所測量的單獨SEQ ID NO I或與SEQ ID NOs 2和3組合的SEQ ID NO I的豐度為小于至少22周妊娠的對照豐度的約10%，那么可發(fā)生早產(chǎn)。另ー方面，如果第一生物標志物為SEQ ID NO 2，如果受試者具有所測量的SEQ IDNO 2豐度為小于至少22周妊娠的對照豐度的約50%，那么可發(fā)生早產(chǎn)。另ー方面，如果受試者具有所測量的SEQ ID NO 2豐度為小于至少22周妊娠的對照豐度的約30%，那么可發(fā)生早產(chǎn)。在又另一方面，如果受試者具有所測量的SEQ ID NO 2豐度為小于至少22周妊娠的對照豐度的約10%，那么可發(fā)生早產(chǎn)。另ー方面，如果第一生物標志物為SEQ ID NO 3，如果受試者具有所測量的SEQ IDNO 3豐度為小于至少22周妊娠的對照豐度的約55%，那么可發(fā)生早產(chǎn)。另ー方面，如果受試者具有所測量的SEQ ID NO 3豐度為小于至少22周妊娠的對照豐度的約35%，那么可暗示早產(chǎn)。在又另一方面，如果受試者具有所測量的SEQ ID NO 3豐度為小于至少22周妊娠的對照豐度的約15%，那么可發(fā)生早產(chǎn)?？珊械谝簧飿酥疚锖偷诙飿酥疚锏娜魏晤愋蜕飿悠房山?jīng)篩查，包括這樣的非限制性實例例如血清、血漿、血液、尿、腦脊液、羊水、滑液、宮頸陰道分泌物、灌洗液、組織及其組合。盡管第一生物標志物(即SEQ ID NOs 1-3或其任何組合)和第二生物標志物存在于大多數(shù)孕婦體內(nèi)，但持續(xù)經(jīng)歷早產(chǎn)的許多孕婦在妊娠期間與具有正常分娩的婦女相比較具有較低血清濃度的第一生物標志物。然而，依所篩查的具體蛋白質(zhì)或肽而定，與具有正常分娩的婦女相比較，持續(xù)經(jīng)歷早產(chǎn)的婦女的第二生物標志物(即促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子α I型受體或其任何組合)更低或更高。關(guān)于第二生物標志物血清濃度的進ー步細節(jié)參見實施例部分的表16。值得注意的是，先前已評價了第二生物標志物對于早產(chǎn)的可預(yù)測性。參見GoldenbergRL,Iams JD, Mercer BM, Meis PJ, Moawad A,DasA, Miodovnik M, Vandorsten PJ,CaritisSN, Thurnau G, Dombrowski MP ；Maternal-Fetal Medicine Units Network。早產(chǎn)預(yù)測研究關(guān)于用于自發(fā)性早產(chǎn)的多標志物試驗(The Preterm Prediction Study toward amultipIe-marker test for spontaneous preterm birth). Am J Obstet Gynecol 2001 ；185(3) :643-510然而，如由以上所提及參考文獻指出的那樣，當在不存在第一生物標志物下檢測和定量第二生物標志物(即促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子a I型受體或其任何組合)時，其不提供足夠的用于臨床預(yù)測PTB的特異性或靈敏度。一方面，與對照相比，PTB病例中第一生物標志物(即SEQ ID NOs 1_3或其任何組合)較不豐富。因此，比較來自受試者的生物樣品中ー種或更多種第一生物標志物的豐度相對于來自未經(jīng)歷早產(chǎn)受試者的已知對照濃度，或者相對于來自所測試受試者的己知生物標志物濃度，可預(yù)測早產(chǎn)。具有較高或較低第一生物標志物豐度的那些受試者可具有增加的早產(chǎn)風(fēng)險，并可因此足夠早地被鑒定以使得能夠適當治療。在預(yù)測早產(chǎn)中特定生物標志物的豐度在以下詳細描述。 —方面，為了計算早產(chǎn)受試者和對照受試者的生物標志物豐度，在28周妊娠時對第一生物標志物取對數(shù)比。例如，log 676. 7/673. 36 (SEQ ID NO I/參考峰)的對數(shù)比得到平均對照為 0.579±0. 101 和平均 PTB 為-0. 015±0. 090。log 856. 8/842. 8 (SEQ ID NO 2/參考峰)的對數(shù)比得到平均對照(未經(jīng)歷早產(chǎn)的受試者)為0. 231±0. 102和平均PTB(處于早產(chǎn)風(fēng)險中的受試者)為-0. 149±0.095(實施例中表12)。參照實施例中表12，計算其它生物標志物的對數(shù)比。log 860. 0/842. 8 (SEQ ID NO 3/參考峰)的對數(shù)比得到平均對照為0. 201 ±0. 096和平均PTB為-0. 204±0. 088。換句話說，處于早產(chǎn)風(fēng)險中的受試者將最可能單獨或共同地呈現(xiàn)SEQ ID NO I減小、SEQ ID NO 2減小和SEQ ID NO 3減小?？紤]到所述描述，一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO I (m/z 677)的豐度與參考分子在m/z 673的豐度的比率被測量為小于約I. 0，那么其可為早產(chǎn)風(fēng)險顯著増加的預(yù)測。另ー方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO I (m/z 677)的豐度與參考分子在m/z 673的豐度的比率被測量為小于約0.8，那么其可為早產(chǎn)風(fēng)險顯著増加的預(yù)測。在又另ー方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO I (m/z 677)的豐度與參考分子在m/z 673的豐度的比率被測量為小于約0. 6，那么其可為早產(chǎn)風(fēng)險顯著増加的預(yù)測。另外，一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 2 (m/z 857)的豐度與參考分子在m/z 843的豐度的比率被測量為小于約0.6，那么其可為早產(chǎn)風(fēng)險顯著増加的預(yù)測。另一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 2 (m/z 857)的豐度與參考分子在m/z 843的豐度的比率被測量為小于約0. 5，那么其可為早產(chǎn)風(fēng)險顯著増加的預(yù)測。在又另一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 2 (m/z 857)的豐度與參考分子在m/z 843的豐度的比率被測量為小于約0. 44，那么其可為早產(chǎn)風(fēng)險顯著増加的預(yù)測。另外，一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 3 (m/z 860)的豐度與參考分子在m/z 843的豐度的比率被測量為小于約0.6，那么其可為早產(chǎn)風(fēng)險顯著増加的預(yù)測。另一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 3 (m/z 860)的豐度與參考分子在m/z 843的豐度的比率被測量為小于約0. 4，那么其可為早產(chǎn)風(fēng)險顯著増加的預(yù)測。在又另一方面，在至少22周妊娠，如果SEQ ID NO 3 (m/z 860)的豐度與參考分子在m/z 843的豐度的比率被測量為小于約O. 2，那么其可為早產(chǎn)風(fēng)險顯著増加的預(yù)測。在某些方面，以上所計算的對數(shù)比可用于統(tǒng)計學(xué)預(yù)測處于經(jīng)歷早產(chǎn)風(fēng)險中的孕婦的風(fēng)險。第一生物標志物和第二生物標志物預(yù)測能力的ー種公用量度為其靈敏度和特異性。本文使用的“靈敏度”為作為真陽性率定義的統(tǒng)計術(shù)語(例如經(jīng)生物標志物正確鑒定，后來經(jīng)歷早產(chǎn)的孕婦百分數(shù))。本文使用的術(shù)語“特異性”定義為真陰性率(例如正確鑒定無并發(fā)癥妊娠的孕婦百分數(shù))。為了使用本文描述的第一生物標志物和第二生物標志物用于預(yù)測早產(chǎn)，建立數(shù)字閾值。為了建立數(shù)字閾值，對于特定生物標志物的數(shù)值范圍考慮從最低至最高并且在每ー個點受試者百分數(shù)正確鑒定為陽性和在相同點對照百分數(shù)錯誤鑒定為陽性。對于特定生物標志物的值范圍可通過從具體數(shù)據(jù)集的最低至最高取實際數(shù)量值來計算。這稱為接受者操作曲線(ROC)。一方面，假陽性率可限于20%，其通常認為是臨床試驗所能容許的最大值。假陽性率(即由生物標志物鑒定處于經(jīng)歷早產(chǎn)風(fēng)險中的無并發(fā)癥妊娠的婦女百分數(shù))根據(jù)100%減去真陰性率來計算。在20%或更小假陽性率的閾值，其相當于特異性為80%或者更高，確定用于確定某人處于風(fēng)險中還是不處于風(fēng)險中的閾值。
參照實施例中的表13和14，對于4個對數(shù)比(即第一生物標志物)中每ー個的閾值經(jīng)測定用于鑒定處于早產(chǎn)風(fēng)險中的受試者。計算每一個的閾值使得存在80%或者更多的特異性(真陰性率)，其與不多于20%的假陽性率相同。使用數(shù)學(xué)上測定的閾值，4個比率獨立地提供靈敏度(真陽性)和特異性(真陰性)比率(表13和14)。參照表14，SEQ IDNO I ( BP log 677/673)的比率對于預(yù)測早產(chǎn)提供最大的靈敏度(65% )和特異性(85% )0因此，一方面，鑒定和定量存在于孕婦中的SEQ ID NO 1(即log 677/673)為經(jīng)歷早產(chǎn)可能性的準確預(yù)測物。盡管SEQ ID NO 1(即log 677/673)的比率為有用的，也預(yù)期對數(shù)比的組合可用于預(yù)測早產(chǎn)風(fēng)險。因此，本文鑒定的第一生物標志物(即SEQ ID NOs 1-3)為預(yù)測早產(chǎn)風(fēng)險的強有力工具。本文所描述的第一生物標志物可預(yù)測早產(chǎn)。然而，在ー些情況下對于早產(chǎn)的測試預(yù)測值可通過篩查和定量第二生物標志物而改迸。一方面，可篩查來自受試者的生物樣品中的第一生物標志物和第二生物標志物,其中所述第一生物標志物為與由SEQ ID NO I、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3表示的序列相同或同源的氨基酸序列或其任何組合，和所述第ニ生物標志物為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子α I型受體或其任何組合。在該方面，當単獨篩查第二生物標志物時，其不為PTB的指征。然而，當以與第一生物標志物的組合(即SEQ ID NOs 1_3或其任何組合)來篩查第二生物標志物時，與單獨篩查第一生物標志物相比較，預(yù)測PTB的靈敏度増加。一方面，當針對PTB而一起篩查第一和第二生物標志物時，靈敏度為大于80%或者為80-90%。在某些方面，靈敏度為90%或者更大。另ー方面，當針對PTB而一起篩查第一和第二生物標志物時，特異性為至少80%。為了比較，當僅檢測和定量第一生物標志物時，靈敏度為約65%。一方面，當篩查生物樣品中的第二生物標志物時，所述第二生物標志物為至少兩種選自以下的蛋白質(zhì)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物和腫瘤壞死因子α I型受體。另ー方面，當篩查生物樣品中的第二生物標志物時，所述第二生物標志物為至少三種選自以下的蛋白質(zhì)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物和腫瘤壞死因子a I型受體。在另一方面，當篩查生物樣品中的第二生物標志物時，所述第二生物標志物為至少四種選自以下的蛋白質(zhì)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物和腫瘤壞死因子a I型受體。在又另一方面，當篩查生物樣品中的第二生物標志物時，所述第二生物標志物為五種蛋白質(zhì)，其包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物和腫瘤壞死因子a I型受體。表1-6包括但不限于其可經(jīng)篩查以預(yù)測PTB的第一和第二生物標志物的可能組合。在這些表中，第一生物標志物包括SEQ ID NO I (單獨或者與SEQ ID NOs 2和3組合)、SEQ ID NO 2 (單獨或者與SEQ ID NOs I和3組合)和SEQ ID NO 3 (單獨或者與SEQ IDNOs I和2組合)并且第二生物標志物包括蛋白質(zhì)(即促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)
素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子a I型受體或其任何組合)的各種組合。例如，在表I中，第一生物標志物為SEQ ID NO I并且第二生物標志物選自包括以下的列表促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子a I型受體或其任何組合。因此，一方面，第一生物標志物可包括SEQ ID NO I并且第二生物標志物可包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子。另ー方面，第一生物標志物可包括SEQ ID NO I并且第二生物標志物可包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子和凝血酶抗凝血酶復(fù)合物。在又另一方面，第一生物標志物可包括SEQ ID NO I并且第二生物標志物可包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物和鐵蛋白。在又另一方面，第一生物標志物可包括SEQ ID NOs 1、2和3并且第二生物標志物可包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物和腫瘤壞死因子a I型受體。表1-6每ー個可通過該方法來解釋。
權(quán)利要求
1.用于評價懷孕受試者中早產(chǎn)風(fēng)險的方法，所述方法包括 (a)檢測存在于來自受試者的生物樣品中的第一生物標志物和第二生物標志物的組合，其中所述第一生物標志物包含氨基酸序列SEQ ID NO I、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或其任何組合，和所述第二生物標志物為包括以下的蛋白質(zhì)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子a I型受體或其任何組合；和 (b)定量生物樣品中所述第一和第二生物標志物的量。
2.權(quán)利要求I的方法，其中步驟(b)包括測量所述第一和第二生物標志物的豐度。
3.權(quán)利要求2的方法，所述方法還包括比較生物樣品中所述第一和第二生物標志物的豐度與來源于未經(jīng)歷早產(chǎn)受試者的對照生物樣品中所述第一和第二生物標志物的對照濃度，以確定早產(chǎn)風(fēng)險増加。
4.權(quán)利要求3的方法，其中確定早產(chǎn)風(fēng)險增加包括確定所述生物樣品中至少ー種肽的豐度顯著低于對照生物樣品中至少ー種肽的對照濃度。
5.權(quán)利要求2的方法，所述方法還包括比較生物樣品中所述第一和第二生物標志物的豐度與來自受試者的生物樣品中參考分子的對照濃度，以確定早產(chǎn)風(fēng)險増加。
6.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一生物標志物包括至少兩種具有氨基酸序列SEQIDNO I、SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO 3 的肽。
7.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一生物標志物包括至少三種具有氨基酸序列SEQIDNO I、SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO 3 的肽。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述第二生物標志物為至少兩種選自以下的蛋白質(zhì)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物和腫瘤壞死因子a I型受體。
9.權(quán)利要求I的方法，其中所述第二生物標志物為至少三種選自以下的蛋白質(zhì)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物和腫瘤壞死因子a I型受體。
10.權(quán)利要求I的方法，其中所述第二生物標志物為至少四種選自以下的蛋白質(zhì)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物和腫瘤壞死因子a I型受體。
11.權(quán)利要求I的方法，其中所述第二生物標志物為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物和腫瘤壞死因子a I型受體。
12.權(quán)利要求1-11中任ー項的方法，其中所述第一生物標志物為SEQID NO I。
13.權(quán)利要求I的方法，其中檢測步驟(a)包括蛋白質(zhì)組學(xué)技木。
14.權(quán)利要求I的方法，其中檢測步驟(a)包括(I)在使得能夠形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下使所述生物樣品與抗體接觸，所述抗體對所述第一或第二生物標志物具有免疫特異性；和(2)測定所述抗體-抗原復(fù)合物的形成以檢測生物樣品中的所述第一或第二生物標志物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗體包括單克隆抗體。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗體與載體分子偶聯(lián)或綴合。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗體與固體載體偶聯(lián)或綴合。
18.權(quán)利要求17的方法，其中在形成所述抗體-抗原復(fù)合物之后，去除未結(jié)合固體載體上抗體的生物樣品的任何組分。
19.權(quán)利要求1-18中任ー項的方法，其中所述生物樣品包括血清、血漿、血液、尿、腦脊液、羊水、滑液、宮頸陰道分泌物、灌洗液或其任何組合。
20.權(quán)利要求1-18中任ー項的方法，其中所述生物樣品為血清。
21.權(quán)利要求1-18中任ー項的方法，其中所述生物樣品為血液。
22.用于評價懷孕受試者中早產(chǎn)風(fēng)險的方法，所述方法包含(a)自受試者獲得生物樣品；(b)使所述生物樣品與第一抗體和第二抗體接觸，其中在使所述樣品與所述第一抗體和第二抗體接觸時，所述第一抗體結(jié)合第一生物標志物并形成第一抗體-抗原復(fù)合物和所述第二抗體結(jié)合第二生物標志物并形成第二抗體-抗原復(fù)合物；其中所述第一生物標志物包含氨基酸序列SEQ ID NO USEQ ID NO 2,SEQ ID NO 3或其任何組合并且所述第二生物標志物為包括以下的蛋白質(zhì)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子α I型受體或其任何組合；(C)對所述第一抗體-抗原復(fù)合物和第二抗體-抗原復(fù)合物的形成進行測定以定量生物樣品中的其第一生物標志物和第ニ生物標志物的量；和(d)比較生物樣品中的所述第一生物標志物和第二生物標志物的量與未經(jīng)歷早產(chǎn)受試者中相同生物標志物的量以評價早產(chǎn)風(fēng)險。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述第一抗體和第二抗體獨立地包括單克隆抗體。
24.用于評價懷孕受試者中早產(chǎn)風(fēng)險的試劑盒，所述試劑盒包括(a)至少第一和第二抗體，其中所述第一抗體能夠選擇性結(jié)合具有包含SEQID NO I、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的氨基酸序列的第一生物標志物并形成第一抗體-抗原復(fù)合物，和其中所述第二抗體能夠選擇性結(jié)合包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、防衛(wèi)素、鐵蛋白、乳鐵蛋白、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物、腫瘤壞死因子α I型受體或其任何組合的第二生物標志物并形成第二抗體-抗原復(fù)合物；和(b)測定所述第一抗體-抗原復(fù)合物和第二抗體-抗原復(fù)合物形成的與所述第一抗體和第二抗體功能性相關(guān)的指示物。
25.權(quán)利要求24的試劑盒，所述試劑盒還包括經(jīng)配置以定量生物樣品中所述第一生物標志物和第二生物標志物量的指示物。
26.權(quán)利要求24的試劑盒，其中所述第一抗體和第二抗體獨立地包括單克隆抗體。
全文摘要
本文描述用于評價懷孕受試者中早產(chǎn)風(fēng)險的方法。所述方法包括檢測和定量來自受試者的生物樣品中與早產(chǎn)有關(guān)的第一生物標志物和第二生物標志物。本文亦描述用于預(yù)測早產(chǎn)風(fēng)險的分離的生物標志物和試劑盒。
文檔編號G01N33/53GK102822669SQ201080049381
公開日2012年12月12日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者S·W·格拉夫, M·S·埃斯普林 申請人:猶他州大學(xué)研究基金會, 布里格姆·揚大學(xué), Ihc醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)公司