專利名稱：一種繁縷水提取物及其制備方法和液相色譜的含量、指紋圖譜、分子量分布測定方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物制備及分析領域，涉及一種繁縷水提取物及其制備方法、高效液相色譜含量、指紋圖譜、分子量分布測定方法及應用。通過高效液相色譜法用凝膠柱測定繁縷水提取物中較大分子量成份含量和分子量分布的測定方法，并可推定各類成份的化合物類型，及將該方法應用于制定繁縷水提取物的質量標準和在繁縷水提取物組合物質量控制中應用。
背景技術：
據(jù)文獻報道，繁縷屬植物的化學成分主要是總酚酸類物質、肽類、氨基酸類、環(huán)縮氨酸類、黃酮及黃酮甙類、皂甙及皂甙原類、阿魏酸及其酯類、綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、奎寧酸、抗壞血酸類、草酸及草酸鈣、單?；肴樘穷愔?、生物堿類等等，其提取物具有抑制艾滋病病毒、肝炎病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、皰疹病毒等分屬RNA和DNA兩大類的多種病毒的作用。繁縷水提取物成分復雜，含有較多繁縷糖肽、多糖、總黃酮、酚酸性物質等，文獻報導過多種方法提取的繁縷水提取物，其分子量分布范圍在300 2，000, OOODa0為了更全面、有效的控制繁縷水提取物的質量控制水平，和國際接軌，實現(xiàn)臨床用藥安全并保證抗病毒療效穩(wěn)定可靠，因此對繁縷水提取物采用更為先進的質量控制手段很有必要。鑒于繁縷水提取物為多組分復雜體系，提取方法不同也會導致成分發(fā)生變化，因此評價其質量應采用與之相適應的，能提供豐富鑒別信息的檢測方法。繁縷水提取物中存在分子量越大的化學成份其抗病毒療效越好的相應聯(lián)系，因此，研究繁縷水提取物中各類大分子量化學成份的含量測定方法、其分子量分布以及各類成份的化合物類型，并作為繁縷水提取物的質量控制標準，對有效控制繁縷水提取物產(chǎn)品的質量具有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種用高效液相色譜法進行繁縷水提取物中大分子量化學成份的含量測定方法、計算其分子量分布及推定化合物類型，并可采用國家藥典委員會規(guī)定的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)來達到控制繁縷水提取物產(chǎn)品質量的目的。本發(fā)明另一個目的是將這種繁縷水提取物的含量測定方法應用于質量控制標準， 從而可進行繁縷水提取物的含量測定、生產(chǎn)工藝研究、有效成份含量大于50%的測定及其穩(wěn)定性研究等。本發(fā)明的目的是通過下列措施實現(xiàn)的—種繁縷水提取物，該提取物含有糖肽，進一步，該提取物還含有黃酮和/或多糖，更進一步，該提取物的分子量分布范圍是100至100，OOODa0所述的繁縷水提取物，該提取物是通過下列方法制備得到的方法1 a.取繁縷鮮草進行粉碎、離心并用水洗滌殘渣，收集汁液，將收集得到的汁液在40 60°C保溫1 8小時，靜置，當出現(xiàn)綠色沉淀物時停止加熱，靜置，待液體溫度降至 10-30°C時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液；或將收集得到的汁液在 1 25°C靜置12 96小時出現(xiàn)綠色沉淀物時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液；或將收集得到的汁液在1 25°C用濾紙過濾，收集棕紅色溶液；或取繁縷干草粉碎，加藥材重2 5倍量的水，在1°C至60°C浸泡1 3次，每次1 4小時，合并濾液，過濾或/和離心得棕紅色溶液；b.將上述棕紅色溶液在10 60°C減壓濃縮至10 30°C時比重1. 01 1. 30，得到濃縮液，離心或過濾后棄去沉淀物，濃縮液優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C 真空干燥、更進一步還可采用出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末；方法2:a.取繁縷鮮草進行粉碎、離心并用水洗滌殘渣，收集汁液，將收集得到的汁液在 40 60°C保溫1 8小時，靜置，當出現(xiàn)綠色沉淀物時停止加熱，靜置，待液體溫度降至 10-30°C時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液；或將收集得到的汁液在 1 25°C靜置12 96小時出現(xiàn)綠色沉淀物時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液；或將收集得到的汁液在1 25°C用濾紙過濾，收集棕紅色溶液；或取繁縷干草粉碎，加藥材重2 5倍量的水，在1°C至60°C浸泡1 3次，每次1 4小時，合并濾液，過濾或/和離心得棕紅色溶液；b、將上述棕紅色溶液用切割分子量為500 1500Da的膜進行納濾或超濾，收集含有大分子量物質的溶液，棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作濃縮含有大分子量物質的溶液使?jié)饪s液在10 30°C時比重達到1. 01 1. 30，若納濾或超濾的濃縮液不能達到較大比重時再在10 60°C時采用減壓濃縮，使?jié)饪s液比重在10 30°C時達到1. 01 1. 30，離心或過濾后棄去沉淀物，濃縮液優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C真空干燥、更進一步還可采用出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末；方法3:a.取繁縷鮮草進行粉碎、離心并用水洗滌殘渣，收集汁液，將收集得到的汁液在 40 60°C保溫1 8小時，靜置，當出現(xiàn)綠色沉淀物時停止加熱，靜置，待液體溫度降至 10-300C時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液；或將收集得到的汁液在 1 25°C靜置12 96小時出現(xiàn)綠色沉淀物時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液；或將收集得到的汁液在1 25°C用濾紙過濾，收集棕紅色溶液；或取繁縷干草粉碎，加藥材重2 5倍量的水，在1°C至60°C浸泡1 3次，每次1 4小時，合并濾液，過濾或/和離心得棕紅色溶液；b.將上述棕紅色溶液用切割分子量為500 1500Da的膜進行納濾或超濾，收集含有大分子量物質的溶液，棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作濃縮含有大分子量物質的溶液使?jié)饪s液在10 30°C時比重達到1. 01 1. 30，若納濾或超濾的濃縮液不能達到較大比重時再在10 60°C時采用減壓濃縮，使?jié)饪s液比重在10 30°C時達到 1. 01 1. 30，離心或過濾后棄去沉淀物，再向濃縮液加入95%乙醇使溶液含醇濃度達60 85%，靜置12 M小時，離心或過濾收集沉淀物(必要時可用無水乙醇或丙酮洗滌沉淀物至近干)，沉淀物優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C真空干燥、更進一步還可采用
7出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末。
所述繁縷水提取物的制備方法，該方法包括以下步驟
a.取繁縷鮮草進行粉碎、離心并用水洗滌殘渣，收集汁液，將收集得到的汁液在 40 60°C保溫1 8小時，靜置，當出現(xiàn)綠色沉淀物時停止加熱，靜置，待液體溫度降至 10-300C時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液；或將收集得到的汁液在 1 25°C靜置12 96小時出現(xiàn)綠色沉淀物時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液；或將收集得到的汁液在1 25°C用濾紙過濾，收集棕紅色溶液；或取繁縷干草粉碎，加藥材重2 5倍量的水，在1°C至60°C浸泡1 3次，每次1 4小時，合并濾液，過濾或/和離心得棕紅色溶液；
b.將上述棕紅色溶液在10 60°C減壓濃縮至10 30°C時比重1. 01 1. 30，得到濃縮液，離心或過濾后棄去沉淀物，濃縮液優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C 真空干燥、更進一步還可采用出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末；或者
將上述棕紅色溶液用切割分子量為500 1500Da的膜進行納濾或超濾，收集含有大分子量物質的溶液，棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作濃縮含有大分子量物質的溶液使?jié)饪s液在10 30°C時比重達到1. 01 1. 30，若納濾或超濾的濃縮液不能達到較大比重時再在10 60°C時采用減壓濃縮，使?jié)饪s液比重在10 30°C時達到1. 01 1. 30，離心或過濾后棄去沉淀物，濃縮液優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C真空干燥、更進一步還可采用出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末；或者
將上述棕紅色溶液用切割分子量為500 1500Da的膜進行納濾或超濾，收集含有大分子量物質的溶液，棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作濃縮含有大分子量物質的溶液使?jié)饪s液在10 30°C時比重達到1. 01 1. 30，若納濾或超濾的濃縮液不能達到較大比重時再在10 60°C時采用減壓濃縮，使?jié)饪s液比重在10 30°C時達到1. 01 1. 30，離心或過濾后棄去沉淀物，再向濃縮液加入95%乙醇使溶液含醇濃度達60 85%， 靜置12 24小時，離心或過濾收集沉淀物(必要時可用無水乙醇或丙酮洗滌沉淀物至近干)，沉淀物優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C真空干燥、更進一步還可采用出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末。
所述繁縷水提取物，測定其含量的方法或/和分子量分布的方法或/和其指紋圖譜，其特征在于測定所得的是高效液相色譜圖即該指紋圖譜，該色譜圖即指紋圖譜含有以下色譜特征峰，各峰的保留時間最大均可同時有士 5%的偏移，百分含量最大均可同時有士 15%的偏差
保留時間(min)包括Rtll. 202、Rtl3. 035、Rtl6. 807、Rtl8. 793、Rtl9. 546、 Rt20. 888、Rt29. 437、Rt31. 711、Rt35. 858、Rt38. 385，其中以 Rtl8. 793(含量占 16. 9275% )、Rtl9. 546(含量占 11. 2738% )和 Rt20. 888(含量占 63. 0929% )的 3 個峰為主，含量占91. % ；
以保留時間為20. 888的色譜峰為基準1，則上述10個色譜峰的相對保留時間依次分別為0. 5363,0. 6240,0. 8046,0. 8997,0. 9358,1. 0000、1. 4093、1. 5181、1.7167、 1. 3377 ；
更進一步，圖譜中含有下列保留時間(min)的特征峰RtlO. 132峰、Rtll. 261峰、Rtl8. 813 峰、Rtl9. 448 峰、Rt20. 529 峰、Rt22. 022 峰、Rt23. 055 峰、Rt23. 786 峰、Rt24. 933 峰、Rt26. 107 峰、Rt26. 542 峰、Rt27. 425 峰、Rt29. 463 峰、Rt30. 751 峰、；Rt31. 786 峰、 Rt33. 594 峰、Rt34. 607 峰、Rt35. 899 峰、Rt38. 403 峰、Rt41. 605 峰、Rt50. 555 峰、Rt55. 260 峰、Rt55. 471 峰;其中以Rtl8. 813 峰(占 4. 8 % )、Rtl9. 448 峰(占 4. 6 % )、Rt20. 529 峰(占 29. 2% )、Rt27. 425 峰(占 5. 5% )、Rt29. 463 峰(占 17. 7% )、Rt31. 786 峰(占 10. 5% )、 Rt38. 403峰(占8. 2% )的7個色譜峰為主，含量占80. 5% ；以保留時間為29. 463的色譜峰為基準1，則上述23個色譜峰的相對保留時間依次分別為0. 3439,0. 3822,0. 6385,0. 6601,0. 6968,0. 7474,0. 7825,0. 8073,0. 8462,0. 8861、
0.9009,0. 9308,1. 0000,1. 0437,1. 0788,1. 1402,1. 1746,1. 2184,1. 3034,1. 4121,1. 7159、
1.8756,1. 8827。所述的繁縷水提取物的高效液相色譜圖即指紋圖譜，該色譜圖指紋圖譜是采用下列高效液相色譜法測定得到其特征在于該方法為該高效液相色譜法所應用的高效液相色譜儀為具有紫外檢測器或/和通用型檢測器的高效液相色譜儀，優(yōu)選具二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀，采用紫外檢測器時檢測波長為195nm 400nm，或采用通用型檢測器時優(yōu)選示差檢測器；色譜柱為凝膠過濾色譜柱，優(yōu)選TSKgel PW系列凝膠色譜柱，進一步，還可以加用 TSKgelPW系列凝膠保護柱，更進一步，還可以用TSKgel SW系列水相凝膠過濾色譜柱；柱理論板數(shù)按參照物聚乙二醇計算，應不低于3，000 ；用一根或一至三根柱串聯(lián)；流動相為含0% 50%乙腈或甲醇或乙醇的水溶液、或pH 1.0 7.0之間的 0. 1 IM硝酸鹽水溶液、或pH 1.0 7.0之間的0. 1 IM硫酸鹽水溶液、或pH 1. 0 7. 0之間的0. 1 IM醋酸鹽水溶液、或pH 1. 0 7. 0之間的0. 1 IM的磷酸鹽緩沖液加 0. 1 IM硫酸鹽水溶液，其中優(yōu)選pH 1. 0 7. 0之間的0. 1 IM硫酸鹽水溶液為流動相；流速為0. lml/min 1. 5ml/min,柱溫為 10_60°C。所述的繁縷水提取物的高效液相色譜測定法，其中TSKge 1 Pff系列凝膠保護柱為TSKge 1G3000PWXL6. 0X40凝膠保護柱，TSKgel Pff系列凝膠色譜柱為TSKgel G3000PWXL7. 8 X 300凝膠過濾色譜柱或TSKgel G4000PWXL7. 8 X 300凝膠過濾色譜柱， TSKgel SW系列水相凝膠過濾色譜柱為TSKgel G3000SW XL 7. 8 X 300凝膠過濾色譜柱。所述的繁縷水提取物的高效液相色譜測定法，其中繁縷水提取物供試品溶液配制繁縷水提取物供試品溶液配制精密稱定0. 0100 1. 0000克的待測樣品溶解于5 IOOml純水或流動相中搖勻、靜置，再精密吸取1 IOml用純水或流動相稀釋至25ml備用， 或直接精密稱定0. 0010 0. 5000克的待測樣品溶解于25毫升純水或流動相中搖勻，備用；供試品溶液進樣量為1 μ L 50 μ L。一種測定繁縷水提取物含量或分子量分布的方法，其特征在于該方法為高效液相色譜法，高效液相色譜儀為具有紫外檢測器或/和通用型檢測器的高效液相色譜儀，優(yōu)選具二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀，采用紫外檢測器時檢測波長為195nm 400nm，或采用通用型檢測器時優(yōu)選示差檢測器；色譜柱為凝膠過濾色譜柱，優(yōu)選TSKgel Pff系列凝膠色譜柱，進一步，還可以加用TSKgelPff系列凝膠保護柱，更進一步，還可以用TSKgel Sff系列水相凝膠過濾色譜柱；柱理論板數(shù)按參照物聚乙二醇計算，應不低于3，000 ；用一根或一至三根柱串聯(lián)；其中TSKgel PW系列凝膠保護柱為TSKgel G3000PWXL6. 0X40凝膠保護柱，TSKgel PW系列凝膠色譜柱為 TSKgel G3000PWXL7. 8 X 300 凝膠過濾色譜柱或 TSKgel G4000PWXL7. 8 X 300 凝膠過濾色譜，TSKgel SW系列水相凝膠過濾色譜柱為TSKgel G3000SW XL 7.8X300流動相為含0% 50%乙腈或甲醇或乙醇的水溶液、或pH 1.0 7.0之間的 0. 1 IM硝酸鹽水溶液、或pH 1.0 7.0之間的0. 1 IM硫酸鹽水溶液、或pH 1. 0 7. 0 之間的0. 1 IM醋酸鹽水溶液、或pH 1. 0 7. 0之間的0. 1 IM的磷酸鹽緩沖水溶液， 其中優(yōu)選PH 1. 0 7. 0之間的0. 1 IM硫酸鹽水溶液為流動相；流速為0. lml/min 1. 5ml/min,柱溫為 10_60°C。用于含量測定及質控標準所繪制回歸曲線所使用的對照品物質是通過分離繁縷水提取物中的峰成份作為外標對照品，例如高效液相色譜法測試實施例1譜圖中保留時間為Rt20. 529min的色譜峰的化學成份A、Rt29. 463min的峰化學成份B、Rt27. 425min的峰化學成份C、Rt31. 786min的峰化學成份D、Rt38. 403min的峰化學成份E，或用其它來源的標準物質作為內標對照品，例如可用云芝糖肽包括云芝胞內糖肽標準品作為內標對照品。所述的繁縷水提取物，該繁縷水提取物的劑型為膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、微丸、微囊、片劑、丸劑、顆粒劑、滴丸、口服液、注射劑、凝膠劑、滴鼻劑、鼻噴劑、氣霧劑、膜劑、涂劑或者口香糖。如無特別說明，本發(fā)明所述的劑型按中華人民共和國藥典2005年版規(guī)定。本發(fā)明的化學成份類型推定是根據(jù)對各類成份在高效液相色譜圖中出現(xiàn)的峰，通過二極管陣列檢測器對其進行紫外掃描得到的紫外掃描譜推定。所述的繁縷水提取物，其中各成份峰經(jīng)紫外掃描有如下最大吸收峰及其吸收谷， 并據(jù)此推定及峰成份化合物類型因儀器測試誤差，其各峰成份進行紫外掃描時均可同時最大有相同的士5%偏移、百分含量最大均可同時有相同的士 10%偏差；成份峰1 =RtlO. 132 峰，含量為 0. 3018%,；成份峰 2 =Rtll. 261，含量為 0. 0134%； 成份峰3 :Rtl8. 813峰，含量為4. 7668 %，在210nm處有最大吸收峰、在270nm處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰4 :Rtl9. 448峰，含量為4. 5857%，在203nm處有最大吸收峰、在 276nm處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰5 為主成份，Rt20. 529峰，含量為29. 2145%，在 208nm處有最大吸收峰、在^Onm處有平緩的肩峰，為糖肽類；成份峰6 :Rt22. 022峰，含量為3. 3082%,在202nm處有最大吸收峰、在275nm處有處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰7 Rt23. 055峰，含量為2. 7628%，在205nm和275nm處有兩個最大吸收峰、在MOnm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰8 :Rt23. 786峰，含量為2. 2094%，在205nm和270nm處有兩個最大吸收峰、在240nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰9 :Rt24. 933峰，含量為2. 4686%，在201nm、 235nm和270nm處有三個最大吸收峰、在212nm和M5nm處有兩個吸收谷，為糖肽類；成份峰10 :Rt26. 107峰，含量為1. 5985%，在202nm和270nm處有兩個最大吸收峰、在239nm處有吸收谷；成份峰11 :Rt26. 542峰，含量為1. 9064 %，在202nm和250nm處有兩個最大吸收峰、在235nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰12 :Rt27. 425峰，含量為5. 5093%，在210nm 處有最大吸收峰呈饅頭形圓頂；成份峰13 :Rt29. 463峰，含量為17. 6918%，在202nm處和 210士2nm處有雙峰、在處有個最大吸收峰、在230nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰 14 :Rt30. 751峰，含量為2. 0638%，在205nm、270nm處有兩個最大吸收峰、在MOnm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰15 :Rt31. 786峰，含量為10. 4588 %，在202nm和250nm處有兩個最大吸收峰、在222nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰16 :Rt33. 594峰，含量為0. 7256%, 在215nm處有最大吸收峰、在處有平緩的肩峰，為糖肽類；成份峰17 :Rt34. 607峰， 含量為0. 2739 %，在205nm處有最大吸收峰，在279nm處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰18 Rt35. 899峰，含量為0. 9427%，在205nm和279nm處有兩個最大吸收峰、在238nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰19 :Rt38. 403峰，含量為8. 2022%，在202nm和275nm處有兩個最大吸收峰、在240nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰20 :Rt41. 605峰，含量為0. 8272%，在225nm 和處有兩個最大吸收峰、240nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰21 :Rt50. 555峰，含量為0. 1231%，可見200nm和254nm處有紫外吸收峰，應為糖肽類；成份峰22 :Rt55. 260峰成份，含量為0. 0208%，含量太低，不便測試；成份峰23 :Rt55. 471峰，含量為0. 0246%，成份含量太低，不便測試；
當用純水洗凈凝膠層析柱后，用含0% 50%乙腈或甲醇或乙醇的水溶液為流動相可在IOmin 90min之間將繁縷水提取物樣品中的黃酮類成份洗脫出來，呈1 7個峰， 用二極管陣列檢測器掃描時可見黃酮類成份峰在210nm、270nm、360nm處有最大紫外吸收峰，且這些峰的紫外最大吸收峰波長均可同時最大有相同的士5%的偏移。
進一步
本發(fā)明的含量測定方法、分子量分布計算、化合物類型推定、并可采用國家藥典委員會規(guī)定的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)來達到控制繁縷水提取物產(chǎn)品質量的目的是采用高效液相色譜法，其色譜條件為
高效液相色譜儀為具有紫外檢測器或/和通用型檢測器的高效液相色譜儀，優(yōu)選具二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀，采用紫外檢測器時檢測波長為195nm 400nm，或采用通用型檢測器時優(yōu)選示差檢測器；
高效液相色譜法的色譜柱為凝膠過濾色譜柱，包括以親水的多孔甲基丙烯酸酯構成的剛性、球性多孔高聚物填料制成的水相凝膠過濾色譜柱，優(yōu)選TSKgel Pff系列凝膠色譜柱，優(yōu)選一根 TSKgel G3000PWXL6. 0X40 凝膠保護柱接一根 TSKgel G3000PWXL7. 8 X 300 凝膠過濾色譜柱，或是以剛性的球型硅膠為基質，在其表面通過共價鍵化學鍵合親水基團而成的填料制成的凝膠柱優(yōu)選TSKgel SW系列水相凝膠過濾色譜柱，可選TSKgel SWXL7.8X300凝膠色譜柱，柱理論板數(shù)按參照物聚乙二醇計算，應不低于3，000 ；用一根或一至三根柱串聯(lián)，其粒徑為5 10 μ m，孔徑200 500埃，適用分離分子量范圍2 X IO3 5 X IO5Da,其理論板數(shù)按參照物P. E. G. (MW :8，565)計算應大于3，000，柱溫保持在10°C 60 0C ；
流動相為含0% 50%乙腈或甲醇或乙醇的水溶液、或pH 1.0 7.0之間的0.1 IM硝酸鹽水溶液、或pH 1.0 7.0之間的0. 1 IM硫酸鹽水溶液、或pH 1. 0 7. 0之間的0. 1 IM醋酸鹽水溶液、或pH 1. 0 7. 0之間的0. 1 IM的磷酸鹽緩沖水溶液，其中優(yōu)選PH 1. 0 7. 0之間的0. 1 IM硫酸鹽水溶液為流動相；流速為0. lml/min 1.5ml/min。
繁縷水提取物供試品溶液配制精密稱定0. 0100 1. 0000克的待測樣品溶解于 5 IOOml純水或流動相中搖勻、靜置，再精密吸取Iml用純水或流動相稀釋至25ml備用， 或直接精密稱定0. 0010 0. 5000克的待測樣品溶解于25毫升純水或流動相中搖勻，備11用；高效液相色譜法測定時，用進樣器吸取供試品溶液1 μ L 50 μ L進樣。繁縷水提取物經(jīng)上述高效液相色譜法測試后，可得到一種頭高尾低(保留時間Rt 小的為頭、大的為尾)呈非正態(tài)分布的、且有一系列具保留時間的色譜峰的特異圖形的色譜圖。本發(fā)明涉及繁縷水提取物的高效液相色譜圖為一種頭高尾低呈非正態(tài)分布、且有一系列具保留時間的色譜峰的特異圖形的色譜圖，其特異圖形可供作該組合物質控標準的指紋圖譜和鑒別應用；對該圖譜中出現(xiàn)的各色譜峰應用二極管陣列檢測器分別進行紫外掃描后即可分別得到這些色譜峰的紫外掃描圖，從而可對組成各色譜峰的化合物類型進行推定。分離圖譜中能基本達到基線分離的色譜峰的成份并用作外標對照品來繪制含量測定的標準曲線一回歸方程，從而進行繁縷水提取物的含量測定，用以制定其質量控制標準，并應用于繁縷水提取物的含量測定、生產(chǎn)工藝研究、有效成份含量大于50%的測定及其穩(wěn)定性研究等質量控制。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明建立了繁縷水提取物進行質量控制的一種高效液相色譜含量測定方法， 并能反映出繁縷水提取物化學成份類型及分子量分布的信息，還能從中分離出色譜峰成份作為測試對照品，從而應用于繁縷水提取物的含量測定及制定其質量控制標準，無需更多更復雜的圖譜或更復雜的質控指標就能夠達到全面、有效地控制繁縷水提取物作為藥物制劑產(chǎn)品或保健產(chǎn)品質量的目的。2、繁縷水提取物在樣品相同的情況下，以本專利提供的優(yōu)選高效液相色譜含量測定分析方法進行測試時，能得到的一種頭高尾低(保留時間Rt小的為頭、大的為尾)呈非正態(tài)分布、且有一系列具保留時間的色譜峰的特異圖形的分子量分布圖譜，可作為本品及本品制劑的指紋圖譜，并可提供作為鑒別使用采用國家藥典委員會規(guī)定的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對本品及其制劑圖譜進行評價，與本品及其制劑質控標準圖譜的共有模式計算相似度，以此得出的相似度結果可作為本品的一種質控標準，操作方便、快捷、結論較為客觀、準確，從而達到能夠更全面、有效地控制本品及本品制劑質量的目的。如果用其它種類填料的凝膠柱、或用其它種類的流動相所做的高效液相分子量分布的色譜圖譜則會呈常見的正態(tài)分布的非特異圖形，難以提供作為鑒別使用或指紋圖譜使用，并且難以從中分離出分子量范圍較小且穩(wěn)定的對照品，從而難以應用作為繁縷水提取物的含量分析方法及質量標準。


圖1是測試方法實施例1的高效液相色圖譜，是用實施例1-⑴方法得到的繁縷水提取物全浸膏作為供試品，在惠普1050型高效液相色譜儀上用TOSOH產(chǎn)一根 TSKge 1G3000PWXL6. 0X40 凝膠保護柱接一根 TSKgel G3000PWXL7. 8X300 凝膠過濾色譜柱，配制0. 2Μ硫酸鈉溶液并用硫酸調ρΗ 2. 30作為流動相，在254nm波長處測得的圖譜，為一種頭高尾低(保留時間Rt小的為頭、大的為尾)呈非正態(tài)分布、并有具保留時間的23個色譜峰的特異圖形的高效液相色譜圖譜，該圖譜可提供作為指紋圖譜和鑒別使用，各峰中以 Rtl8. 813 峰(占 4. 8% )、Rtl9. 448 峰(占 4. 6% )、Rt20. 529 峰(占 29. 2% )、Rt27. 425峰(占 5. 5 % )、Rt29. 463 峰(占 17. 7 % )、Rt31. 786 峰(占 10. 5 % )、Rt38. 403 峰(占 8. 2% )為主，占 80. 5%。圖2是測試方法實施例2的高效液相色圖譜，是用已經(jīng)采集儲藏10個月左右的繁縷干草用制備方法1實施例1-(2)得到的繁縷水提取物作為供試品，在惠普1050 型高效液相色譜儀上用TOSOH產(chǎn)一根TSKge 1 G3000PWXL6. 0X40凝膠保護柱接一根 TSKgelG3000PWXL7. 8 X 300凝膠過濾色譜柱，配制0. 2M硫酸鈉溶液并用硫酸調pH 2. 30作為流動相，在254nm波長處測得的圖譜，與圖1 一樣為一種頭高尾低(保留時間Rt小的為頭、大的為尾)呈非正態(tài)分布、并有具保留時間的17個色譜峰的特異圖形的高效液相色譜圖譜，但因儀器測試的穩(wěn)定性偏差使各峰保留時間與圖1的最大均可同時有約士5%的偏移；且成份峰的數(shù)量及其各峰的百分含量也有比較明顯的變化，說明繁縷草經(jīng)一定時間的儲存后各成份會有所變化。圖3是測試方法例3的高效液相色圖譜，實施是從制備方法3-( 得到的繁縷水提取物中，分離其Rt20. 529min峰的化學成份，得到可供作對照品的樣品作為供試品，用 TOSOH 產(chǎn)一根 TSKgel G3000PWXL6. 0X40 凝膠保護柱，接一根 TSKgel G3000PWXL7. 8 X 300 凝膠過濾色譜柱，再接1根TSKgel G4000PWXL7.8X300凝膠過濾色譜柱共計三根柱，以pH 4. 5的0. 2M硫酸鈉溶液作為流動相所測得的分子量分布圖譜，原本Rt20. 529min峰現(xiàn)推遲到 Rt37. 359min 處。圖4是測試方法實施例4的高效液相色圖譜是分子量分布圖是用TSK gel G3000SWxl7.8X300型凝膠柱、用pH6. 8的0. IM磷酸鈉緩沖液合并0. IM硫酸鈉溶液作流動相的條件下測得的高效液相色譜4，分上下兩圖上圖為繁縷水提取組合物的正態(tài)分布圖，呈常見的正態(tài)分布圖形，沒有特異性，不宜提供作為指紋圖譜和鑒別使用，并難以從中分離出分子量范圍較小且穩(wěn)定的對照品，從而難以應用作為繁縷水提取物的分析方法及質量標準；下圖為蛋白類分子量標準物質的分子量分布測定峰，上下兩圖為保留時間對應分子量。圖5是測試方法實施例5的高效液相色圖譜，是用制備方法2-( 得到的繁縷水提取物作為供試品，用測試方法實施例1相同的色譜測試方法和條件測得的圖譜，雖仍為一種呈頭高尾低非正態(tài)分布的特異圖形的高效液相色譜圖譜，但圖譜中具保留時間的色譜峰只有 10 個，包括 Rtll. 202、Rtl3. 035、Rtl6. 807、Rtl8. 793、Rtl9. 546、Rt20. 888、 Rt29. 437、Rt31. 711、Rt35. 858、Rt38. 385，且各色譜峰含量也發(fā)生明顯變化，其中最突出的是Rt20. 888min的色譜峰含量高達63%以上，Rtl8. 793min和Rtl9. 546min 二峰含量也有所上升，分別達16. 9%和11.3%，說明制備提取方法的改變會使得圖譜中的色譜峰的大小和數(shù)量發(fā)生明顯改變，該圖譜也可提供作為制備方法3得到的繁縷水提取物的指紋圖譜和鑒別使用，也為繁縷水提取物制備提取工藝的研究提供了明確的信息。圖6是HPLC測試方法實施例1的高效液相色圖譜中Rt20. 529min峰頂紫外掃描圖；圖7是HPLC測試方法實施例1的高效液相色圖譜中Rt31. 786min峰頂紫外掃描圖；圖8是HPLC測試方法實施例1的高效液相色圖譜中Rt29. 463min峰頂紫外掃描圖與云芝胞內糖肽成份峰頂紫外掃描圖的比較；具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
一 . 一般性說明，以下實施例中的繁縷水提取物樣品是按照下列四種方法制備得到的
1、制備方法1實施例制備繁縷水提取物樣品(全浸膏)1-
(1)、取新鮮采集的繁縷植物20千克粉碎、離心，并用水洗滌繁縷草殘渣，收集得到的綠色汁液并控溫55士2°C保溫4小時，出現(xiàn)綠色沉淀物，停止加熱，靜置，待液體近于室溫20°C時離心去除綠色殘渣等雜質，收集棕紅色溶液，于55°C進行減壓濃縮至25°C時比重 1. 27，得到濃浸膏，離心后經(jīng)冷凍干燥成粉末狀，稱得81. 76克，得率為0. 4088%，每克干浸膏粉約相當于245克繁縷鮮草原藥材，備用；
(2)、另取已經(jīng)采集儲藏約10個月左右的繁縷干草2千克粉碎，加藥材重約4倍量的水，控溫40 士 2 °C浸泡3小時，過濾，藥渣再加2倍量自來水浸泡2小時，過濾，合并兩次濾液，離心得棕紅色溶液，于58°C進行減壓濃縮至25°C時比重1.沈，得到濃浸膏，離心后經(jīng)冷凍干燥成粉末狀，稱得84. 22克，得率為4. 211 %，每克干浸膏粉約相當于23. 75克繁縷干草原藥材，備用。
2、制備方法2實施例全浸膏經(jīng)納濾或超濾后制備繁縷水提取物樣品2-
(1)、取新鮮采集的繁縷植物20千克粉碎、離心，并用水洗滌繁縷草殘渣，收集得到的綠色汁液于6V 士2°C環(huán)境中靜置72個小時，有綠色沉淀物沉淀，離心去除綠色沉淀物等雜質，收集棕紅色溶液，用切割分子量為1，OOODa的膜進行超濾，收集含有大分子量物質的溶液、棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作并因此而濃縮含有大分子量物質的溶液，25°C時測得濃縮液比重1. 14時，取部份濃縮液經(jīng)冷凍干燥得到色澤較淺的粉末，稱得40. 15克，備用；其余部份濃縮液經(jīng)59°C真空干燥得色澤比較深的粉末，稱得40. 71 克，備用。得率為0.4043%，每克干浸膏粉約相當于247克繁縷鮮草原藥材，備用；
(2)、另取已經(jīng)采集儲藏10個月左右的繁縷干草2千克粉碎，加藥材重約4倍量的水，室溫25V浸泡3小時，過濾，藥渣再加2倍量自來水浸泡2小時，過濾，合并兩次濾液， 離心得棕紅色溶液，用切割分子量為1，OOODa的膜進行超濾，收集含有大分子量物質的溶液、棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作并因此而濃縮含有大分子量物質的溶液，25°C時測得濃縮液比重1. 17時，取部份濃縮液經(jīng)噴霧干燥(進口溫度為200°C，出口溫度為60°C )，得到色澤較淺的粉末，稱得38. 26克，備用；另取部份濃縮液經(jīng)58°C真空干燥得到色澤比較深的粉末，稱得44. 21克，備用。得率為4. 1235%，每克干浸膏粉約相當于 24. 25克繁縷干草原藥材，備用。
3、制備方法3實施例全浸膏經(jīng)納濾或超濾后再醇沉制備繁縷水提取物樣品3-
(1)、取新鮮采集的繁縷植物20千克粉碎、離心，并用水洗滌繁縷草殘渣，收集得到的綠色汁液并控溫5士2°C的冰箱中用濾紙在常壓下過濾，先收集帶有綠色的汁液至流出的汁液無綠色時，將流出并收集的綠色液與綠色汁液合并，同時另行收集流出的棕紅色溶液，經(jīng)90個小時濾完后棄去濾紙及所附著的綠色殘渣，將收集的棕紅色溶液用切割分子量為500Da的膜進行納濾，收集含有大分子量物質的溶液、棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作并因此而濃縮含有大分子量物質的溶液至25°C時比重達到1. 06，再58°C減壓濃縮至25°C時比重達1. 17，在所得到的濃縮液中加入藥用95%乙醇使溶液含醇濃度達80%，靜置24小時，過濾收集沉淀物，并用分析純丙酮洗滌一次，沉淀物再經(jīng)冷凍干燥得到色澤較淺的粉末，稱得75. 31克，得率為0. 3766%，每克干浸膏粉約相當于266克繁縷鮮草原藥材，備用。(2)、另取已經(jīng)采集儲藏10個月左右的繁縷干草2千克粉碎，加藥材重約4倍量的水，室溫27°C浸泡3小時，過濾，藥渣再加2倍量自來水浸泡2小時，過濾，合并兩次濾液，離心得棕紅色溶液，用切割分子量為500Da的膜進行納濾，收集含有大分子量物質的溶液、棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作并因此而濃縮含有大分子量物質的溶液至 20°C時比重達到1. 05，再58°C減壓濃縮至20°C時比重達1. 20，在所得到的濃縮液中再加入藥用95%乙醇使溶液含醇濃度達80%，靜置12小時，離心收集沉淀物，并用無水乙醇洗滌一次，沉淀物再經(jīng)冷凍干燥得到色澤較淺的粉末，稱得74. 73克，得率為3. 7365%，每克干浸膏粉約相當于267. 6克繁縷干草原藥材，備用。二 .高效液相色譜法(HPLC，下同)測試分析實施例1、HPLC測試分析實施例1 供試品樣品為制備方法1實施例制備的繁縷鮮草水提取物樣品(全浸膏)i-(i)1)、高效液相色譜條件在惠普1050型高效液相色譜儀上接TOSOH產(chǎn)一根 TSKge 1G3000PWXL6. 0X40 凝膠保護柱再接一根 TSKgel G3000PWXL7. 8 X 300 凝膠過濾色譜柱，其粒徑為7 μ m,孔徑200埃，適用分離分子量范圍2 X IO3 2 X 74，其理論板數(shù)按參照物 P. E. G. (MW :8，565)計算為彡3，000，用天津譜祥科技公司的M0DEL300恒溫控制箱控制柱溫 40 士0. 1°C，測試波長設定為 220nm、254nm、360nm ；2)、流動相配制配制0. 2M硫酸鈉溶液2，OOOml并用硫酸調pH 3. 3作為流動相， 流動相流速為0. 5ml/min ；3)、供試品溶液配制精密稱取用上述制備方法1實施例制備的繁縷鮮草提取物樣品(全浸膏)1-(1)供試樣品0.9972克于干燥的IOOml容量瓶中，加入流動相溶液至刻度，密塞搖勻，經(jīng)0. 45 μ m過濾器濾后進樣20μ 1 ；4)、對上述制備方法1提取的繁縷水提取物(全浸膏)I-(I)供試品溶液進行測試所得到的色圖譜見圖1，圖1為選用測試波長為254nm處檢測的色譜圖從圖1可以看出HPLC測試分析實施例1所測得的高效液相色譜圖，為一種頭高尾低(保留時間Rt小的為頭、大的為尾)呈非正態(tài)分布的、且有23個色譜峰的特異圖形的圖譜，可供作該繁縷樣品指紋圖譜和鑒別使用。其23個色譜峰的具體保留時間分別如下其色譜圖中各峰的“保留時間”用“Rt”表示，單位為分鐘(min)；并因儀器測試時穩(wěn)定性的偏差使各峰的保留時間最大均可同時有約士5%的偏移，百分含量最大均可同時有約士 15%的偏差；圖譜中含有下列保留時間(min)的特征峰RtlO. 132峰、Rtll. 261峰、Rtl8. 813 峰、Rtl9. 448 峰、Rt20. 529 峰、Rt22. 022 峰、Rt23. 055 峰、Rt23. 786 峰、Rt24. 933 峰、 Rt26. 107 峰、Rt26. 542 峰、Rt27. 425 峰、Rt29. 463 峰、Rt30. 751 峰、;Rt31. 786 峰、Rt33. 594 峰、Rt34. 607 峰、Rt35. 899 峰、Rt38. 403 峰、Rt41. 605 峰、Rt50. 555 峰、Rt55. 260 峰、 Rt55. 471 峰;其中以Rtl8. 813 峰(占 4. 8 % )、Rtl9. 448 峰(占 4. 6 % )、Rt20. 529 峰(占29. 2% )、Rt27. 425 峰(占 5. 5% )、Rt29. 463 峰(占 17. 7% )、Rt31. 786 峰(占 10. 5% )、 Rt38. 403峰(占8. 2% )的7個色譜峰為主，百分含量占80. 5% ；以保留時間為四.463的色譜峰為基準1，則上述23個色譜峰的相對保留時間依次分別為0. 3439,0. 3822,0. 6385,0. 6601,0. 6968,0. 7474,0. 7825,0. 8073,0. 8462,0. 8861、
0.9009,0. 9308,1. 0000,1. 0437,1. 0788,1. 1402,1. 1746,1. 2184,1. 3034,1. 4121,1. 7159、
1.8756,1. 8827。特別說明的是當用純水洗凈凝膠層析柱后(防止鹽析出堵塞柱子甚至損壞柱子等)，用25%甲醇或25%乙醇或20%乙腈的水溶液可在30min 90min之間將繁縷全浸膏樣品中的黃酮類成份峰洗脫出來，呈1 7個峰，用二極管陣列檢測器掃描時可見黃酮類成份峰在210nm、270nm、360nm處有最大紫外吸收峰，這與上述糖肽類的最大紫外吸收峰數(shù)目及波長不同，這些峰的紫外最大吸收峰波長均可同時最大有相同的士 5 %的偏移。2、HPLC測試分析實施例2 供試品樣品為制備方法1實施例制備的樣品1_ (2)1)、HPLC條件包括高效液相色譜儀、凝膠過濾色譜柱(保護柱)、柱溫箱及所控溫度、流動相溶液極其流速、測試波長設定均與上述HPLC測試分析實施例1相同；2)、供試品溶液的配制精密稱取用上述制備方法1-( ，即用繁縷干草制備的實施例提取物(全浸膏)樣品1-0)0.9863克于干燥的IOOml容量瓶中，加入流動相溶液至刻度，密塞搖勻，經(jīng)0. 45 μ m過濾器濾后進樣20 μ 1 ；3)、所得到的色圖譜見附圖2，圖為選用測試波長在254nm波長處測得的圖譜從圖2可以看出與圖1 一樣為一種頭高尾低呈非正態(tài)分布、并有具保留時間的 17個色譜峰的特異圖形的高效液相色譜圖譜，但因樣品為繁縷草經(jīng)10個月儲藏后制備所得，加之儀器測試的穩(wěn)定性偏差使各峰保留時間、成份峰的數(shù)量及其各峰的百分含量與圖1 相比均有比較明顯的變化，說明繁縷草經(jīng)一定時間的儲存后各成份會有所變化。3、HPLC測試分析實施例3 考察增加柱數(shù)量及柱孔徑的變化的影響1)、HPLC條件在惠普1050型高效液相色譜儀上用TOSOH產(chǎn)一根 TSKge 1G3000PWXL6. 0X40 凝膠保護柱，接一根 TSKgel G3000PWXL7. 8 X 300 凝膠過濾色譜柱，再接1根適用分離分子量范圍4X IO3 5 X IO5Da的TSKgel G4000PWXL7. 8 X 300凝膠過濾色譜柱，該柱粒徑10 μ m,孔徑500埃，可分離范圍為1，000至70萬Da，共計三根柱進行測試，用天津譜祥科技公司的M0DEL300恒溫控制箱控制柱溫40士0. 1°C，測試波長設定為 201nm、254nm、360nm ；2)、流動相配制0. 2M硫酸鈉溶液2，OOOml并用硫酸調pH 3. 3作為流動相，流速為 0. 5ml/min ；3)、供試品溶液配制分離HPLC測試分析實施例1圖譜中的Rt29. 463峰成份，精密稱取供試樣品0. 2388克于干燥的25ml容量瓶中，加入流動相溶液至刻度，密塞搖勻，經(jīng) 0. 45 μ m過濾器濾后進樣20 μ 1 ；4)、所得到的色圖譜見附圖3，圖3為選用測試波長為201nm處檢測的色譜圖從圖3可以看出色譜測試分析實施例1中Rt29. 463min處的色譜峰，用HPLC測試分析實施例3的方法進行分析時所測得的圖3中出現(xiàn)在Rt37. 359min處，說明增加色譜柱和柱孔徑增大后色譜成份峰的保留時間將向后推移，測得其峰純度為98. 68%，可供作含量測定的外標對照品。
4、HPLC測試分析實施例4 考察改變柱型及流動相的影響
1)、HPLC條件在惠普1050型高效液相色譜儀上接用TOSOH產(chǎn)一根TSKgel G3000SWxl7. 8 X 300凝膠色譜柱，其粒徑為5 μ m,孔徑250埃，適用分離分子量范圍2 X IO3 2X105，其理論板數(shù)按參照物P. E.G. (MW 8, 565)計算為彡3，000，用天津譜祥科技公司的M0DEL300恒溫控制箱控制柱溫40士0. TC，流動相流速為0. 5ml/min，測試波長設定為 220nm、254nm、360nm ；
2)、流動相的配制流動相分別用純凈水、20%的乙腈水溶液、20%的甲醇水溶液、 20%的乙醇水溶液、pH 4. 0的0. 50M硝酸鈉、pH 5. 0的0. 6M醋酸鈉、pH3. 2的0. 2M硫酸鈉、pH6. 5的0. IM磷酸鈉緩沖液等作流動相，以進行一系列高效液相色譜測試條件的比較；
3)、供試品溶液配制精密稱取用上述制備方法1實施例制備的繁縷鮮草提取物樣品I-(I)供試樣品0. 9972克于干燥的IOOml容量瓶中，加入流動相溶液至刻度，密塞搖勻，經(jīng)0. 45 μ m過濾器濾后進樣20 μ 1 ；
4)、經(jīng)用TOSOH產(chǎn)TSKgel G3000SffXL 7. 8X 300型凝膠色譜柱、用上述一系列不同的流動相分別進行高效液相色譜測試分析并分別得到不同的色譜圖，這些色譜測試分析結果及其色譜圖都可應用于繁縷水提取物的分析測試，但與上述測試方法實施例1相比，在測試糖肽類成份時卻都不如測試方法實施例1的測試結果好，即均各有不足之處。
例如用20%的乙腈水溶液或25%的甲醇水溶液或25%的乙醇水溶液作為流動相，可在30min至90min時洗出黃酮類化合物的峰(流動相溶液不含鹽)，但所測試糖肽類成份的譜圖就不如測試方法實施例1的好；再如用TSK gel G 3000SW型凝膠柱、以 PH6. 8的0. IM磷酸鈉緩沖液加0. IM硫酸鈉作流動相；流動相流速0. 58ml/min，測定波長 220nm的條件下測得的高效液相色譜4 該色譜圖呈常見的正態(tài)分布圖形，雖可用標準分子量物質通過GPC軟件進行分子量分布測定等，但該組合物的圖譜沒有特異性，不宜提供作為指紋圖譜和鑒別使用，并且難以從中分離出分子量范圍較小且穩(wěn)定的對照品，從而難以應用作為繁縷水提取物的分析方法及質控標準。所以，盡管供試樣品與測試方法實施例1相同，但當用不同于測試方法實施例1的其它種類的凝膠柱、并用其它種類的流動相用 HPLC法測試試糖肽類成份時均不如用HPLC測試分析實施例1的測試方法好。
圖4為選用測試波長220nm處檢測的色譜圖，用分子量對照品為短桿菌肽、細胞色素C、牛血清白蛋白為分子量對照品測得樣品分子量分布。
其中上圖為繁縷制備方法實施例制備的提取物I-(I)的高效液相色譜正態(tài)分布譜圖，下圖為分子量標準品譜圖，上下兩圖以保留時間與標準物質分子量對應，其中與 Rt32. 471相應的繁縷化合物分子量在70，000至100，OOODa, Rt34. 914是分子量64，OOODa 的牛血清白蛋白峰，與之相應的繁縷化合物分子量應在400，000至70，OOODa、Rt39. 078是分子量12，OOODa的細胞色素C峰，與之相應的繁縷化合物分子量應在5，000至20，OOODa、 Rt46. 315是分子量1，400Da的短桿菌肽峰，與之相應的繁縷化合物分子量應在1，000至 4，OOODa ；與Rt50. 615min相應的繁縷化合物分子量應在100至1，OOODa ；
該繁縷提取物的分子量分布范圍是在100至100，OOODa0
5. HPLC測試分析實施例5 供試品樣品為制備方法2實施例制備的提取物2_(1)
1)、HPLC條件在惠普1050型高效液相色譜儀上用T0S0H產(chǎn)一根 TSKge 1G3000PWXL6. 0X40 凝膠保護柱接一根 TSKgel G3000PWXL7. 8 X 300 凝膠過濾色譜柱，用天津譜祥科技公司的M0DEL300恒溫控制箱控制柱溫40士0. 1 °C，流動相流速為 0. 5ml/min，測試波長設定為 220nm、254nm、360nm ；2)、流動相的配制配制0. 2M硫酸鈉溶液2，OOOml并用硫酸調pH 3. 3作為流動相；3)、供試品溶液的配制精密稱取0.9932g用上述制備方法2項下的(1)提取的繁縷水提取物供試樣品于干燥的IOOml容量瓶中，加入流動相溶液至刻度，密塞搖勻，經(jīng) 0. 45 μ m過濾器濾后進樣20 μ 1 ；4)、所得到的色圖譜見圖5，圖5為選用測試波長為254nm處檢測的色譜圖圖5的圖譜雖仍為一種呈頭高尾低非正態(tài)分布的特異圖形的高效液相色譜圖譜， 但圖譜中具保留時間的色譜峰只有10個，包括Rtll. 202、Rtl3. 035、Rtl6. 807、Rtl8. 793、 Rtl9. 546、Rt20. 888、Rt29. 437、Rt31. 711、Rt35. 858、Rt38. 385，其中主要的色譜峰只有三個分別為 18. 793(16. 9275% ) ,19. 546 (占 11. 273% )和 Rt20. 888 (占 63. 0929% )、且與圖1相比各色譜峰含量也發(fā)生明顯變化，說明繁縷水提取物制備提取方法的改變會使得圖譜中的色譜峰的大小和數(shù)量發(fā)生明顯改變，即化學成份的數(shù)量和含量均發(fā)生明顯改變，該圖譜也可提供作為制備方法2提取制備的繁縷水提取物樣品的指紋圖譜和鑒別使用，也為繁縷水提取物制備提取工藝的研究提供了有益信息。6. HPLC測試分析實施例6 供試品樣品為制備方法2實施例制備的樣品2_(2)1)、HPLC條件在惠普1050型高效液相色譜儀上用TOSOH產(chǎn)一根 TSKge 1G3000PWXL6. 0X40 凝膠保護柱接一根 TSKgel G3000PWXL7. 8 X 300 凝膠過濾色譜柱，用天津譜祥科技公司的M0DEL300恒溫控制箱控制柱溫40士0. 1 °C，流動相流速為
0.5ml/min，檢測器為示差檢測器；2)、流動相的配制配制0. 2M硫酸鈉溶液2，OOOml并用硫酸調pH 3. 2作為流動相；3)、供試品溶液的配制精密稱取0.2897g用上述制備方法2_(2)用繁縷干草提取的供試樣品于干燥的25ml容量瓶中，加入流動相溶液至刻度，密塞搖勻，經(jīng)0. 45 μ m過濾器濾后進樣20 μ 1 ；HPLC測試分析實施例6所得到圖譜雖仍為一種呈頭高尾低非正態(tài)分布的特異圖形的高效液相色譜圖譜，但圖譜中具保留時間的色譜峰只有6個，其中被儀器積分的色譜峰只有三個分別為 Rtl9. 179 (占 8. 839% )、Rt22. 053 (占 89. 5050% )、Rt29. 980 (占
1.6554% )且與圖4相比各色譜峰的保留時間Rt和百分含量均發(fā)生明顯變化，Rt有約5. 6% 的偏差、含量有約41. 9%的偏差，說明檢測器和繁縷水提取物制備提取方法的改變會使得圖譜中的色譜峰的數(shù)量、其保留時間Rt、百分含量大小都會發(fā)生明顯改變，該圖譜顯然沒有用紫外檢測器測試的圖4靈敏。3、各成份峰的紫外掃描圖及峰成份化合物類型推定實施例對用“HPLC測試分析實施例1”所得色譜圖1中的23個成份峰，經(jīng)惠普1050型高效液相色譜儀的二極管陣列檢測器進行紫外掃描，分別得到各成份峰的紫外掃描圖，其紫外最大吸收峰及吸收谷的波長單位為納米(nm)，因儀器測試誤差其各峰成份紫外掃描時均可同時最大有相同的士5%偏移、百分含量最大均可同時有相同的士 15%偏差；并分別
18根據(jù)各成份峰的紫外最大吸收峰和及其吸收谷的最大波長位置，經(jīng)與內標對照品云芝糖肽包括云芝胞內糖肽峰的紫外掃描峰最大吸收峰波長位置進行比較，推定各個化合物的類型為成份峰1 =RtlO. 132 峰，含量為 0. 3018%,；成份峰 2 =Rtll. 261，含量為 0. 0134%； 成份峰3 :Rtl8. 813峰，含量為4. 7668 %，在210nm處有最大吸收峰、在270nm處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰4 :Rtl9. 448峰，含量為4. 5857%，在203nm處有最大吸收峰、在 276nm處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰5 為主成份，Rt20. 529峰，含量為29. 2145%，在 208nm處有最大吸收峰、在280nm處有平緩的肩峰，為糖肽類；成份峰6 :Rt22. 022峰，含量為3. 3082%，在202nm處有最大吸收峰、在275nm處有處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰7 Rt23. 055峰，含量為2. 7628%，在205nm和275nm處有兩個最大吸收峰、在MOnm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰8 :Rt23. 786峰，含量為2. 2094%,在205nm和270nm處有兩個最大吸收峰、在MOnm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰9 :Rt24. 933峰，含量為2. 4686%，在201nm、 235nm和270nm處有三個最大吸收峰、在212nm和M5nm處有兩個吸收谷，為糖肽類；成份峰10 :Rt26. 107峰，含量為1. 5985%，在202nm和270nm處有兩個最大吸收峰、在239nm處有吸收谷；成份峰11 :Rt26. 542峰，含量為1. 9064 %，在202nm和250nm處有兩個最大吸收峰、在235nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰12 :Rt27. 425峰，含量為5. 5093%，在210nm 處有最大吸收峰呈饅頭形圓頂；成份峰13 :Rt29. 463峰，含量為17. 6918%，在202nm處和 210士2nm處有雙峰、在處有個最大吸收峰、在230nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰 14 :Rt30. 751峰，含量為2. 0638%，在205nm、270nm處有兩個最大吸收峰、在MOnm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰15 :Rt31. 786峰，含量為10. 4588 %，在202nm和250nm處有兩個最大吸收峰、在222nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰16 :Rt33. 594峰，含量為0. 7256%, 在215nm處有最大吸收峰、在處有平緩的肩峰，為糖肽類；成份峰17 :Rt34. 607峰， 含量為0. 2739 %，在205nm處有最大吸收峰，在279nm處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰18 Rt35. 899峰，含量為0. 9427%，在205nm和279nm處有兩個最大吸收峰、在238nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰19 :Rt38. 403峰，含量為8. 2022%，在202nm和275nm處有兩個最大吸收峰、在240nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰20 :Rt41. 605峰，含量為0. 8272%，在225nm 和處有兩個最大吸收峰、240nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰21 :Rt50. 555峰，含量為0. 1231%，可見200nm和254nm處有紫外吸收峰，應為糖肽類；成份峰22 :Rt55. 260峰成份，含量為0. 0208%，含量太低，不便測試；成份峰23 :Rt55. 471峰，含量為0. 0246%，成份含量太低，不便測試；當用純水洗凈凝膠層析柱后，用含0% 50%乙腈或甲醇或乙醇的水溶液為流動相可在IOmin 90min之間將繁縷水提取物樣品中的黃酮類成份洗脫出來，呈1 7個峰， 用二極管陣列檢測器掃描時可見黃酮類成份峰在210nm、270nm、360nm處有最大紫外吸收峰，且這些峰的紫外最大吸收峰波長均可同時最大有相同的士5%的偏移。三、峰成份的分子量分布計算實施例高效液相色譜法測試實施例1中，其保留時間為29. 463min的色譜峰，即為基準1 處峰，該色譜峰的成份用校正曲線方程經(jīng)GPC軟件計算得其分子量為652 士 10，校正曲線方程為At3+Bt2+Ct+D，方程中 A = -0. 001512594，B = O. 13668056，C = -4. 2778539，D = 49.32587351 ；
繪制相對標準曲線所使用的分子量標準物質是多糖分子量標準品，所用多糖標準品分子量及保留時間見表1
表1 多糖標準品分子量及保留時間表
權利要求
1.一種繁縷的水提取物，其特征在于該提取物含有糖肽，進一步，該提取物還含有黃酮和/或多糖，更進一步，該提取物的分子量分布范圍是100至100，OOODa0
2.根據(jù)權利要求1所述的繁縷水提取物，其特征在于該提取物是通過下列方法制備得到的a.取繁縷鮮草進行粉碎、離心并用水洗滌殘渣，收集汁液，將收集得到的汁液在40 60°C保溫1 8小時，靜置，當出現(xiàn)綠色沉淀物時停止加熱，靜置，待液體溫度降至10-30°C 時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液；或將收集得到的汁液在1 25°C 靜置12 96小時出現(xiàn)綠色沉淀物時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液； 或將收集得到的汁液在1 25°C用濾紙過濾，收集棕紅色溶液；或取繁縷干草粉碎，加藥材重2 5倍量的水，在1°C至60°C浸泡1 3次，每次1 4小時，合并濾液，過濾或/和離心得棕紅色溶液；b.將上述棕紅色溶液得到濃縮液，離心或過濾后棄去沉淀物，濃縮液優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C真空干燥、更進一步還可采用出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末；或者將上述棕紅色溶液用切割分子量為500 1500Da的膜進行納濾或超濾，收集含有大分子量物質的溶液，棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作濃縮含有大分子量物質的溶液使?jié)饪s液在10 30°C時比重達到1. 01 1. 30，若納濾或超濾的濃縮液不能達到較大比重時再在10 60°C時采用減壓濃縮，使?jié)饪s液比重在10 30°C時達到1. 01 1. 30，離心或過濾后棄去沉淀物，濃縮液優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C真空干燥、更進一步還可采用出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末；或者將上述棕紅色溶液用切割分子量為500 1500Da的膜進行納濾或超濾，收集含有大分子量物質的溶液，棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作濃縮含有大分子量物質的溶液使?jié)饪s液在10 30°C時比重達到1. 01 1. 30，若納濾或超濾的濃縮液不能達到較大比重時再在10 60°C時采用減壓濃縮，使?jié)饪s液比重在10 30°C時達到1. 01 1. 30，離心或過濾后棄去沉淀物，再向濃縮液加入95%乙醇使溶液含醇濃度達60 85%， 靜置12 M小時，離心或過濾收集沉淀物(必要時可用無水乙醇或丙酮洗滌沉淀物至近干)，沉淀物優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C真空干燥、更進一步還可采用出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末。
3.權利要求1或2所述繁縷提取物的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟a.取繁縷鮮草進行粉碎、離心并用水洗滌殘渣，收集汁液，將收集得到的汁液在40 60°C保溫1 8小時，靜置，當出現(xiàn)綠色沉淀物時停止加熱，靜置，待液體溫度降至10-30°C 時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液；或將收集得到的汁液在1 25°C 靜置12 96小時出現(xiàn)綠色沉淀物時離心或/和過濾去除綠色沉淀雜質，收集棕紅色溶液； 或將收集得到的汁液在1 25°C用濾紙過濾，收集棕紅色溶液；或取繁縷干草粉碎，加藥材重2 5倍量的水，在1°C至60°C浸泡1 3次，每次1 4小時，合并濾液，過濾或/和離心得棕紅色溶液；b.將上述棕紅色溶液在10 60°C減壓濃縮至10 30°C時比重1.01 1. 30，得到濃縮液，離心或過濾后棄去沉淀物，濃縮液優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C真空干燥、更進一步還可采用出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末；或者將上述棕紅色溶液用切割分子量為500 1500Da的膜進行納濾或超濾，收集含有大分子量物質的溶液，棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作濃縮含有大分子量物質的溶液使?jié)饪s液在10 30°C時比重達到1. 01 1. 30，若納濾或超濾的濃縮液不能達到較大比重時再在10 60°C時采用減壓濃縮，使?jié)饪s液比重在10 30°C時達到1. 01 1. 30，離心或過濾后棄去沉淀物，濃縮液優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C真空干燥、更進一步還可采用出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末；或者將上述棕紅色溶液用切割分子量為500 1500Da的膜進行納濾或超濾，收集含有大分子量物質的溶液，棄去含有小分子量物質的溶液，反復進行此項操作濃縮含有大分子量物質的溶液使?jié)饪s液在10 30°C時比重達到1. 01 1. 30，若納濾或超濾的濃縮液不能達到較大比重時再在10 60°C時采用減壓濃縮，使?jié)饪s液比重在10 30°C時達到1. 01 1. 30，離心或過濾后棄去沉淀物，再向濃縮液加入95%乙醇使溶液含醇濃度達60 85%， 靜置12 M小時，離心或過濾收集沉淀物(必要時可用無水乙醇或丙酮洗滌沉淀物至近干)，沉淀物優(yōu)先采用冷凍干燥、進一步可采用40 60°C真空干燥、更進一步還可采用出口溫度為50 70°C的噴霧干燥得到繁縷水提取物粉末。
4.權利要求1或2所述繁縷提取物，測定其含量的方法或/和分子量分布的方法或/ 和其指紋圖譜，其特征在于首先測得的是高效液相色譜圖即該指紋圖譜，該色譜圖即指紋圖譜含有以下色譜特征峰，各峰的保留時間最大均可同時有士5%的偏移，百分含量最大均可同時有士 15%的偏差保留時間(min)包括 Rtll. 202、Rtl3. 035、Rtl6. 807、Rtl8. 793、Rtl9. 546、Rt20. 888、 Rt29. 437、Rt31. 711、Rt35. 858、Rt38. 385，其中以 Rtl8. 793 (含量占 16. 9275 % )、 Rtl9. 546(含量占11. 2738% )和Rt20. 888(含量占63. 0929% )的3個峰為主，含量占 91. 29% ；以保留時間為20. 888的色譜峰為基準1，則上述10個色譜峰的相對保留時間依次分別為0. 5363,0. 6240,0. 8046,0. 8997,0. 9358,1. 0000,1. 4093,1. 5181,1. 7167,1. 3377 ；更進一步，圖譜中含有下列保留時間(min)的特征峰RtlO. 132峰、Rtll. 261峰、 Rtl8. 813 峰、Rtl9. 448 峰、Rt20. 529 峰、Rt22. 022 峰、Rt23. 055 峰、Rt23. 786 峰、Rt24. 933 峰、Rt26. 107 峰、Rt26. 542 峰、Rt27. 425 峰、Rt29. 463 峰、Rt30. 751 峰、；Rt31. 786 峰、 Rt33. 594 峰、Rt34. 607 峰、Rt35. 899 峰、Rt38. 403 峰、Rt41. 605 峰、Rt50. 555 峰、Rt55. 260 峰、Rt55. 471 峰;其中以 Rtl8. 813 峰(占 4. 8% )、Rtl9. 448 峰(占 4. 6% )、Rt20. 529 峰(占 29. 2% )、 Rt27. 425 峰(占 5. 5% )、Rt29. 463 峰(占 17. 7% )、Rt31. 786 峰(占 10. 5% )、Rt38. 403 峰(占8.2% )的7個色譜峰為主，含量占80. 5% ；以保留時間為29. 463的色譜峰為基準1，則上述23個色譜峰的相對保留時間依次分別為0. 3439,0. 3822,0. 6385,0. 6601,0. 6968,0. 7474,0. 7825,0. 8073,0. 8462,0. 8861、0.9009,0. 9308,1. 0000,1. 0437,1. 0788,1. 1402,1. 1746,1. 2184,1. 3034,1. 4121,1. 7159、1.8756,1. 8827。
5.根據(jù)權利要求4所述的繁縷提取物的色譜圖，其特征在于其次該高效液相色譜色譜圖即指紋圖譜是采用下列高效液相色譜法測定得到高效液相色譜儀為具有紫外檢測器或 /和通用型檢測器的高效液相色譜儀，優(yōu)選具二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀，采用紫外檢測器時檢測波長為195nm 400nm，或采用通用型檢測器時優(yōu)選示差檢測器；色譜柱為凝膠過濾色譜柱，優(yōu)選TSKgel PW系列凝膠色譜柱，進一步，還可以加用 TSKgelPW系列凝膠保護柱，更進一步，還可以用TSKgel SW系列水相凝膠過濾色譜柱；柱理論板數(shù)按參照物聚乙二醇計算，應不低于3，000 ；用一根或一至三根柱串聯(lián)；流動相為含0% 50%乙腈或甲醇或乙醇的水溶液、或pH 1. 0 7. 0之間的0. 1 IM硝酸鹽水溶液、或pH 1.0 7.0之間的0. 1 IM硫酸鹽水溶液、或pH 1.0 7.0之間的 0. 1 IM醋酸鹽水溶液、或pH 1. 0 7. 0之間的0. 1 IM的磷酸鹽緩沖水溶液加0. 1 IM硫酸鹽水溶液，其中優(yōu)選pH 1. 0 7. 0之間的0. 1 IM硫酸鹽水溶液為流動相；流速為0. lml/min 1. 5ml/min，保持柱溫范圍為10_60°C。
6.根據(jù)權利要求5所述的繁縷提取物的高效液相色譜測定法，其特征在于TSKgelPff 系列凝膠保護柱為TSKgel G3000PWXL6. 0X40凝膠保護柱，TSKgel Pff系列凝膠色譜柱為 TSKgelG3000PWXL7. 8 X 300 凝膠過濾色譜柱或 TSKgel G4000PWXL7. 8 X 300 凝膠過濾色譜， TSKgel SW系列水相凝膠過濾色譜柱為TSKgel G3000SffXL 7.8X300。
7.根據(jù)權利要求5所述的繁縷提取物的高效液相色譜測定法，其特征在于繁縷提取物供試品溶液配制精密稱定0. 0100 1. 0000克的待測樣品溶解于5 IOOml純水或流動相中搖勻、靜置，再精密吸取1 IOml用純水或流動相稀釋至25ml備用；或直接精密稱定 0. 0010 0. 5000克的待測樣品溶解于25毫升純水或流動相中搖勻，備用；供試品溶液進樣量為lyL 50yL。
8.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于用于含量測定及質控標準所繪制含量測定的回歸方程即標準曲線所使用的對照品物質是通過分離繁縷提取物中的峰成份作為外標對照品，例如高效液相色譜法測試實施例1譜圖中保留時間為Rt20. 529min的色譜峰的化學成份A、Rt29. 463min的峰化學成份B、Rt27. 425min的峰化學成份C、Rt31. 786min的峰化學成份D、Rt38. 403min的峰化學成份E，或用其它來源的標準物質作為內標對照品，例如可用云芝糖肽包括云芝胞內糖肽標準品作為內標對照品。
9.根據(jù)權利要求1所述的繁縷提取物，其特征在于該繁縷提取物的劑型為膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、微丸、微囊、片劑、丸劑、顆粒劑、滴丸、口服液、注射劑、凝膠劑、滴鼻劑、鼻噴劑、氣霧劑、膜劑、涂劑或者口香糖。
10.根據(jù)權利要求1所述的繁縷提取物，其特征在于各成份峰經(jīng)紫外掃描有如下最大吸收峰及其吸收谷，并據(jù)此推定及峰成份化合物類型因儀器測試誤差，其各峰成份進行紫外掃描時均可同時最大有相同的士5%偏移、百分含量最大均可同時有相同的士 15%偏差；成份峰1 =RtlO. 132峰，含量為0. 3018%，；成份峰2 =Rtll. 261，含量為0. 01；34%;成份峰3 :Rtl8. 813峰，含量為4. 7668%，在210nm處有最大吸收峰、在270nm處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰4 :Rtl9. 448峰，含量為4. 5857%,在203nm處有最大吸收峰、在276nm處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰5 為主成份，Rt20. 529峰，含量為29. 2145 %，在208nm處有最大吸收峰、在^Onm處有平緩的肩峰，為糖肽類；成份峰6 :Rt22. 022峰，含量為3. 3082%, 在202nm處有最大吸收峰、在275nm處有處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰7 :Rt23. 055峰， 含量為2. 7628 %，在205nm和275nm處有兩個最大吸收峰、在MOnm處有吸收谷，為糖肽類； 成份峰8 :Rt23. 786峰，含量為2. 2094%，在205nm和270nm處有兩個最大吸收峰、在MOnm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰9 :Rt24. 933峰，含量為2. 4686%，在201nm、235nm和270nm 處有三個最大吸收峰、在212nm和M5nm處有兩個吸收谷，為糖肽類；成份峰10 :Rt26. 107 峰，含量為1. 5985%，在202nm和270nm處有兩個最大吸收峰、在239nm處有吸收谷；成份峰11 :Rt26. 542峰，含量為1. 9064%，在202nm和250nm處有兩個最大吸收峰、在235nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰12 :Rt27. 425峰，含量為5. 5093 %，在210nm處有最大吸收峰呈饅頭形圓頂；成份峰13 :Rt29. 463峰，含量為17. 6918%，在202nm處和210士2nm處有雙峰、在處有個最大吸收峰、在230nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰14 :Rt30. 751 峰，含量為2. 0638%,在205nm、270nm處有兩個最大吸收峰、在240nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰15 :Rt31. 786峰，含量為10. 4588%，在202nm和250nm處有兩個最大吸收峰、在 222nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰16 :Rt33. 594峰，含量為0. 7256 %，在215nm處有最大吸收峰、在處有平緩的肩峰，為糖肽類；成份峰17 :Rt34. 607峰，含量為0. 2739%, 在205nm處有最大吸收峰，在279nm處有平緩肩峰，為糖肽類；成份峰18 :Rt35. 899峰，含量為0. 9427 %，在205nm和279nm處有兩個最大吸收峰、在238nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰19 :Rt38. 403峰，含量為8. 2022 %，在202nm和275nm處有兩個最大吸收峰、在MOnm 處有吸收谷，為糖肽類；成份峰20 :Rt41. 605峰，含量為0. 8272%，在225nm和處有兩個最大吸收峰、240nm處有吸收谷，為糖肽類；成份峰21 :Rt50. 555峰，含量為0. 1231%, 可見200nm和254nm處有紫外吸收峰，應為糖肽類；成份峰22 :Rt55. 260峰成份，含量為 0. 0208%，含量太低，不便測試；成份峰23 :Rt55. 471峰，含量為0. 0246%，成份含量太低， 不便測試；當用純水洗凈凝膠層析柱后，用含0% 50%乙腈或甲醇或乙醇的水溶液為流動相可在IOmin 90min之間將繁縷提取物樣品中的黃酮類成份洗脫出來，呈1 7個峰，用二極管陣列檢測器掃描時可見黃酮類成份峰在210nm、270nm、360nm處有最大紫外吸收峰，且這些峰的紫外最大吸收峰波長均可同時最大有相同的士 5 %的偏移。
全文摘要
一種繁縷水提取物及其制備方法和液相色譜的含量、指紋圖譜、分子量分布測定方法及應用本發(fā)明公開了一種用較大孔徑的凝膠柱進行繁縷水提取物的高效液相色譜含量測定方法、分子量分布測定方法及其指紋圖譜，該測定方法可應用于提取物的工藝研究、穩(wěn)定性研究、制訂質量標準，并可經(jīng)與標準品紫外吸收譜對照推定化合物成份類型；用該含量測定方法測得的高效液相色譜指紋圖譜，采用國家藥典委員會規(guī)定的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對其進行評價，用水提取物樣品的圖譜與本品的質控標準圖譜的共有模式來計算相似度可作為本品的一種質量控制標準，對有效控制組合物的質量具有重要意義。
文檔編號G01N30/78GK102512479SQ20111000554
公開日2012年6月27日 申請日期2011年1月1日 優(yōu)先權日2010年2月3日
發(fā)明者朱耕新 申請人:朱耕新