專利名稱：不同基質(zhì)中藥中桔青霉素的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定不同基質(zhì)中藥材及其制品中桔青霉素的方法，特別是涉及采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器測(cè)定桔青霉素的方法，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證中藥材及其制品中桔青霉素的方法。
背景技術(shù)：
桔青霉素是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、紅曲霉屬(Monascus)中的絲狀霉菌代謝產(chǎn)生的一種真菌毒素。最初是1931年從青霉屬中的桔青霉(Penicillium. citrinum)中分離得到，其它已知的能產(chǎn)生桔青霉素的菌種如變灰青霉(P. canescens)、擴(kuò)展青霉(P. expansum)、閃白曲霉(Aspergillus candidus)、黃柄曲霉(A. flavipes)、紫紅曲霉(Monascus purpureus)、紅曲霉(M. ruber)等。主要污染谷物、食品及飼料，對(duì)人畜危害都較大，它作用的靶器官是腎臟，人和動(dòng)物如攝入被桔青霉素污染的產(chǎn)品后，可引起腎臟腫大、尿量增多、腎小管擴(kuò)張和上皮細(xì)胞變性壞死等癥狀，甚至還可以導(dǎo)致畸形、腫瘤，誘發(fā)突變。桔青霉素在自然界分布極為廣泛，小麥、大麥、燕麥、麥麩、玉米及紅曲類污染桔青霉素都有相關(guān)報(bào)道，并且對(duì)紅曲類產(chǎn)品的調(diào)查結(jié)果顯示桔青霉素的污染水平普遍較高，不難發(fā)現(xiàn)部分藥食兩用的中藥材受桔青霉素的污染相當(dāng)普遍，如麥芽、谷芽、麥麩、紅曲等。1991年在法國里昂召開的真菌毒素和地方腎病與泌尿道腫瘤研討會(huì)上，討論了桔青霉素在Balcan地方腎病發(fā)生中的作用，引起了國際癌癥研究會(huì)及各國學(xué)者的高度重視。國家藥監(jiān)局在紅曲等為原料保健食品產(chǎn)品申報(bào)與審評(píng)有關(guān)事項(xiàng)中增加產(chǎn)品中桔青霉素指標(biāo)的測(cè)定限量暫定為50 μ g/kg。因此，為保證中藥的安全有效，需盡快建立相關(guān)中藥材及其制品中快速、準(zhǔn)確的桔青霉素檢測(cè)方法，完善我國中藥安全控制標(biāo)準(zhǔn)體系，以提高我國在中藥安全國際標(biāo)準(zhǔn)制定中的地位。

發(fā)明內(nèi)容
到目前為止，國內(nèi)外報(bào)道的方法大多僅限于對(duì)中藥材紅曲米中桔青霉素的分析，對(duì)其他不同基質(zhì)的中藥材及其制品中桔青霉素的分析，目前還是空白。因此對(duì)大范圍中藥材中桔青霉素測(cè)定方法的建立迫在眉睫?，F(xiàn)有的測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品、飼料以及紅曲類產(chǎn)品中的桔青霉素的方法，由于樣品基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單，除紅曲類產(chǎn)品會(huì)產(chǎn)生色素成分干擾外，其它因素干擾較小，一般都較易測(cè)定。本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)不足，選擇了適用于不同基質(zhì)中藥材及其制品中桔青霉素的提取、凈化方法，以及采用有較高靈敏度的高效液相-熒光檢測(cè)法，通過方法的優(yōu)化，保證樣品處理簡(jiǎn)便易行，含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，故采用該方法能更加準(zhǔn)確的對(duì)不同基質(zhì)中藥材及其制品中的桔青霉素進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明是采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定中藥材及其制品中的桔青霉素的方法，同時(shí)還建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證中藥材及其制品中桔青霉素的方法。具體的不同基質(zhì)中藥中桔青霉素測(cè)定的方法，可以通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
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儀器、藥品及材料儀器SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀、RF-IOAxL檢測(cè)器，日本島津公司；TGL-16C型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；WH-861型旋渦混合器，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CitriiTest-HPLC 免疫親和柱，美國 VICAM 公司；微纖維膜濾紙，美國VICAM公司；API4000液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。對(duì)照品桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自！^rmentek公司，純度彡99% ；乙腈、甲醇購自Fisher公司，均為色譜純；水為重蒸水；其余試劑均為分析純。樣品所有樣品均為國內(nèi)市場(chǎng)上隨機(jī)購買而來，低溫干燥后備用。1、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定不同基質(zhì)中藥及其制品中的桔青霉素a.色譜條件采用反相C18液相色譜柱，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈-0. 磷酸水(45 55，ν/ν)，檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為331nm，發(fā)射波長(zhǎng)為500nm。b.溶液配制對(duì)照品溶液的配制分別稱取對(duì)照品適量，加乙腈或甲醇制成溶液；c.樣品溶液的制備樣品提取取藥材粉末，置具塞錐形瓶中，加甲醇-水溶液適量，高速震蕩提取，離心，過濾，稀釋，震搖，靜置，再震搖，再靜置，微纖維膜過濾，備用；樣品凈化取上述濾液緩慢通CitriTest-HPLC免疫親和柱，直至空氣通過柱體，再以緩沖溶液淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，并使空氣通過柱體。甲醇水洗脫，收集洗脫液，過濾后進(jìn)HPLC分析。d.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定。2、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證中藥中的桔青霉素a.色譜條件流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫。色譜柱為Gemini C18色譜柱。b.質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源，正離子方式檢測(cè)，噴射電壓為5500V，毛細(xì)管溫度550°C，碰撞能量23/36eV，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。c.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，測(cè)定。本發(fā)明不同基質(zhì)中桔青霉素的測(cè)定方法，優(yōu)選的技術(shù)方案可以按下列測(cè)定步驟進(jìn)行1、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定不同基質(zhì)中藥及其制品中的桔青霉素(1)色譜條件高效液相色譜儀(HPLC-FLD) SHIMADZU LC-20AT系列，RF-IOAxL熒光檢測(cè)器；色譜柱Gemini5u C18 IlOA (250 X 4. 60mm)；流動(dòng)相乙腈-0. 磷酸水(45 55，ν/ν)；柱溫25°C；
流速1. Oml/min ；激發(fā)波長(zhǎng)=331nm，發(fā)射波長(zhǎng)=500nm。(2)溶液配制對(duì)照品溶液的配制精密稱取桔青霉素對(duì)照品適量，加甲醇制成每ml含^g的溶液；PBS稀釋液稱取8. Og氯化鈉，1. 2g磷酸氫二鈉，0. 2g磷酸二氫鉀，0. 2g氯化鉀，用990ml純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)值至7. 0，最后用純水稀釋至1000ml。PBS-吐溫淋洗液(0. 05% )取0. 5ml吐溫-20，加入PBS緩沖溶液并定容至1000ml。(3)樣品溶液的制備樣品提取精密取藥材粉末l.Og，置具塞錐形瓶中，加甲醇-水溶液(70 30, V/V) 5ml，高速震蕩提取3min，6000r/min的轉(zhuǎn)速下離心20min，過濾，取3ml濾液加PBS稀釋液稀釋至30ml，震搖lmin，靜置2min，再震搖lmin，靜置3min，微纖維膜過濾，備用。樣品凈化取上述濾液2ml以1滴/秒的速度緩慢通過CitriTest-HPLC免疫親和柱，直至2-3ml空氣通過柱體，再以IOml 0. 05% PBS-吐溫溶液淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，并使2-3ml空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入2. OmL甲醇-磷酸水(70 30，V/V)洗脫，收集洗脫液定容過濾備用。(4)測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液50 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定桔青
霉素含量。2、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證不同基質(zhì)中藥材及制品中的桔青霉素(1)色譜條件流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.1%甲酸)。梯度 0. 01-0. 60min,90 % A ；0. 60-1. 20min,90 % A-5 % A ；1. 20-2. 50min,5 % A ；2. 50-2. 51min,5% A-90% A ；2. 51-4. 00min,90% Α。色譜柱為 Gemini C18(20mmX2. 00mm,3 μ m),流速為 0. 5ml/min。(2)質(zhì)譜條件離子源為ESI電噴霧離子源，正離子方式檢測(cè)，噴射電壓為5500V，霧化氣60psi，簾幕氣12psi，CAD (碰撞氣)15個(gè)單位，毛細(xì)管溫度550 °C，碰撞能量23/37eV，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。(3)測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液10 μ L，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，進(jìn)行確證。經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，確認(rèn)方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為不同基質(zhì)中藥材及制品中桔青霉素的測(cè)定方法。本發(fā)明提供了不同基質(zhì)中藥及其制品中桔青霉素的高效液相色譜-熒光檢測(cè)的方法以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的確證方法。結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為不同基質(zhì)中藥材及其制品中桔青霉素的測(cè)定方法。


圖1是紅曲米空白樣品的高效相色譜圖；圖2是桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的高效相色譜圖；圖3是紅曲米加樣樣品高效相色譜圖4是紅曲米陽性樣品的高效相色譜圖；圖5是桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的MS2質(zhì)譜圖；圖6是桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的MRM提取粒子流圖；圖7是紅曲米陽性樣品的MRM提取粒子流圖。
具體實(shí)施方案1、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定中藥材及其制品中的桔青霉素(1)色譜條件高效液相色譜儀(HPLC-FLD) :SHIMADZU LC-20AT系列，RF-IOAxL熒光檢測(cè)器；色譜柱Gemini5u C18 IlOA (250 X 4. 60mm)；流動(dòng)相乙腈-0. 磷酸水(45 55，ν/ν)；柱溫25°C；流速1. Oml/min ；激發(fā)波長(zhǎng)=331nm，發(fā)射波長(zhǎng)=500nm。(2)溶液配制對(duì)照品溶液的配制精密稱取桔青霉素對(duì)照品適量，加甲醇制成每ml含^g的溶液；PBS稀釋液稱取8. Og氯化鈉，1. 2g磷酸氫二鈉，0. 2g磷酸二氫鉀，0. 2g氯化鉀，用990ml純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)值至7. 0，最后用純水稀釋至1000ml。PBS-吐溫淋洗液(0.05%)取0. 5ml吐溫-20，加入PBS緩沖溶液并定容至1000ml。(3)樣品溶液的制備樣品提取精密取藥材粉末lg，置具塞錐形瓶中，加甲醇-水溶液(70 30，V/V) 5ml，高速震蕩提取3min，6000r/min的轉(zhuǎn)速下離心20min，過濾，取3ml濾液加PBS稀釋液稀釋至30ml，震搖lmin，靜置2min，再震搖lmin，靜置3min，微纖維膜過濾，備用；樣品凈化取上述濾液2ml以1滴/秒的速度緩慢通過CitriTest-HPLC免疫親和柱，直至2-3ml空氣通過柱體，再以IOml 0. 05% PBS-吐溫溶液淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，并使2-3ml空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入2. OmL甲醇-磷酸水(70 30，V/V)洗脫，收集洗脫液定容過濾備用。(4)回收率實(shí)驗(yàn)采用西洋參、薏苡仁、紅曲米三種中藥材樣品進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)，且經(jīng)過桔青霉素(CIT)免疫親和柱處理之后，進(jìn)HPLC-FLD檢測(cè)，對(duì)添加的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)無干擾，故將其用來做回收率實(shí)驗(yàn)。分別添加了 3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品溶液200μ g/kg、100y g/kg、50y g/kg，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，η = 3。精密稱取l.Og藥材粉末，加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，揮干溶劑后，按上述方法制備樣品溶液，進(jìn)樣量50 μ L，按外標(biāo)法測(cè)定其含量，結(jié)果見表1。表1桔青霉素加樣回收率的測(cè)定
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)不同基質(zhì)中藥及其制品中桔青霉素的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定中藥及其制品中的桔青霉素。(2)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證中藥及其制品中的桔青霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的中藥及其制品中桔青霉素的檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定中藥中的桔青霉素。a.色譜條件采用反相Cw液相色譜柱，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈-7K，檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為331nm，發(fā)射波長(zhǎng)為500nm ；b.溶液配制對(duì)照品溶液的配制分別稱取對(duì)照品適量，加乙腈或甲醇制成溶液；c.樣品溶液的制備樣品提取取藥材粉末，置具塞錐形瓶中，加甲醇-水溶液適量，高速震蕩提取，離心，過濾，稀釋，震搖，靜置，再震搖，再靜置，微纖維膜過濾，備用；樣品凈化取上述濾液緩慢通過桔青霉素免疫親和柱，直至空氣通過柱體，再以緩沖溶液淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，并使空氣通過柱體。甲醇水洗脫，收集洗脫液，過濾后進(jìn)HPLC分析。d.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定。(2)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證中藥中的桔青霉素。a.色譜條件流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫。色譜柱為GeminiC18色譜柱。b.質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源，正離子方式檢測(cè)，噴射電壓為5500V，毛細(xì)管溫度550°C，碰撞能量23/37eV，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。c.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，測(cè)定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的中藥中桔青霉素的檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定中藥中的桔青霉素。a.色譜條件高效液相色譜儀(HPLC-FLD) :SHIMADZU LC-20AT系列，RF-IOAxL熒光檢測(cè)器；色譜柱Gemini 5u C18 IlOA (250 X 4. 60mm)；流動(dòng)相乙腈-0. 磷酸水(45 55, ν/ν)；柱溫:25°C ；流速:1. Oml/min ；激發(fā)波長(zhǎng)=331nm，發(fā)射波長(zhǎng)=500nm。b.溶液配制然后用對(duì)照品溶液的配制精密稱取桔青霉素對(duì)照品適量，加乙腈或甲醇制成每ml含2-8ng的溶液；PBS稀釋液稱取8. Og氯化鈉，1. 2g磷酸氫二鈉，0. 2g磷酸二氫鉀，0. 2g氯化鉀，用990ml純水溶解，濃鹽酸調(diào)節(jié)值至7. 0，最后用純水稀釋至1000ml。PBS-吐溫淋洗液(0. 05% )取0. 5ml吐溫-20，加入PBS緩沖溶液并定容至1000ml。c.樣品溶液的制備樣品提取精密取勻質(zhì)處理的藥材粉末l_5g，置具塞錐形瓶中，加甲醇-水溶液(60-75 40-25，V/V)適量，高速震蕩提取3_5min，6000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10_20min，過濾，取3-15ml濾液加PBS溶液20_40ml稀釋，震搖l_2min，靜置2_;3min，再震搖l_2min，靜置l-3min，玻璃纖維膜過濾，備用；樣品凈化取上述濾液l_5ml緩慢通過CitriTest-HPLC免疫親和柱，直至2_5ml空氣通過柱體，再以10-15mlPBS-吐溫溶液淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，并使l_5ml空氣通過柱體。加anl甲醇水洗脫，收集洗脫液定容過濾備用。d.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液10-50 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定。(2)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證中藥中的桔青霉素。a.色譜條件流動(dòng)相A為水(含0.甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈(含0. 甲酸)。梯度0. 01-0. 60min, 90 % A ；0. 60-1. 20min, 90 % A-5% A ；1. 20-2. 50min, 5% A ；2. 50-2. 51min,5% A-90% A ；2. 51-4. 00min,90% A0 色譜柱為 Gemini C18 (20mmX 2. 00mm，3 μ m)，流速為0. 5ml/min。b.質(zhì)譜條件離子源為ESI電噴霧離子源，正離子方式檢測(cè)，噴射電壓為5500V，霧化氣60psi，簾幕氣12psi，CAD (碰撞氣)15個(gè)單位，毛細(xì)管溫度550°C，碰撞能量23/37eV，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。C.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液10 μ L，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，進(jìn)行確證。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的中藥中桔青霉素的檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定中藥中的桔青霉素。a.色譜條件高效液相色譜儀(HPLC-FLD) :SHIMADZU LC-20AT系列，RF-IOAxL熒光檢測(cè)器；色譜柱Gemini 5u C18 IlOA (250 X 4. 60mm)；流動(dòng)相乙腈-0. 磷酸水(45 55, ν/ν)；柱溫:25°C ；流速:1. Oml/min ；激發(fā)波長(zhǎng)=331nm，發(fā)射波長(zhǎng)=500nm。b.溶液配制對(duì)照品溶液的配制精密稱取桔青霉素對(duì)照品適量，加甲醇制成每ml含^g的溶液；PBS稀釋液稱取8. Og氯化鈉，1. 2g磷酸氫二鈉，0. 2g磷酸二氫鉀，0. 2g氯化鉀，用990ml純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)值至7. 0，最后用純水稀釋至1000ml。PBS-吐溫淋洗液(0. 05% )取0. 5ml吐溫-20，加入PBS緩沖溶液并定容至1000ml。c.樣品溶液的制備樣品提取精密取藥材粉末lg，置具塞錐形瓶中，加甲醇-水溶液(70 30，V/V)5ml，高速震蕩提取3min，6000r/min的轉(zhuǎn)速下離心20min，過濾，取3ml濾液加PBS稀釋液稀釋至30ml，震搖Imin，靜置2min，再震搖Imin，靜置3min，微纖維膜過濾，備用；樣品凈化取上述濾液anl以1滴/秒的速度緩慢通過CitriTest-HPLC免疫親和柱，直至2-3ml空氣通過柱體，再以IOml 0. 05% PBS-吐溫溶液淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，并使2_3ml空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入2. OmL甲醇-磷酸水(70 30，V/V)洗脫，收集洗脫液定容過濾備用。d.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液50 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定桔青霉素含量。(2)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法確證中藥中的桔青霉素；a.色譜條件流動(dòng)相A為水(含0.甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈(含0. 甲酸)。梯度·0. 01-0. 60min,90% A ；0. 60-1. 20min,90% A-5 % A ；1. 20-2. 50min,5% A ；2. 50-2. 51min,5% A-90% A ；2. 51-4. 00min,90% A0 色譜柱為 Gemini C18 (20mmX 2. 00mm，3 μ m)，流速為·0. 5ml/min。b.質(zhì)譜條件離子源為ESI電噴霧離子源，正離子方式檢測(cè)，噴射電壓為5500V，霧化氣60psi，簾幕氣12psi，CAD (碰撞氣)15個(gè)單位，毛細(xì)管溫度550°C，碰撞能量23/37eV，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。C.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液10 μ L，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，進(jìn)行確證。
全文摘要
本發(fā)明為一種采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器(HPLC-FLD)法檢測(cè)不同基質(zhì)中藥材及其制品中桔青霉素的方法，包括樣品的提取，純化及檢測(cè)。所述的樣品采用甲醇-水(70∶30，V/V)高速震蕩提取，離心，過濾，加PBS溶液稀釋，微纖維膜過濾，免疫親和柱凈化后，收集洗脫液，微孔濾膜過濾后進(jìn)樣分析。樣品經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行確證。本方法適用于各種不同基質(zhì)中藥材及其制品中桔青霉素的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，回收率高，檢測(cè)限低。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102590366SQ201110000818
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者李燕, 楊美華 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所