專利名稱：：在食物中發(fā)現(xiàn)的酚類化合物的協(xié)同相互作用的制作方法在食物中發(fā)現(xiàn)的酚類化合物的協(xié)同相互作用相關(guān)申請的交叉引用要求2009年10月20日提交的美國臨時專利申請61/279，368;2010年3月2日提交的美國臨時專利申請61/339，244;和2010年7月14日提交的美國臨時專利申請61/399，548的權(quán)益，在此通過引用將它們并入。
背景技術(shù)：
：植物產(chǎn)生酚類化合物，以起到細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子、抗氧化劑、或侵襲害蟲的毒素(Crozier和其他人,2006)的作用。研究已經(jīng)探討了水果成分(Robards和其他人，1999;Franke和其他人，2004；Harnly其他人，2006)，主要的重點放在酚類化合物上，這是因為它們的高抗氧化能力。在水果中發(fā)現(xiàn)的濃度下的單個酚類化合物的抗氧化能力和全果的抗氧化能力之間有差異(Miller和Rice-Evans,1997;Zheng和Wang,2003);全果的抗氧化能力更高。針對該差異的可能的解釋可包括水果中未被識別的化合物、以低濃度存在于水果中的很多化合物的總和或酚類化合物之間的協(xié)同相互作用。LiIa和Raskin(2005)討論了植物內(nèi)可改變其藥理學(xué)作用的內(nèi)相互作用(endointeraction)或相互作用、以及外相互作用(exointeraction)方面的相加或協(xié)同增強，所述相互作用為不相關(guān)的植物成分和/或藥物之間的相互作用。通過外相互作用的抗氧化協(xié)同作用已經(jīng)受到了ー些關(guān)注。Yang和Liu(2009)報告了蘋果提取物和槲皮素3-β-D-葡萄糖苷的組合顯示了對人乳腺癌細(xì)胞的協(xié)同抗増殖活性。大豆和苜蓿植物雌激素提取物和針葉樓桃(acerolacherry)提取物的組合協(xié)同地起作用，抑制LDL體外氧化(Hwang和其他人，2001)。Liao和Yin(2000)說明了在Fe2+-誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化系統(tǒng)中與單獨的任一化合物相比，α-生育酚和/或抗壞血酸與咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、楊梅黃酮、五倍子酸、槲皮素和蕓香苷的組合具有更大的抗氧化活性。目前的興趣在于開發(fā)或發(fā)現(xiàn)有效的天然防腐劑(Galal，2006)。方法包括使用提取物(Serra和其他人，2008;Conte和其他人，2009)、酌·類化合物(Rodr'iguezVaquero和Nadra,2008)或作為抗菌劑的化合物的混合物(Oliveira和其他人，2010)。理解潛在抗氧化混合物功能之后的機制對于它們作為防腐劑的潛在開發(fā)是重要的。參考文獻(xiàn)Amie1D,Davidovi1cD,Be.sloD,RastijaV,Lu.cB,Trinajsti1oftheantioxidantactivityoffiavonoids.CurrMedChem14:827-45.Bravo,L,1998.Polyphenols:Chemistry,dietarysources,metabolism,andnutritionalsignificance.NutritionReviews56,317-333.BuettnerGR.1993.Thepeckingorderoffreeradicalsandantioxidants:lipidperoxidation,alpha-tocopherol,andascorbate.ArchBiochemBiophys300:535-43.ConteA,ScroccoC,SinigagliaM,DelNobileMA.2009.Lemonextractasnaturalpreservativeinfruitsalad.JFoodSaf29:601-16.CrozierA,CliffordMN,AshiharaHjeds.2006.Plantsecondarymetabolites.Oxford:Blackwe11Publishing.372p.CuvelierC，BondetV，BersetC.2000.Behaviorofphenolicantioxidantsinapartitionedmedium:structure-activityrelationship.JAmOilChemSoc77:819-23.DavalosA,Gomez-CordovesCjBartolomeB.2004.ExtendingApplicabilityoftheOxygenRadicalAbsorbanceCapacity(ORAC-Fluorescein)Assay.JAgricFoodChem52:48-54.Delgado-VargasjF.;Jimenez,A.R.;Paredes-Lopezj0.,2000.Naturalpigments:Carotenoidsjanthocyanins,andbetalains—Characteristics，biosynthesis,processing，andstability.CriticalReviewsinFoodScienceandNutrition40，173—289.DiMajoD，GiammancoM，LaGuardiaM，TripoliE，GiammancoS，F(xiàn)inottiE.2005.Flavanonesincitrusfruit:structure-antioxidantactivityrelationships.FoodResInt38:1161-6.FoleySjNavaratnamSjMcGarveyDJjLandEJjTruscottTGjRice-EvansCA.1999.Singletoxygenquenchingandtheredoxpropertiesofhydroxycinnamicacids.FreeRadicBiolMed26:1202-208.FrankeA,CusterLjArakakiCjMurphyS.2004.VitaminCandflavonoidlevelsoffruitsandvegetablesconsumedinHawaii.JFoodCompostAnal17:1-35.FrankelEN，HuangSWjKannerJ，GermanJB.1994.Interfacialphenomenaintheevaluationofantioxidants:bulkoilvs.emulsions.JAgricFoodChem42:1054-9.Freeman,B.;EggettjD.;Parker,T.Synergisticandantagonisticinteractionsofphenoliccompoundsfoundinnaveloranges.J.Food.Sci.2010，inpress.GalalAM.2006.Naturalproduct-basedphenolicandnonphenolicantimicrobialfoodpreservativesandI,2,3,4-tetrahydroxybenzeneasahighlyeffectiverepresentative:areviewofpatentliterature2000-2005.RecentPatAntiinfectDrugDiscov1:231-9.GitzjD.;LiujL.;McClure，J.PhenoIicmetabolism,growth,anduv_btoleranceinphenylalanineammonia_lyase—inhibitedredcabbage.Phytochemistry.1998，49，377-386.HalliwelljB.，Zhao,K.，Whiteman,M.，2000.Thegastrointestinaltract:AmajorsiteofantioxidantactionFreeRadicalsResearch33，819—830.HarnlyJMjDohertyRF,BeecherGR，HoldenJMjHaytowitzDB,BhagwatS，GebhardtS.2006.FlavonoidcontentofU.S.fruits,vegetablesandnuts.JAgricFoodChem54:9966-77.Hidalgo,M.;Sanchez-MorenojC;dePascual-TeresajS.，2010.Flavonoid-flavonoidinteractionanditseffectontheirantioxidantactivity.FoodChemistry121，691-696.HwangJ，HodisHNjSevanianA.2001.Soyandalfalfaphytoestrogenextractsbecomepotentlow-densitylipoproteinantioxidantsinthepresenceofacerolacherryextract.JAgricFoodChem49:308-14.J01*gensenLVjSkibstedLH.1998.Flavonoiddeactivationofferrylmyoglobininrelationtoeaseofoxidationasdeterminedbycyclicvoltammetry.FreeRadicRes28:335-51.JovanovicSVjSteenkenS，TosicMjMarjanovicB，SimicMG.1994.Flavonoidsasantioxidants.JAmChemSoc116:4846-51.KogaTjTeraoJ.1995.Phospholipidsincreaseradical-scavengingactivityofvitaminEinabulkoilmodelsystem.JAgricFoodChem43:1450-4.LiaoKjYinM.2000.Individualandcombinedantioxidanteffectsofsevenphenolicagentsinhumanerythrocytemembraneghostsandphosphatidylcholineliposomesystems:importanceofthepartitioncoefficient.JAgricFoodChem48:2266-70.LilaMAjRaskinI.2005.Health-relatedinteractionsofphytochemicals.JFoodSci70:R20-7.MillerNJjRice-EvansCA.1997.Therelativecontributionsofascorbicacidandphenolicantioxidantstothetotalantioxidantactivityoforangeandapplefruitjuicesandblackcurrantdrink.FoodChem60:331-7.OliveiraCEVjdeStamfordTLMjGomesNetoNJjdeSouzaEL2010.InhibitionofStaphylococcusaureusinbrothandmeatbrothusingsynergiesofphenolicsandorganicacids.IntJFoodMicrobiol137:312-16.OsmanijS.A.;Hansen,E.H.;Malien-AubertjC;Olsen,C.-E.;BakjS.;MOIIerjB.L.,2009.Effectofglucuronosylationonanthocyanincolorstability.JournalofAgriculturalandFoodChemistry57，3149-3155.OuB，HuangDjHampsch-WoodillM，F(xiàn)lanaganJA，DeemerEK.2002.Analysisofantioxidantactivitiesof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發(fā)明內(nèi)容酚類化合物已知具有抗氧化和抗菌性質(zhì)。這些性質(zhì)可用于食物或飲料的保存。食物內(nèi)酚類化合物的交互抗氧化能力還沒有被很好地探究。理解水果抗氧化劑的組合如何一起作用將有助于它們未來在食物和/或飲料保存中的使用。ー個方面為發(fā)現(xiàn)抗氧化酚類化合物的協(xié)同組合存在于食物中。協(xié)同的內(nèi)相互作用發(fā)生在抗氧化劑本身之間的發(fā)現(xiàn)是重要的。另ー個方面為用于確定抗氧化劑的協(xié)同組合的系統(tǒng)，以及發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用部分取決于這些抗氧化化合物存在于混合物中的比率。另ー個方面為使用食物例如水果作為模型，用于確定可能的協(xié)同抗氧化組合和比率。與其進(jìn)行嘗試所有存在于食物中的抗氧化劑可能的比率和組合的不切實際地漫長和昂貴的過程，不如組合并以它們存在于食物中的比率試驗抗氧化劑。以此方式，將試驗更可能具有協(xié)同抗氧化能力的組合。ー個方面為制造具有協(xié)同抗氧化能力的營養(yǎng)添加物的方法。在食物中，至少兩種抗氧化化合物在食物中被識別，并且它們各自的抗氧化能力被確定。另外，食物中它們相互的比率即食物比率被確定。通過確定混合物的抗氧化能力是否大于相加或預(yù)期的能力——其為單獨來看混合物中化合物抗氧化能力之和，可確定是否在化合物之間在抗氧化能力上存在協(xié)同作用。抗氧化化合物為具有抗氧化能力的化合物。任何合適的系統(tǒng)可被用于測量抗氧化能力。在實施例中，單ー化合物和混合物的抗氧化能力通過氧自由基吸收能力(ORAC)分析被確定。當(dāng)目標(biāo)之ー是表明結(jié)果潛在應(yīng)用于人營養(yǎng)或食物保存吋，由于其在學(xué)術(shù)研究之外常用和熟悉，在抗氧化分析的很多選擇中選擇氧自由基吸收能力(ORAC)分析。然而，考慮確定抗氧化能力的任何合適的方法。合適的方法包括但不限于；ORAC-氧自由基吸收能力分析，NORAC-過亞硝酸鹽ORAC分析，HORAC-羥基ORAC分析，ORAC-PG-氧自由基吸收能力連苯三酚紅分析，DPPH-2,2_ニ苯基-I-苦基肼基自由基分析，F(xiàn)RAP-血衆(zhòng)的三價鐵還原能力分析，TEAC-Trolox等同物抗氧化能力分析，VCEAC-維生素C等同物抗氧化能力分析，ABTS-2丨-連氮基雙-(3-こ基苯并噻唑啉_6_磺酸)分析，CUPRAC-ニ價銅還原抗氧化能力分析，TRAP-總自由基捕獲抗氧化參數(shù)分析，以及CAA-細(xì)胞抗氧化活性分析?？寡趸旌衔镏械膮f(xié)同作用通過首先形成以食物比率包括至少兩種抗氧化化合物的混合物并確定混合物的抗氧化能力進(jìn)行確定，該食物比率為食物中化合物彼此的比率。協(xié)同作用通過將混合物的抗氧化能力與預(yù)期的或相加的抗氧化能力值比較確定。該相加值為，単獨來看或假定每個都獨立地起作用，混合物的單個抗氧化化合物中每ー個的組合抗氧化能力。該比較可通過從所有抗氧化化合物的混合物所得的抗氧化能力中減去各個化合物抗氧化能力之和進(jìn)行計算。正結(jié)果表明協(xié)同作用。負(fù)或統(tǒng)計學(xué)上小正值或無值表明化合物之間的對抗作用或無相互作用。在進(jìn)行抗氧化能力的測量中，幾個樣品的平均將給出統(tǒng)計學(xué)上更好的值。另ー個方面為通過形成具有協(xié)同抗氧化能力的化合物的混合物制成的營養(yǎng)添加物，其為某些抗氧化化合物的混合物，相互之間的比率已經(jīng)確定以具有協(xié)同抗氧化性質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過以在具體食物例如水果中發(fā)現(xiàn)的濃度比率下的各個酚類抗氧化劑開始，可僅用內(nèi)相互作用表明所述協(xié)同作用。這有助于解釋整個食物和單個成分之間的抗氧化能力差異，并且也形成優(yōu)化的水果源抗氧化防腐劑的開發(fā)依據(jù)。食物包括任何種植用于人消費的植物來源的食物，包括已經(jīng)受到后加工的食物，后加工例如干燥、冷凍、加熱(包括巴氏消毒)、與其他成分混合，或任何在被制成可用于人消費前應(yīng)用于食物的加工。任何包含酚類抗氧化化合物的食物被考慮作為食物，并且可被分析以確定抗氧化化合物的協(xié)同組合。例子包括水果(例如以下舉例說明的橙子、草莓和藍(lán)莓)、蔬菜、堅果、雞蛋、植物油、谷物(包括黒米)、大豆、巧克力、肉桂、牛至、發(fā)酵酒(紅葡萄酒)、茶和咖啡。某些肉包括抗氧化劑，例如家禽和魚，并且可被考慮為用于確定協(xié)同抗氧化劑比率的食物。圖I:組合減去組合中各個化合物(等式I至等式3)的氧自由基吸收能力(ORAC)差異。所示出的所有組合都是統(tǒng)計學(xué)上顯著的(P〈0.05，利用Fisher’s最小顯著性差異)；統(tǒng)計學(xué)上不顯著的組合沒有示出。C=綠原酸；H=橙皮苷；L=藤黃菌素；M=楊梅黃酮；N=柚配基；P=對香豆酸；Q=槲皮素。HC表示H和C的混合物的ORAC減去H的ORAC和C的0RAC，對于其他組合也同樣。每個值都是4次重復(fù)的平均值。圖2:在橙子中發(fā)現(xiàn)的濃度下的3種酚類化合物組合的氧自由基吸收能力(ORAC)減去2+1ORAC數(shù)據(jù)之和(等式4)。以此方式分析數(shù)據(jù)解釋了組合模式(pattern)并使其有可能確定哪種化合物相互作用對ORAC最有影響(見進(jìn)一步討論的正文)。所示出的所有組合都是統(tǒng)計學(xué)上顯著的(P〈0.05，利用ANOVA估算)；統(tǒng)計學(xué)上不顯著的組合未示出。C=綠原酸；H=橙皮苷；L=藤黃菌素；M=楊梅黃酮；N=柚配基；P=對香豆酸；Q=槲皮素。HC+N表示H、C和N的混合物的ORAC減去HC的混合物的ORAC和N的0RAC，對于其他組合也同樣。每個值都是4次重復(fù)的平均值。圖3:在橙子中發(fā)現(xiàn)的濃度下的4種酚類化合物的組合的氧自由基吸收能力(ORAC)減去3+1ORAC數(shù)據(jù)之和(等式5)。以此方式分析數(shù)據(jù)解釋了組合模式并使其有可能確定哪種化合物相互作用對ORAC最有影響(見進(jìn)一步討論的正文)。所示出的所有組合都是統(tǒng)計學(xué)上顯著的(P〈0.05，利用ANOVA估算)；統(tǒng)計學(xué)上不顯著的組合未示出。C=綠原酸；H=橙皮苷；L=藤黃菌素；M=楊梅黃酮；N=柚配基；P=對香豆酸；Q=槲皮素。HC+N表示H、C和N的混合物的ORAC減去HC的混合物的ORAC和N的0RAC，對于其他組合也同樣。每個值都是4次重復(fù)的平均值。圖4:酚類化合物的結(jié)構(gòu)和它們的單電子還原電勢。圖5:草莓中抗氧化化合物的結(jié)構(gòu)。圖6:藍(lán)莓中各個化合物的ORAC。圖7:1:1比率的混合物和水果比率混合物與預(yù)期結(jié)果相比較的0RAC。發(fā)明詳述實施例I臍橙中發(fā)現(xiàn)的酚類化合物的協(xié)同和對抗相互作用針對它們的抗氧化能力分析了臍橙(甜橙)中發(fā)現(xiàn)的濃度下的各個酚類化合物(綠原酸、橙皮苷、藤黃菌素、楊梅黃酮、柚配基、對香豆酸和槲皮素)的相互作用，以觀察潛在的對抗、相加、或協(xié)同相互作用。制備2、3和4種酚類化合物的混合物。氧自由基吸收能力(ORAC)分析用于定量這些組合的抗氧化能力。發(fā)現(xiàn)2種化合物的三種不同的組合和3種化合物的5種組合是協(xié)同的。也發(fā)現(xiàn)2種化合物的ー種對抗組合。添加第四種化合物，無另外的協(xié)同作用發(fā)生。開發(fā)了ー種模型以解釋該結(jié)果。還原電勢、相對濃度和兒茶酚(鄰ニ羥基苯)基團(tuán)的存在與缺少是模型中的因子。材料和方法化學(xué)品通過FisherScientificInc.(Waltham,Mass.，U.S.A.)購買Trolox((±)_6_輕基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸)(97%純度，AcrosOrganics)、柚配基(95%,MPBiomedicalsInc.)、槲皮素水合物(95%,AcrosOrganics)、氫氧化鈉(50%溶液)、K2HPO4和KH2PO4(MallinckrodtInc·)。hkSigma-Aldrich(St.Louis,Mo.,U.S.A.)購買綠原酸(95%)、橙皮苷(>80%)、藤黃菌素(99%)、楊梅黃酮(95%)、對香豆酸(98%)和熒光素(Na鹽)ο從WakochemicalsU.S.A.Inc.(Richmond,Va.,U.S.A.)購買AAPH(2,2，-偶?xì)猊?2-甲基丙基味)ニ鹽酸)?；瘜W(xué)物質(zhì)制備選擇橙子中發(fā)現(xiàn)的七種最濃的酚類綠原酸、橙皮苷、藤黃菌素、楊梅黃酮、柚配基、對香豆酸和槲皮素(Proteggente和其他人,2003；Franke和其他人,2004；USDA類黃酮數(shù)據(jù)庫，2007)。除橙皮苷外，每種都在引用的參考文獻(xiàn)中作為糖苷配基(aglycone)定量。所有化合物以公布的濃度制備(表I)。表I選擇的臍橙中發(fā)現(xiàn)的酚類化合物和量?；衔颩g/100g新鮮水果綠原酸αΤθ橙皮苷31藤黃菌素01楊梅黃酮0.0權(quán)利要求1.一種確定具有協(xié)同抗氧化能力的營養(yǎng)添加物的組成的方法，包括(a)識別食物中的抗氧化化合物；(b)測量所述食物中識別的至少兩種所述抗氧化化合物的食物比率，所述食物比率為所述至少兩種化合物的一個與另一個之間的比率；(C)測量所述至少兩種抗氧化化合物的抗氧化能力；(d)以它們的食物比率，形成所述至少兩種抗氧化化合物的混合物；(e)測量所述混合物的抗氧化能力；(f)通過將所述混合物的抗氧化能力與基于所述混合物中所述抗氧化化合物的單獨抗氧化能力值之和所預(yù)期的抗氧化能力相比較，確定所述混合物是否具有協(xié)同抗氧化性質(zhì)，當(dāng)所述抗氧化能力大于所述預(yù)期的抗氧化能力時顯示協(xié)同作用。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，另外包括在所述至少兩種抗氧化化合物的至少ー種是不同的情況下，對于識別的至少兩種抗氧化化合物重復(fù)(b)、(c)、(d)、(e)和(f)。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中四種或更多種抗氧化化合物被識別，并且所述混合物包括至少三種所述抗氧化化合物的組合。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中至少三種抗氧化化合物被識別，并且對于兩種或三種抗氧化化合物的可能組合的另外混合物進(jìn)行所述重復(fù)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中對于兩種或三種抗氧化化合物的所有可能混合物進(jìn)行所述重復(fù)。6.—種包括抗氧化化合物的營養(yǎng)添加物，所述抗氧化化合物基本上由兩種或三種抗氧化化合物以提供協(xié)同抗氧化性質(zhì)的相互比率組成。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的營養(yǎng)添加物，其中所述兩種或三種抗氧化化合物為由如下確定的相互比率(a)識別食物中的抗氧化化合物；(b)測量所述食物中識別的至少兩種所述抗氧化化合物的食物比率，所述食物比率為所述至少兩種化合物的一個與另一個之間的比率；(C)測量所述至少兩種抗氧化化合物的抗氧化能力；(d)以它們的食物比率，形成所述至少兩種抗氧化化合物的混合物；(e)測量所述混合物的抗氧化能力；(f)通過將所述混合物的抗氧化能力與基于所述混合物中所述抗氧化化合物的單獨抗氧化能力值之和所預(yù)期的抗氧化能力相比較，確定所述混合物是否具有協(xié)同抗氧化性質(zhì)，當(dāng)所述抗氧化能力大于所述預(yù)期的抗氧化能力時顯示協(xié)同作用。8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述食物為水果。9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述抗氧化能力由以下測量氧自由基吸收能力分析(ORAC)、過亞硝酸鹽ORAC分析(NORAC)、羥基ORAC分析(HORAC)、氧自由基吸收能力連苯三酚紅分析(ORAC-PG)、.2，2-ニ苯基-I-苦基肼基自由基分析(DPPH)、血漿的三價鐵還原能力分析(FRAP)、Trolox等同物抗氧化能力分析(TEAC)、維生素C等同物抗氧化能力分析(VCEAC)、2’-連氮基雙-(3-こ基苯并噻唑啉-6-磺酸)分析(ABTS)、ニ價銅還原抗氧化能力分析(CUPRAC)、總自由基捕獲抗氧化參數(shù)分析(TRAP)或細(xì)胞抗氧化活性分析(CAA)。10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述抗氧化能力通過ORAC測量。全文摘要多種抗氧化化合物的協(xié)同營養(yǎng)添加物，其比率源自自然產(chǎn)生的食物中的比率。文檔編號G01N33/02GK102667469SQ201080058083公開日2012年9月12日申請日期2010年10月19日優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日發(fā)明者T·L·帕克申請人:布萊阿姆青年大學(xué)