專利名稱：前驅糖尿病的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種前驅糖尿病的檢測方法。更詳細地，本發(fā)明涉及一種通過測定作為血液標記的糖化蛋白來進行特別是前驅糖尿病的胰島素抵抗以及糖耐量受損的檢測的方法、以及能夠基于此在一次健康診斷階段中簡便地檢測前驅糖尿病的前驅糖尿病檢測方法，其中所述糖化蛋白為具有喃唳結構或咪唑啉酮(imidazolone)結構的體內物質,包括精氨卩密唳化合物或輕基咪唑酮(hydroimidazolone)化合物等。
背景技術：
到2030年為止，全世界的糖尿病患者人數(shù)將從目前的2億8，500萬人增長到超過4億人，其中約9成是以生活習慣病為主要原因的肥胖型糖尿病患者。在我國，目前估計已
經(jīng)有大約超過1，000萬人的肥胖型糖尿病患者，患者人數(shù)還在逐年上升。然而，實際上接受糖尿病治療的糖尿病患者還不足300萬人，由于未接受足夠的診斷而放置病情，耽誤了治療，從而引發(fā)腎臟疾病的患者，毎年持續(xù)增加I萬人。而且，近年來，有人指出，在前驅糖尿病(所謂的糖尿病預備軍)中，盡管空腹血糖(Fasting Plasma Glucose :FPG)正常，但是由于糖耐量受損(Impaired GlucoseTolerance :IGT)而導致飯后血糖值極高(隱匿型糖尿病)，因而引發(fā)心血管疾病的患者正在増加。因此，美國糖尿病學會和世界保健機構規(guī)定，前驅糖尿病是顯著的疾病，提倡通過生活習慣的質量改善和藥物治療來改善前驅糖尿病的IGT的重要性?？紤]到在日本患有這樣的前驅糖尿病的患者估計有超過1，000萬人的現(xiàn)狀，不難想象，糖尿病患者人數(shù)在不久的將來將會劇增。作為前驅糖尿病和糖尿病的診斷標準，日本糖尿病學會在一次健康診斷中指導空腹血糖(FPG)的實施,另外在二次健康診斷中指導ロ服葡萄糖耐量試驗(Oral GlucoseTolerance Test :0GTT)的實施。由于僅進行一次健康診斷的FPG檢測或糖化血紅蛋白(HbAlc)檢測，難以準確診斷前驅糖尿病患者的IGT，因此，對于在一次健康診斷中疑似患有前驅糖尿病的受試者，建議接受OGTT的二次健康診斷。由于該OGTT除帶來糖攝取這樣的身體負擔以外，為了接受檢測還不得不請假，因此，事實上，對于從事前驅糖尿病患病率高的工作的中老年人來說，接受OGTT的二次健康診斷是較大的負擔。但是，疏于接受二次健康診斷的潛在前驅糖尿病患者，在未接受治療的情況下確實發(fā)展成真性糖尿病，而未覺察到糖尿病或其并發(fā)癥，從而導致出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥癥狀，或者不得不進行腎透析。鑒于該現(xiàn)狀，考慮到在僅目前的治療費就已經(jīng)達到幾萬億日元水平的腎透析患者的原發(fā)性糖尿病患者中，約半數(shù)患者因心肌梗塞或腦梗塞等缺血性疾病而死亡，這樣下去，與糖尿病及其并發(fā)癥相關的醫(yī)療費將不可避免地高漲。如上所述，在一次健康診斷中，通常實施以空腹血糖(FPG)、隨時血糖或糖化血紅蛋白(HbAlc)為判斷指標的檢測，F(xiàn)PG值為100mg/dL以上、或HbAlc值為5. 2%以上時，診斷疑似胰島素抵抗或由此引發(fā)的IGT。但是，由胰島素抵抗引發(fā)的IGT表現(xiàn)為以飯后高血糖為主的初期變化，因此，可以說在現(xiàn)有的一次健康診斷中使用的所有指標在準確度這一點上都不夠。因此，現(xiàn)實是，對于在一次健康診斷中使用這些指標而疑似胰島素抵抗或IGT的受試者，在二次健康診斷或以后的健康診斷中實施ロ服75g葡萄糖耐量試驗(75g 0GTT)、血液中膜島素、穩(wěn)定模型評估指數(shù)(Homeostasis model assessment ratio、H0MA-R)等檢測，通過這些費事的試驗來檢測胰島素抵抗或IGT是否是陽性，從而進行前驅糖尿病的確診。因此，如果有能夠利用一次健康診斷中所使用的相同的用于測定血糖的采血樣品、以與OGTT同等的準確度來確診前驅糖尿病的方法，就能夠飛躍提高前驅糖尿病患者的檢出率，而且不需要二次健康診斷中的OGTT檢測，能夠推進世界保健機構等提倡的通過前驅糖尿病的早期診斷和治療而實施的糖尿病化阻止戰(zhàn)略。在此，對在二次健康診斷或其之后的糖尿病診斷中使用的檢測方法進行簡單說明。 (I) ロ服75g葡萄糖耐量試驗(75g OGTT)該ロ服75g葡萄糖耐量試驗(75g OGTT)為表示檢測時刻的IGT的檢測，包括喝完含75g葡萄糖的溶液后，經(jīng)過一定時間測定血糖值、尿糖、血液中胰島素值等，觀察經(jīng)時變化。在國內的診斷標準中，采用該OGTT的2小時血糖值。關于該75g 0GTT，除檢測花時間以外，還有攝取葡萄糖后導致嚴重的高血糖的可能性，因此應該慎重實施。(2)血液中胰島素值近年來，血液中胰島素值不包含在診斷標準中，但是，其由干與代謝癥候群相關而受到關注。肥胖型糖尿病或前驅糖尿病的IGT的較大原因有，血液中胰島素的靈敏度降低即胰島素抵抗，因此，被確認為IGT的前驅糖尿病或肥胖型糖尿病患者的血液中胰島素濃度比健康人高(例如，早晨空腹時的血液中胰島素濃度為15iiU/mL以上時，胰島素抵抗明顯為陽性，發(fā)生IGT的可能性高)。(3)穩(wěn)定模型評估指數(shù)(Homeostasis model assessment ratio、H0MA-R)空腹血糖為140mg/dL以下時，認為HOMA-R與IGT的值等很相關，利用下述式中所示的空腹血糖與空腹時血液中胰島素濃度之間的關系來計算HOMA-R。HOMA-R =空腹時胰島素值(U U/mL) X空腹血糖(mg/dL) /405在上述式中，HOMA-R為2. 5以上時，有胰島素抵抗；HOMA-R為1.6以下時，正常。但是，HOMA-R是一次健康診斷以外的項目，不能用于胰島素治療中的患者。(4)葡萄糖鉗夾法葡萄糖鉗夾法是，通過注射葡萄糖和胰島素，并制定維持血糖值的正常值的要點，從而調查胰島素能夠使受試者的血糖值下降多少，即給予胰島素的有效程度(機體的胰島素靈敏度)的方法。在目前所使用的胰島素抵抗的測定中，該葡萄糖鉗夾法最準確，但是，由于其處理麻煩，因此，一般即使在醫(yī)院中也很少用。另外，眾所周知，作為生成糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycation Endproducts AGEs)的反應而公知的美拉德反應在體內進行，參與老化或已經(jīng)出現(xiàn)癥狀的糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展，其中所述糖基化終末產(chǎn)物作為氧化應激誘導因子而公知(例如參照非專利文獻I)。該美拉德反應為包括前期階段和后期階段這兩個階段的反應，在前期階段的反應中，蛋白質的側鏈氨基或N末端氨基與糖的羰基反應，生成席夫堿后，生成阿馬多利重排(amadori rearrangement)化合物。這樣生成的存在于體內的該前期階段反應產(chǎn)物，已知例如有HbAlc或糖化白蛋白等，已知其參與各種疾病，特別是糖尿病。另ー方面，在后期階段的反應中，上述前期階段反應產(chǎn)物進ー步經(jīng)過氧化、脫水、縮合、環(huán)狀化等復雜反應，生成具有熒光性、褐色化、分子內和分子間交聯(lián)以及生物識別中至少任意ー種特性的作為后期反應產(chǎn)物的被稱作糖化蛋白的糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)。S卩，已知氨基酸、肽或蛋白質的氨基與還原糖的醛基發(fā)生非酶縮合并被糖化，分別被轉化成糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白(以下有時簡稱為“糖化蛋白等”)。作為在上述美拉德反應前期階段中的反應性羰基化產(chǎn)物之一的丙酮醛(以下有時簡稱為“MG0”)，已知特別是在血液中大量存在，還公開了其在糖尿病患者中的血清水平高，或者在通過鏈脲霉素而誘導糖尿病的大鼠的眼球晶體中大量存在(非專利文獻2、3)。另外，不僅發(fā)表了 MGO以體內濃度水平與蛋白質反應生成熒光性產(chǎn)物，起生成AGE的直接介質的作用，而且還發(fā)表了 MGO與糖尿病或老化之間的關聯(lián)性(非專利文獻4、5、6)，MGO與胰島素 抵抗或血管疾病之間的關聯(lián)性(非專利文獻7、8)等。可以說，具有這樣的功能的丙酮醛(MGO)與構成蛋白質的氨基酸側鏈，特別是與堿性的賴氨酸或精氨酸側鏈發(fā)生化學反應，阻礙參與組織重建的蛋白酶或膠原酶的酶反應，引起組織損傷，另一方面，MGO使構成與代謝、調節(jié)相關的功能蛋白質的活性中心的氨基酸側鏈改性失活，參與代謝毒性。然而，可以認為，MGO在通常的狀態(tài)即氧化應激不亢進的狀態(tài)下，通過こニ醛酶被解毒為d-乳酸，但是，在氧化應激亢進的血糖管理狀態(tài)下，MGO的解毒機制發(fā)生障礙，對神經(jīng)細胞和血管內產(chǎn)生障礙，成為神經(jīng)損傷、或視網(wǎng)膜病變、腎炎等糖尿病并發(fā)癥的原因(例如參照專利文獻I)。因此，盡管測定MGO作為糖尿病并發(fā)癥的指標非常有用，但是，由于MGO的化學反應性高，而且因其含量變化而難以控制等原因，MGO的直接測定極其困難。然而，已知未在體內發(fā)生解毒代謝而殘留的過量MGO中的一部分利用其高化學反應性，與蛋白質的精氨酸側鏈反應，生成作為糖基化終末產(chǎn)物(AGE)的精氨喃唳化合物(argpyrimidines APs )或輕基咪唑酮化合物等丙酮酸-精氨酸加合物(methylglyoxal-arginine adduct)(例如參照非專利文獻9、10)。因此,嘗試著眼于該丙酮醛-精氨酸加合物，測定該丙酮醛-精氨酸加合物，以間接測定MG0。發(fā)表了實際上在使用了對于被MGO改性的氨基酸的多克隆抗體的免疫組織學研究中，人動脈硬化病灶存在于利用該多克隆抗體較強染色的部位(例如參照非專利文獻11)。而且，公開了使用能夠特異性地識別精氨嘧啶的抗單克隆抗體(例如參照專利文獻I、3、4)來測定丙酮醛-精氨酸加合物的結果顯示，對糖尿病性腎臟疾病或缺血性腦梗塞中的腦動脈病變部的特異性免疫染色是有用的(例如參照非專利文獻12);公開了丙酮醛-精氨酸加合物與糖尿病性視網(wǎng)膜病變部位之間的關聯(lián)性(例如參照非專利文獻13);公開了丙酮醛-精氨酸加合物對糖尿病患者的血管并發(fā)癥是有用的(例如參照非專利文獻14)。從上述背景來看，認為通過特異性地檢測精氨嘧啶或其部位來檢測糖化蛋白，在臨床學上或分析方法上非常有用。因此，有人提出了使用了上述抗單克隆抗體的丙酮醛-精氨酸加合物的測定方法(例如參照專利文獻1、3、5)。在這些現(xiàn)有技術文獻中，均記載了丙酮醛-精氨酸加合物可用作已經(jīng)出現(xiàn)癥狀(血糖值顯著上升)的糖尿病或糖尿病并發(fā)癥用標記的可能性，但是，既未明示也未暗示丙酮醛-精氨酸加合物作為由胰島素抵抗引起IGT的前驅糖尿病的診斷標記的有用性。有人發(fā)表了，通過對于該AGE衍生物的抗體進行的免疫學研究發(fā)現(xiàn)，該AGE衍生物在老化、糖尿病、和糖尿病性腎炎等中為陽性(例如參照非專利文獻15、16、17)。還記載了作為該AGE衍生物之一的羧甲基賴氨酸可用作已經(jīng)出現(xiàn)癥狀(空腹或隨時血糖值顯著上升)的糖尿病的并發(fā)癥診斷用標記(例如參照專利文獻2)。但是，既未明示也未暗示該AGE衍生物能否用作對于前驅糖尿病的診斷標記?，F(xiàn)有技術文獻專利文獻專利文獻I :特開2004-309147號(專利第4146264號)專利文獻2 :特開平9-178740號專利文獻3 :特開平1ト246600號(專利第4013312號)專利文獻4 :特開平11-246599號專利文獻5 :特開2004-309147號(專利第4146264號) 非專利文獻非專利文獻I Bio Industry, Vol. 3, No. 7, p. 14, 1996非專利文獻2 Biochem. Pharmacol. , Vol. 46, pp. 805-811，1993非專利文獻3 Clin. Sci.，Vol. 87，pp-21-29，1994非專利文獻4 Biochim. Biophys. Acta. , Vol. 1270, pp. 36-43，1995非專利文獻5 J. Biol. Chem.，Vol. 269，pp. 32299-32305，1994非專利文獻6 J. Biol. Chem.，Vol. 267，pp. 4364-4369，1992非專利文獻7 Diabetes, Vol. 55，pp. 1289-1299，2006非專利文獻8 J. Cell Biochem.，Vol. 103，pp. 1144-1157，2008非專利文獻9:Archives Of Biochemistry And Biophysics, 1997, Vol. 344, No. I,pp.29-36非專利文獻10 :Invest6.0phthalmol.Vis.Sci. ,December2003, vol. 44, no. 12, pp. 5287-5292非專利文獻11 FEBS Letters, Vol. 410，pp. 313-318，1997非專利文獻12:The Journal Of Biological Chemistry 1999, Vol. 274, No. 26, pp. 18492-18502非專利文獻13 :Current Eye Research 2001, Vol. 23, No. 2, pp. 106-115非專利文獻14:The Journal OfBiological Chemistry1998，Vol. 273, No. 12，pp. 6928-6936非專利文獻15 J. Clin. Invest.，85，380-384，1990非專利文獻16 J. Biol. Chem.，263，3758-3764，1989非專利文獻17 J. Clin. Invest.，89，1102-1112，199
發(fā)明內容
本發(fā)明人為開發(fā)有效、迅速且簡便地實施前驅糖尿病的診斷的技術，進行潛心研究，結果發(fā)現(xiàn)了通過測定作為機體試樣中的體內物質的精氨嘧啶化合物(以下也稱作“AP化合物”)或羥基咪唑酮化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物作為診斷標記，能夠有效、迅速且簡便地實施胰島素抵抗或由其引發(fā)的IGT (IGT)的檢測的胰島素抵抗或IGT檢測方法，并且發(fā)現(xiàn)了根據(jù)該結果來檢測前驅糖尿病的前驅糖尿病檢測方法、特別是可在一次健康診斷中實施的前驅糖尿病的檢測方法。S卩，本發(fā)明人著眼于作為丙酮醛(MGO)蛋白結合體的AP化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物起IGT誘導因子的作用的可能性，并進行潛心研究，結果發(fā)現(xiàn)了丙酮醛改性精氨酸衍生物的增加與IGT的發(fā)展之間密切的關聯(lián)性，通過測定機體試樣中的丙酮醛改性精氨酸衍生物，能夠進行IGT的檢測，能夠在一次健康診斷中檢測前驅糖尿病。本發(fā)明人使用可選擇性識別丙酮醛改性精氨酸衍生物的單克隆抗體，調查血液中AP與由肥胖引起的內臟脂肪的増加之間的關聯(lián)性，結果發(fā)現(xiàn)了血液中丙酮醛改性精氨酸衍生物與內臟脂肪的増加之間具有相關關系。因此，本發(fā)明基于這些見解而完成。本說明書中使用的術語“前驅糖尿病”或“前驅”是指，空腹血糖(FPG)為平常值或
比平常值稍高的值、即為lOOmg/dL以上且不足110mg/dl或不足126mg/dL吋，疑似出現(xiàn)前驅糖尿病的癥狀，在糖耐量(OGTT)試驗中，相當于糖負荷2小時后的血糖值為140-199mg/dl的情況(日本糖尿病學會ガィドラィン2010/2009新區(qū)分)。即，前驅糖尿病或前驅的患者在日本是被稱作所謂的糖尿病預備軍的患者。但是，在美國糖尿病學會和世界保健機構中，認為前驅已經(jīng)是由飯后高血糖等而引發(fā)動脈硬化惡化的危險性高的顯著的疾病。另外，空腹血糖(FPG)為126mg/dl以上、或糖耐量(OGTT)的血糖值為200mg/dl以上吋，診斷為糖尿病。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種前驅糖尿病的檢測方法，其包括通過測定血液試樣等試樣中的AP化合物或羥基咪唑酮化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物來檢測有無特別是前驅糖尿病的胰島素抵抗或IGT。本發(fā)明的目的在于提供一種作為優(yōu)選的方式的前驅糖尿病的檢測方法，其利用測定體系來測定血液等機體試樣中的丙酮醛改性精氨酸衍生物，其中該測定體系使用了特異性地識別AP化合物或羥基咪唑酮化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物的抗體，例如單克隆抗體或多克隆抗體，所述測定體系優(yōu)選為酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-1 inkedimmunosorbent assay)測定體系(以下有時簡稱作“ELISA測定體系”)。本發(fā)明的目的在于提供一種作為更優(yōu)選的方式的前驅糖尿病的檢測方法，其包括一次抗體反應エ序，使試樣中的AP化合物或羥基咪唑酮化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物與抗丙酮醛單克隆抗體等一次抗體反應；固相化工序，將血清白蛋白(BSA)等蛋白質與丙酮醛(MGO)反應而得到的蛋白質-丙酮醛(MGO)偶聯(lián)物固相化；MG0- —次抗體反應エ序，將利用該一次抗體反應エ序處理的該試樣添加到該固相化蛋白質-MGO偶聯(lián)物中，使該蛋白質-MGO偶聯(lián)物的MGO與該試樣中的一次抗體反應；以及測定エ序，使利用該MGO- —次抗體反應エ序反應后的一次抗體與標記二次抗體反應，測定該標記二次抗體。本發(fā)明的目的在于提供一種作為更優(yōu)選的方式的前驅糖尿病的檢測方法，其根據(jù)標準樣品中的丙酮醛(MGO)值的校正曲線，使試樣中的丙酮醛(MGO)值定量。本發(fā)明的目的在于提供ー種作為其它方式的前驅糖尿病的檢測方法，其包括根據(jù)上述前驅糖尿病的胰島素抵抗或IGT檢測的結果，檢測前驅糖尿病。本發(fā)明的前驅糖尿病的檢測方法對于特別是標準血糖值不足110mg/dl的血液試樣的檢測有用。
本發(fā)明的目的在于提供ー種作為其它方式的測定用試劑盒，其用于通過上述測定方法來檢測前驅糖尿病。在本說明書中，即使在僅以“AP化合物”或“精氨嘧啶化合物”或相關術語為例進行說明吋，除應該解釋為限于該術語的情況之外，該術語除應該解釋為AP化合物以外，還應該解釋為包括羥基咪唑酮化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物。為達到上述目的，本發(fā)明提供一種前驅糖尿病的檢測方法，其通過測定血液等機體試樣中的用通式[I][化學式I]
權利要求
1.一種前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，通過測定通式[I] [化學式I]
2.根據(jù)權利要求I所述的前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，符號R所示的含N雜環(huán)基為式[VI] [化學式2]
3.根據(jù)權利要求I或2所述的前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，丙酮醛改性精氨酸衍生物[I]為通式[II] [化學式6]
4.根據(jù)權利要求1-3中任意一項所述的前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，所述丙酮醛改性精氨酸衍生物[I]為式[VI] [化學式10]
5.根據(jù)權利要求1-4中任意一項所述的前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，利用測定體系來測定所述丙酮醛改性精氨酸衍生物，其中該測定體系使用了識別該丙酮醛改性精氨酸衍生物的抗體。
6.根據(jù)權利要求5所述的前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，所述抗體為特異性地識別所述丙酮醛改性精氨酸衍生物的單克隆抗體或多克隆抗體。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，該測定體系為ELISA測定體系。
8.根據(jù)權利要求5-7中任意一項所述的前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，該測定體系包括 一次抗體反應工序，使試樣中的丙酮醛改性精氨酸衍生物與一次抗體反應； 固相化工序，將血清白蛋白與丙酮醛反應而得到的血清白蛋白-丙酮醛偶聯(lián)物固相化； 丙酮醛-一次抗體反應工序，將利用該一次抗體反應工序處理后的該試樣添加到利用該固相化工序而固相化的該血清白蛋白-丙酮醛偶聯(lián)物中，使該血清白蛋白-丙酮醛偶聯(lián)物的丙酮醛與該試樣中的一次抗體反應；以及 測定工序，使利用該丙酮醛-一次抗體反應工序反應后的一次抗體與標記二次抗體反應，測定該標記二次抗體。
9.根據(jù)權利要求8所述的前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，該一次抗體為抗丙酮醛單克隆抗體。
10.根據(jù)權利要求1-9中任意一項所述的前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，該方法包括對于進一步測定的丙酮醛值，根據(jù)標準試樣的校正曲線，使該試樣中的丙酮醛量定量。
11.根據(jù)權利要求1-10中任意一項所述的前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，測定血液試樣中的丙酮醛改性精氨酸衍生物。
12.根據(jù)權利要求1-11中任意一項所述的前驅糖尿病的檢測方法，其特征在于，該血液試樣的標準血糖值小于110mg/dL或小于126mg/dL。
13.一種前驅糖尿病檢測用試劑盒，其特征在于，該試劑盒為通過測定丙酮醛改性精氨酸衍生物來進行權利要求I中所述的前驅糖尿病的胰島素抵抗以及IGT的檢測用試劑盒，用于檢測有無前驅糖尿病的胰島素抵抗以及IGT，并根據(jù)該結果來檢測前驅糖尿病，其包括下述組成 丙酮醛改性精氨酸衍生物、一次抗體、將丙酮醛(MGO)與牛血清白蛋白(BSA)的BSA-MGO偶聯(lián)物固相化后的固相化板、二次抗體、標記抗體(例如HRP標記抗體等)以及標準試樣的標準曲線。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過測定丙酮醛改性精氨酸衍生物來進行前驅糖尿病檢測的方法，其能夠與測定血糖值相同地，簡便且安全地處理多個試樣，并且利用在一次健康診斷中實施的一次采血完成，且能夠解決受試者的時間限制和繁雜性或危險性等問題。本發(fā)明的通過測定丙酮醛改性精氨酸衍生物來檢測前驅糖尿病的方法包括利用測定體系來測定血液中的丙酮醛改性精氨酸衍生物，其中該測定體系使用了特異性識別丙酮醛改性精氨酸衍生物的抗體。
文檔編號G01N33/53GK102792162SQ20108005801
公開日2012年11月21日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權日2009年12月28日
發(fā)明者渡邊俊明 申請人:學校法人福岡大學