專利名稱：一種用于診斷q熱病的蛋白組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于診斷Q熱病的蛋白組合物。
背景技術(shù)：
貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii)為專性吞噬細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性小桿菌。 該菌對(duì)外界環(huán)境抵抗力很強(qiáng)，對(duì)人和動(dòng)物有極強(qiáng)的感染力，可通過氣溶膠擴(kuò)散經(jīng)呼吸道進(jìn)入體內(nèi)導(dǎo)致人及動(dòng)物發(fā)生感染并導(dǎo)致Q熱。Q熱是一種呈世界性分布的人獸共患病，在我國(guó)分布廣泛。人類Q熱分為急性和慢性兩種類型，急性Q熱以發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛為主要癥狀，并常伴有肺炎發(fā)生，部分患者還可發(fā)生肝炎、心肌炎甚至腦膜炎。如果急性Q熱未得到及時(shí)或徹底治療可轉(zhuǎn)變?yōu)槁裕鹇愿窝?、心?nèi)膜炎、骨髓炎等。目前，Q熱最常用的特異性診斷方法為血清學(xué)診斷，包括間接免疫熒光(IFA)技術(shù)，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術(shù)等.這些檢測(cè)方法特異性較高，是目前臨床用得最多的檢測(cè)方法。但這些檢測(cè)方法對(duì)樣本需求量大、步驟較為繁瑣費(fèi)時(shí)、并且都需要純化的貝氏柯克斯體全菌作為抗原，而提取純化貝氏柯克斯體的防護(hù)要求高，工藝復(fù)雜，成本昂貴，因此這些方法都難以被廣泛推廣和使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于診斷Q熱病的蛋白組合物。本發(fā)明所提供的用于診斷Q熱病的蛋白組合物，由如下(1)-(7)中所述蛋白組成(1)為如下Ι-a或Ι-b所示l_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 1所示的蛋白質(zhì)；Ι-b、將SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由Ι-a衍生的蛋白質(zhì)；(2)為如下2-a或2-b所示2-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示的蛋白質(zhì)；2-b、將SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-a衍生的蛋白質(zhì)；(3)為如下3-a或3_b所示3-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 3所示的蛋白質(zhì)；3-b、將SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-a衍生的蛋白質(zhì)；(4)為如下4-a或4_b所示4-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 4所示的蛋白質(zhì)；4-b JfSEQ ID NO :4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-a衍生的蛋白質(zhì)；(5)為如下5-a或5_b所示5-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 5所示的蛋白質(zhì)；5-b、將SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由5-a衍生的蛋白質(zhì)；(6)為如下6-a或6_b所示6-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 6所示的蛋白質(zhì)；6-b、將SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由6-a衍生的蛋白質(zhì)；(7)為如下7-a或7_b所示7-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 7所示的蛋白質(zhì)；7-b、將SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由7-a衍生的蛋白質(zhì)。上述蛋白組合物中，所述Q熱病是由病原菌貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii) 感染動(dòng)物引起的。上述蛋白組合物中，所述動(dòng)物為人或家畜或鼠；所述家畜為牛、羊或馬。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于診斷Q熱病的蛋白芯片。本發(fā)明所提供的用于診斷Q熱病的蛋白芯片，由基底、檢測(cè)點(diǎn)、陽性質(zhì)控點(diǎn)和陰性質(zhì)控點(diǎn)組成，檢測(cè)點(diǎn)、陽性質(zhì)控點(diǎn)和陰性質(zhì)控點(diǎn)均點(diǎn)制在所述基底上；所述檢測(cè)點(diǎn)分為七種，每種檢測(cè)點(diǎn)由如下(1)-(7)所示蛋白中的一種點(diǎn)制而成；(1)為如下Ι-a或Ι-b所示Ι-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 1所示的蛋白質(zhì)；Ι-b、將SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由Ι-a衍生的蛋白質(zhì)；(2)為如下2-a或2_b所示2-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示的蛋白質(zhì)；2-b、將SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-a衍生的蛋白質(zhì)；(3)為如下3-a或3_b所示3-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 3所示的蛋白質(zhì)；3-b、將SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-a衍生的蛋白質(zhì)；(4)為如下4-a或4_b所示4-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 4所示的蛋白質(zhì)；4-b JfSEQ ID NO :4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-a衍生的蛋白質(zhì)；(5)為如下5-a或5_b所示5-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 5所示的蛋白質(zhì)；5-b、將SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由5_a衍生的蛋白質(zhì)；(6)為如下6-a或6_b所示6-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 6所示的蛋白質(zhì)；6-b、將SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由6-a衍生的蛋白質(zhì)；(7)為如下7-a或7_b所示7-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 7所示的蛋白質(zhì)；7-b、將SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由7-a衍生的蛋白質(zhì)。上述蛋白芯片中，所述基底可為任何制備蛋白芯片時(shí)所用的基底，具體可如醛基化玻片。上述蛋白芯片中，所述陰性質(zhì)控對(duì)照可為任何本領(lǐng)域中常用的陰性質(zhì)控對(duì)照，具體可如水、PBS緩沖液，還具體可為蛋白洗脫緩沖液或轉(zhuǎn)入空載體pET-32a(+)的BL21(DE3) 的細(xì)胞裂解液。其中，轉(zhuǎn)入空載體pET_32a(+)的BL21 (DE3)的細(xì)胞裂解液按照如下方法制備將轉(zhuǎn)入pET-32a(+)的BL21(DE!3)接入安芐抗性(Amp+) LB液體培養(yǎng)基中，37°C震搖過夜，次日按1 100接種新鮮安芐抗性(Amp+)LB液體培養(yǎng)基，37°C震搖至OD6tltl = 0. 4，加入誘導(dǎo)劑IPTG，濃度為0. 4mM,于37°C繼續(xù)震搖4小時(shí)，得到發(fā)酵液。取誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液100ml， 8000rpm/min離心5min，集菌，棄上清。用30ml裂解緩沖液重懸菌體，以25%振幅超聲破碎 (超3s，停9s) 1小時(shí)，得到轉(zhuǎn)入pET-32a(+)的BL21 (DE3)的細(xì)胞裂解液。其中，每1升裂解緩沖液按照如下方法制備將50mmo 1 NaH2PO4 · H2O、300mmo 1 NaClUOmmol咪唑和水混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，用水定容至1L，得到裂解緩沖液。其中，每1 升洗脫緩沖液組成將 50mmol NaH2PO4 'H2O^OOmmol NaCl、250mmol 咪唑、0. 3L甘油和水混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，用水定容至1L，得到洗脫緩沖液。上述任一所述蛋白芯片中，所述陽性質(zhì)控點(diǎn)由人源IgG或除人外的其它動(dòng)物來源的IgG點(diǎn)制而成。上述任一所述蛋白芯片中，每個(gè)所述檢測(cè)點(diǎn)中蛋白的量為4. 5μ g ；每個(gè)所述陽性質(zhì)控點(diǎn)中IgG的量為4.上述任一所述蛋白芯片中，所述除人外的其它動(dòng)物來源的IgG為家畜來源的IgG 或鼠來源的IgG ；所述家畜來源的IgG為牛來源的IgG、羊來源的IgG或馬來源的IgG。上述任一所述蛋白芯片中，所述Q熱病是由病原菌貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii)感染動(dòng)物引起的。上述任一所述蛋白芯片中，所述感染動(dòng)物為感染人或感染家畜或感染鼠；所述家畜為牛、羊或馬。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種用于血清學(xué)診斷Q熱的試劑盒。本發(fā)明所提供的用于血清學(xué)診斷Q熱的試劑盒，為如下I或II所示I、由上述任一所述蛋白組合物、封閉液、漂洗液和熒光素標(biāo)記的二抗組成；II、由上述任一所述蛋白芯片、封閉液、漂洗液和熒光素標(biāo)記的二抗組成；所述封閉液按照如下方法制備得到將BSA溶于pH值為7. 4的PBS緩沖液中，BSA與PH值為7. 4的PBS緩沖液的配比為Ig 100ml，得到的溶液即為所述封閉液；所述熒光素標(biāo)記的二抗為Cy5標(biāo)記的羊抗人IgG或Cy5標(biāo)記的羊抗除人以外其它動(dòng)物來源的IgG ；所述漂洗液為PBST緩沖液；每1升所述pH值為7. 4的PBS緩沖液按照如下方法制備將8gNaCl、0. 2g KCl、 3. 53gNa2HP04. 12H20、0. 24g KH2PO4和水混合，用水定容至1升，得到的溶液的pH值為7. 4， 即得到所述PBS緩沖液；所述PBST緩沖液按照如下方法制備將所述pH值為7.4的PBS緩沖液與 Tween-20混合，pH值為7. 4的PBS緩沖液與Tween-20的配比為IL 1ml，得到所述PBST 緩沖液。上述任一所述蛋白組合物在制備Q熱病診斷芯片中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述蛋白組合物在制備Q熱病診斷試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的蛋白組合物及蛋白芯片可對(duì)Q熱病人或動(dòng)物的血清進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的血清學(xué)分析診斷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，樣本用量少，省時(shí)省力，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的繁瑣、累人、耗時(shí)的血清學(xué)診斷方法做Q熱血清學(xué)診斷。本發(fā)明屬于艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項(xiàng)中內(nèi)容，項(xiàng)目名稱傳染病病原體診斷和組合檢測(cè)技術(shù)研究；課題編號(hào)2008ZX10004-002。本發(fā)明對(duì)國(guó)家利益或公共利益具有重大意義，迫切需要采取專利方式予以保護(hù)。


圖1為重組蛋白的電泳結(jié)果。圖2為蛋白芯片與感染小鼠血清反應(yīng)。圖3為蛋白芯片與病人血清反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。貝氏柯克斯體新橋株(Coxiella burnetii)Xinqiao strain 在文獻(xiàn)"Wen，B.， S. Yu, G. Yu, Q.Li, and X. Zhang. 1991. Analysis of proteins and lipopolysaccharides fromChinese isolates of Coxiella burnetii with monoclonal antibodies. Acta Virol35 :538-544. ”中公開過，公眾可從中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。實(shí)施例1、7種抗原蛋白的制備載體pET_32a(+)購自Novagen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為69015。pQE30購自qiagen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為33203。大腸桿菌BL21購自Novagen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為69450。大腸桿菌M15購自 Novagen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為；34210。
一、7種抗原蛋白的蛋白序列及編碼基因序列7種抗原蛋白的蛋白序列及編碼基因序列如表1所示。表1、蛋白及基因序列
蛋白名稱蛋白序列編碼基因序列QmpHSEQ ID NO 1SEQ ID NO 8ComlSEQ ID NO 2SEQ ID NO 9YbgFSEQ ID NO 3SEQ ID NO 10MipSEQ ID NO 4SEQ ID NO 11DnaKSEQ ID NO 5SEQ ID NO 12GroELSEQ ID NO 6SEQ ID NO 13RplLSEQ ID NO 7SEQ ID NO 14二、蛋白OmpH的制備OmpH基因擴(kuò)增以貝氏柯克斯體新橋株(Coxiella burnetii)的基因組DNA為模板，用引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；用限制性內(nèi)切酶BamHI和MlI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的基因片段；用限制性內(nèi)切酶BamHI和MlI酶切出發(fā)載體pET_32a(+)，回收載體大片段；將目的基因片段和載體大片段連接，得到重組載體；PCR擴(kuò)增的通用條件 94°C預(yù)變性 5min，95°C 30sec、55°C 30sec、72°C 1. 5min，循環(huán)；35 次，72°C延伸 7min。重組菌的制備將重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌大腸桿菌BL21中，得到重組菌。驗(yàn)證將重組菌接入含有安芐抗性(Amp+)的固體LB平板培養(yǎng)基中，抗性篩選，挑取單性克?。粚慰寺〗尤隠B液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果在載體pET-3h (+)的BamHI和 SalI酶切位點(diǎn)間插入的基因序列如SEQ ID NO 8所示，表明構(gòu)建的載體正確。蛋白表達(dá)將陽性重組菌接入安芐抗性(Amp+)LB液體培養(yǎng)基中，37°C震搖過夜，次日按1 100接種新鮮安芐抗性(Amp+)LB液體培養(yǎng)基，37°C震搖至OD6tltl = 0. 4，加入誘導(dǎo)劑IPTG，濃度為0. 4mM，于37°C繼續(xù)震搖4小時(shí)，得到發(fā)酵液。蛋白純化取誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液100ml，8000rpm/min離心5min，集菌，棄上清。用 30ml裂解緩沖液重懸菌體，以25%振幅超聲破碎(超3s，停9s) 1小時(shí)。取出超聲裂解物， 以12000rpm離心20min，棄掉沉淀，收集上清液。向上清液中加入IOml回收緩沖液后混勻， Ih后以12000rpm離心20min，棄掉沉淀，收集上清液。將上清液與^ilNi-NTA混合，室溫 200rpm振蕩混勻4h，使目的蛋白與Ni-NTA完全結(jié)合。吸掉上清，依次加入含6M OM(6M、 5M、4M、3M、2M、1M、0M)尿素的復(fù)性緩沖液逐級(jí)復(fù)性；每次加入復(fù)性緩沖液后混勻，室溫靜置作用4h。待加入含OM尿素的復(fù)性緩沖液作用4h后，倒入純化空柱中，加入IOml洗滌緩沖液洗滌，并控制流速為3ml/min。待液體流凈，加入洗脫緩沖液，共洗脫4次，每次0. 5ml，將每次收集的洗脫液合并，即得到目的蛋白溶液。
每1升裂解緩沖液按照如下方法制備將50mmol NaH2PO4 · H2O、300mmol NaCl、 IOmmol咪唑和水混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，用水定容至1L，得到裂解緩沖液。0. lmol/L Tris-Cl 緩沖液配制將 12. llgTris、800mL ddH20 禾口 49mL HCl 混合，滴加濃鹽酸調(diào)PH至8. 0，用ddH20定溶至IOOOmL,得到0. lmol/L Tris-Cl緩沖液。每1升回收緩沖液按照如下方法制備將IOOmmol NaH2PO4 · H20、0. ILTris-Cl緩沖液(即IOmmol Tris)、8mol尿素和水混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，用水定容至1L，得到回收緩沖液。復(fù)性緩沖液制備每1升含6M尿素復(fù)性緩沖液按照如下方法制備將500mmol NaCl,0. 2L Tris-Cl 緩沖液、6mol尿素、0. 2L甘油和水混合，調(diào)節(jié)pH至7. 4，用水定容至1升，得到含6M尿素復(fù)性緩沖液。每1升無尿素復(fù)性緩沖液按照如下方法制備將500mmOl NaCl,0. 2L Tris-Cl緩沖液、0. 2L甘油和水混合，調(diào)節(jié)pH至7. 4，用水定容至1升，得到無尿素復(fù)性緩沖液。5M-1M尿素復(fù)性緩沖液由6M尿素復(fù)性緩沖液和無尿素復(fù)性緩沖液不同體積配比得到。每1 升洗滌緩沖液組成將 50mmol NaH2PO4 'H2O^OOmmol NaCl、20mmol 咪唑和水混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，用水定容至1L，得到洗滌緩沖液。每1 升洗脫緩沖液組成將 50mmol NaH2PO4 · H20、300mmol NaCl、250mmol 咪唑、 0. 3L甘油和水混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，用水定容至1L，得到洗脫緩沖液。每1升LB液體培養(yǎng)基組成將IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg氯化鈉和水混合，用水定容至1L，得到LB液體培養(yǎng)基。三、其它蛋白的制備制備方法與步驟二中基本相同，不同的是引物、出發(fā)載體、限制性內(nèi)切酶、出發(fā)菌株、重組菌抗性篩選方式不同，具體如表2所示。當(dāng)所用出發(fā)載體為pET_32a(+)時(shí)，用的出發(fā)菌株為BL21，對(duì)應(yīng)的抗性篩選采用安芐抗性(Amp+)；當(dāng)所用出發(fā)載體為pQE30時(shí)，用的出發(fā)菌株為M15，對(duì)應(yīng)的抗性篩選采用安芐 (Amp+)和卡那(Kan+)雙抗性。表2、引物、載體、酶
權(quán)利要求
1.一種用于診斷Q熱病的蛋白組合物，由如下(1)-(7)中所述蛋白組成(1)為如下l_a或Ι-b所示Ι-a、氨基酸序列為SEQ ID NO=I所示的蛋白質(zhì)；Ι-b、將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由Ι-a衍生的蛋白質(zhì)；(2)為如下2-a或2-b所示2_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示的蛋白質(zhì)；2-b、將SEQID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-a衍生的蛋白質(zhì)；(3)為如下3-a或3-b所示3_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 3所示的蛋白質(zhì)；3-b、將SEQID NO :3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-a衍生的蛋白質(zhì)；(4)為如下4-a或4-b所示4_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 4所示的蛋白質(zhì)；4-b、將SEQID NO :4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-a衍生的蛋白質(zhì)；(5)為如下5-a或5-b所示5_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 5所示的蛋白質(zhì)；5-b、將SEQID NO :5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由5-a衍生的蛋白質(zhì)；(6)為如下6-a或6-b所示6_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 6所示的蛋白質(zhì)；6-b、將SEQID NO :6所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由6-a衍生的蛋白質(zhì)；(7)為如下7-a或7-b所示7_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 7所示的蛋白質(zhì)；7-b、將SEQID NO :7所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由7-a衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白組合物，其特征在于所述Q熱病是由病原菌貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii)感染動(dòng)物引起的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白組合物，其特征在于所述動(dòng)物為人或家畜或鼠；所述家畜為牛、羊或馬。
4.一種用于診斷Q熱病的蛋白芯片，由基底、檢測(cè)點(diǎn)、陽性質(zhì)控點(diǎn)和陰性質(zhì)控點(diǎn)組成， 檢測(cè)點(diǎn)、陽性質(zhì)控點(diǎn)和陰性質(zhì)控點(diǎn)均點(diǎn)制在所述基底上；所述檢測(cè)點(diǎn)分為七種，每種檢測(cè)點(diǎn)由如下(1)-(7)所示蛋白中的一種點(diǎn)制而成；(1)為如下Ι-a或l_b所示Ι-a、氨基酸序列為SEQ ID NO 1所示的蛋白質(zhì)；Ι-b、將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由Ι-a衍生的蛋白質(zhì)；(2)為如下2-a或2-b所示2_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示的蛋白質(zhì)；2-b、將SEQID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由2-a衍生的蛋白質(zhì)；(3)為如下3-a或3-b所示3_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 3所示的蛋白質(zhì)；3-b、將SEQID NO :3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由3-a衍生的蛋白質(zhì)；(4)為如下4-a或4-b所示4_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 4所示的蛋白質(zhì)；4-b、將SEQID NO :4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由4-a衍生的蛋白質(zhì)；(5)為如下5-a或5-b所示5_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 5所示的蛋白質(zhì)；5-b、將SEQID NO :5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由5-a衍生的蛋白質(zhì)；(6)為如下6-a或6-b所示6_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 6所示的蛋白質(zhì)；6-b、將SEQID NO :6所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由6-a衍生的蛋白質(zhì)；(7)為如下7-a或7-b所示7_a、氨基酸序列為SEQ ID NO 7所示的蛋白質(zhì)；7-b、將SEQID NO :7所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由7-a衍生的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白芯片，其特征在于所述陽性質(zhì)控點(diǎn)由人源IgG或除人外的其它動(dòng)物來源的IgG點(diǎn)制而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的蛋白芯片，其特征在于每個(gè)所述檢測(cè)點(diǎn)中蛋白的量為 4. 5 μ g ；每個(gè)所述陽性質(zhì)控點(diǎn)中IgG的量為4. 5 μ g ；所述除人外的其它動(dòng)物來源的IgG為家畜來源的IgG或鼠來源的IgG ；所述家畜來源的IgG為牛來源的IgG、羊來源的IgG或馬來源的IgG。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的蛋白芯片，其特征在于所述Q熱病是由病原菌貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii)感染動(dòng)物引起的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的蛋白芯片，其特征在于所述感染動(dòng)物為感染人或感染家畜或感染鼠；所述感染家畜為感染牛、感染羊或感染馬。
9.一種用于血清學(xué)診斷Q熱的試劑盒，為如下I或II所示I、由權(quán)利要求1或2或3所述蛋白組合物、封閉液、漂洗液和熒光素標(biāo)記的二抗組成；II、由權(quán)利要求4-8中任一所述蛋白芯片、封閉液、漂洗液和熒光素標(biāo)記的二抗組成；所述封閉液按照如下方法制備得到將BSA溶于pH值為7. 4的PBS緩沖液中，BSA與PH值為7. 4的PBS緩沖液的配比為Ig 100ml，得到的溶液即為所述封閉液；所述熒光素標(biāo)記的二抗為Cy5標(biāo)記的羊抗人IgG或Cy5標(biāo)記的羊抗除人以外其它動(dòng)物來源的IgG ；所述漂洗液為PBST緩沖液；每1升所述PH值為7.4的PBS緩沖液按照如下方法制備將8gNaCl、0.2g KC1、 3. 53gNa2HP04. 12H20、0. 24g KH2PO4和水混合，用水定容至1升，得到的溶液的pH值為7. 4， 即得到所述PBS緩沖液；所述PBST緩沖液按照如下方法制備將所述pH值為7. 4的PBS緩沖液與Tween-20混合，PH值為7. 4的PBS緩沖液與Tween-20的配比為IL lml，得到所述PBST緩沖液。
10.權(quán)利要求1或2或3所述蛋白組合物在制備Q熱病診斷芯片中的應(yīng)用；權(quán)利要求1 或2或3所述蛋白組合物在制備Q熱病診斷試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于診斷Q熱病的蛋白組合物。該蛋白組合物由如下(1)-(7)中所述蛋白組成(1)氨基酸序列為SEQ ID NO1所示的蛋白質(zhì)；(2)氨基酸序列為SEQ ID NO2所示的蛋白質(zhì)；(3)氨基酸序列為SEQ ID NO3所示的蛋白質(zhì)；(4)氨基酸序列為SEQ ID NO4所示的蛋白質(zhì)；(5)氨基酸序列為SEQ ID NO5所示的蛋白質(zhì)；(6)氨基酸序列為SEQ ID NO6所示的蛋白質(zhì)；(7)氨基酸序列為SEQ ID NO7所示的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白組合物及蛋白芯片可對(duì)Q熱病人或動(dòng)物的血清進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的血清學(xué)分析診斷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，樣本用量少，省時(shí)省力，有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的繁瑣、累人、耗時(shí)的血清學(xué)診斷方法做Q熱血清學(xué)診斷。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102169122SQ201110001420
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者溫博海, 熊小路, 王錫樂 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所