專利名稱:通過對定向序列聚合物的組合物進行基于血清蛋白的檢測,改進含定向序列聚合物的組 ...的制作方法
通過對定向序列聚合物的組合物進行基于血清蛋白的檢測,改進含定向序列聚合物的組合物的設計、生物利用度和
效能的方法
相關申請本申請要求2009年11月17日遞交的美國臨時申請No. 61/281,470和2010年9月27日遞交的美國臨時申請No. 61/386,909的優(yōu)先權益。
背景技術:
復雜的肽混合物是肽治療劑的一個新興的類型,其中考帕松(醋酸格拉默)是一個領先的例子。復雜的肽混合物包括有一個或幾個共享特征(如氨基酸組成和/或序列 相似)的多樣性肽,并包括改變了的肽配體(APL)、肽庫、肽文庫、含隨機序列聚合物(RSP)的組合物(如醋酸格拉默,及W003/029276、WO 05/112972和WO 05/085323中公開的組合物)及含定向序列多肽(DSP)的組合物(見例如WO 2007/120834、WO 2009/051797和WO2009/128948)。DSP和RSP組合物在如下方面是相似的二者都包含大量不同的肽,它們的序列在某些確定的公共參數上是隨機變化的。在RSP組合物中,序列的相似性起源于肽的氨基酸含量有限,因為所有肽由相同的為數不多的氨基酸以隨機順序排列而組成。在DSP組合物中,序列的相似性則起源于共享的基礎肽序列,其中某些氨基酸位置被有限的氨基酸標記以有限的頻率隨機地取代?,F有技術中已有檢測簡單多肽的方法,但是只有較少方法適合于檢測和測定復雜的肽混合物。檢測定向序列聚合物(DSP)有效血漿濃度的方法是復雜的,因為與具有明確氨基酸序列的各別肽相比,DSP是肽的復雜混合物。需要對多種制造方法制備的DSP組合物的均一性和組成進行評估的改進方法。確定DSP組合物在體內的狀態(tài)具有重要的免疫學意義,因為取決于給藥途徑和/或給藥頻率及血清蛋白與DSP的結合,這種肽混合物可能激發(fā)初級炎癥反應(THl型)或初級調控反應(TH2型),導致其在受試對象中的藥代動力學和藥效學改變。更加嚴謹的設計和堅持給予DSP組合物可能提高治療效果或者減少潛在的不良炎癥應答反應。因此,為了治療目的,需要定量分析DSP組合物的方法,例如促進這種肽混合物在體內狀況的評估和確定合適的劑量及給藥方式。
發(fā)明概述本申請?zhí)峁z測和評價DSP組合物的改進的方法。本發(fā)明提供檢測和定量分析DSP組合物的方法。本發(fā)明提供基于肽亞組與特定捕獲多肽相互作用的測定,和富集DSP組合物中多肽亞組亞組的方法。本發(fā)明進一步提供對需要接受治療的患者給予DSP組合物的方法,其中可根據上述檢測和定量方法來確定或評估給藥方案和劑量。本申請還提供檢測DSP組合物的方法,包括以下步驟(a)將所述DSP組合物附著于固相支持物上;(b)使(a)所述固相支持物與含蛋白質生物液體接觸;(c)鑒定特異性結合于(a)所述固相支持物的(b)所述的蛋白質;(d)獲得基本純的(C)所述結合蛋白產物;(e)將(c)所述蛋白質附著于定量檢測所述DSP組合物用的工具上;和(f)測定所述DSP組合物與(e)所述蛋白每一種的結合。本說明書也提供一種改進DSP組合物設計的方法,包括以下步驟(a)將所述DSP組合物附著于固相支持物上;(b)使(a)所述固相支持物與含蛋白的生物液體接觸;(c)鑒定特異性結合于(a)所述固相支持物的(b)所述的蛋白質;(d)獲得基本純的(C)所述的結合蛋白產物;(e)使(C)所述蛋白質附著于定量檢測DSP組合物用的工具上;(f)測定所述DSP組合物與(e)所述蛋白質結合的每一種肽;(g)調整所述DSP組合物的設計以增加或減少與(e)所述一種或多種蛋白質的結合;(h)重復步驟(f) ;(i)任選地重復步驟(f_h),其中調整所述DSP組合物的設計可導致一種或多種效果提高生物利用度、減少毒性和提高效能。此外,本申請?zhí)峁┮环N檢測DSP組合物中肽種類的方法,包括以下步驟(a)將所述DSP組合物附著于固相支持物上;(b)使(a)所述固相支持物與含蛋白的生物液體接觸;(C)鑒定特異性結合于(a)所述固相支持物的(b)所述的蛋白質;(d)獲得基本純的(C)所 述結合蛋白制品;(e)使(C)所述蛋白質附著于固相支持物上;(f)使(e)所述固相支持物與所述DSP組合物接觸;(g)測定所述DSP組合物中每種肽與(f)所述固相支持物的結合。另外,本申請?zhí)峁┮环N改進DSP組合物中肽種類設計的方法,包括以下步驟(a)使所述DSP組合物附著于固相支持物上;(b)使(a)所述固相支持物與含蛋白的生物液體接觸;(C)鑒定特異性結合于(a)所述固相支持物的(b)所述蛋白質;(d)獲得基本純的(C)所述結合蛋白制品;(e)使(C)所述蛋白質附著于固相支持物上;(f)使(e)所述固相支持物與所述DSP組合物接觸;(g)測定所述DSP組合物中與(f)所述固相支持物結合的每一種肽;(h)調整所述DSP組合物的設計以增加或減少與(f)所述一種或多種蛋白質的結合;(i)重復步驟(g) ;(j)任選地重復步驟(g_j),其中調整所述DSP組合物肽種類的設計可導致一種或多種效果提高生物利用度、減少毒性,和提高效能。通過應用本申請所述方法,研究者不僅可以更可靠地檢測DSP組合物中的低含量組分,而且可以特異性地檢測DSP組合物中與生物活性如毒性或效力有關或對其有貢獻的肽種類。本發(fā)明的基礎是,發(fā)現YEAK或YFAK組合物中的一種肽或多種肽可與某些具有蛋白質性質的物質特異性結合。相反,具有蛋白質性質的物質在本說明書稱為“捕獲多肽”,這種物質較佳地也結合DSP組合物。相反,一旦“捕獲多肽”被鑒定,便可利用一種或多種這類捕獲多肽定量分析DSP組合物中所含的肽,并分離DSP組合物中功能更優(yōu)良的肽亞組,或者根據結合特異性給DSP組合物中的各組分分類。為了實施本發(fā)明,鑒定到能與(DSP組合物所含)肽結合的捕獲多肽后,即可將其制備成可用于實施本發(fā)明的形式,即對其進行分離和純化,純度達到足以結合(DSP組合物所含)肽而不受到存在的其他組分干擾。本發(fā)明的一個方面提供了一種評價或測定DSP組合物不同制造的制劑、用不同方法制造的、或不同的制造后加工的產品的差異的方法。本發(fā)明的具體方法是,比較不同的DSP組合物制品與捕獲多肽的結合來確定各制品之間的相似性和/或差異。本發(fā)明的另一方面提供一種定量分析DSP組合物或含DSP組合物的樣品中所含肽的方法。本發(fā)明的一些實施方式是檢測給予DSP組合物后其在體內的生物可利用含量或濃度(如血漿濃度)的方法。本發(fā)明的方法是檢測受試對象組織中存在的DSP組合物,所述受試對象先前曾接觸過DSP組合物或用其治療過,在這種接觸后立即、或在接觸后至少大約10、20、30、或45分鐘,或者 1、2、4、6、12、24、36 或 48 小時,或 3、4、5、6、7 或 10 天,或 2、3、4、6、8 或 12 周進行
一次或多次所述方法的檢測。本發(fā)明的一種具體方法是檢測哺乳動物血清或血漿中存在的DSP組合物的各組分,所述哺乳動物在進行所述方法前曾在上述期間內用所述DSP組合物治療過。在某些具體實施方案中,所述哺乳動物是人。在某些實施方案中,本發(fā)明方法包括通過使DSP與一種或多種預先確定的捕獲多肽結合然后用例如免疫檢測方法檢測DSP組合物的存在,和任選地檢測其含量。因此。本發(fā)明的一個方面包括選擇或鑒定能與DSP組合物優(yōu)先結合的血清蛋白。在某些實施方案中,鑒定一種或多種血清蛋白的方法包括使DSP組合物與包括血清的生物樣品接觸;如果樣品中存在DSP組合物中的肽,則檢測其與血清中一種或多種組分的結合;分離得到結合組分,鑒定一種或多種結合組分。在一些實施方式中,分離這種結合組分的方法是,使樣品接觸設計的能與DSP組合物所含肽結合的親和柱、隨后洗脫結合組分,然后鑒定結合組分。任何能與DSP組合物所含肽結合的血清結合蛋白可用于上述方法。合適的檢測方 法包括直接競爭酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、Western印跡法、免疫流式細胞檢測法、放射免疫檢測法(RIA),或者任何其他能定量檢測特異性抗原的免疫學檢測方法。本發(fā)明的一個方面是一種檢測生物樣品中DSP組合物存在與否的方法,包括使生物樣品與至少一種捕獲多肽接觸;檢測捕獲多肽與DSP組合物有無結合,其中存在這種結合表明在生物樣品中存在DSP組合物中的肽組分??蛇M一步延伸用這種方法檢測樣品中DSP組合物的含量或濃度。本發(fā)明的另一個方面是測量DSP組合物在哺乳動物中的生物利用度的方法,包括給予哺乳動物一定劑量的DSP組合物;取得對象的生物樣品;使該生物樣品與至少一種捕獲多肽接觸;進而檢測該生物樣品中DSP組合物的生物利用度或者生物可利用的程度。本發(fā)明的另一個方面是提供給予哺乳動物對象DSP組合物的方法,給藥量取決于用上述檢測方法或者本說明書描述的其他方法檢測的該劑量的生物可利用部分。在某些實施方式中,本發(fā)明方法還包括對照樣品,和進行藥效學試驗,通過比較樣品與對照兩者的檢測結果,測定生理標志(例如激素、酶、血清蛋白、細胞因子、免疫調節(jié)劑,或者這些功能蛋白的效應物或調節(jié)劑)的變化,并確定能引起所需藥效學參數變化的有效劑量。在某些實施方案中,觀察對象報告的行為改變、自覺癥狀改變,例如疼痛或疾病癥狀的減輕或其他間接效應。在一些具體實施例中,所述哺乳動物是小鼠或大鼠等嚙齒動物,其他的實施例中,所述對象是人。本發(fā)明這個方面的某些實施方案,提供確定給予需要的受試對象DSP組合物合適劑量的方法包括(a)給予受試對象一個劑量DSP組合物;(b)取得受試對象的生物樣品;
(c)使此生物樣品與至少一種捕獲多肽接觸;(d)檢測該生物樣品中DSP組合物各組分的水平;(e)任選地用不同劑量重復步驟(a)至(d) ;(g)將所測得的水平與預先確定的生物樣品中的DSP組合物合適水平作比較;其中所述合適劑量是導致生物樣品中DSP組合物達到預定合適水平的劑量。本發(fā)明的某些實施方案提供預測DSP組合物所含的有生物利用價值組分的方法。這種方法包括使含DSP組合物的樣品與DSP組合物給予和遞送后預期可到達部位原位的預定捕獲多肽接觸,測定DSP組合物與該捕獲多肽的結合。被大量DSP組合物結合,可表明較大比例的肽是與治療和/或生理相關的肽,結合較緊密(對每種肽測定其解離常數)可能表示延長那些肽體內半衰期的保護作用。本發(fā)明的又一個方面提供根據從實驗對象獲得的數據預測擬給予治療對象(如人)的DSP組合物的治療有效量的方法。在某些實施方案中,該方法包括給予非人哺乳動物實驗對象DSP組合物,測定該劑量的生物可利用部分(例如用本說明書所述的定量測定方法),測定功能讀出,根據從哺乳動物實驗對象獲得的數據和治療對象與實驗對象之間的相關比率,預測擬給予治療對象的DSP組合物的治療有效量。為了本發(fā)明的目的,“功能讀出”可以是受試對象的表型或功能、受試對象細胞的表型或功能、或受試對象產生的一種或幾種液體的組成。功能讀出還可包括或者包括測量一種或幾種生物合成或代謝產生的組分,如激素、酶、血清蛋白、細胞因子、趨化因子、生長因子、免疫調節(jié)劑,或所述功能讀出的效應物或調節(jié)劑。在某些實施方式中,檢測步驟可以各種有規(guī)律或無規(guī)律的時間間隔后重復進行,來測定給予DSP組合物后其生物利用度、代謝和/或清除的時間進程。在某些實施方案中,可用此方法測定一組DSP組合物的血漿半衰期。在又一個實施方案中,可用此方法 測定DSP組合物中一種肽類的半衰期。在具體實施方案中,實驗對象是嚙齒動物,例如小鼠或大鼠。本發(fā)明另一個方面提供通過給予DSP組合物治療患者的有效方法,包括通過合成肽(例如同時利用每輪延伸合并的氨基酸單體)制備DSP組合物,制備所述DSP組合物的藥學上可接受的制劑,給予治療對象所述DSP組合物,取得治療對象的組織樣品,測定所述組織樣品中DSP組合物的含量和/或濃度,測定功能讀出,將DSP組合物含量與功能讀出相關聯,及調整給予治療對象的DSP組合物劑量以改善功能讀出。本發(fā)明的另一個方面是治療或預防治療對象產生不希望有的免疫應答反應的方法,包括給予治療對象合適劑量的DSP組合物,確定合適劑量可通過(i)給予治療對象一個劑量的DSP組合物;(ii)取得治療對象的生物樣品;(iii)使該生物樣品與至少一種捕獲多肽接觸;(iv)檢測生物樣品中該捕獲多肽的水平;(V)任選地用不同劑量重復步驟(i)至(iv) ;(vi)將測得的水平與預定的生物樣品中DSP組合物的合適水平作比較;其中合適劑量是導致生物樣品中DSP組合物達到預定合適水平的劑量。在前述某些方面和實施方案中,捕獲多肽是標記的多肽。在某些實施方案中,捕獲多肽附著于固相支持物。在某些實施方案中,檢測和/或分離包含捕獲多肽的復合體和DSP組合物的一個或多個肽組分。在具體實施方案中,用對所述復合體而不是對捕獲多肽或DSP組合物的肽組分具有特異性的抗體來檢測和/或分離這種復合體。本發(fā)明另一個方面提供一種分離所選擇的組成DSP組合物的肽亞組的方法。在特別的例子中,該亞組由氨基酸序列不同的一種或多種肽組成。在其他例子中,可根據結合特異性利用捕獲多肽對DSP組合物所含組分分類。在某些實施方案中,分離含DSP組合物樣品中肽的方法包括(a)使該樣品與至少一種捕獲多肽接觸;(b)分離混合物中結合于捕獲多肽的肽。在這樣的實施方案中,捕獲多肽附著于固相支持物上。在一些實施方式中,捕獲多肽是表位示蹤或標記的多肽。在一些實施方式中,該方法還包括分離與捕獲多肽結合的肽,以分離得到這些肽。在具體實施方式
中,該方法還包括測定該分離肽的特性,例如合并的分離肽中的氨基酸組成和/或分離肽的氨基酸序列。
在某些實施方案中,鑒定在受試對象中DSP組合物的生物可利用肽的方法包括(a)給予受試對象DSP組合物;(b)在執(zhí)行步驟(a)后取得受試對象的生物樣品;(c)鑒定該樣品中結合于至少一種捕獲多肽的肽。在某些實施方案中,鑒定能結合捕獲多肽的肽亞組的方法包括按擬定方案制備DSP組合物,使所述DSP組合物與預先確定的捕獲多肽(如適合作為體內靶標或運載體的多肽)接觸,測定DSP組合物中的結合肽,鑒定能區(qū)別結合肽和未結合肽的特征,制備能反映一種或多種差別特征的改進的DSP組合物。本發(fā)明的另一個方面是改進含DSP組分的組合物制備工藝的方法。在某些實施方案中,根據鑒定結合捕獲多肽的肽亞組的上述方法設計DSP組合物。在某些實施方案中,設計的DSP組合物其氨基酸組成和/或氨基酸序列接近于結合捕獲多肽的肽亞組的氨基酸組成和/或氨基酸序列。在某些實施方案中,DSP組合物與參比DSP組合物相比效力增強,其中參比DSP組合物與接觸捕獲多肽的最初DSP組合物的效力相同或基本相同。在其他實施方式中,DSP組合物的毒性比參比DSP組合物低。 在可替代的實施方案中,一種方法包括按擬定方案制備DSP組合物,配制含DSP的組合物,通過檢測功能讀出的水平或程度確定所述組合物中生物可利用的DSP組分的含量,將功能讀出與標準值作比較,和調整擬定方案或組合物的配方以獲得滿意的生物利用度。本發(fā)明還有一個方面是通過將DSP組合物(例如參比DSP組合物或用本說明書所述方法產生的改進的DSP組合物)或DSP組合物的一個組分與受關注的治療劑締合而使該藥物靶向特定組織,其中所述DSP組合物或其組分與具有組織特異性靶向性能的捕獲多肽結合,可將這種締合藥劑給予患者使所述藥物靶向能與相應捕獲多肽結合的組織。本發(fā)明這一方面的一些實施方式提供了將治療劑轉運到治療對象特定組織的方法,該方法包括(a)使DSP組合物與組織特異性肽接觸并分離混合物中結合于該組織特異性肽的肽,得到標記肽;(b)將標記肽與治療劑偶聯,(C)給予治療對象該偶聯物。本發(fā)明的其它實施方式包括通過上述方法的步驟(a)和(b)制備這種靶向治療劑的方法,及用此方法制備的靶向治療劑。本發(fā)明的又一個方面是上述方法之一中有用的組合物。本發(fā)明這一方面的一個實施方式是一種用于檢測生物樣品中DSP組合物的組合物,這種組合物包含至少一種捕獲多肽。在一些實施方式中,所述捕獲多肽選自正常人血清、正常非人靈長類動物血清、正常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常豬血清、正常狗血清、正常馬血清、正常綿羊血清、正常母牛血清中的一種組分,哺乳動物HDL蛋白質組的一種組分,哺乳動物LDL蛋白質組的一種組分,補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間- α -胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α-I-抗胰蛋白酶酶,載脂蛋白A_IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(BLAST檢索表明它是IgM重鏈),載脂蛋白E,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2-HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,IgM的C鏈,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子ΙΙ(凝血酶),IgK輕鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,IgAI Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a -2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及IgJ-鏈。
在一些具體的實施方式中,捕獲多肽可以是血清結合蛋白。在更具體的實施方式中,捕獲多肽選自α-1-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-I、α-1-Β-糖蛋白、載脂蛋白A-IV、載脂蛋白D和前白蛋白,或選自本段落前一段所枚舉的捕獲多肽,或選自本說明書公開的血清多肽。在上述任何一個實施方式中,DSP組合物所含肽可在生理上相關的其它組分存在下與捕獲多肽(例如血清蛋白)進行結合。在具體實施方式
中,其它組分是脂質,如膽固醇或甘油三酯。在具體實施方式
中,其它組分是除捕獲多肽外基本上沒有蛋白成分的HDL或LDL復合物。
附圖的簡單描述圖I是測定DSP組合物與血清結合蛋白(已結合于支持物上)結合所用的試驗的示意圖。在血清蛋白被鑒定后,將其結合于固相支持物。將DSP組合物(單獨或包含于血清中)加到支持物上。加入抗DSP組合物(或抗DSP組合物與血清蛋白的偶聯物)的第一 抗體,再用第二抗體和檢測試劑檢測第一抗體與其靶標的結合。圖2顯示當抗體結合于它們的靶標后,結合了抗YFAK和抗YEAK抗體的HRP組合物的Α450比色吸光度。靶標包括含有與正常人血清中所含(或所加)血清蛋白結合的YEAK或YFAK肽的復雜肽混合物。在復雜肽混合物濃度較高時,用抗YEAK或YFAK抗體檢測的偶合物高于較低濃度復雜肽混合物。在病人中,12. 5ng/mL對應于大約2mg劑量。圖3顯示能結合PI-2301或考帕松(Copaxone)的血清蛋白列表。血清蛋白的來源是正常小鼠血清或正常人血清(已標明)。PI-2301可以是乙?;蚍且阴;摹S每筜FAK和抗YEAK抗體識別PI-2301或考帕松的結合復合體,并用第二抗體和檢測試劑加以檢測。洗脫該復合體中的血清蛋白并鑒定。根據檢測試劑的A450吸光度給蛋白評分。與背景吸光度相比,70分對應的P值< O. 001,認為具有統計學顯著意義。圖4顯示小鼠靜脈內給予4mg/kg或皮下給予21mg/kg劑量的YEAK后血清中的YEAK,用比色法和偶聯有HRP的抗-YEAK抗體檢測YEAK與其結合于正常人血清所含血清蛋白的靶標YEAK肽結合后的A450吸光度。該圖顯示,給予GA(乙酸格拉默)片段后約15分鐘,GA達到了血清最高濃度1800ng/mL。皮下給予Copaxone 的估計生物利用度為靜脈給予Copaxone⑧的12%。給藥后2小時仍可測到GA組分。圖5顯示給予小鼠YEAK后血清或血漿中對YEAK應答產生的可溶性因子緊急釋放的示范例,此例中為CCL22,也稱為MDC。如該圖所示,皮下給予小鼠的YEAK劑量與觀察到的最大CCL22血漿濃度之間存在線性相關。圖6顯示用LC-MS觀察從固定于CNBr-S^h柱的YEAK片段洗脫所得血清蛋白的肽圖像。用Mascot搜索引擎鑒定肽序列。簡言之,將胰蛋白酶消化產生的YEAK片段偶聯于溴化氰Sepharose (CNBr-Seph) 4b,與人或小鼠血清一起室溫培育2小時。用0. IM甘氨酸-鹽酸,PH 2. 8液洗脫結合于YEAK片段的血清蛋白,在50%甲醇/50mM碳酸氫銨中用胰蛋白酶消化,干燥后用液相色譜法(LC)分離,除去溶劑,電離后噴霧到質譜儀(MS)中,直視觀察并用Mascot搜索引擎鑒定。圖7顯示用圖I所示的本發(fā)明方法進行ELISA試驗,其中,將YEAK加入到男性和女性正常人血清后合并男性和女性正常人血清。該試驗顯示檢測血清YEAK濃度的線性范圍在l-100ng/ml之間。用小鼠血清或用無關對照,如抗匙孔戚血蘭蛋白(KLH)多克隆血清,不能重復該試驗。圖8 顯示第 P53218 和 119142 批次 Copaxone (YEAK)分子量的 SE-HPLC 圖形,二批的圖形相似。圖9顯示用圖I所示本發(fā)明方法檢測圖8中兩批Copaxone⑧的結果。
圖10顯示,對圖8和圖9所用的兩批Copaxone 作的生物試驗,其中單核細胞系RAW264. 7細胞接觸YEAK后以濃度依賴方式釋放CCL22。圖11顯示,用MALDI-T0F檢測,長度明確不同的YEAK共聚體的實際平均分子量與理論平均分子量之間有嚴格的線性關系。將計算的理論值乘以共聚體的氨基酸長度,即
20、40、60和80乘以一個氨基酸加一個水分子的理論平均分子量。用Y、E、A和K各自的質量減去在氨基酸偶聯過程中丟失的一個水分子的質量,計算出一個氨基酸的理論質量,這4個氨基酸的比例為1.0 : 1.5 : 4.5 : 3.6。 圖12顯示固相合成制備的長度不同YEAK共聚體的氨基酸分析,按100個氨基酸標準化后的輸出比例,以及對圖8、9和10所示的兩批Copaxone 進行的相同分析。用含20、40、60和80個氨基酸的YEAK共聚體產生標準曲線。為了比較,也用Copaxone產生標準曲線。圖12顯示YEAK共聚體的大小與基于競爭性ELISA的PK試驗檢測結果之間的關系。20-聚YEAK共聚體的抑制作用很小,但用80-聚YEAK共聚體產生的標準曲線與用Copaxone獲得的曲線重疊。圖13顯示ELISA試驗結果,其中家兔多克隆血清的Ig組分與Copaxone 相互作用強烈,表明隨著固相合成的YEAK共聚體長度增加,其識別能力也提高。圖14顯示用先前PCT公開文本W02009/075854(其內容整體納入本說明書作為參考)所描述的PK方法與固相合成的YEAK共聚體所作的ELISA試驗結果,證明YEAK共聚體的大小與用上述試驗方法測得的結果之間相關。圖15顯示,單核細胞系RAW264. 7細胞與圖12、13和14所示固相合成的大小不同的共聚體一起培育后,隨著共聚體長度的增加,CCL22的產量也增加。圖16顯示,圖8、9、10和12所用的兩批Copaxone 與圖12、13、14和15所用的固相合成的長度不同的YEAK共聚體,能在體內誘導用2. 5mg/kg Copaxone⑧每周一次X 3周免疫的小鼠的脾細胞增殖。最后一次皮下給予后,收集脾臟,制備細胞懸液,將脾細胞與不同濃度的不同共聚體一起培養(yǎng)4天。用本領域熟知的方法通過測定氘化胸腺嘧啶的摻入檢測脾細胞增殖。
發(fā)明詳述
定向序列聚合物(DSP)的組合物DSP是一種所含序列衍生于已知基礎肽序列的肽,可以是但不限于與免疫應答反應相關的天然表位,如起始位點??砂创_定的規(guī)則進行置換,使DSP具有一個或多個與所述基礎肽的序列不同的氨基酸殘基。由于DSP組合物序列的半隨機多樣性,該組合物中存在大量的肽序列。多樣性的肽序列可賦予比多樣性少的組合物更高的效力,特別是當發(fā)生表位漂移和擴散時。在一些實施方式中,利用包含多種DSP的DSP組合物來調控不希望有的免疫應答反應,或在所述基礎肽免疫原性微弱或不能測到時用其來誘導免疫應答反應。對DSP進行設計以包含在基礎肽序列的任何給定位置引入明確比例的明確的氨基酸殘基變異。不像產生的肽RSP如Cop-I那樣,雖然它們可在不同程度上被置換,但其特定長度的明確預定肽序列仍能維持它們與天然序列的氨基酸殘基相似性。每個氨基酸位置的改變,應根據一組明確的規(guī)則,這樣的取代氨基酸選自基礎肽異基因同工蛋白質中所見的化學性質相關的氨基酸,空間結構相似的氨基酸,種系發(fā)育改變的氨基酸,不會導致基礎肽功能障礙的已知等位基因變異,或導入后不會破壞肽的二極結構的小氨基酸殘基。在某些實施方式中,按照Kosiol等,J. Theoretical Biol, 2004, 228 :97-106所述方法置換氨基酸?;蛘撸砂凑誔CT/US2004/032598第10-11頁所述的示例性置換方法改變氨基酸??捎霉滔嚯暮铣煞ㄖ苽銬SP,每輪合成時,用按上述理由選定的明確比例混和的受適當保護的氨基酸混合物,而不是單個的氨基酸摻入合成的多肽中。根據該混和比例,所選氨基酸的引入(肽鏈)有所不同。因此,與RSP組合物相同,DSP組合物不是以單一的肽合 成的,而總是以共同的模板序列為基礎合成含多種相關DSP肽組成的組合物,可重復產生整個混和物,這與所采用的合成規(guī)則相一致。產生的是有用的理論上相關蛋白質的混合物,本說明書將其稱為包含“定向序列聚合物”或“DSP”的組合物。對于固相合成法,肽中給定位置氨基酸的混合物是按比例一一限定的。開始合成前,對肽的每個決定要改變的位置確定氨基酸的混和比例。得到的定向順序肽混和物包含多種相關的肽序列??捎糜诒景l(fā)明的一些 DSP 包括國際專利申請 TO 2007/120834、TO 2009/051797、TO 2009/128948 和美國申請公布公報US 2009/0036653中所描述的那些DSP。這些參考文獻描述了合成DSP的方法、包含DSP的組合物、DSP的治療制劑,給予治療對象DSP組合物的方法、可用DSP治療的疾病和可以與DSP共同給予治療對象的其他治療有效制劑。所有這些專利、專利申請和出版物均以整體內容納入本說明書作為參考,特別注意討論DSP結構、制備和功能的部分。通過選擇沒有已知功能、具有已知或預期的研究價值、具有已知或預期的診斷價值、或具有已知或預期的與疾病相關性的蛋白質,及選擇蛋白中的一個部分,該部分可以是如下免疫原性范圍內的表位(從沒有已知的免疫原性到弱免疫原性到強免疫原性,或已知其與疾病病理相關),來設計和制備DSP。對于制備DSP組合物,可從不同來源選擇基礎肽序列。在某些情況下,可通過相關表位的實驗研究來鑒定對疾病狀態(tài)或不良反應有某些意義的肽序列。這些序列可包括已證明對治療疾病或病況有用的天然存在的肽序列,一個例子可參見國際專利申請WO 2006/031727,美國專利No. 6,930, 168和相關的科學出版物Stern等,Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2005,102 :1620-25。另外,憑經驗確定可能作為表位的基礎肽序列,方法可以是通過對合成的組合肽文庫進行位置掃描鑒定候選序列(例如,參見D. Wilson等,同上;R. Houghten等,同上;Hernandez等,Eur. J. Immunol, 2004, 34 :2331-41),或標出受關注的整個蛋白的重疊肽序列,和測試肽的免疫反應活性,所用的方法有例如適合于尋找疾病和物種有關表位的體外或體內試驗系統中對此類目的有用的任何讀出試驗,如HI試驗,病毒攻擊模型,或NIH,John Wiley 父子公司出版的由 John E Coligan, Ada M Kruisbeek, David H Margulies,Ethan M Shevach, Warren Strober 編著的“免疫學當代方案(Current Protocols inImmunology) ”中描述的方法。候選分子可包括合成期間或合成后修飾的肽,例如加入糖基或修飾的糖基,如糖基化和糖原化(可以是N-連接或S-連接),脂肪酸修飾,如十四烷?;虍a生二硫鍵。鑒定到候選表位后,可利用病原的次代品系變異、簇群變異、漂移變異、替換變異,通過目前易于得到的參考文獻(如WO 2000/042559)中所述的模擬算法和預測算法,如對突變、可能的抗體接觸表位進行對比和分析,或利用2005/103679、WO 2002/073193和WO99/45954中描述的預測方法來預測這些可能表位的結合,從而制備可能的一組額外相關的表位。在一些實施方式中,設計DSP用的基礎肽序列是與選自多發(fā)性硬皮病、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病、重癥肌無力、類風濕關節(jié)炎和尋常型天皰疹等自身免疫疾病相關的表位。在其他實施方式中,基礎肽序列是與選自白血病、乳腺癌、皮膚癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、腦癌、喉癌、膽囊癌、胰腺癌、直腸癌、甲狀旁腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、神經癌、頭頸癌、結腸癌、胃癌、支氣管癌、腎癌、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤、轉移性皮膚癌、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、veticulum細胞瘤、骨髓瘤、骨巨細胞瘤、小細胞肺癌、胰島細胞瘤、淋巴細胞、粒細胞、毛細胞瘤、腺瘤、增生、髓樣瘤、嗜鉻細胞瘤、卵巢腫瘤、宮頸非典型增生、原位癌、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、軟組織肉瘤、卡波西肉瘤和骨肉瘤的癌癥病理學相關表位。 在其他實施方式中,基礎肽序列是與病毒感染疾病病理上相關的表位,這些疾病選自AIDS、AIDS相關綜合征、水痘、感冒、巨細胞病毒感染、科羅拉多蜱傳熱、登革熱、埃博拉出血熱、頭足口病、肝炎、單純性皰疹、帶狀皰疹、HPV、流感(Flu)、拉沙熱、麻疹、馬爾堡出血熱、傳染性單核細胞增多癥、流行性腮腺炎、脊髓灰質炎、進行性多病灶白細胞腦病、狂犬病、風疹、SARS、天花、病毒性腦炎、病毒性胃腸炎、病毒性腦膜炎、病毒性肺炎、西尼洛河病和黃熱病。在其他實施方式中,基礎肽序列是與細菌染疾病病理上相關的表位,這些疾病選自炭疽、細菌性腦膜炎、肉毒中毒、布魯氏桿菌病、彎曲菌病、貓抓病、霍亂、白喉、淋病、膿皰病、軍團菌病、麻風病、鉤端螺旋體病、李斯特桿菌病、萊姆病、類鼻疽、MRSA感染、諾卡氏菌病、百日咳、鼠疫、肺炎球菌性肺炎、鸚鵡熱、Q熱病、落磯山斑疹熱(RMSF)、沙門氏菌病、猩紅熱、志賀氏菌病、梅毒、破傷風、沙眼、結核病、土拉菌病、傷寒熱、斑疹傷寒(包流行性斑疹傷寒)和尿道感染。在其他實施方式中,所述基礎肽序列是寄生蟲傳染疾病病理上相關的表位,這些疾病選自阿米巴病、蛔蟲病、巴貝西蟲病、南美洲錐蟲病、支睪吸蟲病、隱孢子蟲病、囊蟲病、裂頭絳蟲病、麥地那龍線蟲病、包蟲病、蟯蟲病、片吸蟲病、姜片蟲病、絲蟲病、自由活動的阿米巴感染、賈第蟲病、腭口線蟲病、膜殼絳蟲病、等孢球蟲病、黑熱病、利什曼病、瘧疾、后殖吸蟲病、蠅咀病、盤尾絲蟲病、虱病、蟯蟲感染、瘧原蟲感染、疥瘡、血吸蟲病、絳蟲病、弓蛔蟲病、弓漿蟲病、旋毛蟲病、鞭蟲病、滴蟲病和錐蟲病(包括非洲錐蟲病)。在一些實施方式中,基礎肽序列是與影響中樞和/或外周神經系統的蛋白質構象無序病理上相關的表位,這些疾病選自阿爾茨海默病(AD)、荷蘭遺傳性腦出血伴淀粉樣變(又名腦血管淀粉樣變)、congophilic血管病;皮克病、進行性核上麻痹癥、家族性英國癡呆、帕金森氏病(PD)、Lewy體相關病、多系統萎縮癥、哈施二氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)、享廷頓氏病(HD)、脊髓小腦共濟失調癥、神經元核內包涵體病、遺傳性齒狀核紅核蒼白球丘腦下部核萎縮病、朊蛋白相關疾病如羊瘙癢癥、牛海棉狀腦病、變體型克雅二氏癥、Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合征、庫魯癥、致命性家族性失眠癥;及隨著疾病發(fā)展以腦萎縮和檢測到細胞內和/或細胞外纖絲凝聚為特征的其他疾病。
在一具體實施方式
中,所述蛋白構象無序疾病是帕金森氏病。在另一具體實施方式
中,所述蛋白構象無序疾病是阿爾茨海默病。在一具體實施方式
中,所述構象無序疾病是朊蛋白相關疾病。在一具體實施方式
中,所述構象無序疾病是肌萎縮性脊髓側索硬化癥。在一具體實施方式
中,所述構象無序疾病是享廷頓氏病。在其他實施方式中,用于加工制備DSP組合物的基礎肽序列是與影響中樞神經系統外的多個器官的蛋白構象無序病理上相關的表位,這些疾病選自脊髓和延髓性肌萎縮、遺傳性全身和腦淀粉樣變性、芬蘭型家族淀粉樣變性、老年性全身淀粉樣變性(又名老年性心臟淀粉樣變)、家族性淀粉樣多神經病、II型糖尿病特別是胰島淀粉樣變性、透折相關性淀粉樣變性(DRA)、炎癥相關性反應性全身淀粉樣變(又名AA淀粉樣變)、主動脈中層淀粉樣變性、甲狀腺髓質癌、遺傳性腎淀粉樣變性、輕鏈相關性淀粉樣變性、輕鏈沉積病、輕鏈管型腎病、輕鏈心肌病、心房淀粉樣變性、注射局部淀粉樣變性、囊性纖維化病(CF)、鐮狀細胞貧血癥,以及在受累器官或組織中觀察到有原纖維形成的 其他疾病。天然未折疊的蛋白質和肽,那些懷疑經歷原纖維形成的天然展開因而與蛋白構象無序相關、可用作制備DSP組合物的基礎肽來源序列的蛋白質和肽,例子包括朊蛋白及其片段,淀粉樣β蛋白及其片段,abri蛋白、微管相關蛋白、α突觸核蛋白及其中心片段、胰島淀粉樣多肽(也稱為糊精)、享廷頓病外顯子I、前胸腺素α、雄激素受體蛋白氨基末端結構域、蝦紅素-l(ataxin-l)、DRPLA蛋白(也稱為萎縮素-I)和降鈣素。經歷原纖維形成因而與蛋白構象無序相關、可用作DSP組合物基礎肽來源序列的球蛋白的例子包括半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、運甲狀腺素蛋白、β-2微球蛋白、血清淀粉樣蛋白A及其片段、享廷頓蛋白、免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)、胰島素、溶菌酶(特別是人溶菌酶)、α乳清蛋白和莫尼糖蛋白、雄激素受體蛋白的配體和DNA-結合結構域、Iactadherein及其特異性片段(如殘基245-294片段,也稱為medin)、凝溶膠蛋白、載脂蛋白Al、纖維蛋白素原及其片段,和心房利鈉因子。作為一個具體例子,在病理學上,阿爾茨海默病與存在4kDa淀粉樣β (Αβ)肽強烈相關,這種肽系早老素I (PSl)酶切割Αβ肽的前體(APP)而產生。大多數Αβ長40個氨基酸,稱為Aβ 40、Aβ 1-40,或氨基末端含變異的ΑβΧ-40。此外,研究表明微纖維形式的Αβ 1-40能激活通常認為在阿爾茨海默病病理發(fā)生中具有重要作用的小膠質細胞(Jekabsone,A 等,J. Neuroinflammation 3 :24(2006))。Aβ 1-40 的妝序列見表 I 中的 SEQID Ν0:7。另一方面,Αβ1-42是空斑形成Αβ的微小組分,認為其幫助啟動了纖絲狀Aβ的生成。該肽“全長形式”見表I的SEQ ID NO 8ο因此,所述基礎肽序列可以是SEQ ID NO 8所示的Αβ肽。該基礎肽序列也可以是較短的肽,即ΑβΧ-40、Αβ 1-11,在一些報導中具有臨床意義的有A β 14-23 或A β 16-20οTjernberg, L. O.等,Biochem. J. 366 :343-351 (2002)。
表I :表位的不例
權利要求
1.一種檢測DSP組合物的方法,包括以下步驟 a.提供一種或多種捕獲多妝的基本純制劑; b.使一種或多種捕獲多肽附著于定量檢測DSP組合物的工具;和 c.測定DSP組合物與一種或多種所述捕獲多肽的結合。
2.一種改進DSP組合物設計的方法,包括以下步驟 a.提供一種或多種捕獲多妝的基本純制劑; b.使一種或多種捕獲多肽附著于定量檢測DSP組合物的工具; c.測定DSP組合物與一種或多種所述捕獲多肽的結合; d.調整所述DSP組合物的設計以增加或減少其與一種或多種捕獲多肽的結合; e.重復步驟(C); f.任選地重復步驟(c_e), 其中調整所述DSP組合物的設計導致提高其生物利用度、減小毒性和提高效能中的一種或多種。
3.一種檢測DSP組合物中肽種類的方法,包括以下步驟 a.提供一種或多種捕獲多妝的基本純制劑; b.使一種或多種捕獲多肽附著于固體支持物上; c.使所述固體支持物與DSP組合物接觸;和 d.測定所述DSP組合物中單個肽種類與固體支持物的結合。
4.一種改進DSP組合物中肽種類設計的方法,包括以下步驟 a.提供一種或多種捕獲多妝的基本純制劑; b.使一種或多種捕獲多肽附著于固體支持物上; c.使所述固體支持物與DSP組合物接觸; d.測定所述DSP組合物中單個肽種類與固體支持物的結合; e.調整所述DSP組合物的設計以增加或減少所述DSP組合物與一種或多種捕獲多肽的結合; f.重復步驟⑷; g.任選地重復步驟(d-f), 其中調整所述DSP組合物的設計導致提高生物利用度、減小毒性和提高效能中的一種或多種。
5.如權利要求1-4之一所述的方法,其中(a)所述一種或多種捕獲多肽通過以下步驟進行鑒定 i.使DSP組合物附著于固體支持物上; ·使(i)中所述固體支持物與含蛋白質生物液體接觸; iii.鑒定特異性結合于(i)所述固體支持物的(ii)中所述的蛋白質; 其中,(ii)中所述的蛋白質是一種捕獲多肽。
6.如權利要求1-5之一所述的方法,其中所述捕獲多肽選自補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α-I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號No. CAA34971),載脂蛋白E,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2-HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,Ig Al Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及IgJ-鏈。
7.一種測定DSP組合物存在的方法,包括以下步驟 a.使一種或多種蛋白質附著于定量檢測樣品中所述DSP組合物的工具,所述一種或多種蛋白質選自以下物質補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間- α -胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α-I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A_IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號NO.CAA34971),載脂蛋白E,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2-HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子ΙΙ(凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,IgAI Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a -2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產 物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及IgJ-鏈;和 b.測定所述樣品中所述DSP組合物的水平。
8.如權利要求1-4之一所述的方法,其中所述捕獲多肽選自補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α-I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號No. CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2-HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,IgAI Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及IgJ-鏈。
9.一種檢測生物樣品中DSP組合物存在的方法,包括以下步驟 a.使生物樣品與正常人血清、正常非人靈長類動物血清、正常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常豬血清、正常狗血清、正常馬血清、正常綿羊血清、正常母牛血清中所含的至少一種捕獲多肽接觸;和 b.檢測捕獲多肽與DSP組合物的結合存在與否, 其中,存在這種結合表明生物樣品中DSP組合物的存在。
10.如權利要求9所述的方法,其中所述捕獲多肽選自包括HDL蛋白質組、LDL蛋白質組的至少一種組分或至少一種血清蛋白的多肽。
11.一種檢測生物樣品中包含YFAK或YEAK肽的DSP組合物存在的方法,包括以下步驟 (a)使生物樣品與至少一種捕獲多肽接觸,所述捕獲多肽包括選自以下組的肽補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α-I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號NO.CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2_HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,Ig Al Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,α-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及 IgJ-鏈;和 (b)檢測捕獲多肽與DSP組合物的結合存在與否, 其中,存在這種結合表明生物樣品中YEAK或YFAK肽的存在。
12.—種檢測生物樣品中包含YFAK肽或YEAK肽的DSP組合物含量的方法,包括以下步驟 a.使生物樣品與至少一種捕獲多肽接觸,所述捕獲多肽包含選自以下組的肽補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白, α -I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號NO.CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2_HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,Ig Al Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及 IgJ-鏈;和 b.定量測定捕獲多肽與DSP組合物的結合水平, 其中,結合水平表示生物樣品中DSP組合物的含量。
13.一種測定DSP組合物在哺乳動物體內生物利用度的方法,包括以下步驟 a.給予哺乳動物一個劑量的含DSP組合物的組合物; b.從受試對象取生物樣品; c.使該生物樣品與至少一種捕獲多肽接觸,所述捕獲多肽包含選自以下組的肽補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α-I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號NO.CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2_HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,Ig Al Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及 IgJ-鏈; 從而確定生物樣品中DSP組合物的生物利用度。
14.一種確定對有需要的對象給予DSP組合物的合適劑量的方法,包括以下步驟 a.給予受試對象一個劑量DSP組合物; b.從受試對象取生物樣品; c.使生物樣品與至少一種捕獲多肽接觸,所述捕獲多肽包含選自以下組的肽補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α -I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號NO.CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2_HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,Ig Al Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,α-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及 IgJ-鏈; d.檢測該生物樣品中捕獲多肽的水平; e.任選地用不同劑量重復步驟(a)至(d);和 f.將生物樣品中測得的這些水平與DSP組合物預定的合適水平比較; 其中合適劑量是導致生物樣品中DSP組合物達到預定合適水平的劑量。
15.一種治療或預防受試對象不希望有的免疫應答反應的方法,包括以下步驟 a.給予受試對象合適劑量的DSP組合物,其中所述合適劑量由如下步驟確定 (i)給予受試對象一個劑量的DSP組合物; (ii)從受試對象取生物樣品; (iii)使生物樣品與至少一種捕獲多肽接觸,所述捕獲多肽包括選自以下組的肽補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α-I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號No. CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a 2-HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,Ig Al Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,α-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及 IgJ-鏈; (iv)檢測生物樣品中該捕獲多肽的水平; (v)任選地用不同劑量重復步驟(i)至(iv);和 (vi)將生物樣品中測得的水平與預定的DSP組合物合適水平作比較; 其中合適劑量是導致生物樣品中DSP組合物達到預定合適水平的劑量。
16.如權利要求11-15之一所述的方法,其中所述捕獲多肽是被標記的多肽。
17.如權利要求11-15之一所述的方法,其中所述捕獲多肽附著于固體支持物上。
18.如權利要求11-15之一所述的方法,還包括分離含結合于DSP組合物的捕獲多肽的復合物。
19.如權利要求11-15之一所述的方法,還包括用抗捕獲多肽的抗體檢測捕獲多肽與DSP組合物的結合。
20.如權利要求11-15之一所述的方法,其中所述組合物是皮下注射給予的。
21.一種用于檢測生物樣品中DSP組合物的組合物,其包含至少一種捕獲多肽,所述捕獲多肽包括選自以下組的肽補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間- α -胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α-I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A_IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號NO.CAA34971),載脂蛋白E,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2-HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子ΙΙ(凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,IgAI Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a -2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及IgJ-鏈。
22.—種分離含DSP組合物樣品中的肽的方法,包括以下步驟 a.使樣品與至少一種捕獲多肽接觸,所述捕獲多肽包括選自以下組的肽補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α -I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號NO.CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2_HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,IgAI Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a -2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及 IgJ-鏈;和 b.從混合物中分離結合于捕獲多肽的肽。
23.如權利要求22所述的方法,其中所述捕獲多肽固定于固體支持物上。
24.如權利要求23所述的方法,其中所述捕獲多肽是表位標記的多肽。
25.如權利要求22所述的方法,還包括從捕獲多肽分離結合的肽。
26.如權利要求22所述的方法,還包括測定所分離的肽的特性。
27.如權利要求26所述的方法,其中所述測定所述特性包括測定結合肽的氨基酸序列或測定結合肽中氨基酸的相對比例。
28.一種在受試對象上鑒定DSP組合物中生物可利用肽的方法,包括以下步驟 a.在第一時間給予受試對象DSP組合物; b.在給藥后的第二時間從受試對象取組織樣品;和 c.鑒定樣品中結合于至少一種捕獲多肽的肽,所述捕獲多肽包括選自以下組的肽補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α -I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號NO.CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2_HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,Ig Al Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No.CAA28659),及 IgJ-鏈。
29.一種制備含毒性減弱的DSP組合物的方法,包括以下步驟 a.使DSP組合物與至少一種捕獲多肽接觸,所述捕獲多肽包括選自以下組的肽補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α -I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號No. CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a 2-HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,Ig Al Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,α-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及 IgJ-鏈; b.將結合于捕獲多肽的肽與混合物分離; c.測定所分離肽的特性;和 d.制備具有所分離肽的特性的一系列肽。
30.一種制備效應增強的DSP組合物的方法,包括以下步驟 a.使DSP組合物與至少一種捕獲多肽接觸,所述捕獲多肽包括選自以下組的肽補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α-I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號NO.CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2_HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,Ig Al Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及 IgJ-鏈; b.將結合于捕獲多肽的肽與混合物分離; c.測定所分離肽的特性;和 d.制備具有所分離肽的特性的一系列肽。
31.一種治療或預防受試對象不希望有的免疫應答反應的方法,包括 a.提供一種DSP組合物; b.給予受試對象該DSP組合物; c.從受試對象取生物樣品; d.使此生物樣品與至少一種捕獲多肽接觸,所述捕獲多肽包括選自以下組的肽序列補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α -I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號NO.CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2_HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,Ig Al Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及 IgJ-鏈; e.將結合于捕獲多肽的肽與混合物分離; f.測定所分離肽的特性; g.制備具有所分離肽的特性的一組肽;和 h.將這組新的肽給予受試對象。
32.如權利要求28或31所述的方法,其中所述肽給予受試對象一次以上。
33.如權利要求32所述的方法,其中所述肽以1,2,3,4,6,12,18,24,36,48或72小時的間隔給予受試對象。
34.一種比較DSP組合物不同制劑的方法,包括以下步驟a.使第一種DSP組合物與正常人血清、正常非人靈長類動物血清、正常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常豬血清、正常狗血清、正常馬血清、正常綿羊血清、正常母牛血清中所含的至少一種捕獲多肽接觸; b.使第二種DSP組合物與正常人血清、正常非人靈長類動物血清、正常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常豬血清、正常狗血清、正常馬血清、正常綿羊血清、正常母牛血清中所含的至少一種捕獲多肽接觸; c.必要時重復步驟(b); d.從步驟(a-c)的混合物中分離結合于捕獲多肽的肽; e.測定步驟(d)分離的肽的特性;和 f.比較具有步驟(d)分離的肽的特性的所述一組分離肽。
35.一種制備靶向受試對象組織的治療劑的方法,包括以下步驟 a.提供DSP組合物;和 b.將治療劑與DSP組合物偶聯以形成偶聯物。
36.一種向受試對象特定組織遞送治療劑的方法,包括以下步驟 a.通過以下步驟分離標記肽 (i)使DSP組合物與組織特異性肽接觸,所述組織特異性肽包括選自以下組的肽補體組分C3,載脂蛋白A-I前原蛋白,載脂蛋白A-II前原蛋白(載脂蛋白D),補體組分C4A,胰蛋白酶抑制劑,間-α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白,α-I-抗胰蛋白酶,載脂蛋白A-IV,血漿銅藍蛋白,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登錄號NO.CAA34971),載脂蛋白Ε,補體因子B,前白蛋白,載脂蛋白C-III,a2_HS糖蛋白,載脂蛋白J前體,C鏈,IgM,免疫球蛋白λ輕鏈,凝血因子II (凝血酶),IgK鏈V-III (KAU冷凝集素),載脂蛋白J前體,Ig Al Bur,富含組氨酸的糖蛋白前體,a-2-HS糖蛋白,凝溶膠蛋白同工型a前體,抑制劑Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白產物(NCBI基因座/登記號No. CAA28659),及 IgJ-鏈; (ii)從混合物中分離結合于組織特異性肽的肽; b.將標記肽與治療劑偶聯;和 c.將偶聯物給予受試對象。
37.如權利要求35或36所述的方法,其中所述治療劑是有機小分子或生物大分子。
38.如權利要求35或36所述的方法,其中所述組織是腦、肺或肝組織。
39.如權利要求35或36所述的方法,其中所述標記肽通過共價鍵、包絡物、離子鍵或氫鍵偶聯于治療劑。
全文摘要
本領域已有檢測簡單肽的方法。然而,檢測定向序列聚合物(DSP)有效血漿濃度的方法是復雜的,因為與具有明確氨基酸序列的各別肽相反,DSP是肽的復雜混合物。本申請?zhí)峁z測和評估DSP組合物的改進方法,檢測和定量測定DSP組合物的方法,根據肽亞組與某些捕獲多肽的相互作用確定和富集DSP組合物中肽亞組的方法,和對需要的對象給予DSP組合物的方法,其中,劑量方案和用量可根據上述檢測和定量方法加以確定和評估。
文檔編號G01N33/53GK102869990SQ201080052758
公開日2013年1月9日 申請日期2010年11月17日 優(yōu)先權日2009年11月17日
發(fā)明者E·扎內利, J·克里格, J·康諾利, K·H·柯林斯 申請人:阿雷斯貿易股份有限公司