專利名稱：曙紅及其衍生物在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)負(fù)染檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及蛋白質(zhì)檢測(cè)的一種新的負(fù)染染料。
背景技術(shù)：
在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，凝膠蛋白質(zhì)染色技術(shù)是銜接二維電泳和下游質(zhì)譜分析的關(guān)鍵技術(shù)。當(dāng)前先進(jìn)的質(zhì)譜儀已能夠分析Pg級(jí)的痕量蛋白。常規(guī)的凝膠蛋白質(zhì)染色技術(shù)有考馬斯亮藍(lán)染色、銀染、熒光染色等。考馬斯亮藍(lán)染色法靈敏度低，銀染法操作復(fù)雜、質(zhì)譜兼容性差，熒光染色法價(jià)格昂貴。這些因素嚴(yán)重地制約了高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。雖然，近三四十年開發(fā)出了不少新的染色技術(shù)，但仍存在著如下一個(gè)或幾個(gè)缺點(diǎn)靈敏度低、重現(xiàn)性差、毒性大、質(zhì)譜兼容性差、價(jià)格昂貴、操作繁瑣等。尋找新的染色方法以適應(yīng)當(dāng)前先進(jìn)的質(zhì)譜分析技術(shù)已成為后基因組時(shí)代推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。曙紅負(fù)染法為凝膠蛋白質(zhì)染色提供了一種快速、靈敏的方法，其靈敏度達(dá)0. 1 0. ^g/band，可以和銀染相媲美。 而且曙紅負(fù)染方法是對(duì)凝膠背景進(jìn)行著色，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)沒(méi)有修飾或破壞作用，有良好的質(zhì)譜兼容性，彌補(bǔ)了銀染法質(zhì)譜兼容性差的缺陷。曙紅負(fù)染法將很好地銜接二維電泳和下游質(zhì)譜分析，推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供曙紅及其衍生物在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的曙紅相關(guān)化合物是指以曙紅陰離子為母核的鈉鹽、鉀鹽和銨鹽等。曙紅母核為為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種電泳凝膠上蛋白質(zhì)負(fù)染的方法，包括如下步驟1)將SDS-PAGE電泳后的蛋白樣品凝膠置于固定液中固定10 60min，棄固定液， 然后用去離子水沖洗1 3次，每次1 lOmin。優(yōu)選的固定時(shí)間為30min，去離子水沖洗次數(shù)為2次，沖洗時(shí)間為5min。固定液可以是含有50%乙醇和10%乙酸的水溶液；2)在甲醇溶液里平衡5 20min，其中甲醇溶液為按體積比30 70%的甲醇水溶液；優(yōu)選的平衡時(shí)間為lOmin，優(yōu)選的甲醇濃度為50% ；
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3)加入染色液染色1 30min，然后放在去離子水中漂洗1 lOmin，其中染色液為含重量體積比0. 1 2%的曙紅或其衍生物及按體積比30 70%的甲醇、0. 5 1. 5% 的乙酸水溶液；優(yōu)選的曙紅及其衍生物的濃度為0. 5%,甲醇濃度為50%，乙酸濃度為； 優(yōu)選的水洗時(shí)間為3min。4)檢測(cè)，凝膠染色后，可放在黑色背景下直接肉眼觀察；或在愛普生V700掃描儀下，反向掃描模式掃描，其靈敏度更高；還可進(jìn)行熒光檢測(cè)，曙紅本身能發(fā)較強(qiáng)的熒光，可在檢測(cè)波長(zhǎng)250 400nm下檢測(cè)，優(yōu)選波長(zhǎng)為365nm。前期研究表明該技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)1)靈敏度高曙紅負(fù)染靈敏度高于考馬斯亮藍(lán)染色法數(shù)百倍，和銀染法靈敏度相當(dāng)；2)操作簡(jiǎn)單迅速操作步驟少，可在1個(gè)小時(shí)內(nèi)完成；3)重現(xiàn)性好受溫度、搖床擺動(dòng)頻率等外部條件影響較??；4)可逆性好容易脫色；5)質(zhì)譜兼容性好由于曙紅負(fù)染是對(duì)凝膠背景進(jìn)行染色，不和凝膠上的蛋白質(zhì)結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)完全不受影響，所以可與MALDI-TOF等質(zhì)譜儀高度兼容；6)使用安全采用毒性低的染料，提高實(shí)驗(yàn)操作的安全性，對(duì)環(huán)境污染?。?)成本低。


圖1.曙紅的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖2.在一向SDS-PAGE膠上，(A)曙紅負(fù)染法、⑶傳統(tǒng)戊二醛銀染法、(C) SYPRORuby熒光染色法和⑶咪唑鋅負(fù)染法靈敏度的比較。戊二醛銀染法、SYPRO Ruby熒光染色法和咪唑鋅負(fù)染法均按照文獻(xiàn)記載；采用Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(SDS6H2)為樣品。帶 1，IOOOng ；帶 2，500ng ；帶 3，250ng ；帶 4，IOOng ；帶 5，50ng ；帶 6，IOng ；帶 7，&ig ；帶 8,0. 8ng ；帶 9,0. 4ng ；帶 10，0. 2ng。圖3. 二向SDS-PAGE膠上，㈧曙紅負(fù)染法、⑶傳統(tǒng)戊二醛銀染法、(C) SYPRORuby 熒光染色法和(D)咪唑鋅負(fù)染法靈敏度的比較。分離樣品為大腸桿菌總蛋白；IPG膠條長(zhǎng) 13厘米，pH 4-7 ；分離膠的濃度為11. 4% ；樣品上樣量為100微克/膠條。圖4.比較在一向SDS-PAGE膠上曙紅負(fù)染法、傳統(tǒng)戊二醛銀染法、SYPRO Ruby熒光染色法和咪唑鋅負(fù)染法檢識(shí)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的線性范圍。標(biāo)準(zhǔn)蛋白經(jīng)染色后，其中三個(gè)代表蛋白 phosphorylase b(A，B)、BSA (C，D)禾口 carbonic anhydrase (Ε, F)經(jīng) ImageQuant TL 圖像軟件分析后繪得標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣量與條帶強(qiáng)度的線性曲線。圖中A、C、E所測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量范圍為0. 8-lOOOng，而B、D和F所測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量范圍為0. 8-lOOng。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1曙紅蛋白質(zhì)負(fù)染染色圖1是曙紅的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
圖2-4的曙紅蛋白質(zhì)負(fù)染實(shí)驗(yàn)采用下述步驟進(jìn)行1)將經(jīng)SDS-PAGE電泳后的蛋白質(zhì)樣品(SDS6H2)凝膠于50%甲醇/10%乙酸溶液中固定30min。然后去離子水洗2次，每次5min ；2)在50%甲醇溶液中平衡IOmin ；3)在染色液中染色15min，再放在去離子水里漂洗3min，染色液為含0. 5% (W/V) 曙紅含50%甲醇/1%乙酸的水溶液；4)凝膠染色后，在愛普生V700掃描儀下，反向掃描模式掃描。按照上述方法分別用曙紅的鈉鹽、鉀鹽、銨鹽進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，結(jié)果表明用這些衍生物均能夠得到類似于曙紅的檢測(cè)結(jié)果。圖2是說(shuō)明曙紅負(fù)染法與其它染色法效果對(duì)比按照實(shí)施例1的方法，采用不同染料進(jìn)行染色，(A)曙紅負(fù)染法、(B)傳統(tǒng)戊二醛銀染法、(C)SYPRO Ruby熒光染色法和(D)咪唑鋅負(fù)染法靈敏度的比較。傳統(tǒng)戊二醛銀染法、SYPRO Ruby熒光染色法和咪唑鋅負(fù)染法均按照文獻(xiàn)記載；采用Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(SDS6H2)為樣品。帶1，1000叫；帶2，500叫；帶3，250叫；帶4，100叫；帶5，50叫；帶6， IOng ；帶7,2ng ；帶8,0. 8ng ；帶9,0. 4ng ；帶10，0. 2ng。結(jié)果如圖2所示，曙紅負(fù)染法檢測(cè)靈敏度最高。圖3是說(shuō)明曙紅負(fù)染法與其它染色法對(duì)E. coli總蛋白的染色對(duì)比取E. coli菌液，12000rpm離心收集菌群，加入0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)重懸菌體。利用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞。18000rpm離心30min，收集上清，即得E. coli 總蛋白提取液(粗蛋白制品)，將上述粗蛋白制品經(jīng)二向凝膠電泳分離后，分別采用實(shí)驗(yàn)例 1的㈧曙紅負(fù)染法、⑶傳統(tǒng)戊二醛銀染法、(C)SYPRO Ruby熒光染色法和⑶咪唑鋅負(fù)染法進(jìn)行染色，結(jié)果如圖3所示。顯示曙紅負(fù)染是一種簡(jiǎn)單，而且靈敏度可同銀染媲美的方法。圖4是說(shuō)明曙紅負(fù)染法與其他染色法的線性動(dòng)態(tài)范圍對(duì)比用曙紅負(fù)染法、傳統(tǒng)戊二醛銀染法、SYPRO Ruby熒光染色法和咪唑鋅負(fù)染法染色標(biāo)準(zhǔn)蛋白的線形動(dòng)態(tài)范圍。三個(gè)代表蛋白phosphorylase b (A，B)、BSA(C，D)和carbonic anhydrase(E,F)在10%聚丙烯酰胺凝膠中分離。染色后，經(jīng)ImageQuant TL圖像軟件分析后繪得標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣量與條帶強(qiáng)度的線性曲線。圖中A、C、E所測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量范圍為 0. 8-lOOOng,而B、D和F所測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量范圍為0. S-IOOngo由圖可知曙紅負(fù)染法具有較好的線性動(dòng)態(tài)范圍。圖2-4中的其它染色方法及其相關(guān)文獻(xiàn)傳統(tǒng)戊二醛銀染法操作方法參見文獻(xiàn)Heukeshoven，J. and Dernick，R. (1985) Simplifiedmethod for silver staining of proteins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining. Electrophoresis 6,103-112.SYPRO Ruby熒光染色法操作方法參見文獻(xiàn)Malone，J.，Radabaugh, Μ.， Leimgruber, R. , Gerstenecker, G. (2001)Practical aspects of fluorescent staining for proteomic application. Electrophoresis 22,919-932.咪唑鋅負(fù)染染色法操作方法參見文獻(xiàn)Castellanos-Serra，L.，Proenza, W.， Huerta, V. , Moritz, R. L. , Simpson, R. J. (1999)Proteome analysis of polyacrylamidegel-separated proteins visualizedby reversible negative staining using imidazole-zinc salts. Electrophoresis 1999，20，732-737.
權(quán)利要求
1.曙紅及其衍生物在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的曙紅及其衍生物為曙紅的鈉鹽、鉀鹽或銨鹽。
3.一種凝膠蛋白質(zhì)負(fù)染檢測(cè)方法，其包括步驟1)將經(jīng)SDS-PAGE電泳后的蛋白質(zhì)樣品凝膠置于固定液中固定10 60min，棄固定液， 然后用去離子水沖洗1 3次，每次1 IOmin ；2)在甲醇溶液里平衡5 20min，其中甲醇溶液為按體積比30 70%的甲醇水溶液；3)加入染色液1 30min，然后放在去離子水中漂洗1 lOmin，其中染色液為含重量體積比0. 1 2%的曙紅或其衍生物及按體積比30 70%的甲醇、0. 5 1. 5%的乙酸水溶液。然后放在去離子水中漂洗1 IOmin ；4)檢測(cè)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟1)中蛋白質(zhì)固定時(shí)間為30min，固定液為50 %乙醇/10 %乙酸溶液，然后用去離子水沖洗兩次，每次5min。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟幻甲醇溶液為50%甲醇水溶液，平衡時(shí)間為IOmin。
6.如權(quán)利要求3 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)染色液中曙紅的濃度按重量體積比為0.5%。
7.如權(quán)利要求3 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)中甲醇濃度為50%，乙酸濃度為1%。
8.如權(quán)利要求3 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)染色液染色時(shí)間為 15min。
9.如權(quán)利要求3 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)去離子水中漂洗時(shí)間為 3min。
10.如權(quán)利要求3 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟4)檢測(cè)既可以用肉眼直接觀察，又可以用愛普生V700掃描儀以反向掃描模式掃描，還可以在檢測(cè)波長(zhǎng)365nm下檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)負(fù)染檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)是曙紅及其衍生物在蛋白質(zhì)負(fù)染檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了應(yīng)用曙紅進(jìn)行蛋白負(fù)染檢測(cè)的方法，包括步驟將蛋白質(zhì)樣品電泳后的凝膠在固定液中固定，去離子水沖洗；甲醇溶液平衡，染色；顯影。本發(fā)明具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單迅速、重現(xiàn)性好、線性關(guān)系好、質(zhì)譜兼容性好、使用安全、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，可較好適用于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。
文檔編號(hào)G01N1/30GK102590100SQ20111002296
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者叢維濤, 金利泰 申請(qǐng)人:溫州安得森生物科技有限公司