專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)、分子生物學(xué)和生物制品領(lǐng)域，尤其是一種檢測(cè)人西尼羅病毒 IgG抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
西尼羅病毒(West Nile Virus，WNV)為黃病毒科黃病毒屬(Flavivirus)，為單股正鏈RNA病毒，表達(dá)的蛋白可以分為10個(gè)單獨(dú)的蛋白結(jié)構(gòu)3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，囊膜蛋白( E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(C)，以及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、 NS4B和NS5結(jié)構(gòu)與登革病毒等黃病毒相似。西尼羅病毒感染人體以后可以引起一種稱(chēng)之為“西尼羅熱”的急性傳染病。這種病毒可以引起高熱、頭痛、肌肉疼痛、皮疹、淋巴結(jié)腫大等癥狀，可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生腦膜腦炎癥狀，嚴(yán)重者危及病人生命。目前尚無(wú)有效的治療方法和疫苗接種，因此該病一旦暴發(fā)流行極易引起人們的恐慌，已構(gòu)成全球性公共衛(wèi)生的新威脅。西尼羅病毒感染的主要流行地區(qū)是非洲、北美洲、歐洲，但近年來(lái)，印度、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、菲律賓、土耳其、以色列、印度尼西亞、巴基斯坦等我國(guó)周邊的國(guó)家相繼出現(xiàn)，并有向我國(guó)傳入的趨勢(shì)，加強(qiáng)西尼羅病毒傳入的監(jiān)測(cè)和防范工作非常必要，尤其需要加強(qiáng)出入境人員、動(dòng)物的感染監(jiān)測(cè)以及出入境血液制品、生物制品等生物物質(zhì)檢測(cè)工作，并盡快調(diào)查國(guó)內(nèi)動(dòng)物血清學(xué)感染情況。因此，急需建立一種快速、簡(jiǎn)便的西尼羅病毒診斷方法。目前，國(guó)內(nèi)建立的檢測(cè)WNV抗體的方法有PCRJaciMan RT2PCR、NASBA、SYBR Green RT-PCR等核酸檢測(cè)，病毒分離培養(yǎng)，補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，血凝抑制實(shí)驗(yàn)等等。上述技術(shù)和方法雖然可以檢測(cè)WNV及其抗體水平，在實(shí)踐中也取的一定的效果，但均存在試驗(yàn)操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，需要特定的專(zhuān)業(yè)技能和儀器設(shè)備等，常限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，很難普及和推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，內(nèi)設(shè)置有包被西尼羅病毒樣顆粒的可拆96孔酶標(biāo)板，酶結(jié)合物工作液，cutoff血清，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，樣品稀釋液，洗滌液，TMB底物溶液和終止液。進(jìn)一步，所述西尼羅病毒樣顆粒是通過(guò)基因重組技術(shù)，以真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)病毒衣殼的蛋白成分，通過(guò)病毒形態(tài)學(xué)和分子免疫學(xué)鑒定，蔗糖梯度離心結(jié)合超速離心純化，獲得西尼羅病毒的VLPs。進(jìn)一步，所述樣品稀釋液為的0. 01M、pH7. 4的磷酸緩沖液；所述洗滌液為含0. 1% 吐溫-20的0. 1M、pH7. 4的磷酸緩沖液，所述終止液為2M硫酸溶液。利用上述試劑盒間接ELISA診斷人西尼羅病毒的方法，具體為
1)被檢測(cè)血清、cutoff血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清都用血清稀釋液作 1:100稀釋后，按酶標(biāo)板加樣模式每孔加入IOOul，37度放置Ih ；
2)倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置:3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
3)每反應(yīng)孔加入辣根過(guò)氧化物酶羊抗人IgG使用液，每孔100ul，37度放置0. 5h， 倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
4)每個(gè)顯色孔加顯色底物IOOul，室溫放置15min ；
5)每個(gè)顯色孔加終止液50ul終止反應(yīng)；
6)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光光。進(jìn)一步，所述方法檢測(cè)樣本的判定標(biāo)準(zhǔn)為每板、或同一板的孔條或孔檢測(cè)時(shí)，必須包括cut-off校準(zhǔn)樣和兩個(gè)對(duì)照樣，判定結(jié)果以待測(cè)樣本OD45tl值與cutoff OD450值比值 P/C，大于等于1. 5判定為陽(yáng)性，小于等于1. 3判定為陰性，介于1. 3-1. 5之間為可疑，須重檢，重檢時(shí)P/C值大于等于1. 5判定為陽(yáng)性，小于等于1. 3判定為陰性。本發(fā)明應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的西尼羅病毒樣顆粒為包被抗原建立了 ELISA方法，由于病毒樣顆粒(VLPs)是含有一個(gè)或多個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒(méi)有病毒的核酸，不能自主復(fù)制，而且具有與天然病毒同樣的構(gòu)象和抗原表位，因此對(duì)人不具有感染性，穩(wěn)定性好，不易失活，有較高的安全性，免疫原性更接近天然病毒。本發(fā)明為檢測(cè)人西尼羅病毒IgG抗體提供一種安全，特異，敏感，快速，操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)的試劑盒，為預(yù)防和控制西尼羅病毒從國(guó)外入我國(guó)方面提供了技術(shù)手段和方法。


圖1為具有完整序列的四株西尼羅病毒資料統(tǒng)計(jì)圖2A為具有完整序列的西尼羅病毒株M氨基酸進(jìn)化樹(shù)比對(duì)圖； 圖2B為具有完整序列的西尼羅病毒株E氨基酸進(jìn)化樹(shù)比對(duì)圖； 圖2C為具有完整序的西尼羅病毒北美株與亞洲株M氨基酸進(jìn)化樹(shù)比對(duì)圖； 圖2D為具有完整序列的西尼羅病毒北美株與亞洲株E氨基酸進(jìn)化樹(shù)比對(duì)圖； 圖3A — 1為正常細(xì)胞在IOX倍下鏡下圖； 圖3Α — 2為正常細(xì)胞在40Χ倍下鏡下圖； 圖3Α — 3為正常細(xì)胞在100Χ倍下鏡下圖:3Β — 1為轉(zhuǎn)染P⑶NA5-WNV-JME后的細(xì)胞在IOX倍下鏡下結(jié)果圖； 圖:3Β — 2為轉(zhuǎn)染P⑶NA5-WNV-JME后的細(xì)胞在40Χ倍下鏡下結(jié)果圖； 圖:3Β — 3為轉(zhuǎn)染P⑶NA5-WNV-JME后的細(xì)胞在100Χ倍下鏡下結(jié)果圖； 圖4Α為SDS-PAGE結(jié)果圖4Β為用西尼羅病毒E單抗(millipore)進(jìn)行Wfestern印跡雜交圖； 圖5A為蔗糖密度梯度超速離心純化后共表達(dá)西尼羅病毒Μ、E蛋白的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)形成西尼羅病毒樣顆粒電鏡圖； 圖5B為圖5A中的A部放大圖； 圖6為ELISA結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式如圖1至圖6所示，圖4A為SDS-PAGE結(jié)果，泳道1為正常細(xì)胞超聲破碎，離心上清，過(guò)濾、超濾管濃縮后樣品；泳道2為蛋白Marker ；泳道3為共表達(dá)西尼羅病毒包膜蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清液過(guò)濾、超濾管濃縮后樣品；泳道4為共表達(dá)西尼羅病毒包膜蛋白的細(xì)胞超聲破碎，離心上清，過(guò)濾、超濾管濃縮后樣品。圖4Β為用西尼羅病毒E單抗(mi 11 ipore)進(jìn)行Wfestern印跡雜交。泳道1為共表達(dá)西尼羅病毒包膜蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清液過(guò)濾、超濾管濃縮后樣品；泳道2為共表達(dá)西尼羅病毒包膜蛋白的細(xì)胞超聲破碎，離心上清，過(guò)濾、超濾管濃縮后樣品；泳道3為正常細(xì)胞超聲破碎，離心上清， 過(guò)濾、超濾管濃縮后樣品；泳道2為蛋白Marker。圖5A、5B顯示蔗糖密度梯度超速離心純化后共表達(dá)西尼羅病毒M、E蛋白的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)形成西尼羅病毒樣顆粒電鏡照片。這些顆粒是由西尼羅病毒包膜M、E蛋白在細(xì)胞中共表達(dá)而產(chǎn)生于細(xì)胞胞內(nèi)自動(dòng)組裝形成的。本發(fā)明一種檢測(cè)人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，采用的技術(shù)策略是 通過(guò)基因重組技術(shù)，以真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)病毒衣殼的蛋白成分，通過(guò)病毒形態(tài)學(xué)和分子免疫學(xué)鑒定，獲得西尼羅病毒的VLPs，以用于抗體檢測(cè)試劑盒的組裝工作以及西尼羅病毒單克隆抗體的篩選工作。在GENEBANK中檢索西尼羅病毒(WNV)，挑取完整全序列病毒株，用生物軟件對(duì)這完整全序列病毒株Μ、E蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析比對(duì)，篩選出典型西尼羅病毒株 NY99-crow-V76/l ；
調(diào)出其目的基因片段PrMO CpreM和M)和ft~E0，分別合成，合成后克隆入pET30_a載體中.以其為模板，設(shè)計(jì)合適的引物，PCR擴(kuò)增M，E片段，然后設(shè)計(jì)合適的引物，以其PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增，得到重組基因WNV-ME ；最后引入信號(hào)肽，再克隆到P⑶NA5-FRT載體上，轉(zhuǎn)化篩選、測(cè)序鑒定，即得到了重組質(zhì)粒PCDNA5-WNV-JME ；
采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，將重組質(zhì)粒PCDNA5-WNV-JME，轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，通過(guò)間接免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、Western blotting等方法鑒定目的蛋白表達(dá)，透射電鏡下鑒定VLPs形成，采用蔗糖梯度離心結(jié)合超速離心對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化；
以表達(dá)的病毒樣顆粒為基礎(chǔ)，通過(guò)酶聯(lián)免疫技術(shù)研制一種檢測(cè)人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒。一.篩選典型西尼羅病毒株NY99-crow_V76/l
在GENEBANK中檢索西尼羅病毒(WNV)，共獲得102株，其中完整全序列共四株。用生物軟件對(duì)這四株M、E蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析比對(duì)，著重分析北美株與印度株表達(dá)的M、E 蛋白在氨基酸水平上的同源性，最終選擇典型毒株NY99-Crow-V76/l為研究對(duì)象(附圖1和 2)
二.重組質(zhì)粒PCDNA5-WNV-JME的構(gòu)建
1. WNV病毒的prM和E基因合成及融合PCR擴(kuò)增prME基因片段根據(jù)WNV NY99-crow-V76/l毒株的基因組序列(GenBank序列號(hào)為FJ151394. 1)，分別合成prM禾口 E 基因片段，合成后克隆入pET30-a載體中。設(shè)計(jì)用于prM和E基因融合PCR的上下游引物， 其序列為
prM的上游引物MEMPl
5’ GAAGATCTGGATCCGAACCACCATGGATGTTACCCTCTCTAACT3’， prMM的下游引物MEMP2:5' ctcattccaaggcagttgaaGCTGTAAGCTGGGGCCACCA3'； E的上游引物MEEPl
5’ TGGTGGCCCCAGCTTACAGCttcaactgccttggaatgag3，， E的下游引物MEEP2:
5’ CGGAATTCCTCGAGCCTATTAATGATGATGATGATGGTGAG3'。劃線部分分別為BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)。分別將prM_pET30a和E_pET30a作為模板，擴(kuò)增PrM和E片段，擴(kuò)增條件分別是95°C5 min，然后95°C30 s, 72°C 30s, 72°C 1 min，擴(kuò)增；35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10 min; 95°C 5 min，然后 95°C30 s,72°C 30s,72°C 2 min, 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 min。然后以擴(kuò)增出的prM和E片段為模板，用prM的上游引物MEMPl和E的下游引物MEEP2通過(guò)融合PCR擴(kuò)增prME基因全長(zhǎng)，擴(kuò)增條件95°C 5 min, 然后 95°C30 s，72°C 30s，72°C 2. 5 min，擴(kuò)增；35 個(gè)循環(huán)，72°C 10 min。2.引入信號(hào)肽，獲得重組基因WNV-JME設(shè)計(jì)用于信號(hào)肽和WNV-ME基因融合PCR 的上下游引物，其序列為
信號(hào)肽上游引物WJP2-1: 5’ CGGGATCCGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3’ ； E下游引物WWP8
5' CCGCTCGAGCTATTAAGCGTGCACGTTCACGGAG 3'；
劃線部分分別為BamH I和)(h0 I酶切位點(diǎn).以信號(hào)肽和WNV-ME基因作模板，用 PfuUltra II高保真聚合酶拼接擴(kuò)增WNV-JME片段。PCR 反應(yīng)體系為(50μ1) :WJP2-1 (10UM) μ1、·Ρ8 (10UM) Ιμ 、dNTPmix (2. 5mmol/ Ι_ 5μ1, PfuUltra II 10xBuffer5Pl、PfuUltra II 高保真聚合酶 μ 、ddH20 35μ1, WNVME PCR產(chǎn)物(稀釋100倍) μ1，信號(hào)肽WNV-SignalPCR產(chǎn)物(10倍稀釋) μ1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性5 min，95°C變性30 s，72°C退火30s，72°C延伸3 min，；35個(gè)循環(huán)后72°C 延伸10 min。3.將重組基因WNV-JME克隆到PCDNA5-FRT載體上 WNV-JMEW純化產(chǎn)物經(jīng)BamHI 和BioI雙酶切后，在T4連接酶的作用在，插入到BamHI和BioI雙酶切的載體pcDNA5/FRT 上，即獲得了重組質(zhì)粒PCDNA5-WNV-JME。三.表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)及鑒定
將重組質(zhì)粒P⑶NA5-WNV-JME通過(guò)PEI或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過(guò)間接免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、Western blotting等方法鑒定。1、間接免疫熒光法初步檢測(cè)西尼羅病毒蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染4 后的細(xì)胞，用預(yù)冷的IxPBS清洗細(xì)胞兩遍，取適量細(xì)胞滴到八孔顯微鏡載玻片上，晾干，冷丙酮固定lOmin，加入稀釋的抗WNV抗體(使用PBS 1 40稀釋)37度孵育1 h，漂洗液洗滌 5次，每次;3min;加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG室溫結(jié)合40min(使用伊文思蘭1:50稀釋)。漂洗液洗滌5次后于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果轉(zhuǎn)染的細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，為轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未出現(xiàn)綠色熒光，表明西尼羅病毒蛋白轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中表達(dá)了(附圖3)。2、表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和蛋白印跡鑒定。將收集到細(xì)胞上清過(guò)濾和超濾管濃縮進(jìn)行初步純化，電泳前將初步純化的表達(dá)產(chǎn)物3體積加入1體積的4X SDS樣品處理液，100 度水浴lOmin，冷卻后加樣行12% SDS-PAGE.蛋白分離后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色后 GL200凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，行Wfestern blotting時(shí)，蛋白分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，37°C 5%脫脂奶粉封閉1.5h，一抗(鼠抗西尼羅病毒E 1:100)4°C過(guò)夜，二抗37°C孵育lh，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，暗室壓片。結(jié)果既表明西尼羅病毒包膜蛋白E的表達(dá)又表明表達(dá)產(chǎn)物保持了西尼羅病毒的抗原性(附圖4)。3、純化產(chǎn)物的TEM電鏡觀察
取少量純化產(chǎn)物，經(jīng)磷酸鎢負(fù)染后，TEM(透射電鏡)電鏡下觀察可見(jiàn)到直徑大約50nm 左右，圓形的顆粒物，表面有類(lèi)似刺突樣的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)類(lèi)似天然WNV顆粒(附圖5)。4、 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)鑒定。(1)試劑配制
包被液Na2C03 1.59克，NaHC03 2. 93克，加蒸餾水至1000mL。PBS :ΚΗ2Ρ04 0. M 克，Na2HP04 · 12H20 3· 58 克，NaCl 8· 0 克，KCl 0. 2 克，加蒸溜水至 lOOOmL，pH7. 4。PBST :KH2P04 0. 24 克，Na2HP04 · 12H20 3. 58 克，NaCl 8. 0 克，KCl 0. 2 克，加蒸餾水至lOOOmL，pH7. 4，再加Iml的吐溫-20，用于洗滌。封閉液PBS中加入15%胎牛血清，用于封閉。終止液2M硫酸溶液
(2)操作過(guò)程
1)將初步純化的抗原用ELISA包被液稀釋?zhuān)磻?yīng)板每孔加100ul，4°C冰箱過(guò)夜；
2)倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上， 使孔中洗滌液流盡；
3)加封閉液300ul，37°C放置2h；
4)倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上， 使孔中洗滌液流盡；
5)將西尼羅病毒陽(yáng)性血清和陰性血清用封閉液1:200倍稀釋?zhuān)磻?yīng)板每孔lOOul，同時(shí)作稀釋液對(duì)照，37 °C放置Ih;
6)倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上， 使孔中洗滌液流盡；
7)加辣根過(guò)氧化物酶羊抗人IgG(1:5000倍稀釋)，每孔lOOul，37°C放置0.釙；
8)倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上， 使孔中洗滌液流盡；
9)加底物加TMB100ml，室溫暗處放置15min ；
10)加終止液每孔50ul；
11)觀察結(jié)果用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄450nm讀數(shù)
(3)結(jié)果陽(yáng)性血清OD45tlnm和陰性血清OD45tlnm有明顯的差異。(附圖6)
至此，通過(guò)間接免疫熒光、^festern blotting、TEM電鏡以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)鑒定，表明了西尼羅病毒包膜蛋白(PrM/M，Ε)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)并且在細(xì)胞中自動(dòng)組裝而形成病毒樣顆粒，保持其完整的抗原性及其顆粒形態(tài)，ELISA的結(jié)果說(shuō)明該表達(dá)產(chǎn)物具有開(kāi)發(fā)西尼羅病毒檢測(cè)ELISA試劑盒的潛力。四.人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒的制備、組裝及使用本試劑盒應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的病毒樣顆粒作為包被抗原。1.試劑盒的組分
①ELISA板條每個(gè)試劑盒裝有1塊錫箔真空包裝的ELISA板，每個(gè)ELISA板含有可拆卸的已包被抗原的ELISA板條，包被抗原為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的西尼羅病毒樣顆粒，規(guī)格8孔xl2條
②洗滌液和血清稀釋液洗滌液為10倍濃縮的PH7. 4 PBST溶液100ml，血清稀釋液為含有PH 7.4 PBS，萬(wàn)分之一的硫柳汞和保護(hù)蛋白的溶液100ml.
③酶標(biāo)二抗辣根過(guò)氧化物酶羊抗人IgG使用液，15ml/瓶
④底物顯色液直接使用，15ml/瓶
⑤終止液2molH2S0415ml/瓶
⑥cutoff 血清0. Iml
⑦標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清0.Iml
⑧標(biāo)準(zhǔn)陰性血清0.Iml 2.組分的制備
①抗原的制備
細(xì)胞培養(yǎng)上清10000 rpm離心IOmin去除細(xì)胞碎片，澄清后的上清通過(guò)0. 45um的過(guò)濾器過(guò)濾，濾過(guò)液經(jīng)100KD超濾管濃縮至5ml，樣品做進(jìn)一步的超速離心純化。將樣品轉(zhuǎn)入 Ultra-clear 離心管，50000rpm，3h，4°C，(SW 55Ti 轉(zhuǎn)子)棄去上清，200 ulPBS 重懸。超離心管加入4. 8ml的10%-60%的連續(xù)性蔗糖溶液(離心緩沖液配制，w/w)，頂端加入初步純化的樣品200 ul，30000rpm，2. 5h，4 °C ( Sff 55Ti轉(zhuǎn)子)，從上往下每管400ul收集樣品， 共收集13管。ELISA法確定并收集富含目的蛋白的樣品，將樣品轉(zhuǎn)入U(xiǎn)ltra-clear離心管， 50000rpm,3h,4°C, (Sff 55Ti轉(zhuǎn)子)棄去上清，200 ulPBS重懸，分裝保存。② 陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照與cutoff對(duì)照的制備
將篩選獲得的西尼羅病毒陽(yáng)性血清按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，按萬(wàn)分之一的比例加入硫柳汞，無(wú)菌過(guò)濾，作為陽(yáng)性對(duì)照；將篩選獲得的西尼羅病毒陽(yáng)性血清按1000U/ ml加入青霉素和鏈霉素，按萬(wàn)分之一的比例加入硫柳汞，無(wú)菌過(guò)濾，作為陽(yáng)性對(duì)照；應(yīng)用建立的檢測(cè)人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA方法對(duì)100份已知陰性的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于這些血清數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定一個(gè)能區(qū)分陰性和陽(yáng)性血清的校準(zhǔn)值，這個(gè)校正值即定義為cutoff校正值，接近c(diǎn)utoff校正值的血清作為cutoff血清。將按篩選得到的 cutoff血清，按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，按萬(wàn)分之一的比例加入硫柳汞，無(wú)菌過(guò)濾， 作為cutoff對(duì)照。③試劑配制
1)包被液為pH9. 6 0. 05M碳酸鹽緩沖液(Na2C03 1. 59克，NaHC03 2. 93克，加蒸餾水至1000mL。2)樣品稀釋液為的0. OlM的磷酸緩沖液(KH2P04 0. 24克，Na2HP04 · 12H20 3. 58 克，NaCl 8.0 克，KCl 0. 2 克，加蒸餾水至 lOOOmL，pH7. 4)。3) 10倍濃縮的洗滌液為含0. 1%吐溫-20的0. IM的磷酸緩沖液(KH2P04 2.克，Na2HP04 · 12H20 35. 8 克，NaCl 80 克，KCl 2 克，加蒸溜水至 IOOOmL, ρΗ7· 4，取 990ml 再加 IOml的吐溫-20)
4)封閉液為含15%胎牛血清的0.OlM的磷酸緩沖液(KH2P04 0. M克，Na2HP04 ·12Η20 3. 58 克，NaCl 8. 0 克，KCl 0. 2 克，加蒸餾水至 IOOOmL, ρΗ7· 4，取 850ml 加 150ml 的胎牛血
清)
5)終止液為2M硫酸溶液，即量取111.2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至1000ml。④ELISA檢測(cè)板條的制備
1)將抗原用包被液按一定濃度稀釋后，包被ELISA板，每孔包被100ul，4度包被過(guò)夜。2)將包被了抗原的微孔板用PBST (PBS+0. l%Tween_20)洗滌3次，每次3min，最
后一次拍干。3)用封閉液進(jìn)行封閉，每孔300ul，37度放置池
4)用PBST洗滌3次，室溫晾干，每次3min，最后一次甩干，室溫晾干，真空包裝，4度保存。3.使用
①被檢測(cè)血清、CUtOff血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清都用血清稀釋液作 1 100稀釋后，按酶標(biāo)板加樣模式每孔加入IOOul，37度放置lh，倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
②每反應(yīng)孔加入辣根過(guò)氧化物酶羊抗人IgG使用液，每孔IOOul，37度放置0.證，倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
③每個(gè)顯色孔加顯色底物IOOul，室溫放置15min；
④每個(gè)顯色孔加終止液50ul終止反應(yīng)；
⑤用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光光度值。4. 結(jié)果判定
每板檢測(cè)時(shí)(或同一板的孔條或孔)必須包括CUt-Off校準(zhǔn)樣和兩個(gè)對(duì)照樣，判定結(jié)果以待測(cè)樣本OD45tl值(去除空白OD45tl值)與cutoff OD45tl值(去除空白OD45tl值)比值(P/C)， 大于等于1. 5判定為陽(yáng)性，小于等于1. 3判定為陰性。介于1. 3-1. 5之間為可疑，須重檢， 重檢時(shí)P/C值大于等于1. 5判定為陽(yáng)性，小于等于1. 3判定為陰性。本發(fā)明中所用的診斷抗原為西尼羅病毒樣顆粒，它是由西尼羅病毒包膜蛋白 (PrM/M, Ε)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)并在細(xì)胞中自動(dòng)組裝而形成的空心顆粒，沒(méi)有病毒的核酸，不能自主復(fù)制，而在形態(tài)結(jié)構(gòu)、抗原性等方面具有與原病毒非常相似。與其他免疫診斷抗原相比較①西尼羅病毒樣顆粒在形態(tài)結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)像、抗原性等方面都接近于天然病毒，它既能解決具有病毒抗原表位的合成肽抗原的抗原表位少的問(wèn)題，又能克服基因重組抗原只有線性抗原表位而無(wú)(或者含有很少)構(gòu)象抗原表位的缺陷。②滅活的病毒作為抗原，提取的抗原純度相對(duì)較差，影響測(cè)定的特異性和靈敏性，且存在散毒的危險(xiǎn)，病毒樣顆粒，是空心顆粒，無(wú)核酸，不能自主復(fù)制，不存在散毒的危險(xiǎn)，且能保證測(cè)定的特異性和靈敏性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)于原核表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白最接近，糖基化后加工更準(zhǔn)確。本發(fā)明中所用的診斷抗原是采用基因重組技術(shù)，通過(guò)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)獲得，保證了抗原的特異性和敏感性。
用西尼羅病毒樣顆粒建立ELISA診斷方法，具有操作簡(jiǎn)便、快捷，所需試劑及實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，并具有良好的特異性與敏感性，為西尼羅病毒感染的診斷及免疫評(píng)價(jià)提供了良好的方法。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，該試劑盒內(nèi)設(shè)置有包被西尼羅病毒樣顆粒的可拆96孔酶標(biāo)板，酶結(jié)合物工作液，cutoff血清，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，樣品稀釋液，洗滌液，TMB底物溶液和終止液。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，所述西尼羅病毒樣顆粒是通過(guò)基因重組技術(shù)，以真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)病毒衣殼的蛋白成分，通過(guò)病毒形態(tài)學(xué)和分子免疫學(xué)鑒定，蔗糖梯度離心結(jié)合超速離心純化，獲得西尼羅病毒的VLPs。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液為的0. 01M、pH7. 4的磷酸緩沖液；所述洗滌液為含0. 1%吐溫-20的 0. 1Μ、ρΗ7. 4的磷酸緩沖液，所述終止液為2M硫酸溶液。
4.利用上述試劑盒間接ELISA診斷人西尼羅病毒的方法，其特征在于，該方法具體為1)被檢測(cè)血清、cutoff血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清都用血清稀釋液作 1:100稀釋后，按酶標(biāo)板加樣模式每孔加入IOOul，37度放置Ih ；2)倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置:3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；3)每反應(yīng)孔加入辣根過(guò)氧化物酶羊抗人IgG使用液，每孔100ul，37度放置0.證，倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；4)每個(gè)顯色孔加顯色底物IOOul，室溫放置15min；5)每個(gè)顯色孔加終止液50ul終止反應(yīng)；6)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光光。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法檢測(cè)樣本的判定標(biāo)準(zhǔn)為每板、 或同一板的孔條或孔檢測(cè)時(shí)，必須包括cut-off校準(zhǔn)樣和兩個(gè)對(duì)照樣，判定結(jié)果以待測(cè)樣本OD45tl值與cutoff OD45tl值比值P/C，大于等于1.5判定為陽(yáng)性，小于等于1.3判定為陰性， 介于1. 3-1. 5之間為可疑，須重檢，重檢時(shí)P/C值大于等于1. 5判定為陽(yáng)性，小于等于1. 3 判定為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種檢測(cè)人西尼羅病毒IgG抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測(cè)方法，本發(fā)明應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的西尼羅病毒樣顆粒為包被抗原建立了ELISA方法，由于病毒樣顆粒(VLPs)是含有一個(gè)或多個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒(méi)有病毒的核酸，不能自主復(fù)制，而且具有與天然病毒同樣的構(gòu)象和抗原表位，因此對(duì)人不具有感染性，穩(wěn)定性好，不易失活，有較高的安全性，免疫原性更接近于天然病毒。本發(fā)明為檢測(cè)人西尼羅病毒IgG抗體提供一種安全，特異，敏感，快速，操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)的試劑盒，為預(yù)防和控制西尼羅病毒從國(guó)外輸入我國(guó)方面提供了技術(shù)手段和方法。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102183637SQ20111002642
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者咸慶杰, 平芮巾, 張麗萍, 楊鵬飛, 胡孔新, 郭雪, 馬雪征 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院