專利名稱：L3和/或l5源作為寄生蟲病疫苗或診斷的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備治療、預(yù)防和/或診斷寄生蟲病的藥劑或藥物的L3和/或L5源。
背景技術(shù)：
利什曼病包括若干種由屬于利什曼原蟲(Leishmania)屬的細(xì)胞內(nèi)原生寄生蟲引起的疾病，利什曼原蟲主要感染各種哺乳動(dòng)物(包括人和犬)的巨噬細(xì)胞。疾病譜在很大程度上取決于寄生蟲的種類和人宿主的免疫能力狀態(tài)，范圍從自愈的皮膚利什曼病(CL)到致死的內(nèi)臟利什曼病(VL)或黑熱病(kalaazar) (18)。由嬰兒利什曼原蟲(Leishmaniainfantum)和恰氏利什曼原蟲(L. chagasi)引起的犬內(nèi)臟皮膚利什曼病(VCL)是發(fā)現(xiàn)于地中海盆地、中東和拉丁美洲周圍國家的重要新興動(dòng)物傳染病(16);作為這些寄生蟲的主要儲(chǔ)主，犬在通過白蛉(phebotomine sand flies) (44)傳播給人中起著重要的作用。感染的結(jié)果由宿主免疫系統(tǒng)和不同寄生蟲種類間的相互作用決定，但是利什曼病的發(fā)病機(jī)理仍是不清楚的且關(guān)于涉及對(duì)人和犬中利什曼原蟲的免疫反應(yīng)的機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍是有限的。一般而言，保護(hù)性免疫與典型的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相關(guān)，該典型的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)通過T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化。另一方面，不可治愈的疾病與強(qiáng)烈的體液反應(yīng)的產(chǎn)生相關(guān)(15、24)?；谖醇庸さ募纳x成分或確定的寄生蟲抗原，對(duì)于第二代疫苗的開發(fā)的研究，集中于不同表面或分泌的寄生蟲分子(secreted parasite molecules)的鑒定,所述分泌的寄生蟲分子已利用不同佐藥以幾種試驗(yàn)?zāi)Ｊ阶鳛楹蜻x疫苗被測試(1、17、20、43、45、46、
49、50)。來自感染的動(dòng)物或人的血清的表達(dá)庫的篩選能夠促進(jìn)作為候選疫苗的一些抗原的選擇(參見(9))。在表達(dá)庫中，在感染的小鼠或患者細(xì)胞中主要引出Th1-型免疫反應(yīng)的表達(dá)庫，不考慮細(xì)胞位置，與不同動(dòng)物模型中的保護(hù)性反應(yīng)的產(chǎn)生有關(guān)(48、51、52)。另一方面，一些分離的抗原為細(xì)胞內(nèi)保守蛋白，在用實(shí)驗(yàn)方法感染的小鼠中，所述細(xì)胞內(nèi)保守蛋白主要刺激遭受VL或Th2-介導(dǎo)的體液反應(yīng)的人或犬中的體液反應(yīng)(3、33、35、37、39)。在患有利什曼病的犬中對(duì)利什曼病所引起的不充足的體液反應(yīng)被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致免疫病理(immunopathology),主要由于免疫復(fù)合物(immune complexes)的副作用如葡萄膜炎(uveitis) (13)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變(central nervous system lesions) (14)或腎炎(21、
22、30、31)。最近還顯示了人體內(nèi)IgG免疫復(fù)合物的存在和VL與不能解除感染相關(guān)，表明了免疫復(fù)合物對(duì)感染的宿主可能是不利的(27 )。盡管不作為優(yōu)良的疫苗候選被首先考慮，在感染過程中引起強(qiáng)烈體液反應(yīng)的蛋白質(zhì)與保護(hù)性反應(yīng)的誘導(dǎo)相關(guān)。例如，寄生蟲的微管蛋白和組蛋白H2B被來源于免疫供體的T-細(xì)胞克隆識(shí)別(36)。另外，通過免疫小鼠的T細(xì)胞，rK39引起增殖并產(chǎn)生IFN-Y (23)。還顯示了在小鼠內(nèi)臟利什曼病模型中，利用寄生蟲H2B、H3和H4基因的基因免疫會(huì)引起保護(hù)(62)。而且，激活的C激酶(LACK)受體的免疫(29)，一些寄生蟲半胱氨酸蛋白酶(38、41)或形成Th1促進(jìn)佐藥管理的組蛋白的寄生蟲核小體(11、19)產(chǎn)生了與小鼠模型中抗皮膚利什曼病的保護(hù)相關(guān)的免疫反應(yīng)。在利什曼原蟲進(jìn)化的保守抗原中，幾種跡象表明，在利什曼原蟲感染過程中，核糖體蛋白質(zhì)為免疫相關(guān)的分子。一些情況下，在感染過程中，核糖體成分能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞活性和細(xì)胞因子的釋放的能力導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)功能紊亂。因此，將碩大利什曼原蟲(L. major)核糖體蛋白質(zhì)S3a注入BALB/c小鼠中，引起了 B-細(xì)胞克隆的多克隆擴(kuò)增(polyclonal expansion)并抑制了 T-細(xì)胞的增殖(10)。而且,在小鼠模型中，通過IL-10和Th2細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，利用DNA疫苗編碼用于公認(rèn)的60S核糖體蛋白質(zhì)L31的基因免疫加重了病情(41、63)。另外，在患有利什曼病的犬和人中，一些寄生蟲核糖體蛋白質(zhì)如寄生蟲酸性P蛋白與強(qiáng)烈體液反應(yīng)的發(fā)生相關(guān)(參見(39))。然而，還指出了幾種試驗(yàn)的核糖體蛋白質(zhì)并不能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫性的保護(hù)性反應(yīng)，或者獲得的免疫性保護(hù)反應(yīng)是次優(yōu)的(55、41)。目前，雖然做了許多努力，但仍沒有針對(duì)寄生蟲病(如利什曼原蟲病)有價(jià)值的疫 苗。因此，仍然迫切需要這種疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，我們意外地發(fā)現(xiàn)兩種碩大利什曼原蟲的核糖體蛋白質(zhì)L3和L5是抗原性的。這意味著這兩種蛋白質(zhì)的每一種都能夠被感染利什曼病的個(gè)體的血清識(shí)別。另外，在皮膚利什曼病的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)了 IgGl同型的抗L3和抗L5抗體。在BALB/c小鼠中兩種蛋白質(zhì)的免疫，在CpG-ODN的存在下，誘導(dǎo)抗兩種蛋白質(zhì)的Thl反應(yīng)。作為疫苗接種的結(jié)果，能夠保護(hù)小鼠抵抗碩大利什曼原蟲攻擊后CL的發(fā)展。我們進(jìn)一步論證了碩大利什曼原蟲蛋白質(zhì)還能夠賦予保護(hù)抵抗巴西利什曼原蟲的感染。我們還論證了 L3和L5核糖體蛋白質(zhì)至少在不同的利什曼原蟲物種間是高度保守的。將這種組合物用于藥物組合物，特別是作為診斷、疫苗或治療用途是非常吸引人的。下面進(jìn)一步描述本發(fā)明。用途在本發(fā)明的第一方面，提供了 L3和/或L5源與任選的佐藥在制備用于治療或預(yù)防受試對(duì)象的寄生蟲病的藥物或藥劑中的用途。L3和L5蛋白為核糖體蛋白質(zhì)。核糖體蛋白質(zhì)是很保守的胞衆(zhòng)蛋白質(zhì)。因此，L3和/或L5源可以從任何的真核生物中制得，所述真核生物為植物或動(dòng)物，可以選自哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、魚類、昆蟲類或任何其他具有染色體的生物，如原生動(dòng)物。L3和/或L5源優(yōu)選從與疾病緊密相關(guān)的生物中獲得，優(yōu)選從進(jìn)化樹中引起寄生蟲病的生物中獲得。因此，特別優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療寄生蟲病的L3和/或L5源為原生動(dòng)物如瘧原蟲(Plasmodium)和特別是錐蟲(trypanosomatid)科中的成員，更特別是錐蟲原生動(dòng)物利什曼原蟲的不同物種。存在超過20種已知的利什曼原蟲，包括利什曼原蟲亞屬的物種，包括復(fù)雜的碩大利什曼原蟲，包括碩大利什曼原蟲，復(fù)雜的杜氏利什曼原蟲(L. donovani),包括恰氏利什曼原蟲、杜氏利什曼原蟲和嬰兒利什曼原蟲，復(fù)雜的墨西哥利什曼原蟲(L. mexicana),包括亞馬孫利什曼原蟲(L. amazonensis)和墨西哥利什曼原蟲，以及維納尼亞亞種(subspeciesViannia),包括復(fù)雜的巴西利什曼原蟲(L. braziliensis),包括巴西利什曼原蟲和秘魯利什曼原蟲(L. peruviana)和復(fù)雜的圭亞利什曼原蟲(L. guyanensis),包括圭亞利什曼原蟲和巴拿馬利什曼原蟲(L. panamensis)。特別優(yōu)選的痕原蟲為惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)和間日痕原蟲(Plasmodium vivax)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，L3和/或L5源從利什曼原蟲物種中獲得，優(yōu)選碩大利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲、杜氏利什曼原蟲、墨西哥利什曼原蟲、恰氏利什曼原蟲和/或巴西利什曼原蟲。更優(yōu)選L3源從利什曼原蟲物種中獲得，優(yōu)選碩大利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲和/或墨西哥利什曼原蟲。更優(yōu)選L5源從利什曼原蟲物種中獲得，優(yōu)選碩大利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲、巴西利什曼原蟲和/或墨西哥利什曼原蟲。在實(shí)施例2中，我們證實(shí)了在至少三個(gè)不同的利什曼原蟲物種中存在高度保守的L3和L5同系物(一致性至少為90%，見表I)。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，L3和/或L5源從瘧原蟲物種中獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，L3和/或L5源優(yōu)選還可以通過混合來自本文限定的幾種不同生物的L3和/或L5源而制得。由于L3和/或L5源在治療對(duì)象(treated subject)中表現(xiàn)出誘導(dǎo)免疫保護(hù)性反應(yīng),本文已證實(shí)將L3和/或L5源用于疫苗具有誘人的免疫性能。術(shù)語“L3和/或L5源”可以被“L3源和/或L5源”替換。L3和/或L5源優(yōu)選包 括L3和/或L5蛋白、L3和/或L5衍生的肽或蛋白片段和/或編碼L3和/或L5蛋白或衍生的肽或蛋白片段的核酸。優(yōu)選的L3蛋白如SEQ IDN0:1所示。該優(yōu)選的L3蛋白源于碩大利什曼原蟲且優(yōu)選由SEQ ID N0:2編碼。另一優(yōu)選的L3蛋白如SEQ ID N0:48所示。該優(yōu)選的L3蛋白源于嬰兒利什曼原蟲且優(yōu)選由SEQ ID N0:49編碼。另一優(yōu)選的L3蛋白如SEQ IDN0:50所示。該優(yōu)選的L3蛋白源于墨西哥利什曼原蟲且優(yōu)選由SEQ IDN0:51編碼。優(yōu)選的L5蛋白如SEQ ID NO:3所示。該優(yōu)選的L5蛋白源于碩大利什曼原蟲且優(yōu)選由SEQ ID N0:4編碼。另一優(yōu)選的L5蛋白如SEQ ID N0:52所示。該優(yōu)選的L5蛋白源于嬰兒利什曼原蟲且優(yōu)選由SEQ ID N0:53編碼。另一優(yōu)選的L5蛋白如SEQ ID N0:54所示。該優(yōu)選的L5蛋白源于墨西哥利什曼原蟲且優(yōu)選由SEQ ID N0:55編碼。另一優(yōu)選的L5蛋白如SEQ ID N0:56所示。該優(yōu)選的L5蛋白源于巴西利什曼原蟲且優(yōu)選由SEQ ID NO:65編碼。貫穿本申請(qǐng)，每次提及的特定核苷酸序列SEQ ID NO (以SEQ ID N0:2或4或49或51或53或55或65為例)可以被包括與SEQ ID NO:2或4或49或51或53或55或65具有至少60%的序列一致性或相似性的核苷酸序列的核苷酸序列替代。貫穿本申請(qǐng)，每次提及的特定氨基酸序列SEQ ID NO (以SEQ ID N0:1或3或48或50或52或54或56為例)可以被包括與氨基酸序列SEQ ID NO: I或3或48或50或52或54或56具有至少60%的序列一致性或相似性的氨基酸序列的多肽替代。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，L3源為包括與氨基酸序列SEQ ID N0:1或48或50具有至少60%的序列一致性或相似性的氨基酸序列的多肽和/或由與SEQ ID NO:2或49或51具有至少60%的一致性的核苷酸序列編碼的多肽。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，L5源為包括與氨基酸序列SEQ ID N0:3或52或54或56具有至少60%的序列一致性或相似性的氨基酸序列的多肽和/或由與SEQ ID NO:4或53或55或65具有至少60%的一致性的核苷酸序列編碼的多肽。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，L3源為包括與核苷酸序列SEQ ID NO: 2或49或51具有至少60%的序列一致性或相似性的核苷酸序列的核酸和/或編碼與SEQ ID NO: I或48或50具有至少60%的一致性的氨基酸序列的核酸。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，L5源為包括與核苷酸序列SEQ ID N0:4或53或55或65具有至少60%的序列一致性或相似性的核苷酸序列的核酸和/或編碼與SEQ ID NO: 3或52或54或56具有至少60%的一致性的氨基酸序列的核酸。優(yōu)選地，當(dāng)編碼的蛋白質(zhì)或多肽、蛋白片段、肽至少在一定程度上仍能至少引起從SEQ ID N0:1或3或48或50或52或54或56獲得的免疫反應(yīng)時(shí)，與特定限定的氨基酸或核苷酸序列具有至少60%的一致性或相似性的所述氨基酸序列或核苷酸序列被本發(fā)明涵蓋且據(jù)說是功能性的。至少在一定程度上優(yōu)選指至少50%、至少60%、70%、80%、至少90%或100%。引起免疫反應(yīng)定義如下當(dāng)能夠引起治療對(duì)象的免疫反應(yīng)，優(yōu)選指能夠促進(jìn)或引起Th1免疫反應(yīng)對(duì)給定的抗原L3和/或L5和/或能夠預(yù)防和/或延緩真皮或粘膜病變的發(fā)展和/或引起重要的真皮和/或粘膜病變中和/或耳朵中和/或引流淋巴結(jié)(draininglymph node) (DLN)(優(yōu)選引流任意這些感染的部位(真皮、粘膜部位、耳朵))中以及內(nèi)部器官(如肝臟、脾臟、骨髓、腎臟、大腦等)中寄生蟲量下降的時(shí)候，化合物是功能性的。涵蓋于 本發(fā)明的氨基酸序列可以包括一、二、三、四、五或更多的取代和/或插入和/或缺失和/或添加的N-或C-端氨基酸或化學(xué)基團(tuán)，以增強(qiáng)穩(wěn)定性、溶解性和免疫原性。本文定義的L3和/或L5蛋白片段或L3和/或L5衍生的肽優(yōu)選為包括與L3和/或 L5 蛋白對(duì)應(yīng)的至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸的片段并能夠引起前文定義的免疫反應(yīng)。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，本文定義的L3和/或L5蛋白片段或L3和/或L5衍生的肽優(yōu)選為包括 SEQ ID N0:1 或 3 或 48 或 50 或 52 或 54 或 56 的至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸的片段。作為優(yōu)選的實(shí)施方式，優(yōu)選的L3蛋白片段或優(yōu)選的L3-衍生的肽包括或由L3蛋白的 C-端部的最后的 40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20個(gè)連續(xù)的氨基酸組成。甚至更優(yōu)選地，包括或由SEQ ID NO: I或48或50的最后的40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20 個(gè)連續(xù)的氨基酸組成。甚至更優(yōu)選地，包括或由SEQ ID NO: I的氨基酸394-419組成。作為另一優(yōu)選實(shí)施方式，優(yōu)選的L5蛋白片段或優(yōu)選的L5-衍生的肽包括或由L5蛋白的N-端部的起始的40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20 個(gè)連續(xù)的氨基酸組成。甚至更優(yōu)選地，包括或由SEQ ID N0:3或52或54或56的起始的40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20 個(gè)連續(xù)的氨基酸組成。甚至更優(yōu)選地，包括或由SEQ ID NO: 3的氨基酸1-23組成。作為另一優(yōu)選實(shí)施方式，優(yōu)選的L5蛋白片段或優(yōu)選的L5-衍生的肽包括或由L5蛋白的C-端部的最后的40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6個(gè)連續(xù)的氨基酸組成。甚至更優(yōu)選地，包括或由SEQ ID N0:3或52或54或56的最后的 40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6個(gè)連續(xù)的氨基酸組成。甚至更優(yōu)選地，包括或由SEQ ID NO: 3的氨基酸322-328組成。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，L3和L5源含有蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)含有至少一種L3蛋白的蛋白片段以及至少一種L5蛋白的蛋白片段。更優(yōu)選地，將L3蛋白片段和L5蛋白片段融合在一起以形成嵌合蛋白(chimeric protein)。因此,本發(fā)明還涵蓋一種核酸或編碼該L3和L5源的核酸。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，L3和/或L5源包括至少一種L3和/或L5蛋白和/或至少一種L3和/或L5的蛋白片段。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，L3和/或L5源包括至少兩個(gè)L3和/或L5蛋白和/或至少兩個(gè)L3和/或L5的蛋白片段。該實(shí)施方式涉及蛋白質(zhì)_基源，優(yōu)選蛋白質(zhì)基疫苗。提出在優(yōu)選實(shí)施方式中本文限定的L3和/或L5源不能理解為涵蓋W02009/090175中限定的核糖體蛋白質(zhì)提取物(RPE)。利用存在于受試對(duì)象體內(nèi)時(shí)引起寄生蟲病的寄生蟲細(xì)胞通過進(jìn)行以下步驟獲得RPE a.將寄生蟲細(xì)胞與裂解緩沖液混合，b.離心獲得的混合物以獲得胞漿提取物，c.從獲得的胞漿提取物中制備RPE。因此在優(yōu)選的實(shí)施方式中，L3和/或L5源不是以上定義的RPE。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，L3和/或L5源包括至少一種編碼L3和/或L5的核酸和/或至少一種編碼L3和/或L5的蛋白片段的核酸。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，L3和/或L5源包括至少兩個(gè)編碼L3和/或L5蛋白的核酸和/或至少兩個(gè)編碼L3和/或L5蛋白片段的核酸。該實(shí)施方式涉及核酸-基源，優(yōu)選核酸-基疫苗。L3和/或L5源可以為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的消化物和/或其片段，可以為純化的形式或者可以包含在未加工的組合物中，優(yōu)選為生物源的組合物，如細(xì)菌溶菌產(chǎn)物、酵母菌溶菌產(chǎn)物、真菌溶菌產(chǎn)物，超聲波降解(sonicate)或固定(fixate)。替換地,L3和/或L5源可以為化學(xué)合成的或體外酶促反應(yīng)的產(chǎn)物。L3和/或L5源蛋白或其片段還可以為從RNA或DNA模版編碼所述蛋白或其片段的核酸。RNA或DNA分子可以為‘裸’DNA，優(yōu)選包含在囊泡或脂質(zhì)體中，或包含在載體中。所述載體可以為本領(lǐng)域已知的任意(重組)DNA或RNA載體，且優(yōu)選為質(zhì)粒；其中，將編碼潛在抗原的基因可操作地連接于賦予編碼信使的表達(dá)和翻譯的調(diào)控序列上。所述載體還可以為任意DNA或RNA病毒，例如但不限于腺病毒、腺-相關(guān)病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、修飾的痘苗安卡拉病毒(modified Vaccinia Ankara virus)(MVA)或禽痘病毒或任何其他能夠賦予多肽表達(dá)至被選擇的受試對(duì)象的病毒性載體。DNA載體可以為非整合的，例如附加型復(fù)制載體(episomally replicating vectors),或可以為通過隨機(jī)整合或通過同源重組整合到宿主基因組的載體。 根據(jù)本發(fā)明，DNA分子包括編碼L3和/或L5蛋白或其片段的基因，任選地嵌入載體如病毒或質(zhì)粒中，可以整合到受試對(duì)象的基因組中。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述宿主可以為微生物。優(yōu)選該重組微生物為分枝桿菌(Mycobacterium),種類如結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、恥垢分枝桿菌(M. smegmatis) (Yue. Y. et al、(2007), J. Virol.Meth. , 141:41-48, Cayabiyab Y. et al, (2006)，J. Virol.，80:1645-1652)或牛分枝桿菌(M. bovis)且最優(yōu)選牛分枝桿菌卡介苗(Bacillus Calmette Guerin) (BCG)或恥垢分枝桿菌，根據(jù)本發(fā)明能夠傳遞多肽或其片段到宿主中。重組BCG和重組的方法為本領(lǐng)域所熟知；例如，W02004094469。可以將該重組微生物制成活重組體和/或活減毒疫苗，如Jacobs etal. 1987, Nature, 327(6122) :532-5)。所述載體還可以包含在細(xì)菌源的宿主中，例如但不限于活減毒的和/或重組的志賀氏桿菌(Shigella)或沙門氏菌(Salmonella bacteria)。本發(fā)明可以使用任何已知的佐藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道幾種合適的佐藥。佐藥最優(yōu)選選自以下列出的佐藥陽離子(抗菌的)肽、阜角苷(saponine)和Toll-樣受體(TLR)配體例如但不限于聚(I:C)、CpG基序、LPS、脂質(zhì)A、脂肽Pam3Cys和細(xì)菌鞭毛蛋白或其部分，及它們的具有化學(xué)修飾的衍生物。在根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物中使用的其他優(yōu)選的佐藥為活的或死的BCG的混合物、帶有所述潛在抗原或其部分的免疫球蛋白復(fù)合物、IC31 (來自 WWW. intercell, com;W003047602 中)、QS21/MPL(US2003095974)、DDA/MPL(W02005004911)、DA/TDB (W02005004911;Holten-Andersen etal, 2004InfectTmmun. 2004Mar; 72 (3) : 1608-17.)和可溶的 LAG3 (CD223)(來自 www. Immunotep.com; US2002192195)。另外,其他優(yōu)選的佐藥包括短小棒狀桿菌(Corynebacterium paryum)或痤瘡丙酸桿菌(Propionobacterium acnes)的使用(64、65、66)。特別優(yōu)選的佐藥為已知通過Toll-樣受體作用的佐藥。能夠激活先天免疫系統(tǒng)的佐藥能通過Toll樣受體(TLR’ s)(包括TLR’s 1_10)和/或通過RIG-I (維甲酸誘導(dǎo)基因-I)蛋白和/或通過內(nèi)皮素受體(endothelin receptor)很好地被激活。本領(lǐng)域很好地記載了能夠激活TLR受體的化合物及其變形和衍生物。TLRl可以被細(xì)菌脂蛋白及其 乙?；问郊せ?，TLR2還可以被革蘭氏陽性細(xì)菌的糖脂、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、來自細(xì)菌或來自宿主的熱休克蛋白(heatshock proteins)、以及分枝桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖(Mycobacterial Iipoarabinomannans)激活。TLR3 可以被 dsRNA,尤其為病毒源的dsRNA,或被化合物聚(I :C)激活。TLR4可以被革蘭氏陰性LPS、LTA、來自宿主或來自細(xì)菌源的熱休克蛋白、病毒衣殼或包膜蛋白、紫杉醇(taxol)或其衍生物、含有低聚糖和纖維連接蛋白的透明質(zhì)酸激活。TLR5可以被細(xì)菌的鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可以被分枝桿菌的脂蛋白和B族鏈球菌不耐熱的可溶性因子(GBS-F)或葡萄球菌調(diào)節(jié)蛋白(Staphylococcusmodulins)激活。TLR7可以被喹啉咪唑(imidazoquinolines)及衍生物激活。TLR9可以被未甲基化的CpG DNA或染色質(zhì)-IgG復(fù)合物激活。特別地，TLR3、TLR4、TLR7和TLR9在調(diào)節(jié)對(duì)病毒感染的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，并將能夠激活這些受體的化合物特別優(yōu)選用于本發(fā)明。特別優(yōu)選的佐藥包括但不限于合成的化合物，包括dsRNA、聚(I:C)、觸發(fā)TLR3和TLR9受體的未甲基化的CpG DNA、IC31、TLR9激動(dòng)劑、頂SAVAC、TLR4激動(dòng)劑。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述佐藥物理地連接至前文定義的L3和/或L5源上。佐藥和共刺激化合物(costimulatory compounds)或官能團(tuán)與含有肽的HLA I類和HLA II類表位的物理連接通過同時(shí)發(fā)生的抗原遞呈細(xì)胞(特別是吸收、消化并顯示抗原的樹突細(xì)胞)的刺激提供了增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。其他優(yōu)選的免疫修飾化合物為T細(xì)胞粘附抑制劑，更優(yōu)選為內(nèi)皮素受體如BQ-788 (67)的抑制劑。BQ-788為N-順-2，6- 二甲基哌啶羰基-L- y -甲基亮氨酰-D-I-甲氧基羰基色氨酰基-D-正亮氨酸(N-cis-2, 6-dimethyIpiperidinocarbonyl-L-gamma-methylleucyl-D-1-methoxy-carbonyltryptophanyl-D-norleucine)。然而，任意BQ-788的衍生物或改性的BQ-788化合物也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。其他佐藥包括MPL-SE (Glaxo Smithkline Biologicals，比利時(shí))或 EM005 (IDRI美國)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，佐藥為Th「促進(jìn)佐藥(如含有CpG ODN基序的佐藥)。如文獻(xiàn)(68)所述，Th1-促進(jìn)佐藥是當(dāng)與抗原(此處為L3和/或L5源)一起使用時(shí)，能夠促進(jìn)或引起對(duì)給定抗原的Th1免疫反應(yīng)的佐藥，當(dāng)與抗原一起培養(yǎng)時(shí)，在治療對(duì)象的脾細(xì)胞的上層清液中檢測到。作為對(duì)照，在同一受試對(duì)象的脾細(xì)胞群中評(píng)測Th1免疫反應(yīng)的促進(jìn)或引起，所述受試對(duì)象未用抗原和佐藥處理，或者同一群僅用抗原處理。優(yōu)選用通過與抗原一起培養(yǎng)治療對(duì)象 的脾細(xì)胞和/或通過誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性IgG2a免疫球蛋白檢測到的IFN y的誘導(dǎo)定義引起或促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)。優(yōu)選通過實(shí)施例中描述的脾細(xì)胞的ELISA而進(jìn)行該細(xì)胞因子誘導(dǎo)的評(píng)測。優(yōu)選通過實(shí)施例I中描述的ELISA或蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)進(jìn)行IgG2a誘導(dǎo)的評(píng)測。用L3和/或L5源和佐藥刺激脾細(xì)胞的IFN Y和/或IgG2a的誘導(dǎo)優(yōu)選指佐藥適合用作Th1-促進(jìn)佐藥。替換地或者與以上給出的引起或促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)的第一定義結(jié)合，引起或促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)可以進(jìn)一步定義為不存在(或誘導(dǎo)的不存在)Th2免疫反應(yīng)。Th2免疫反應(yīng)的特征在于當(dāng)與未處理的脾細(xì)胞相比時(shí)，IL-4、IL-10誘導(dǎo)的顯著增強(qiáng)和/或顯著IgGl免疫球蛋白的產(chǎn)生。優(yōu)選通過實(shí)施例中描述的脾細(xì)胞的ELISA進(jìn)行IL-4和/或IL-10的誘導(dǎo)的評(píng)測。優(yōu)選通過實(shí)施例I中描述的ELISA或蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行IgGl誘導(dǎo)的評(píng)測。替換地或者與以上給出的引起或促進(jìn)Th1S疫反應(yīng)的兩個(gè)第一定義結(jié)合，引起或促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)可以進(jìn)一步定義為針對(duì)指定抗原(L3和/或L5源的情況)，發(fā)生IFN y /IL-10比例和/或IFN Y /IL-4比例的增大和/或IgGl/IgG2a比例的減小。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這些比例中任意2個(gè)以上的變化表明佐藥具有Thl性能。優(yōu)選通過實(shí)施例中描述的脾細(xì)胞的ELISA進(jìn)行各個(gè)提到的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的評(píng)測。優(yōu)選通過實(shí)施例I中描述的ELISA或蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行免疫球蛋白IgGl或IgG2a誘導(dǎo)的評(píng)測。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，Th1-促進(jìn)佐藥是，或包括，或由寡脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotide)組成。更優(yōu)選地,寡脫氧核苷酸(ODN)包括或由CpG組成,其中，C是未甲基化的(CpG 0DN) :3’嘌呤-CpG-5’嘧啶。優(yōu)選的寡脫氧核苷酸是，或包括，或由硫代磷酸-修飾的ODN序列組成。使用具有這種修飾的寡脫氧核苷酸是有利的，因?yàn)槭褂玫墓衙撗鹾塑账嵋虼吮任葱揎椀墓衙撗鹾塑账岣€(wěn)定且因此它們?cè)谘髦胁灰捉到?。?yōu)選的Th1-促進(jìn)佐藥由或包括至少一種CpG基序、至少兩種或至少三種組成。優(yōu)選的免疫刺激 ODN (immunostimulatory 0DN) (5，至 3，)序列為 TCAACGITGA (SEQ ID NO:5)和GCTAGCGTTAGCGT(SEQ ID N0:6)。本領(lǐng)域技術(shù)人員不會(huì)受到本文明確描述的序列的限制。他/她可以設(shè)計(jì)其他序列并隨后測試它們?nèi)缜拔亩x的它們的Th-I促進(jìn)性能。該優(yōu)選限定的佐藥CpG ODN極具吸引力，因?yàn)樵趯?shí)施例中證實(shí)了 LRPE與該Th1-促進(jìn)佐藥的混合接種(co-inoculation)誘導(dǎo)了抵抗BALB/c和C57BL/6小鼠菌株中抗碩大利什曼原蟲寄生蟲的攻擊的保護(hù)。在兩個(gè)模型中，保護(hù)與特定IFN-Y的產(chǎn)生有關(guān)。在BALB/c中，還檢測到了IL-4和IL-10產(chǎn)生的限制。本發(fā)明提供了 L3和/或L5源的適當(dāng)?shù)挠猛救鏘)預(yù)防(預(yù)防劑)，2)暴露/感染后(post-exposure/infection)或3)治療/醫(yī)療的疫苗。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以制備用于治療寄生蟲病的廣譜藥制劑即跨物種特異性的藥的制備。在許多寄生蟲病中，疫苗針對(duì)特定的物種，只對(duì)特定的物種有作用。其中這種寄生蟲病的一個(gè)實(shí)例為利什曼病。目前，該病已被藥物控制，但是藥物治療并不能防止該病的傳播且在很多情況下并不是很有效。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，寄生蟲病為利什曼病或瘧疾。更優(yōu)選地，寄生蟲病由利什曼原蟲或瘧原蟲物種引起。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，寄生蟲病由除L3和/或L5源來源的物種外的不同物種引起。具體地，由利什曼原蟲屬的一種物種引起的利什曼病可以通過使用基于來源于另一利什曼原蟲物種的L3和/或L5源的組合物來治療，如實(shí)驗(yàn)部分(見實(shí)施例2)所示，幾個(gè)利什曼原蟲物種的L3和L5同系物是高度保守的(至少90%的一致性，見表I)。另外，我們還在實(shí)驗(yàn)部分(見實(shí)施例I和3)證實(shí)了碩大利什曼原蟲的L3和L5蛋白能夠保護(hù)抵抗碩大利什曼原蟲或巴西利什曼原蟲感染。在一個(gè)實(shí)施方式中，由碩大利什曼原蟲引起的利什曼病成功地被含有來自嬰兒利什曼原蟲、恰氏利什曼原蟲、亞馬孫利什曼原蟲或巴西利什曼原蟲的L3和/或L5源的組合物治療。在另一實(shí)施方式中，由恰氏利什曼原蟲或亞馬孫利什曼原蟲引起的利什曼病成功地被含有來自嬰兒利什曼原蟲的L3和/或L5源的組合物治療。在另一實(shí)施方式中，由碩大利什曼原蟲或巴西利什曼原蟲引起的利什曼病成功地被含有來自碩大利什曼原蟲的L3和/或L5源的組合物治療。替換地，其他寄生蟲病如瘧疾可以成功地被基于其他物種的L3和/或L5源(例如基于嬰兒利什曼原蟲或碩大利什曼原蟲或墨西哥利什曼原蟲或巴西利什曼原蟲的L3和/或L5源)的組合物治療。在本發(fā)明的上下文中，受試對(duì)象指人或動(dòng)物。涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)的動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為犬。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文定義的藥物(或藥制劑或制藥組合物或藥劑)用于增強(qiáng)人或動(dòng)物免疫系統(tǒng)抗感染和/或疾病(更優(yōu)選為寄生蟲感染和/或寄生蟲病)的能力。具體地，它可給人或動(dòng)物受試對(duì)象服用。本文定義的藥物優(yōu)選腸道外給藥，例如通過靜脈、皮下、 腹腔、肌肉、動(dòng)脈或病灶(intralesional)途徑注射或注入。優(yōu)選的給藥模式為皮下注射。本發(fā)明并不限于L3和/或L5源給藥的特定模式。優(yōu)選的給藥模式為使用膠囊或片劑的口服給藥。替換地，L3和/或L5源可以通過導(dǎo)管或泵、或栓劑局部給藥。替換地，13和/或L5源可以整體給藥。L3和/或L5源或包括L3和/或L5源的組合物的配制取決于預(yù)期的給藥模式和(治療)應(yīng)用。藥物載體可以為任何適于遞送L3和/或L5源給受試對(duì)象的可兼容的、無毒的物質(zhì)。如可以使用無菌水、或惰性固體或賦形劑作為載體，通常補(bǔ)充制藥可接受的佐藥、緩沖劑、分散劑等。組合物可以為液體的，如穩(wěn)定的L3和/或L5源或包括L3和/或L5源的組合物的懸浮液，也可以為固體的和/或干燥的形式如粉末。對(duì)于口服和直腸給藥，L3和/或L5源可以以固體制劑如膠囊、片劑、栓劑和粉末的形式給藥，或者以液體制劑如酏劑、糖漿劑、乳劑、軟膏和懸浮液的形式給藥。另一形式可以為半固體或半液體形式，其中，L3和/或L5在固體支持物(如塊)中或上以液體形式存在?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的傳統(tǒng)技術(shù)將藥物與制藥可接受的介質(zhì)或遞送載體組合。例如，可以將L3和/或L5源和任選的佐藥溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。制備腸道外給藥的組合物的方法為本領(lǐng)域所熟知且在多種資源中描述得更詳細(xì)，包括例如，Remington’sPharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro,第 20 版，2000, Williams & Wilkins, PA,美國。優(yōu)選藥物以治療有效劑量給藥，治療有效劑量即可增強(qiáng)人或動(dòng)物免疫系統(tǒng)抗本文定義的感染和/或疾病的能力的劑量。優(yōu)選地，本發(fā)明藥物制劑的治療有效劑量能夠引起本文定義的免疫反應(yīng)當(dāng)能夠引起治療對(duì)象免疫反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選指當(dāng)能夠?qū)o定的抗原L3和/或L5促進(jìn)或引起Th1免疫反應(yīng)和/或能夠預(yù)防和/或延緩真皮或粘膜病變的發(fā)展和/或引起真皮和/或粘膜病變中和/或耳朵中和/或引流淋巴結(jié)(DLN)(優(yōu)選引流任意感染的部位(真皮、粘膜部位、耳朵))中以及內(nèi)部器官(如肝臟、脾臟、骨髓、腎臟、大腦等)中寄生蟲量的顯著下降時(shí)，劑量是治療有效的。真皮病變存在的評(píng)測如實(shí)施例I所描述(見圖4 :腳掌腫脹(footpad swelling))。寄生蟲量的評(píng)測如實(shí)施例所描述(見圖4)。在使用本發(fā)明組合物的最初一次疫苗接種然后一次連續(xù)用寄生蟲感染并等待約6個(gè)星期的時(shí)間段之后，本發(fā)明藥物的治療有效劑量將優(yōu)選預(yù)防真皮病變的發(fā)展和/或?qū)?yōu)選誘導(dǎo)耳朵中寄生蟲量下降約3個(gè)數(shù)量級(jí)和/或DLN中約相似的數(shù)量級(jí)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,本文定義的藥物為疫苗。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，將至少12ii g的L3和/或L5源用作疫苗。使用的L3和/或L5源的量指的是使用的L3和L5的總量。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，應(yīng)當(dāng)將至少12-20 u g的L3和/或L5源用于提供免疫反應(yīng)，任選地與至少50 ii g的佐藥結(jié)合，例如優(yōu)選為Th1促進(jìn)佐藥如CpG ODN0本文定義的疫苗可以為預(yù)防的或治療的疫苗。L3和/*L5源和任選的佐藥(優(yōu)選Th1促進(jìn)佐藥)溶解的量可以在100-500微升范圍內(nèi)變動(dòng)。鉬合物在另外的方面，提供了一種包括L3和/或L5源和任選的佐藥(優(yōu)選Th1促進(jìn)佐藥)的組合物。本文已定義L3和/*L5源和佐藥。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物由13和/或L5源和Th1促進(jìn)佐藥組成。優(yōu)選的Th1促進(jìn)佐藥為CpG ODN0優(yōu)選的組合物包括或由L3和/或L5源和任選的佐藥(優(yōu)選Th1促進(jìn)佐藥)溶于PBS中組成。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明還涵蓋將L3和/或L5源和佐藥(優(yōu)選Th1促進(jìn)佐藥)連續(xù)給藥。因此，兩種成分不需要完全地存在于一種單一的組合物中，只要將它們都供給受試對(duì)象即可。該組合物進(jìn)一步包括制藥可接受的佐藥和/或載體。優(yōu)選將該組合物用作藥物。所述藥物優(yōu)選為疫苗。本文已擴(kuò)展定義了藥物、佐藥和疫苗。如本文已定義的，組合物可以為液體、固體或半液體或半固體形式。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，為了改善治療或預(yù)防處理的特異性，與L3和/或L5源按順序或同時(shí)使用其他化合物。例如使用其他化合物是有利的，將進(jìn)一步增強(qiáng)治療對(duì)象的免疫反應(yīng)。更優(yōu)選地，該化合物不與L3和/或15源一起存在于單一組合物中。例如，所述化合物選自由來自引起寄生蟲病(19)如利什曼病的寄生蟲的其他蛋白質(zhì)源組成的組中。所述蛋白質(zhì)源與前文定義的L3和/或L5源具有相同的含義。優(yōu)選上下文中的蛋白質(zhì)為組蛋白如H2A、H2B、H3、H4，其他核糖體蛋白如 Li2A(LiP)、LiP2b(LiP’ )、LiPO、L2、L7、L8、L16、S6、L19 和 S4。優(yōu)選的H2A蛋白如SEQ ID N0:7所示。優(yōu)選的編碼H2A的核酸如SEQID N0:8所示。優(yōu)選的H2B蛋白如SEQ ID N0:9所示。優(yōu)選的編碼H2B的核酸如SEQ ID NO: 10所示。優(yōu)選的H3蛋白如SEQ ID NO: 11所示。優(yōu)選的編碼H3的核酸如SEQ ID NO: 12所示。優(yōu)選的H4蛋白如SEQ ID NO: 13所示。優(yōu)選的編碼H4的核酸如SEQ ID NO: 14所示。優(yōu)選的Li2A(也稱為LiP2a蛋白)如SEQ ID NO: 15或16所示。優(yōu)選的編碼Li2A的核酸如SEQ IDNO: 17所示。SEQ ID NO: 17為基因組序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從該基因組序列衍生出優(yōu) 選的編碼序列。該優(yōu)選的編碼序列對(duì)應(yīng)于編碼mRNA的核酸，編碼如SEQ ID NO: 15或16所示的Li2A蛋白的mRNA : —個(gè)來自SEQ ID NO: 17的核苷酸791-1111且一個(gè)來自1662-1982。優(yōu)選的LiP2b蛋白如SEQ ID NO: 18所示。優(yōu)選的編碼LiP2b的核酸如SEQ IDNO: 19所示。優(yōu)選的LiPO蛋白如SEQ ID N0:20所示。優(yōu)選的編碼LiPO的核酸如SEQ IDNO: 21所示。SEQ ID N0:8、10、12、14、19和21為基因組序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從這些基因組序列衍生出其他優(yōu)選的編碼序列。這些其他優(yōu)選的編碼序列對(duì)應(yīng)于編碼mRNA的核酸，mRNA編碼各自的蛋白質(zhì)這些核酸序列分別如SEQ ID N0:68、69、70、71、72和73所示。優(yōu)選的L2蛋白如SEQ ID NO: 22所示。優(yōu)選的編碼L2的核酸如SEQ ID NO: 23所示。優(yōu)選的L7蛋白如SEQ ID N0:24所示。優(yōu)選的編碼L7的核酸如SEQ ID N0:25所示。優(yōu)選的L8蛋白如SEQ ID NO: 26所示。優(yōu)選的編碼L8的核酸如SEQ ID NO: 27所示。優(yōu)選的L16蛋白如SEQ ID N0:28所示。優(yōu)選的編碼L16的核酸如SEQ ID N0:29所示。優(yōu)選的L19蛋白如SEQ ID N0:30所示。優(yōu)選的編碼L19的核酸如SEQ ID N0:31所示。優(yōu)選的S4蛋白如SEQ ID N0:32 所示。優(yōu)選的編碼S4的核酸如SEQ ID N0:33所示。優(yōu)選的S6蛋白如SEQ ID N0:34所示。優(yōu)選的編碼S6的核酸如SEQ ID N0:35所示。另一實(shí)例是使用含有幾種寄生蟲抗原的聚蛋白(63，65)。聚蛋白的例子為EP1141305中限定的蛋白Q。編碼蛋白Q的核酸分子如SEQ ID N0:36所示。對(duì)應(yīng)的編碼的蛋白Q如SEQ ID NO: 37所示。蛋白Q或其部分或其片段或蛋白Q源或蛋白Q的片段源可以與L3和/或L5源組合使用。另一聚蛋白的例子為Leish-IIOf (69)。Leish-IlOf或其部分或其片段或Leish-IlOf源或Leish-IlOf的片段源可以與L3和/或L5源組合使用。下段中，可以用來與L3和/*L5蛋白源組合的蛋白質(zhì)以組蛋白源為例。同樣適用于以上定義的其他蛋白質(zhì)，優(yōu)選除L3和/或L5外的其他核糖體蛋白。優(yōu)選的化合物包括組蛋白或其片段，或編碼所述組蛋白或所述組蛋白片段的核酸分子。更優(yōu)選地，組蛋白為EP 1687023中限定的H2A、H2B、H3和/或H4。組蛋白H2A、H2B、H3和H4為很保守的核蛋白且其序列為本領(lǐng)域所熟知，見參考文獻(xiàn)39。優(yōu)選地，組蛋白從在進(jìn)化樹中與引起疾病的生物鄰近的生物中獲得。因此，特別優(yōu)選用于治療寄生蟲病如利什曼病的組蛋白源為原生動(dòng)物且特別是錐蟲科中的成員，更特別是錐蟲原生動(dòng)物利什曼原蟲的不同物種。其他優(yōu)選的化合物包括其他核糖體蛋白或其片段或編碼所述蛋白或其片段的核酸分子。其他核糖體蛋白的實(shí)例包括L19和S4。其他優(yōu)選的化合物包括WO 2009/090175中限定的核糖體蛋白提取物。各化合物或各化合物源可以與L3和/或L5源組合使用。組合使用可以按順序或同時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，L3和/或15源與S4和/或S6源組合使用。更優(yōu)選地，L3、L5、S4和S6源組合使用。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方式中，L3、L5和S4源組合使用。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方式中，L3、L5和S6源組合使用。我們證實(shí)了(見實(shí)施例5)與單獨(dú)使用L3或L5或S4相比，將L3、L5和S4源組合使用提供了協(xié)同保護(hù)作用。在上下文中，優(yōu)選的S4蛋白如SEQ ID N0:32所示。優(yōu)選的編碼S4的核酸如SEQ ID N0:33所示。優(yōu)選的S6蛋白如SEQ ID N0:34所示。優(yōu)選的編碼S6的核酸如SEQ ID N0:35所示。在“S4和/或S6源”中使用的術(shù)語“源”與在“L3和/或L5源”中使用的術(shù)語“源”具有相同的含義。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，S4源為多肽，所述多肽包括與氨基酸序列SEQ IDNO: 32具有至少60%的序列一致性或相似性的氨基酸序列和/或由與SEQ ID NO: 33具有至少60%的一致性的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，S6源為多肽，所述多肽包括與氨基酸序列SEQ IDNO: 34具有至少60%的序列一致性或相似性的氨基酸序列和/或由與SEQ ID NO: 35具有至少60%的一致性的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，S4源為核酸，所述核酸包括與核苷酸序列SEQ IDNO: 33具有至少60%的序列一致性或相似性的核苷酸序列和/或編碼與SEQ ID NO: 32具有至少60%的一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
取決于使用的源的類型(蛋白質(zhì)基或核酸基)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道哪種類型的制劑是合適的。源可以這樣給藥(裸蛋白或核酸)。替換地，核酸基源可以利用本文定義的核酸構(gòu)建體(nucleic acid construct)給藥。S6 源在另一方面提供了一種S6源或組合物，所述組合物包括或由S6源但不包括L3和/或L5和/或S4源組成。我們證實(shí)了(見實(shí)施例4)單獨(dú)使用S6能夠提供保護(hù)抵抗利什曼原蟲感染。在“S6源”中使用的術(shù)語“源”與在“L3和/或L5源”中使用的術(shù)語“源”具有相同的含義。 本文定義的包括L3和/或L5源的各個(gè)用途或方法或組合物的類型也適用于S6源。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，S6源為多肽，所述多肽包括與氨基酸序列SEQ IDNO: 34具有至少60%的序列一致性或相似性的氨基酸序列和/或由與SEQ ID NO: 35具有至少60%的一致性的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，S6源為核酸，所述核酸包括與核苷酸序列SEQ IDNO: 35具有至少60%的序列一致性或相似性的核苷酸序列和/或編碼與SEQ ID NO: 34具有至少60%的一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。方法在另一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防和/或治療寄生蟲病和/或延緩其發(fā)展和/或能夠引起本文定義的免疫反應(yīng)的方法當(dāng)能夠引起治療對(duì)象的免疫反應(yīng)，優(yōu)選指能夠?qū)o定的抗原L3和/或L5和/或?qū)o定的L3和/或L5源促進(jìn)或引起Th1免疫反應(yīng)和/或能夠預(yù)防和/或延緩真皮或粘膜病變的發(fā)展和/或引起真皮和/或粘膜病變中和/或耳朵中和/或引流淋巴結(jié)(DLN)(優(yōu)選引流任意感染的部位(真皮、粘膜部位、耳朵))中以及內(nèi)部器官(如肝臟、脾臟、骨髓、腎臟、大腦等)中寄生蟲量的顯著下降的時(shí)候，方法是有療效的。在該方法中，本發(fā)明的疫苗發(fā)揮治療疫苗的作用。典型地，在感染和患病之間存在一定的時(shí)間。在這種情況下，疫苗會(huì)發(fā)揮藥理學(xué)免疫產(chǎn)品(pharmacological immune product)的作用，所述藥理學(xué)免疫產(chǎn)品會(huì)通過引發(fā)宿主中與感染的病理學(xué)作用相抵消的免疫反應(yīng)來預(yù)防和/或治療疾病和/或延緩其發(fā)展。治療疫苗與預(yù)防疫苗的不同在于治療疫苗將在已感染或患病的患者中誘導(dǎo)保護(hù)。本發(fā)明既涵蓋治療也涵蓋預(yù)防疫苗。在該方法中，任選的S4和/或S6源可以與L3和/或L5源組合使用。用途在另一方面，提供了 L3和/*L5源在診斷受試對(duì)象寄生蟲病中的用途。寄生蟲病、L3和/或L5源和受試對(duì)象前文已定義。在這種情況下，任選的S4和/或S6源可以與L3和/或L5源組合使用。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以獲得特定和早期寄生蟲病的廣譜診斷。寄生蟲病的一個(gè)實(shí)例為利什曼病。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，寄生蟲病為利什曼病或瘧疾。更優(yōu)選地，寄生蟲病由利什曼原蟲或瘧原蟲物種引起。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，寄生蟲病由除L3和/或L5源來源的物種外的不同物種引起。具體地，由利什曼原蟲屬的一個(gè)物種引起的利什曼病可以通過使用基于來源于另一利什曼原蟲物種的L3和/或L5源的組合物來診斷。在一個(gè)實(shí)施方式中，由碩大利什曼原蟲引起的利什曼病成功地被含有來自碩大利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲、巴西利什曼原蟲或墨西哥利什曼原蟲的L3和/或L5源的組合物診斷。替換地，其他寄生蟲病如瘧疾可以成功地被基于另一物種的L3和/或L5源(例如基于嬰兒利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲、巴西利什曼原蟲或墨西哥利什曼原蟲的L3和/或L5源)的組合物診斷。原則上，任何受試對(duì)象都可以利用本發(fā)明進(jìn)行診斷。診斷方法可以根據(jù)需要時(shí)常用于受試對(duì)象。優(yōu)選地，診斷的受試對(duì)象為疑似存在感染引起所述寄生蟲病的所述寄生蟲的風(fēng)險(xiǎn)。疑似存在感染所述寄生蟲的風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象可以生活在病區(qū)(endemic area)或去過病區(qū)。病區(qū)包括從阿爾及利亞到沙特阿拉伯、肯尼亞、蘇丹、埃塞俄比亞的北非。還包括南歐地中海國家西班牙、法國、希臘等。還包括中美洲(所有國家)和南美洲巴西、委內(nèi)瑞拉、秘魯、玻利維亞、哥倫比亞、阿根廷北部、巴拉圭、烏拉圭，亞洲中部至西南部印度、伊朗、伊拉克、蒙古、阿富汗、尼泊爾、孟加拉國。在本發(fā)明的上下文中，本文定義的用途優(yōu)選為體外(in vitro)或離體(ex vivo)的用途。優(yōu)選指所述用途在來自于所述受試對(duì)象的樣品上進(jìn)行。優(yōu)選的樣品包括血液、血 清、血漿、唾液、腦脊液或尿液。更優(yōu)選地，所述樣品為從受試對(duì)象獲得的血液或血清樣品。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在表現(xiàn)出所述寄生蟲病的癥狀之前診斷出來，稱為癥狀前診斷或無癥狀診斷受試對(duì)象。在該上下文中，“癥狀前”優(yōu)選指在表現(xiàn)出第一癥狀的至少I天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天或更多天前。與寄生蟲病有關(guān)的第一癥狀或第一臨床表現(xiàn)如利什曼病可以選自發(fā)熱、脾腫大、肝腫大、淋巴結(jié)腫大、結(jié)膜炎、皮炎鉤甲(onychogriphosis)、角膜結(jié)膜炎、冷漠(apathy)和極度瘦弱(cachexia)。他們中的大多數(shù)可以通過身體的外部檢查進(jìn)行簡單的檢測。結(jié)膜炎、皮炎鉤甲、角膜結(jié)膜炎是皮膚變化(cutaneous alteration)的形式。優(yōu)選的與利什曼病有關(guān)的第一癥狀是淋巴結(jié)腫大。可以通過身體的外部檢查如觸診(palpation)進(jìn)行檢測。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，在表現(xiàn)出所述寄生蟲病的一些癥狀之前診斷出來，稱為寡癥狀(oligosymptomatic)受試對(duì)象的診斷。在該上下文中,“寡癥狀”優(yōu)選指具有最多三種以上定義的癥狀的受試對(duì)象。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，在表現(xiàn)出所述寄生蟲病的所有癥狀之前診斷出來，稱為有癥狀的受試對(duì)象的診斷。在該上下文中，“有癥狀的”優(yōu)選指具有至少四種以上定義癥狀(包括以上定義的皮膚變化形式)的受試對(duì)象。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是診斷的最重要類型是無癥狀受試對(duì)象的診斷，因?yàn)檫@將有助于防止疾病的進(jìn)一步傳播且可以更有效地幫助并治療無癥狀的受試對(duì)象，如果他們被診斷處于該階段。在這種用途中，L3和/或L5和/或S4和/或S6源可以為用于檢測下文闡釋的樣品中抗體存在的L3和/或L5和/或S4和/或S6蛋白或蛋白片段。替換地，L3和/或L5和/或S4和/或S6源可以為用于檢測下文闡釋的樣品中L3和/或L5和/或S4和/或S6核酸存在的核酸分子。方法
在另一方面，提供了一種利用L3和/或L5源診斷受試對(duì)象寄生蟲病的方法，該方法包括檢驗(yàn)從受試對(duì)象獲得的樣品中是否存在識(shí)別L3和/或L5源的抗體。任選地，可以將S4和/或S6源與L3和/或L5源組合使用。本發(fā)明優(yōu)選的方法為關(guān)于優(yōu)選體外或離體進(jìn)行的本發(fā)明的優(yōu)選用途。前文已定義。在優(yōu)選的方法中，L3和/或L5源存在于組合物中。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，另一種化合物也存在于所述組合物中。替換地，沒有其他的化合物存在于所述組合物中。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，為了改善方法的特異性，其他化合物與L3和/或L5源按順序或同時(shí)使用。例如，使用將能夠辨別無癥狀、寡癥狀或有癥狀受試對(duì)象和接種了疫苗的受試對(duì)象的其他化合物是有利的。更優(yōu)選地，所述化合物不與L3和/或L5源一起存在于單一的組合物中。在上下文中，可以使用名為組合物部分中鑒別的每種蛋白質(zhì)。例如，所述化合物選自由引起寄生蟲病(19)如利什曼病的其他蛋白質(zhì)源組成的組中。所述蛋白質(zhì)源與前文定義的L3和/或L5源具有相同的含義。優(yōu)選上下文中的蛋白質(zhì)為組蛋白如H2A、H2B、H3、H4,另一核糖體蛋白如 Li2A(LiP)、LiP2b (LiP，)、LiPO、L2、L7、L8、L16、S6、L19 和 S4。 另一實(shí)例為使用含有幾種寄生蟲抗原的聚蛋白(59，61)。聚蛋白的例子為EP I141 305中限定的蛋白Q。蛋白Q或其部分或其片段或蛋白Q源或蛋白Q的片段源可以與L3和/或L5源組合使用。優(yōu)選的抗原包括組蛋白或其片段或編碼所述組蛋白的核酸分子。更優(yōu)選地，組蛋白為EP I 687 023中限定的H2A、H2B、H3和/或H4。組蛋白H2A、H2B、H3和H4為很保守的核蛋白且其序列為本領(lǐng)域所熟知，見參考文獻(xiàn)39。優(yōu)選地，組蛋白從在進(jìn)化樹中與引起疾病的生物鄰近的生物中獲得。因此，特別優(yōu)選用于治療寄生蟲病如利什曼病的組蛋白源為原生動(dòng)物且特別是錐蟲科中的成員，例如瘧原蟲如惡性瘧原蟲，更特別是錐蟲原生動(dòng)物利什曼原蟲的不同物種。在更優(yōu)選的診斷方法中，當(dāng)存在可檢測量的識(shí)別L3和/或L5源的抗體(優(yōu)選為蛋白質(zhì)或肽或蛋白部分)時(shí)和/或當(dāng)所述抗體存在的量增加時(shí)，診斷寄生蟲病。在受控制的或健康的受試對(duì)象中，一般不能檢測所述抗體。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法如ELISA進(jìn)行所述抗體存在的檢測。優(yōu)選的檢測方式如實(shí)施例I所述。識(shí)別L3和/或L5源的抗體(優(yōu)選為蛋白質(zhì)或肽或蛋白部分)優(yōu)選指至少存在一種能夠識(shí)別存在于L3和/或L5源中的至少一種化合物的抗體。所述化合物可以為L3和/或L5蛋白或L3和/或L5蛋白片段或蛋白部分或肽。同樣適用于識(shí)別S4和/或S6源的抗體。在另一方法中，利用另一核酸分子檢測L3和/或L5核酸分子。L3和/或L5核酸分子優(yōu)選為前文定義的編碼L3和/或L5分子的核酸分子或其部分。另一核酸分子優(yōu)選為引物，所述引物被設(shè)計(jì)為能夠檢測PCR反應(yīng)或RNA印跡中L3和/或L5核酸分子的存在。同樣適用于能夠檢測S4和/或S6核酸分子存在的引物。檢測L3和/或L5核酸分子存在的引物優(yōu)選包括或由以下序列組成通過PCR特異性檢測L3的引物序列正義鏈，5’-AACACGAAGGAGGGCAAGGTC-3’(LmL3序列的核苷酸 418-438) (SEQ IDNO:38)
反義鏈，5’-CTTCTTCGCGGCCTTTGCCTTG-3’(LmL3 序列的核苷酸 1242-1263 的反向和互補(bǔ))(SEQ ID NO:39)通過PCR特異性檢測L5的引物序列正義鏈，5’-TGCACGCTGGCAAAITGGGTAC-3’(LmL5序列的核苷酸 10-31) (SEQ IDNO:40)反義鏈，5’-CTTCTT CGT GCG CAC AGC AG-3’(LmL5 序列的核苷酸 464-483 的反向和互補(bǔ))(SEQ ID NO:41)通過RNA印跡特異性檢測L3的引物序列5’-CTTCTTCGCGGCCTTTGCCTTG-3’(LmL3 序列的核苷酸 1242-1263 的反向和互補(bǔ))(SEQ ID NO:42) 通過RNA印跡特異性檢測L5的引物序列5，-CTT CTT CGT GCG CAC AGC AG-3’(LmL5 序列的核苷酸 464-483 的反向和互補(bǔ))(SEQ ID NO:43)。L3和/*L5核酸分子的表達(dá)水平的檢測或增強(qiáng)優(yōu)選定義為與所述核酸分子在對(duì)照受試對(duì)象中的表達(dá)水平相比，所述核酸分子的表達(dá)水平的可檢測的變化。通常，對(duì)照受試對(duì)象不包括該L3和/或L5核酸分子。優(yōu)選地，L3和/或L5核酸分子表達(dá)水平的增強(qiáng)指利用PCR核苷酸序列的表達(dá)水平的至少5%的增加。在另一方面，提供了一種用于診斷受試對(duì)象寄生蟲病的分析設(shè)備，其中，所述設(shè)備包括L3和/或L5源。任選地，S4和/或S6源與L3和/或L5源組合也存在于該分析設(shè)備中。可以通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測特異性識(shí)別所述源的抗體的存在(如參見通過引用的方式并入本文的Harlow和Lane, Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。適當(dāng)?shù)姆椒òㄓH和層析聯(lián)合電泳(ACE)分析和(酶聯(lián)免疫吸附分析)ELISA。優(yōu)選地，所述分析包括ELISA。以下將更廣泛地描述多種分析方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，分析涉及固定于以結(jié)合至固體支撐(solid support)上的L3和/或L5源的使用并除去樣品中的抗體。然后可以利用與抗體/L3和/或L5源復(fù)合物結(jié)合的且具有可檢測的信息基團(tuán)的檢測試劑檢測所述結(jié)合的抗體。適當(dāng)?shù)臋z測試劑包括與抗體/L3和/或L5源復(fù)合物結(jié)合的抗體以及用信息基團(tuán)標(biāo)記的游離多肽(如半競爭性分析中)。替換地，可以使用競爭性分析，其中，與L3和/或L5源結(jié)合的抗體用信息基團(tuán)標(biāo)記且在帶有樣品的源溫育后，將所述抗體結(jié)合于固定的L3和/或L5源。樣品的成分抑制標(biāo)記抗體與所述L3和/或L5源結(jié)合的程度表示樣品與固定的L3和/或L5源的反應(yīng)度。固體支撐可以為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的可以粘附L3和/或L5源的任何材料。例如，支撐可以為微量滴定板(microtiter plate)或硝化纖維或其他適當(dāng)?shù)哪ぶ械脑囼?yàn)孔(test well)。替換地,支撐可以為小珠(bead)或圓盤(disc),如玻璃、玻璃纖維、乳膠或塑料材料如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支撐還可以為磁性粒子或光纖傳感器(fiber opticsensor)，例如美國專利5，359，681中公開的那些材料?？梢岳酶鞣N本領(lǐng)域已知的技術(shù)將L3和/或L5源結(jié)合至所述固體支撐。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“結(jié)合”既指非共價(jià)連接(如吸附)，也指共價(jià)連接(可以是在抗原和支撐上的功能基團(tuán)之間的直接連接或者可以是通過交聯(lián)劑的方式的連接)。優(yōu)選通過吸附結(jié)合至微量滴定板或膜中的孔。在這種情況下，可以通過將適當(dāng)緩沖液中的L3和/或L5源與固體支撐接觸適當(dāng)?shù)臅r(shí)間完成吸附。接觸時(shí)間隨著溫度而變化，但是典型的在I小時(shí)和I天之間。通常，與塑料的微量滴定板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔接觸的L3和/或L5源的量在IOng-Ig范圍內(nèi)，優(yōu)選為lOOng，足以結(jié)合充足量的L3和/*L5源。此外，當(dāng)給出了一定數(shù)量或量的L3和/或L5源時(shí)，就確定了使用的L3和/或L5源的總量。通?？梢酝ㄟ^支撐與雙官能團(tuán)試劑的第一反應(yīng)實(shí)現(xiàn)L3和/或L5源與固體支撐的共價(jià)連接，所述雙官能團(tuán)試劑將與支撐和功能基團(tuán)(如多肽上的羥基或氨基)反應(yīng)。例如，可以利用苯醌或通過支撐上的醛基與多 肽上的氨基和活性氫的縮合將L3和/或L5源結(jié)合至具有適當(dāng)聚合物涂層的支撐上(如參見Pierce Immunotechnology Catalog andHandbook(1991)at A 12-A 13)。在特定的實(shí)施方式中，分析為酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)。該分析可以通過首先將已固定在固體支撐(通常為微量滴定板的孔)上的L3和/或L5源與樣品接觸，使得樣品內(nèi)L3和/或L5源特異的抗體與固定的L3和/或L5源結(jié)合進(jìn)行。然后從固定源上除去未結(jié)合的樣品并添加能夠與固定的抗體-L3和/或L5源復(fù)合物結(jié)合的檢測試劑。然后利用適于特異性檢測試劑的方法測定仍然結(jié)合至固體支撐上的檢測試劑的量。一旦將L3和/或L5源固定在支撐上，通常將所述支撐上剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)封閉?？梢允褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的任何適當(dāng)?shù)姆忾]劑，如牛血清白蛋白(BSA)或吐溫20 (Sigma Chemical公司，圣路易斯，MO)。然后將固定的L3和/或L5源與樣品一起溫育，并使抗體(如果樣品中存在)與所述源結(jié)合?？梢栽跍赜坝眠m當(dāng)?shù)南♂寗?如磷酸鹽緩沖液(PBS))稀釋樣品。通常，合適的接觸時(shí)間(即溫育時(shí)間)為允許充分檢測樣品中抗體存在的時(shí)段。優(yōu)選地，所述接觸時(shí)間為足以獲得結(jié)合程度至少為結(jié)合與未結(jié)合抗體間平衡時(shí)獲得的95%。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)的是，可以容易地通過分析時(shí)段內(nèi)產(chǎn)生的結(jié)合程度而測得達(dá)到平衡所需的時(shí)間。在室溫下，通常充足的溫育時(shí)間約為30min。然后可以通過用適當(dāng)?shù)木彌_液清洗固體支撐除去未結(jié)合的樣品，如然后可以將含有0. 1%吐溫20的PBS檢測試劑添加至固體支撐。適當(dāng)?shù)臋z測試劑為任何與固定的抗體-L3和/或L5源復(fù)合物結(jié)合的化合物且可以通過任何各種本領(lǐng)域熟知的方式檢測。優(yōu)選地，所述檢測試劑含有與信息基團(tuán)結(jié)合的結(jié)合劑(例如，如蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白、凝集素或游離的抗原)。優(yōu)選的信息基團(tuán)包括酶(如辣根過氧化物酶)、底物、輔因子、抑制因子、染料、放射性核素(radionucleides)、發(fā)光基團(tuán)、突光基團(tuán)和生物素。可以利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)現(xiàn)結(jié)合劑與信息基團(tuán)的結(jié)合?？梢陨藤彽某Ｒ?guī)結(jié)合劑與來自一些源(如Zymed Laboratories,舊金山，CA and Pierce,羅克福德，IL)的信息基團(tuán)結(jié)合。然后將檢測試劑與固定的抗體L3和/或L5源復(fù)合物溫育一段充足的時(shí)間以檢測結(jié)合的抗體。通?？梢詮膹S家的說明書或通過分析時(shí)段內(nèi)產(chǎn)生的結(jié)合程度確定合適的時(shí)間。然后除去未結(jié)合的檢測試劑并利用信息基團(tuán)檢測結(jié)合的檢測試劑。用來檢測信息基團(tuán)的方法取決于信息基團(tuán)的性質(zhì)。對(duì)于放射性基團(tuán)，閃爍計(jì)數(shù)(scintillation counting)或自動(dòng)射線照相方法通常是合適的?？梢允褂霉庾V法檢測染料、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)?？梢岳寐?lián)接至不同信息基團(tuán)(通常放射性或熒光基團(tuán)或酶)的抗生物素蛋白檢測生物素。一般可以通過添加底物(通常為特定的時(shí)段)，然后通過光譜或其他反應(yīng)產(chǎn)物的分析方法檢測酶信息基團(tuán)。
為了確定樣品中寄生蟲病如利什曼病特異性抗體的存在或不存在，一般將檢測到的來自仍結(jié)合至固體支撐上的信息基團(tuán)的信號(hào)與相應(yīng)的預(yù)測定的臨界值(cut-off value)比較。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，臨界值優(yōu)選為當(dāng)固定的L3和/或L5源與來自未感染的受試對(duì)象的樣品溫育時(shí)獲得的信號(hào)的平均值。通常，產(chǎn)生在預(yù)測定的臨界值以上為三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的信號(hào)的樣品被認(rèn)為是陽性的(即與L3和/或L5源反應(yīng))。在替換的優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù) Sackett et al, Clinica l Epidemiology:A Basic Science for ClinicalMedicine, p. 106-7 (Little Brown and Co.，1985)的方法,利用接收器操作曲線(ReceiverOperator Curve)測定所述臨界值。簡單地說,在該實(shí)施方式中，可以從多對(duì)對(duì)應(yīng)于各個(gè)可能的診斷測試結(jié)果的臨界值的真陽性率(即敏感性)和假陽性率(100%-特異性)的曲線(plot)中確定所述臨界值。曲線上最接近左上角(即圍繞最大區(qū)域的值)的臨界值是最準(zhǔn)確的臨界值，且產(chǎn)生比通過該方法確定的臨界值高的信號(hào)的樣品可以認(rèn)為是陽性的。替換地，所述臨界值可以沿曲線移動(dòng)至左邊，以減小假陽性率，或至右邊，以減小假陰性率。在相關(guān)的實(shí)施方式中，以穿流或帶狀測試形式(flow-through or strip testformat)進(jìn)行分析，其中，將L3和/或L5源固定在膜如硝化纖維上。在穿流測試中，當(dāng)樣品穿過膜時(shí)，樣品中的抗體與固定的L3和/或L5源結(jié)合。然后當(dāng)含有檢測試劑的溶液穿過膜時(shí)，檢測試劑(如蛋白A膠體金(protein A-colloidal gold))與抗體_L3和/或L5源復(fù)合物結(jié)合。然后可以如上所述的進(jìn)行結(jié)合的檢測試劑的檢測。在帶狀測試形式中，將結(jié)合有源的膜的一端浸入含有樣品的溶液中。樣品沿膜移動(dòng)穿過含有檢測試劑的區(qū)域至固定有多肽的區(qū)域。L3和/或L5源中檢測試劑的濃度表示樣品中存在引起寄生蟲病如利什曼病的寄生蟲的抗原的特異性抗體。通常地，那個(gè)位點(diǎn)上檢測試劑的濃度會(huì)形成圖案，如線條，是可見的。不存在該圖案表示陰性結(jié)果。通常，如上所述，當(dāng)樣品含有抗體的量足以在ELISA中產(chǎn)生陽性信號(hào)時(shí)，選擇膜上固定的L3和/或L5源的量以產(chǎn)生視覺可辨別的圖案。優(yōu)選地，膜上固定的L3和/或L5源的量在25ng-500ng范圍內(nèi)。通?？梢杂煤苌倭?如一滴)受試對(duì)象的血清或血液進(jìn)行這樣的測試。如果在該分析設(shè)備中S4和/或S6源與L3和/或L5源組合使用，公開的用于L3和/或L5源的分析設(shè)備的各個(gè)部件也可以用于S4和/或S6源。任何受試對(duì)象或醫(yī)師可以在辦公室/家中使用該設(shè)備，每當(dāng)有需要時(shí)，重復(fù)使用該設(shè)備。一般在分析中使用額外的分子作為陽性或陰性對(duì)照。典型的陽性對(duì)照可以為識(shí)別測試樣品中已知存在的分子的抗體。典型的陰性對(duì)照可以為識(shí)別測試樣品中已知存在的分子的抗體。一般定義在本發(fā)明的上下文中，蛋白質(zhì)或蛋白片段由氨基酸序列表示。 在本發(fā)明的上下文中，核酸分子由編碼蛋白質(zhì)或多肽或蛋白片段的核酸或核苷酸序列表示。核酸分子可以包括調(diào)控區(qū)域。應(yīng)當(dāng)理解的是，本文通過給出的序列號(hào)(SEQ ID NO)限定的各個(gè)核酸分子或蛋白質(zhì)或蛋白片段并不限于所公開的特定序列。本文限定的各個(gè)基因序列或核苷酸序列編碼給出的蛋白質(zhì)或多肽或蛋白片段或自己本身是蛋白質(zhì)或蛋白片段。貫穿本申請(qǐng)，每次提及的特定核苷酸序列SEQ ID NO (以SEQ ID NO:2或4為例)，可以將其替換為i.含有與SEQ ID N0:2或4或49或51或53或55或65 (示例)具有至少60%的序列一致性或相似性的核苷酸序列的核苷酸序列。ii.與(i)的序列的核酸分子雜交的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈；iii.由于遺傳密碼的簡并，與(iii)的核酸分子的序列不同的核苷酸序列。iv.編碼與由核苷酸序列SEQ ID N0:2或4或49或51或53或55或65編碼的氨基酸序列具有至少60%的氨基酸一致性或相似性的氨基酸序列的核苷酸序列。貫穿本申請(qǐng)，每次提及的特定氨基酸序列SEQ ID NO (以SEQ ID N0:1或3或48或50或52或54或56為例),可以將其替換為含有與氨基酸序列SEQ ID NO: I或3或48或50或52或54或56具有至少60%的序列一致性或相似性的氨基酸序列的多肽。本文通過借助與給定的核苷酸序列或氨基酸序列的一致性或相似性百分比(至少60%)描述的各個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列在優(yōu)選的實(shí)施方式中分別與給定的核苷酸或氨基酸序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%的一致性或相似性或者分別與給定的核苷酸或氨基酸序列具有更多的一致性或相似性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過比對(duì)前文限定的序列的全長確定序列一致性或相似性。本文將“序列一致性”定義為兩個(gè)或更多的氨基酸(多肽或蛋白質(zhì))序列間的關(guān)系或兩個(gè)或更多的核酸(多核苷酸)序列間的關(guān)系，通過比對(duì)序列而確定。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，基于兩個(gè)給出的SEQ ID NO的全長或其部分計(jì)算序列一致性。其部分優(yōu)選指兩個(gè)SEQID NO的至少50%、60%、70%、80%、90%或100%。本領(lǐng)域中，“一致性”還指氨基酸或核酸序列間序列相關(guān)性的程度，根據(jù)具體情況，通過這些序列的條帶(strings)間的匹配確定。通過將氨基酸序列及其一個(gè)多肽的保守氨基酸取代與第二個(gè)多肽序列比對(duì)確定兩個(gè)氨基酸序列間的“相似性”?？梢酝ㄟ^已知的方法容易地計(jì)算“一致性”和“相似性”，包括但不限于這些文獻(xiàn)中描述的方法Computational MolecularBiology, Lesk, A. M. , ed.,牛津大學(xué)出版社，紐約,1988;Biocomputing: Informaticsand Genome Projects, Smith, D. ff. , ed.,學(xué)術(shù)出版社，紐約，1993; Computer Analysisof Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. , and Griffin, H. G. , eds.,胡馬納出版社，新澤西,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G.,學(xué)術(shù)出版社，1987;and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds.,MStockton 出版社，紐約，1991;以及 Carillo, H.，and Lipman, D. , SIAM J. AppliedMath. ,48:1073 (1988) o設(shè)計(jì)確定一致性的優(yōu)選方法以在測試的序列間產(chǎn)生最大的匹配。確定一致性和相似性的方法編纂在公開可用的計(jì)算機(jī)程序中。優(yōu)選的確定兩個(gè)序列一致性和相似性的計(jì)算機(jī)程序方法包括例如GCG程序包(Devereux、J. , et al. , Nucleic AcidsResearch 12 (I) : 387 (1984) )、BestFit、BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul、S. F. etal. , J. Mol. Biol. 215:403-410(1990) BLAST X 程序是 NCBI 和其他來源(BLAST Manual、Altschul, S. , et al. , NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894;Altschul, S. , et al. , J. Mol.Biol. 215:403-410 (1990))公開可獲得的。還可以使用眾所周知的Smith Waterman算法來確定一致性。、
優(yōu)選的多肽序列比對(duì)參數(shù)包括如下規(guī)則系統(tǒng)(Algorithm) :Needleman andffunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970);比對(duì)矩陣(Comparison matrix) :BL0SSUM62 來自Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992);間隙罰分(Gap Penalty):12和間隙長度罰分(Gap Length Penalty):4。就像來自位于麥迪遜,威斯康星州(Madison，WI)的遺傳學(xué)電腦集團(tuán)的“Ogap”程序一樣，帶有這些參數(shù)的有用的程序是公開可獲得的。前述的參數(shù)為氨基酸比對(duì)(閉口間隙(end gaps)不伴隨罰分(penalty))的默認(rèn)參數(shù)。優(yōu)選的核酸比對(duì)參數(shù)包括如下規(guī)則系統(tǒng)Needleman and ffunsch, J. Mol.Biol. 48:443-453 (1970);比對(duì)矩陣:匹配(matches) =+10，失配(mismatch) =0 ;間隙罰分50 ;間隙長度罰分3?？色@得如來自麥迪遜,威斯康星州(Madison, Wis)的遺傳學(xué)電腦集團(tuán)的間隙程序。以上給出的是核酸比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)。任選地，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，在確定氨基酸相似性程度時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員 還可以考慮稱為“保守的”氨基酸取代。保守的氨基酸取代指的是具有相似的側(cè)鏈的殘基的可替換性。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一組具有脂肪族-羥基的側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；以及一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公開的氨基酸序列取代變體為公開的序列中至少一個(gè)殘基缺失且不同的殘基在其位置插入的氨基酸序列。優(yōu)選地，氨基酸的變化是保守的。優(yōu)選的各個(gè)自然發(fā)生的氨基酸的保守取代如下Ala到 Ser ；Arg 到 Lys ；Asn 到 Gln 或 His ；Asp 到 Glu ；Cys 到 Ser 或 Ala ；Gln 到 Asn ；Glu 到Asp ；Gly 到 Pro ；His 到 Asn 或 Gln ；Ile 到 Leu 或 Val ；Leu 到 Ile 或 Val ；Lys 到 Arg ；Gln或 Glu ；Met 到 Leu 或 lie ；Phe 到 Met、Leu 或 Tyr ；Ser 到 Thr ；Thr 到 Ser ；Trp 到 Tyr ；Tyr到Trp或Phe ；以及Val到Ile或Leu。核酸構(gòu)建體核酸構(gòu)建體包括編碼本文定義的蛋白質(zhì)或蛋白片段的核苷酸序列。包括編碼本文定義的給定的蛋白質(zhì)或蛋白片段的核酸分子的核酸構(gòu)建體將確保給定的核酸分子、以及相應(yīng)的蛋白質(zhì)或蛋白片段在治療對(duì)象中的表達(dá)。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體包括I個(gè)以上的核酸分子，各個(gè)核酸分子編碼給定的蛋白質(zhì)或蛋白片段。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體包括2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)核酸分子，各個(gè)核酸分子編碼給定的蛋白質(zhì)或蛋白片段。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體包括表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包括各種所需的核酸分子。各個(gè)核酸分子可操作地與存在的其他核酸分子相連。最優(yōu)選地，適當(dāng)?shù)膯?dòng)子可操作地與所述表達(dá)盒相連，以確保受試對(duì)象中核酸分子的表達(dá)。在本文和其權(quán)利要求中，動(dòng)詞“包括”及其詞形變化(conjugations)以其非限制性的意義使用，意指含有詞后的那些項(xiàng)，但是沒有排除未明確提到的項(xiàng)。另外，動(dòng)詞“組成”可以由“基本上由…組成”替換，意指除了明確鑒定的成分外，本文定義的產(chǎn)物或組合物或L3或L5源可以包括其他的成分，所述其他的成分不會(huì)改變本發(fā)明的獨(dú)特特征。另外，關(guān)于用不定冠詞“a”或“an”修飾的元件不排除存在一個(gè)以上的可能性，除非上下文中明確要求存在一個(gè)且僅一個(gè)元件。因此不定冠詞“a”或“an”通常指“至少一個(gè)”。將本說明書中引用參考的所有專利和文獻(xiàn)通過引用其全部內(nèi)容的方式并入本文。以下通過實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)理解為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。


圖I.重組碩大利什曼原蟲rLmL3和rLmL5蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化。誘導(dǎo)后(泳道I)、通過Ni-NTA瓊脂糖柱傳代后(泳道2)以及純化的重組rLmL3和rLmL5 (泳道3)的pQELmL3 (板L3)或pQELmL5 (板L5)載體轉(zhuǎn)染的大腸桿菌溶菌產(chǎn)物的考馬斯亮藍(lán)染色的(Coomassie-blue-stained) 13% 聚丙烯酰胺凝膠。圖2. L3和L5蛋白的抗原性(a)用5X IO4的碩大利什曼原蟲穩(wěn)定期的前鞭毛體s. c.感染12只BALB/c小鼠的左腳掌并在攻擊后8周獲得血清。通過ELISA分別確定患有皮膚利什曼病(MCL)的小鼠血清的IgGl和IgG2a抗體抗rLmL3和rLmL5的相關(guān)性(relativities)。還表征了感染前相同小鼠血清缺乏相關(guān)性。患有有癥狀CVL犬的血清和抗rLmL3 (b)和rLmL5 (c)重組蛋白質(zhì)的對(duì)照組血清的ELISA相關(guān)性。圖3.BALB/C小鼠中通過接種疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)物。將BALB/c小鼠(每組 6 只)用 IOiig 的 rLmL3+50iig 的 CpG-ODN(L3+CpG)或 10 y g 的 rLmL5+50 y g 的CpG-ODN(L5+CpG)、用50 y g的CpG-ODN(CpG)或用PBS (生理鹽水)s. c.免疫三次。接種疫苗后4周獲得脾臟細(xì)胞并于存在rLmL3 (a、c和e)、rLmL5 (b、d和f)和僅培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)48h。通過ELISA評(píng)估培養(yǎng)物上層清液中IFN-y (a和b)、IL_4 (c和d)和IL-10 (e和f)的水平。各條代表來自單個(gè)小鼠的數(shù)據(jù)的平均值土SD。圖4.攻擊后BALB/c接種疫苗的小鼠中碩大利什曼原蟲感染的過程。(a將給出的腳掌腫脹作為感染和未感染的對(duì)側(cè)腳掌間厚度的差異。(b在攻擊后8周，通過有限稀釋各自確定感染了的腿的腿彎部(poplyteal)引流淋巴結(jié)和脾臟中有活性的寄生蟲的量。(*，P〈0. 01)圖5. L3+CpG ODN接種疫苗的小鼠中由感染引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)。寄生蟲攻擊后8周，制備脾臟細(xì)胞培養(yǎng)物。將細(xì)胞不刺激(培養(yǎng)基)或在37°C下于5%C02中，分別用LRP (利什曼原蟲核糖體蛋白質(zhì))(12 u gmr1)、SLA (溶解的利什曼原蟲抗原)(12 u gmF1)、MRP (鼠核糖體蛋白質(zhì))(12li g mr1)或L3(6ii gmF1)刺激48h。通過捕獲酶聯(lián)免疫吸附方法(captureenzyme-linked immunosorbent assay)測量培養(yǎng)物上層清液中 IFN-Y (a，)IL_4(b)和IL-lO(c)水平。各條代表每組6只單個(gè)小鼠中細(xì)胞因子水平的平均值加上標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖6.L5+CpG ODN接種疫苗的小鼠中由感染引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)。寄生蟲攻擊后8周，制備脾臟細(xì)胞培養(yǎng)物。將細(xì)胞不刺激(培養(yǎng)基)或在37°C下于5%C02中，分別用LRP(12u gmr1)>SLA(12u gmr1)>MRP(12u gmF1) ^ L5 (6 u gmF1)刺激 48h。通過捕獲酶聯(lián)免疫吸附方法測量培養(yǎng)物上層清液中IFN-Y (a,)IL-4(c)和IL-10 (b)水平。各條代表每組6只單個(gè)小鼠中測定的細(xì)胞因子水平的平均值加上標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖7.攻擊后BALB/c接種疫苗的小鼠中巴西利什曼原蟲感染的過程。(A)感染耳朵的炎性病變。病變尺寸(毫米)用在5只小鼠上進(jìn)行一個(gè)實(shí)驗(yàn)獲得的平均值土SD表示。用rLmL5+CpG-0DN或rLmL3+CpG_0DN接種疫苗的以及兩對(duì)照組的小鼠間的*P〈0. 05。(B)在感染后5周，測定耳朵真皮中寄生蟲載量。結(jié)果用每組5個(gè)耳朵的平均值土SD表示。rLmL5+CpG-ODN和兩對(duì)照小鼠組間*P〈0. 05顯著下降。圖8. LmL3和LmL5蛋白的核糖體位置。將I U g的rLmL3蛋白(A)、I ii g的rLmL5蛋白⑶和10 ii g的碩大利什曼原蟲LRP提取物(A和B)在線性10-13%梯度SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳。考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠如左邊板所示(A和B)。將相等的凝膠與用rLmL3(板a -LmL3) (A)免疫的小鼠的血清和五犬內(nèi)臟利什曼病血清(板a-LmL5)⑶的親和純化的抗LmL5抗體部分雜交并探測。圖9.在CpG的存在下用核糖體蛋白質(zhì)S6、L2、L7、L8和L6接種疫苗的小鼠中感染參數(shù)的分析。(A)每周檢測感染組的病變發(fā)展直至感染后8周。感染后8周，S6加CpGODN和對(duì)照(生理鹽水和佐藥)組間腳掌腫脹的差異是統(tǒng)計(jì)上顯著的(*P〈0. 05)。(B)感染后8周，分析DLNs和脾臟中寄生蟲載量測定。S6加CpG ODN接種免疫組和對(duì)照(生理鹽水和佐藥)組的脾臟中寄生蟲負(fù)載的差異是統(tǒng)計(jì)上顯著的(*P〈0. 05)。為了簡明，僅顯示了生理鹽水組和S6加CpG ODN接種免疫組的SD。圖10. S6加CpG ODN接種疫苗引起的免疫反應(yīng)。在最后一次劑量給藥后，從用S6加CpG ODNXpG ODN和生理鹽水免疫了 4周的小鼠中獲得血清樣品。通過ELISA分別測試血清以確定抗-S6特異性IgG、IgGl和IgG2a抗體的存在。S6加CpG ODN組和對(duì)照(生理鹽水和CpG)組間統(tǒng)計(jì)上顯著的差異(*P〈0. 05)。(B)將脾臟細(xì)胞不刺激(培養(yǎng)基)或在37°C下于5%C02中用S6刺激48h。通過捕獲酶聯(lián)免疫吸附方法測量培養(yǎng)物上層清液中IFN- y、IL-4和IL-10水平。各條代表每組4只單個(gè)小鼠中測定的細(xì)胞因子水平的平均值加上標(biāo)準(zhǔn)偏差。S6加CpG ODN組和對(duì)照(生理鹽水和CpG)組間統(tǒng)計(jì)上顯著的差異(*P〈0. 05)。圖11.在CpG的不存在或存在下用L3、L5和S4單獨(dú)或混合制劑免疫的小鼠中病變的發(fā)展。每周檢測病變直至感染后6周。(A)對(duì)照小鼠組和用不含佐藥的重組蛋白質(zhì)接種疫苗的小鼠組。(B)對(duì)照小鼠組和用重組蛋白質(zhì)加CpG ODN接種疫苗的小鼠組。感染后6 周，L3 加 CpG ODN、L5 加 CpGODN, L3 加 L5 加 CpG ODN 或 L3 加 L5 加 S6 加 CpG ODN 以及對(duì)照(生理鹽水和佐藥)組間腳掌腫脹的差異是統(tǒng)計(jì)上顯著的(*P〈0. 05)。圖12.接種疫苗的小鼠中寄生蟲載量。感染后7周，確定脾臟和DLN中的寄生蟲負(fù)載。(A)對(duì)照小鼠組和用不含佐藥的重組蛋白質(zhì)接種疫苗的小鼠組。(B)對(duì)照小鼠組和用重組蛋白質(zhì)加CpG ODN接種疫苗的小鼠組。L3加CpG ODN、L5加CpG ODN、L3加L5加CpGODN或L3加L5加S6加CpG ODN以及對(duì)照(生理鹽水和佐藥)組間脾臟寄生蟲載量的差異是統(tǒng)計(jì)上顯著的(*P〈0. 05)。L3加L5加CpG ODN或L3加L5加S6加CpG ODN以及對(duì)照(生理鹽水和佐藥)組間腿彎部(popliteal)寄生蟲載量的差異是統(tǒng)計(jì)上顯著的(*P〈0. 05)。圖13.提出的嵌合結(jié)構(gòu)的圖示。顯示了為克隆設(shè)計(jì)的引物和選擇的酶切位點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例實(shí)施例I :碩大利什曼原蟲L3和L5蛋白的克降以及這#蛋白賦予的對(duì)碩大利什曼原蟲感染的防護(hù)作用
材料和方法小鼠菌株和寄生蟲雌性BALB/c 小鼠(6-8 周大)購于 Harlan Interfauna Iberica S. A.(巴塞羅那，
西班牙)。碩大利什曼原蟲寄生蟲(WH0M/IR/-/173)通過在BALB/c小鼠中傳代而保持在易傳染的狀態(tài)(virulent state)。通過在補(bǔ)充有20%的胎牛血清的Schneider’ s培養(yǎng)基(Gibco, BRL，格蘭德島，紐約，美國)中于26°C下培養(yǎng)而獲得碩大利什曼原蟲無鞭毛體并轉(zhuǎn)化成前鞭毛體。CpG-ODN 硫代磷酸修飾的CpG-ODN (5，-TCAACGITGA-3’ 和 5’ -GCTAGCGTTAGCGT-3’)(SEQID N0:5、6)通過等基因(Isogen)(荷蘭)合成。編碼碩大利什曼原蟲核糖體蛋白L3和L5的DNA序列的克隆。從碩大利什曼原蟲基因組數(shù)據(jù)庫(www. genedb. org/genedb/leish)利用釀酒酵母(S. cerevisiae) L3和L5蛋白序列作為探針(56)獲得編碼碩大利什曼原蟲L3和L5蛋白的開放閱讀框(0RF)。對(duì)于rLmL3和rLmL5蛋白的表達(dá)，使用碩大利什曼原蟲(MH0M/IL/80 (Friedlin))的DNA作為模板PCR擴(kuò)增其編碼區(qū)(CR)。將擴(kuò)增的DNAs克隆至pBluescript質(zhì)粒(Stratagene, La Jolla加拿大)并在克隆至pQE30表達(dá)載體(QIAGEN,希爾登，德國)前進(jìn)行測序。LmL3CR 克隆使用的引物為正義鏈，5’ -CGGGATCCATGTCTCACTGCAAGTTCGAG-3 ’(LmL3CR 的位置 1-20 (LmjF34. 2880)) (SEQ ID NO:44):反義鏈，5’-AACTGCAGTTACTTCTTCGCGGCCTTTG-3’(與 LmL3CR 的位置 1241-1260 反向和互補(bǔ)(LmjF34. 2880)) (SEQ ID NO:45)。包括BamHI和PstI限制酶切位點(diǎn)(畫有下劃線)用于克隆的目的。LmL5CR 克隆使用的引物為正義鏈,5’ -CGGGATCCATGTGCACGCTGGCAAATTG-3J (LmL5CR 的位置 1-20 (LmjF35. 1890)) (SEQ ID NO: 46)反義鏈，5’ -CCCAAGCTTTTACTTGCCGAGGCGCTCGC-3，(與 LmL5CR 的位置 968-987 反向和互補(bǔ)(LmjF35. 1890. 319)) (SEQ ID NO :47)。包括BamHI和HindIII限制酶切位點(diǎn)(畫有下劃線)用于克隆的目的。蛋白質(zhì)的純化rLmL3和rLmL5蛋白在用pQE_LmL3或pQE_LmL5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中過表達(dá)并在變性的條件下于Ni-次氮基三乙酸(Ni-NTA)瓊脂糖柱(Qiagen)上純化。結(jié)合到Ni-NTA瓊脂糖上后，重組蛋白質(zhì)在所述親和柱上重折疊(57)。所述重組蛋白質(zhì)穿過多粘菌素-瓊脂糖(Sigma,圣路易斯,密蘇里州)。用定量顯色當(dāng)變形細(xì)胞法(Quantitative ChromogenicLimulus Amebocyte Assay) QCL-1000 (BioWhittaker, Walkersville,馬里蘭州)測定殘余的內(nèi)毒素含量(<12pg/y g的重組蛋白質(zhì))。免疫、寄生蟲攻擊和寄生蟲的定量用各自與25 ii g的CpG-ODN混合的10 y g的rLmL3或10 y g的rLmL5在兩個(gè)獨(dú)立的BALB/c小鼠組(每組六只)的右腳掌(right footpad)上皮下(s. c.)接種。作為對(duì)照，分別僅用25 ii g的CpG-ODN或用具有磷酸鹽緩沖液(PBS)的CpG-ODN接種兩個(gè)另外的小鼠組。2和4周后,每組使用用于啟動(dòng)(priming)的相同劑量進(jìn)行提升(boosted)。最后一次接種后4周，通過在左(未處理)腳掌s. c.接種5X104穩(wěn)定期的碩大利什曼原蟲(WH0M/IR/-/173)的前鞭毛體進(jìn)行寄生蟲攻擊。用度量卡尺(metric caliper)測定腳掌腫脹并計(jì)算左腳掌的厚度減去右腳掌的厚度。通過所述的有限稀釋測定法(limiting dilution assay)(70)確定耳朵、引流淋巴結(jié)(DLN)和脾臟中的寄生蟲數(shù)量。利什曼原蟲抗原和小鼠核糖體蛋白。對(duì)于碩大利什曼原蟲LRP的制備，收獲IO9個(gè)前鞭毛體，在預(yù)冷的PBS中洗滌兩次并懸浮于 Iml 的 NP40 裂解緩沖液(IOmM Tris HCl、pH 8. 0U50mM NaClU. 5mM MgCl2和0. 5%NP40)中并用移液器吸取來回10次。裂解后，在4°C下將樣品以3000 Xg微量離心(microfuged) 2min,以使細(xì)胞核團(tuán)成小球(pellet the nuclei)。在4°C下將上層清液以13000\8微量離心151^11并如[57]所述地從細(xì)胞溶質(zhì)上層清液中制得核糖體。簡單地說，在4°C下將細(xì)胞溶質(zhì)置于Beckman TL100. 3轉(zhuǎn)子中以90000rpm高速離心30min。將未加工的核糖體小球(pellet)重新懸浮于緩沖液 A (20mM Tris-HCl、pH7. 4、500mM AcNH4UOOmMMgCl2、5mM P -巰基乙醇)中并在4°C下置于TL100. 3轉(zhuǎn)子中以90000rpm離心通過緩沖液A中的不連續(xù)蔗糖梯度(20/40%)。將洗過的核糖體小球溶解于PBS中并用超聲波處理直至核糖體RNA完全降解。利用相同的方法從5X IO7RAW 264.7鼠科動(dòng)物的巨噬細(xì)胞中制得小鼠核糖體蛋白提取物(MRP )。如(70)所述地制備碩大利什曼原蟲的總蛋白(可溶的利什曼原蟲抗原[SLA])。簡單地說，將碩大利什曼原蟲前鞭毛體(101°)在PBS中洗滌兩次，重新懸浮于500ml的PBS中并通過三次冷凍和解凍的循環(huán)進(jìn)行裂解。細(xì)胞裂解后，通過利用微型離心機(jī)以12000Xg離心15min從不溶的部分分離可溶的抗原。將上清液等分(aliquoted)并忙存于-70°C。上層清液中細(xì)胞因子的測量利用商用ELISA試劑盒(Diaclone, Besancon,法國)測量用重組蛋白質(zhì)刺激的脾細(xì)胞培養(yǎng)物的上層清液中IFN- y、IL-10和IL-4的釋放。簡單地說，在48h過程中在37°C下將3\106脾臟細(xì)胞接種于存在1^1^3(61^1111_1)或rLmL5(6ii gmr1)或僅培養(yǎng)基的48-孔 板中。在小鼠和犬中抗-L3和抗-L5抗體反應(yīng)的檢測從埃斯特雷馬杜拉區(qū)(Extremadura region)(西班牙)的20只天生被嬰兒利什曼原蟲感染的有臨床癥狀的犬中收集犬血清樣品。在西班牙克瑞斯的埃斯特雷馬杜拉大學(xué)獸醫(yī)院寄生蟲系(the Department of Parasitology of the VeterinarySchool, Extremadura University, Caceres, Spain)臨床分析評(píng)價(jià)感染的動(dòng)物。當(dāng)通過間接免疫熒光法測試時(shí)，所有的血清是呈陽性的，并通過直接觀察確定腿彎部和前肩胛骨淋巴結(jié)中寄生蟲無鞭毛體形式的存在。從寄生蟲系(埃斯特雷馬杜拉大學(xué))飼養(yǎng)的8只健康動(dòng)物中獲得對(duì)照組血清。感染后8周，收集用實(shí)驗(yàn)方法感染5X104個(gè)穩(wěn)定期碩大利什曼原蟲(WHOM/IR/-/173)前鞭毛體的12只BALB/c小鼠的血清。作為對(duì)照，收集相同小鼠感染前的血清。在室溫下用IOOiil各個(gè)重組核糖體蛋白(PBS中2 ii gmr1)包被標(biāo)準(zhǔn)ELISA板過夜。在PBS-Tween 20(0. 5%)-酪蛋白(5%)中以1/200的稀釋度分析犬和鼠的血清樣品。使用購于北歐免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室(Nordic Immunological Laboratories)(蒂爾堡，荷蘭)的第二抗體辣根過氧化酶偶聯(lián)的抗-犬-IgG(l/1000)、抗-鼠-IgGl(l/1000)和抗-鼠-IgG2a (1/500)。使用鄰苯二胺氫氯化物(Ortophenyle diamine dihydrochloride)(OPD) (Dako, A/S，葛洛斯楚普，丹麥)作為ELISA分析的過氧化物酶底物。15min后，添加100 u I的H2SO4IM終止反應(yīng)并讀取450nm下的吸光度。統(tǒng)計(jì)分析通過學(xué)生t測試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)P〈0. 05時(shí)，認(rèn)為差異是顯著的。結(jié)果和討論LmL3和LmL5蛋白的鑒定、克隆和表達(dá)為了鑒定碩大利什曼原蟲L3和L5的編碼區(qū)，我們進(jìn)行了 BLASTP檢索，利用釀酒酵母L3和L5的氨基酸序列(分別為Y0R063W和YPL131w)作為探針[58]。將注釋為推定LmL3和LmL5蛋白的兩個(gè)不同的詞條(LmjF34. 2880和LmjF35. 1890)用BLAST分值的顯著值顯示(rescued)?；跀?shù)據(jù)庫序列數(shù)據(jù),設(shè)計(jì)PCR引物以擴(kuò)增LmL3和LmL5CR,包括克隆 目的的不同限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。對(duì)擴(kuò)增的DNAs在pBluescript中進(jìn)行亞克隆并測序。碩大利什曼原蟲推定的L3蛋白擁有分子量為47. 5kDa的419氨基酸和11. 67的預(yù)測等電點(diǎn)。碩大利什曼原蟲推定的L5蛋白擁有分子量為36. 6kDa的328氨基酸和10. 69的預(yù)測等電點(diǎn)。碩大利什曼原蟲L3和L5推導(dǎo)氨基酸序列與它們的釀酒酵母對(duì)應(yīng)物的比較揭示了高度的同源性L3蛋白57%的一致性，73. 5%的相似性；L5蛋白51. 2 %的一致性，66. 3 %的相似性(見比對(duì)圖)。本文中的比對(duì)圖顯示了利什曼原蟲L3和L5蛋白含有一些具有高度相似性的區(qū)域。還明顯地觀察到這兩種寄生蟲的蛋白質(zhì)比酵母的蛋白質(zhì)長，在LmL3的羧基端和LmL5的兩端存在額外的氨基酸殘基。屬于保守蛋白家族的利什曼原蟲蛋白質(zhì)不尋常的一級(jí)結(jié)構(gòu)似乎與免疫相關(guān)，因?yàn)樵诟腥具^程中引起的抗這些蛋白質(zhì)的體液和細(xì)胞反應(yīng)能夠特異性地抗寄生蟲，而不與宿主對(duì)應(yīng)物的同源蛋白交叉反應(yīng)(39、36、58)。在pQE30表達(dá)載體中將LmL3和LmL5CR亞克隆。推導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的氨基酸序列如比對(duì)圖的C和D部分所示。兩種蛋白質(zhì)均存在包括用于親和層析純化的6個(gè)組氨酸的N-端標(biāo)記。隨后，兩種蛋白質(zhì)在大腸桿菌培養(yǎng)物中過表達(dá)并被純化。如圖I所示，根據(jù)它們N-端區(qū)12個(gè)氨基酸額外的組氨酸-標(biāo)記延伸(stretch)的存在,純化的rLmL3和rLmL5蛋白質(zhì)顯示明顯的分子量分別為48kDa和38kDa。因?yàn)樵诳捡R斯亮藍(lán)染色SDS-PAGE凝膠(圖I)中兩個(gè)純化的重組蛋白質(zhì)均觀察到了單一的條帶，所以確定了蛋白質(zhì)的純度。通過犬內(nèi)臟利什曼病(CVL)血清和來自感染了碩大利什曼原蟲的BALB/c小鼠(MCL)的血清識(shí)別LmL3和LmL5。為了確定VL影響的犬體內(nèi)碩大利什曼原蟲L3和L5蛋白質(zhì)的抗原性，在利用20只嬰兒利什曼原蟲感染的犬的血清的ELISA分析中，使用重組的rLmL3和rLmL5蛋白質(zhì)作為抗原。作為對(duì)照，分析從8只健康犬獲得的血清對(duì)兩個(gè)重組蛋白質(zhì)的反應(yīng)。CVL血清75%(15/20)識(shí)別rLmL3蛋白質(zhì)(圖2b)且90%(18/20)識(shí)別反應(yīng)活性值(reactivityvalues)高于阻斷值(cut off value)的rLmL5蛋白質(zhì)(圖2c)?？箁LmL3和rLmL5間的吸光值的光譜不同，因?yàn)镃VL血清抗rLmL5的反應(yīng)活性高(平均值=0. 61 ±0. 36)于rLmL3獲得的反應(yīng)活性(平均值=0.28±0. 10)。可以推論，犬天生利什曼病的免疫系統(tǒng)中，暴露的兩種寄生蟲蛋白質(zhì)是LmL5蛋白比LmL3蛋白與免疫原更相關(guān)。雖然此處使用的血清量有限，但是獲得的數(shù)據(jù)可以作為可以與其他抗原組合使用兩種重組寄生蟲蛋白質(zhì)的指示，用于促進(jìn)CVL的血清學(xué)診斷測試。接下來我們利用由于感染碩大利什曼原蟲而患有皮膚利什曼病(MCL)的BALB/c小鼠血清分析了 LmL3和LmL5蛋白質(zhì)的抗原性。為了那個(gè)目的，通過ELISA分析了抗兩種重組蛋白質(zhì)的IgGl和IgG2a抗體的存在。兩種蛋白質(zhì)被MCL血清識(shí)別，MCL血清為IgGl同型的主要抗它們而引起的抗體(圖2a)。感染前相同小鼠中未觀察到抗它們的反應(yīng)活性(圖2a)。由于分別將IgGl和IgG2a抗體的誘導(dǎo)用作Th2_型和Thl-型免疫反應(yīng)的標(biāo)志(8)，我們可以推斷在BALB/c小鼠感染碩大利什曼原蟲的過程中，誘導(dǎo)了 Th2-樣體液反應(yīng)來抗這些抗原。在CpG ODN存在下用rLmL3和rLmL5重組核糖體蛋白免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)了抗它們的Thl-型反應(yīng)。由于在感染的BALB/c小鼠中引起了抗它們的Th2介導(dǎo)的體液反應(yīng)，我們分析了在Thl誘導(dǎo)佐藥(CpG-ODN)存在下的rLmL3和rLmL5的免疫效果。為了那個(gè)目的，將6只小鼠的組各自用結(jié)合CpG-ODN的rLmL3和rLmL5進(jìn)行免疫。作為對(duì)照，將6只小鼠的組僅用CpG-ODN和PBS (用作輔料的緩沖液)進(jìn)行免疫。三次劑量后，分析由免疫帶來的細(xì)胞反應(yīng)。獲得脾臟細(xì)胞并在相應(yīng)rLmL3和rLmL5抗原的存在和不存在下培養(yǎng)。在rLmL3抗原刺 激后，用rLmL3+CpG-0DN免疫了的小鼠的脾臟細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IFN-Y (圖3a)。在rLmL5抗原刺激后，在用rLmL5+CpG-0DN免疫了的小鼠的脾臟細(xì)胞上層清液中檢測相似的IFN- y水平(圖3b )。相反，在對(duì)rLmL3或rLmL5刺激的反應(yīng)中，用佐藥或輔料免疫了的小鼠的脾臟細(xì)胞產(chǎn)生低水平的IFN-Y (圖3ab)。從分別用rLmL3+CpG-0DN (圖3c)或rLmL5+CpG_0DN(圖4d)免疫了的小鼠獲得的脾臟細(xì)胞的rLmL3或rLmL5刺激后，對(duì)IL-4產(chǎn)物，檢測到該細(xì)胞因子非常低的水平。最后，在任何組中都沒有檢測到IL-10特異性產(chǎn)物(圖3ef)。因此，可以推斷CpG-ODN佐藥使抗重組抗原對(duì)Thl反應(yīng)的免疫反應(yīng)偏斜(skews)。rLmL3+CpG-0DN和rLmL5+CpG_0DN的疫苗接種保護(hù)BALB/c小鼠抗碩大利什曼原蟲的攻擊。我們分析了給藥兩種重組蛋白質(zhì)是否能夠誘導(dǎo)保護(hù)易受感染的BALB/c小鼠抗碩大利什曼原蟲感染。rLmL3+CpG-0DN或rLmL5+CpG_0DN接種疫苗的小鼠的腳掌腫脹明顯小于PBS或CpG-ODN對(duì)照組的腳掌腫脹(圖4a)。另外，在rLmL3+CpG_0DN或rLmL5+CpG_0DN免疫的小鼠的引流淋巴結(jié)細(xì)胞中，觀察到了大約2-log寄生蟲載量(parasite burden)的下降。最后，在脾臟中不能檢測到寄生蟲，然而在兩個(gè)對(duì)照組小鼠的脾臟中都檢測到了寄生蟲(圖3b)?？梢酝茢嘤眉纳xLmL3和LmL5蛋白(表示為重組蛋白質(zhì))與CpG-ODN混合免疫了的小鼠被保護(hù)抗碩大利什曼原蟲感染。接種疫苗的小鼠真皮病狀不存在或很低。在這些小鼠中，寄生蟲的存在受腿彎部引流淋巴結(jié)的限制。觀察到的防護(hù)與通過用編碼利什曼原蟲核小體組蛋白(19)、如DNA疫苗一樣給藥的PO蛋白(54)和與CpG-ODN結(jié)合的LRP提取物(55)的質(zhì)粒DNA混合物的小鼠的免疫而獲得的防護(hù)相似。因此，我們已確定了兩種核糖體成分的特征，所述兩種核糖體成分的免疫可以促進(jìn)抗利什曼病的有效分子定義的疫苗的更合理的發(fā)展。與防護(hù)相關(guān)的免疫參數(shù)的分析為了確定與防護(hù)相關(guān)的免疫參數(shù)，攻擊后8周，分析接種疫苗的小鼠組和對(duì)照小鼠組中由SLA、LRP、MRP和相應(yīng)的重組蛋白質(zhì)驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞因子產(chǎn)物(IFN- y，IL-4和IL-10)。攻擊后8周，L3和L5接種疫苗的小鼠比對(duì)照組小鼠的脾臟細(xì)胞產(chǎn)生更多的SLA、LRP和重組抗原特異性IFN-Y (圖5a為L3的且圖6a為L5的)。因?yàn)槠⑴K細(xì)胞與MRP的培養(yǎng)物的刺激不導(dǎo)致該細(xì)胞因子的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)IFN-Y產(chǎn)物特異性地由利什曼原蟲核糖體蛋白質(zhì)誘導(dǎo)(圖5a為L3的且圖6a為L5的)。另外，與對(duì)照組小鼠(CpG和生理鹽水)相比，從防護(hù)小鼠獲得的脾臟細(xì)胞上層清液中發(fā)現(xiàn)了更低水平的SLA和LRP特異性IL-IO (圖5b為L3的且圖6b為L5的)和IL-4 (圖5c為L3的且圖6c為L5的)。另外，在防護(hù)的小鼠中，IL-10和IL-4的MRP-特異性L3和L5依賴的產(chǎn)物很低。因此，可以推斷感染后，防護(hù)的表型與能夠控制由寄生蟲引起的IL-4和IL-10反應(yīng)的L3和L5Thl反應(yīng)的誘導(dǎo)相關(guān)。LmL3和LmL5序列數(shù)據(jù)的比對(duì)圖。 碩大利什曼原蟲L3(A)和L5⑶蛋白與它們的釀酒酵母同源基因的氨基酸序列比對(duì)圖。保守氨基酸加有陰影。顯示了 LmL3和LmL5氨基酸數(shù)量。從它們相應(yīng)的DNA序列預(yù)測碩大利什曼原蟲氨基酸序列。(C和D)重組LmL3 (rLmL3)(C)和LmL5 (rLmL5)⑶蛋白的氨基酸序列或預(yù)測的氨基酸序列在細(xì)菌中表達(dá)。位于它們N-端的額外組氨酸-標(biāo)記序列加粗并畫下劃線表示。顯示了 LmL3和LmL5蛋白的氨基酸數(shù)量。
權(quán)利要求
1.L3和/或L5源在治療或預(yù)防或延緩受試對(duì)象寄生蟲病中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其中，L3源為包括與氨基酸序列SEQID NO: I具有至少60%的序列一致性或相似性的氨基酸序列的多肽和/或由與SEQ ID NO:2具有至少60%的一致性的核苷酸序列編碼的多肽，以及 其中，L5源為包括與氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少60%的序列一致性或相似性的氨基酸序列的多肽和/或由與SEQ ID N0:4具有至少60%的一致性的核苷酸序列編碼的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的用途，其中，S4和/或S6源與L3和/或L5源組合。
4.S6源在治療或預(yù)防或延緩受試對(duì)象寄生蟲病中的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，存在佐藥。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，L3和/或L5和/或S4和/或S6源為疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，L3和/或L5和/或S4和/或S6源為蛋白質(zhì)、蛋白片段、肽、核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述佐藥為Thl-促進(jìn)佐藥。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中，所述Thl-促進(jìn)佐藥為CpGODN0
10.一種包括L3和/或L5源的組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中，所述組合物包括S4和/或S6源。
12.一種包括S6源或由S6源組成的組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物進(jìn)一步包括佐藥。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中，所述佐藥為Thl-促進(jìn)佐藥。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中，所述Thl-促進(jìn)佐藥為CpGODN。
16.根據(jù)權(quán)利要求10-15中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物進(jìn)一步包括制藥可接受的佐藥和/或載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求10-16中任意一項(xiàng)所述的組合物，該組合物用作藥物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中，所述藥物為疫苗。
19.L3和/或L5源在體外診斷受試對(duì)象寄生蟲病中的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中，進(jìn)一步使用S4和/或S6源。
21.S6源在體外診斷受試對(duì)象寄生蟲病中的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-9或19-21中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，L3和/或L5和/或S4和/或S6源從利什曼原蟲物種中獲得。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，其中，所述利什曼原蟲物種為碩大利什曼原蟲(Leishmania major)、嬰兒利什曼原蟲(Leishmania infantum)、巴西利什曼原蟲(Leishmania braziliensis)MJliiil(Leishmania mexicana)0
24.根據(jù)權(quán)利要求1-9或19-23中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述寄生蟲病為利什曼病或瘧疾。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-9或19-24中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述寄生蟲病由利什曼原蟲或瘧原蟲物種引起。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-9或19-25中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述寄生蟲病由除L3和/或L5和/或S4和/或S6源來源的物種外的不同物種引起。
27.一種利用L3和/或L5源診斷受試對(duì)象寄生蟲病的方法，該方法包括確定從受試對(duì)象獲得的樣品中是否存在識(shí)別所述源的抗體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，還使用S4和/或S6源。
29.一種利用S6源診斷受試對(duì)象寄生蟲病的方法，該方法包括確定從受試對(duì)象獲得的樣品中是否存在識(shí)別所述源的抗體。
30.一種診斷受試對(duì)象寄生蟲病的分析設(shè)備，其中，該設(shè)備包括L3和/或L5源。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的分析設(shè)備，其中，S4和/或S6源也存在于所述設(shè)備中。
32.—種診斷受試對(duì)象寄生蟲病的分析設(shè)備，其中，該設(shè)備包括S6源或由S6源組成。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-32中任意一項(xiàng)所述的分析，其中，所述分析為ELISA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于制備治療或預(yù)防寄生蟲病藥物的包括L3和/或L5源與任選的佐藥的組合物及其所述寄生蟲病的診斷用途。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102712684SQ201080061107
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者C·阿朗索貝達(dá)特, L·拉米雷斯加西亞, M·索托阿爾瓦雷斯 申請(qǐng)人:熱體實(shí)驗(yàn)室有限公司