專利名稱：一種基因工程單鏈抗體檢測伏馬菌素B₁的試劑盒及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用基因工程單鏈抗體檢測真菌毒素的檢測試劑盒，更具體地涉 及了利用基因工程單鏈抗體檢測伏馬菌素B1 (Fumonisin B1, FB1)的試劑盒，進一步涉及 使用該試劑盒檢測FB1的方法。
背景技術：
伏馬菌素是一種水溶性真菌毒素，在世界上的污染廣泛存在，主要污染糧食作物 及飼料，尤其對玉米及其制品污染嚴重。伏馬菌素的熱穩(wěn)定性高，不易被破壞，對人畜具 有神經(jīng)毒性、肺毒性等多種毒性及致癌性，主要損傷肝臟和腎臟，嚴重危害人類和動物的健 康。目前，用于免疫檢測伏馬菌素的抗體都是單克隆抗體。單克隆抗體的生產(chǎn)采用抗原免疫 動物，然后利用免疫動物的脾細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，最后篩選出具有高 抗體活性而又能大量繁殖的雜交瘤細胞。整個生產(chǎn)過程比較復雜，消耗的時間長、費用高， 尤其是生產(chǎn)過程需要熟練的專業(yè)技術人員進行操作。

發(fā)明內容
為了克服現(xiàn)有單克隆抗體生產(chǎn)費時、費力、費錢的不足，本發(fā)明提供了一種基因工 程單鏈抗體檢測伏馬菌素A的試劑盒及方法，使得伏馬菌素B1的檢測過程簡便易行，省時、 省力、省錢，
本發(fā)明的技術方案如下
本發(fā)明的利用基因工程單鏈抗體檢測真菌毒素的試劑盒，其試劑包括
(1)樣品提取液去離子水；
(2)標準試劑=FB1-KLH；
(3)酶標抗原試劑為含F(xiàn)B1-KLH-HRP偶聯(lián)蛋白的0.OlM PBS溶液，保存于體積比為 50%的甘油內，_20°C保存，效價為5000 ；使用時用PBS溶液稀釋；
(4)洗滌液TNT溶液；配方組份體積比為0.05%的吐溫-20，20mmol/L Tris -HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；
(5)BSA試劑含5% (重量比)BSA的TNT溶液；
(6)顯色底物10ml 顯色液；配方組份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 pH 6. 8 的 1. 0 mol/L iTris-HCl,_20°C保存；使用時加 7 μ L 30% (體積 比)H2O2 ；
(7)終止液去離子水中含0.1 mol / L亞硫酸鈉，2 mol / L硫酸。使用上述利用基因工程單鏈抗體檢測真菌毒素的試劑盒檢測FB1毒素的方法，依 次包括以下步驟
(1)樣品處理在Ig樣品中加入細1樣品提取液，液氮或機械研磨粉碎，超聲萃取、離 心，上清液即為含樣品的提取液；
含樣品的提取液取與酶標抗原試劑等體積混和均勻，即成A試劑；標準試劑取系列濃度分別與酶標抗原試劑等體積混和均勻，即成系列濃度的B試劑； 所述酶標抗原試劑使用時先用PBS溶液稀釋(5毫升PBS溶液中加1 μ L酶標抗原試劑)；
(2)試劑平衡將試劑盒平衡至室溫；
(3)小孔編號取出酶標條放置在反應板上，標記1號孔為陰性孔，2— 6號孔為FB1毒 素標準對照孔，其余孔為樣品孔；酶標條每孔內已經(jīng)有固相化抗FB1毒素單鏈抗體；
(4)洗滌每孔內加入200 300μ L洗滌液，洗滌液不得溢出孔外，放置aiiin后，去掉 洗滌液，在吸水紙上拍干，重復洗滌一次；
(5)加樣1號孔加上50PL BSA試劑，2 — 6號孔分別加入系列濃度的B試劑50 μ L, 樣品孔加入相應的A試劑50 μ L，輕輕震蕩，使各孔混勻；
(6)反應將反應板放入37°C恒溫箱中孵育30 min ；
(7)洗滌取出反應板，去掉反應液，拍干；每孔加入200 300μ L洗滌液，洗滌液不得 溢出，放置2 min后，去掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復洗滌4次；
(8)顯色每孔加入顯色底物100μ L，搖勻，將反應板放入37 °C恒溫箱中存放15
min ；
(9)終止與儀器測定每孔分別加入終止液50μ L，然后用酶標儀在450 nm處測定各 孔的吸光值A，以B試劑的系列濃度為橫坐標，以其相應的吸光值A為縱坐標繪制標準曲線， 根據(jù)標準曲線得到樣品中TO1的濃度，根據(jù)計算公式FB1含量(yg/g) =C*V / m，其中C-FB1的濃度，μ g/mL ；V-樣品提取液的體積，mL ；m-樣品質量，g ；計算樣品中FB1的含量。其中所述抗FB1毒素單鏈抗體制備方法如下所述抗FB1單鏈抗體的制備方法如 下使用Trizol試劑盒從免疫小鼠的脾臟中提取總RNA，反轉錄成cDNA，經(jīng)PCR擴增cDNA 的重鏈可變區(qū)Vh基因和輕鏈可變區(qū)Vl基因，PCR擴增程序為94°C 5 min -MV 45s, 55°C 45s, 72°C 45s，33循環(huán)；72°C延伸10 min;然后1 %的瓊脂糖凝膠電泳，驗證PCR擴增產(chǎn) 物；由于PCR產(chǎn)物均只有一條帶，回收V1^Pt的PCR產(chǎn)物。通過一段連接肽(Linker，Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser)將 Vh 和 Vl 連接成單鏈抗 體(scFv)，形成單鏈抗體，然后將其克隆到載體(pCANTAB 5E)上構建噬菌體抗體文庫，再 通過生物淘選以獲得對FB1毒素具高親和力的抗FB1毒素單鏈抗體。所述抗FB1毒素單鏈 抗體的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。本發(fā)明提供了一種基因工程單鏈抗體，其結構如圖1所示。該單鏈抗體(scFv)是 用基因工程方法將345 bp的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)和325 bp的輕鏈可變區(qū)通過一段連 接肽(Linker)連接而成的重組蛋白；如圖2所示抗FB1單鏈抗體(scFv)的大小為750 bp ； 該單鏈抗體(scFv)保持了親本抗體的抗原親和活性和特異性的最小功能性抗體片段，可在 細菌中大規(guī)模經(jīng)濟生產(chǎn)，使得用于免疫檢測的抗體生產(chǎn)簡便和經(jīng)濟，大大減少了診斷試劑 的費用。本發(fā)明試劑盒的最小檢出量為0.5mg/Kg。本發(fā)明的顯著優(yōu)點
本發(fā)明的試劑盒中采用的抗FB1毒素單鏈抗體可以在大腸桿菌中高效表達，并可大規(guī) 模生產(chǎn)，制備過程簡便易行，省時省力省錢。利用本發(fā)明的試劑盒檢測FB1毒素，在1.5-2 h時間內即可確定樣品是否受FB1毒素污染，以及所含F(xiàn)B1毒素的量，使用方便快捷，成本低 廉
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圖1是本發(fā)明的單鏈抗體結構示意圖； 圖2是本發(fā)明的單鏈抗體基因scFv擴增的電泳圖； 圖3是本發(fā)明的單鏈抗體競爭ELISA檢測曲線圖。
具體實施例方式以下為本發(fā)明的具體實例，進一步描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此。實施例1
按以下試劑制作利用基因工程單鏈抗體檢測FB1毒素的試劑盒
(1)樣品提取液去離子水；
(2)FB1-KLH 標準試劑分別為含 1,2,4,8,16 μ g/mL 的 FB1-KLH 樣品；
(3)酶標抗原試劑為含F(xiàn)B1-KLH-HRP偶聯(lián)蛋白的0.OlM PBS溶液，保存于體積比50% 的甘油內，_20°C保存，效價為5000 ；使用時用PBS溶液稀釋；
(4)洗滌液TNT溶液；配方組份體積比為0.05%吐溫-20，20mmol/L Tris — HCl， 150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；
(5)BSA試劑含5% BSA的TNT溶液；
(6)顯色底物10ml 顯色液；配方組份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 1. 0 mol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，_20°C保存；使用時加 7 μ L 30% H2O2 ；
(7)終止液去離子水中含0.1 mol / L亞硫酸鈉，2 mol / L硫酸。根據(jù)上述試劑盒按以下程序檢測FB1
(1)樣品處理在Ig樣品(大米、小麥、玉米或花生的整個果實、種子或其經(jīng)過深加工 的產(chǎn)品)中加入細1樣品提取液，液氮或機械研磨粉碎，超聲萃取10 min，5000rpm，離心10 min，上清液即為含樣品的樣品提取液；
含樣品的樣品提取液取100 μ 1與100 μ 1酶標抗原試劑混和均勻，即成A試劑； 系列濃度的FB1-KLH標準試劑1，2，4，8，16 μ g/mL各100 μ L分別與100 μ L酶標 抗原試劑混和均勻，即成系列濃度的B試劑；酶標抗原試劑使用時先用PBS試劑稀釋(5毫 升PBS溶液中加1 μ L酶標抗原試劑)；
(2)試劑平衡將試劑盒自-20°C冰箱取出，放置15min以上，平衡至室溫；
(3)小孔編號根據(jù)需要取出酶標條放置在反應板支架上。1號孔為陰性孔，2— 6號孔 為FB1-KLH標準對照孔，其余孔為樣品孔；酶標條每孔內已經(jīng)有固相化抗FB1單鏈抗體；所 述抗FB1單鏈抗體制備步驟為從免疫小鼠的脾臟中提取總RNA，經(jīng)反轉錄成cDNA，經(jīng)PCR擴 增抗體重鏈可變區(qū)Vh基因和輕鏈可變區(qū)\基因，通過一段連接肽(Linker)把Vh和\連接 成單鏈抗體(scFv)，然后克隆到載體上構建噬菌體抗體文庫，再通過生物淘選以獲得對FB1 具高親和力的單鏈抗體。(4)洗滌每孔加入250 μ L洗滌液，洗液不得溢出，放置^iiin后，去掉洗滌液，在 吸水紙上拍干，重復洗板一次；
(5)加樣1號孔加上50PL BSA試劑，2 — 6號孔分別加入系列濃度的B試劑50 μ L, 樣品孔加入相應的A試劑50 μ L，輕輕震蕩，使各孔混勻；
(6)反應將反應板放入37°C恒溫箱中孵育30 min ；
(7)洗滌取出反應板，去掉反應液，拍干。每孔加入250μ L洗滌液，洗液不得溢出，放置2 min后，去掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復洗板4次；
(8)顯色每孔加入顯色底物100μ L，搖勻，將反應板放入37 °C恒溫箱中存放15
min ；
(9)終止與儀器測定每孔分別加入終止液50μ L，然后用酶標儀在450 nm處測定各 孔的吸光值A，以B試劑的系列濃度為橫坐標，以其相應的吸光值A為縱坐標繪制標準曲線。通過抗FB1單鏈抗體上的E-tag將抗FB1單鏈抗體與固定于酶標板上的抗E_tag 抗體結合，形成固相抗體；加入待測樣品和酶標抗原試劑，樣品中的抗原和酶標抗原競爭與 固相抗體結合，待測樣品中抗原含量越高，則與固相抗體結合的越多，使得酶標抗原與固相 抗體結合的機會就越少，甚至沒有機會結合，這樣加入底物后就不顯色或顯色很淺，顯色深 者為陰性。如表1所示，隨著所加入的標準濃度FB1-KLH的濃度的逐步升高，相對應的吸光 值OD值逐步減少。根據(jù)此數(shù)據(jù)繪制的FB1-KLH標準濃度曲線如圖3所示，0D450 nm處吸光 值與待測樣品的濃度呈反比關系，因此根據(jù)待測樣品的0D450 nm處吸光值就可判斷樣品中 含有的FB1的濃度。根據(jù)計算公式樣品中FB1含量(μ g/g) =C*V / m，其中C-樣品中FB1W濃度，μ g/ mL ；V-樣品提取液的體積，mL ；m-樣品質量，g ；計算樣品中FB1的含量。當吸光值為1. 363 時，卩81含量1*4 /1=4 μ g/go
表1本發(fā)明的單鏈抗體的競爭ELISA檢測的吸光值
權利要求
1.一種基因工程單鏈抗體檢測伏馬菌素B1的試劑盒，其特征在于其試劑包括(1)樣品提取液去離子水；(2)標準試劑=FB1-KLH；(3)酶標抗原試劑為含F(xiàn)B1-KLH-HRP偶聯(lián)蛋白的0.OlM PBS溶液，保存于體積比為 50%的甘油內，_20°C保存，效價為5000 ；使用時用PBS溶液稀釋；(4)洗滌液TNT溶液；配方組份體積比為0.05%的吐溫-20，20mmol/L Tris -HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；(5)BSA試劑含5% (重量比)BSA的TNT溶液；(6)顯色底物10ml 顯色液；配方組份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 pH 6. 8 的 1. 0 mol/L iTris-HCl，_20°C保存；使用時加 7 μ L 30% (體積 比)H2O2 ；(7)終止液去離子水中含0.1 mol / L亞硫酸鈉，2 mol / L硫酸。
2.一種使用基因工程單鏈抗體檢測伏馬菌素B1的試劑盒的方法，其特征在于依次包 括以下步驟(1)樣品處理在Ig樣品中加入細1樣品提取液，液氮或機械研磨粉碎，超聲萃取、離 心，上清液即為含樣品的提取液；含樣品的提取液取與酶標抗原試劑等體積混和均勻，即成A試劑；標準試劑取系列濃度分別與酶標抗原試劑等體積混和均勻，即成系列濃 度的B試劑；所述酶標抗原試劑使用時先用PBS溶液稀釋；(2)試劑平衡將試劑盒平衡至室溫；(3)小孔編號取出酶標條放置在反應板上，標記1號孔為陰性孔，2— 6號孔為FB1毒 素標準對照孔，其余孔為樣品孔；酶標條每孔內已經(jīng)有固相化抗FB1毒素單鏈抗體；(4)洗滌每孔內加入200 300μ L洗滌液，洗滌液不得溢出孔外，放置aiiin后，去掉 洗滌液，在吸水紙上拍干，重復洗滌一次；(5)加樣1號孔加上50PL BSA試劑，2 — 6號孔分別加入系列濃度的B試劑50 μ L, 樣品孔加入相應的A試劑50 μ L，輕輕震蕩，使各孔混勻；(6)反應將反應板放入37°C恒溫箱中孵育30 min ；(7)洗滌取出反應板，去掉反應液，拍干；每孔加入200 300μ L洗滌液，洗滌液不得 溢出，放置2 min后，去掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復洗滌4次；(8)顯色每孔加入顯色底物100μ L，搖勻，將反應板放入37 °C恒溫箱中存放15min ；(9)終止與儀器測定每孔分別加入終止液50μ L，然后用酶標儀在450 nm處測定各 孔的吸光值A，以B試劑的系列濃度為橫坐標，以其相應的吸光值A為縱坐標繪制標準曲線， 根據(jù)標準曲線得到樣品中TO1的濃度，根據(jù)計算公式FB1含量(yg/g) =C*V / m，其中C-FB1的濃度，μ g/mL ；V-樣品提取液的體積，mL ；m-樣品質量，g ；計算樣品中FB1的含量。
3.根據(jù)權利要求2所述使用基因工程單鏈抗體檢測伏馬菌素B1的試劑盒的方法，其特 征在于步驟(3)所述抗FB1毒素單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基因工程單鏈抗體檢測伏馬菌素B1的試劑盒及方法，本發(fā)明的試劑盒中，其試劑包括樣品提取液、標準試劑、酶標抗原試劑、洗滌液、BSA試劑、顯色底物、終止液。通過樣品處理、試劑平衡、洗滌、加樣、洗滌、顯色、終止，計算樣品中FB1毒素的含量。本發(fā)明的試劑盒中采用的抗伏馬菌素B1單鏈抗體可以在大腸桿菌中高效表達，并可大規(guī)模生產(chǎn)，制備過程簡便易行，省時省力省錢。利用本發(fā)明的試劑盒檢測伏馬菌素B1，在1.5-2h內即可確定樣品是否受伏馬菌素B1污染，以及計算所含伏馬菌素B1的量，使用方便快捷，成本低廉。
文檔編號G01N33/543GK102095850SQ20111002705
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權日2011年1月26日
發(fā)明者劉曉雷, 莊振宏, 楊燕凌, 林玲, 汪世華, 袁軍, 高媛媛 申請人:福建農(nóng)林大學