專利名稱：牛結(jié)核病抗原特異性γ-干擾素ELISA試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別地，涉及牛分枝桿菌ΜΡΒ83、ΜΡΒ70，結(jié)核分枝桿菌 ESAT6和CFPlO四種重組蛋白克隆、表達和純化，四種蛋白作為診斷抗原多重組合最佳濃度的確定，牛IFN-γ重組蛋白表達，其單克隆抗體制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)實驗(Tuberculin skin test, TST) 一直被用于牛結(jié)核病的檢測，但其敏感性低、特異性差、難以檢測早期牛結(jié)核感染。IFN-Y作為Thl型細胞免疫效應(yīng)的主要指征在牛結(jié)核分枝桿菌感染早期分泌水平顯著升高，這為開發(fā)早期牛結(jié)核病的有效檢測試劑指明了方向。國內(nèi)有關(guān)牛γ -干擾素單克隆抗體制備及牛結(jié)核病夾心ELISA檢測方法的建立有研究報道，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的徐賢坤博士采用rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白來孵育刺激全血IFN-γ釋放，建立了水牛結(jié)核病夾心ELISA檢測方法。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)對抗牛IFN-Y單克隆抗體制備及ELISA檢測方法的建立進行研究；揚州大學(xué)建立了牛γ干擾素抗原捕獲 ELISA檢測方法，并且利用抗牛γ干擾素特異性的抗體，建立了競爭抑制ELISA方法和膠體金試紙條檢測牛Y干擾素。其申請的試劑盒專利是通過全血培養(yǎng)、牛分枝桿菌抗原PPD 作為刺激物，利用牛Y干擾素特異性抗體檢測全血培養(yǎng)中釋放出的Y干擾素，從而對牛結(jié)核病進行診斷。從這些報道或?qū)＠梢钥闯觯镜脑硎且粯拥?，都采用牛Y干擾素特異性抗體檢測全血培養(yǎng)中釋放出的Y干擾素，對牛結(jié)核病進行診斷。但四川農(nóng)業(yè)大學(xué)采用 rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白這種方法，結(jié)核分枝桿菌可以分泌CFP10/ESAT6，牛分枝桿菌缺失這些蛋白的基因，臨床無法檢測牛分枝桿菌感染，靈敏性有待提高。揚州大學(xué)建立的牛 Y干擾素抗原捕獲ELISA檢測方法，采用牛分枝桿菌抗原PPD作為刺激物，臨床診斷中難以與禽分支桿菌等環(huán)境分支桿菌感染區(qū)分開，特異性差。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述不足，本發(fā)明旨在提供一種牛結(jié)核病抗原特異性Y -干擾素ELISA試劑盒及其檢測方法，其檢測的特異性和敏感性好，而且操作方便。本發(fā)明第一個目的在于牛結(jié)核病抗原特異性Y-干擾素ELISA試劑盒，其包括(1)包被牛Y干擾素單克隆抗體的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記牛Y干擾素單克隆抗體；(3)含有牛分枝桿菌ΜΡΒ83、ΜΡΒ70，結(jié)核分枝桿菌ESAT6和CFPlO四種重組蛋白的蛋白液；其中，包被在酶標(biāo)板的牛Y干擾素單克隆抗體與酶標(biāo)記牛Y干擾素單克隆抗體分別針對牛Y干擾素不同的抗原表位。本發(fā)明從牛淋巴細胞中克隆出了牛Y干擾素的CDNA，構(gòu)建到原核表達載體中，體外表達并純化出牛 干擾素重組蛋白。以牛 干擾素重組蛋白為免疫抗原制備牛 干擾素單克隆抗體，篩選出9株單克隆抗體能識別牛IFN-Y重組蛋白的2個不同表位，進一步篩選出分別識別2個不同表位的單克隆抗體代表株，所述的2個不同表位的單克隆抗體代表株上清效價較高。在本發(fā)明實施例中，所述含有牛分枝桿菌MPB83、MPB70，結(jié)核分枝桿菌ESAT6和 CFPlO的蛋白液的濃度優(yōu)選為3 μ g/ml，其中，MPB83、MPB70、ESAT6和CFPlO的質(zhì)量比優(yōu)選為 1 1 1 1。根據(jù)本發(fā)明，所述的酶標(biāo)記牛Y干擾素單克隆抗體的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶。本發(fā)明提供的試劑盒還可進一步包括以下試劑中的一種或多種洗滌液、二抗稀釋液、底物顯色液、終止液。本發(fā)明另一個目的在于提供應(yīng)用所述的試劑盒進行牛Y干擾素ELISA檢測的方法，其包括如下步驟1)用所述的MPB83、MPB70、ESAT6和CFPlO蛋白液刺激所采集的待測牛的血液， 37°C培養(yǎng)16 Mh，收集上清；2)包被將單克隆抗體用包被液稀釋為1.(^8/!1^，10(^17孔，41放置過夜，取出后用PBST洗滌3次，3min/次；3)封閉用5%小牛血清封閉，100 μ L/孔，于37°C放置Ih;封閉后，用PBST洗滌 3 次，3min/次；4)加樣將步驟1)制備的檢測樣品與陰陽性對照分別按1 2稀釋，100 μ L/孔， 37°C反應(yīng)60min ；反應(yīng)完畢后，用PBST洗滌3次，3min/次；5)加酶標(biāo)記單抗將識別的抗原表位與步驟2、中包被的單克隆抗體所識別的抗原表位不同的酶標(biāo)單克隆抗體用稀釋液稀釋成2. 5 μ g/mL, 100 μ L/孔，37。C反應(yīng)45min ；反應(yīng)完畢后，用PBST洗滌3次，3min/次；6)顯色加入新鮮配制的TMB底物，100 μ L/孔，37°C反應(yīng)15min ；7)終止底物反應(yīng)完后，加入終止液，每孔加入50 μ L 2M的硫酸終止；8)測值于酶標(biāo)儀上讀數(shù)，測定各孔0D450nm值，并判定結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)點主要體現(xiàn)在以下幾個方面1)使用牛分枝桿菌MPB83、MPB70,結(jié)核分枝桿菌ESAT6和CFPlO作為牛血液淋巴細胞的刺激原，確定了刺激的最佳濃度，提高Y-干擾素ELISA檢測牛結(jié)核病方法的特異性和敏感性。MPB83，MPB70是牛分枝桿菌培養(yǎng)早期分泌物中的重要蛋白，在體內(nèi)引發(fā)細胞免疫，具有較強免疫原性和免疫保護性。ESAT6和CFPlO的編碼基因都位于1號缺失區(qū)域 (RDl)，是結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，因此，與PPD相比，以RDl抗原結(jié)合牛分支桿菌特異性抗原作為檢測抗原，IFN-Y試驗具有更高的特異性。而且以多種抗原組合作為檢測抗原， 可以克服使用單一抗原以提高檢測特異性的同時，會犧牲一部分檢測的靈敏度這個缺陷， 達到更高的精確度，從而成為一種強有力的結(jié)核病的診斷工具。2)建立了用ELISA方法檢測牛血液淋巴細胞釋放Y-干擾素含量的方法。確定了牛結(jié)核病抗原特異性Y -干擾素ELISA方法中最佳包被抗體的包被量、包被時間和包被方法，最佳酶標(biāo)抗體的作用時間。3)由試驗中所用的牛分枝桿菌MPB83、MPB70,結(jié)核分枝桿菌ESAT6和CFPlO建立的牛結(jié)核病抗原特異性Y -干擾素ELISA檢測方法比較穩(wěn)定，其特異性為96 %，敏感性為88. 6%。


圖 1 為 CFP-10、ESAT-6、MPB70 和 MPB83 基因的 PCR 擴增，其中 A CFP-10 基因的 PCR擴增，B為ESAT-6基因的PCR擴增，C為MPB70基因的PCR擴增，D為MPB83基因的PCR 擴增，其中1為各自的PCR產(chǎn)物，M為DNA Marker DL2000。圖2為重組質(zhì)粒pET30a-CFP-10的酶切鑒定，其中1 2為重組質(zhì)粒 pET30a-CFP-10 的雙酶切鑒定；M 為 DNAMarker DL2000。圖3為重組質(zhì)粒pET30a_MPB83的酶切鑒定，其中1 2為重組質(zhì)粒pET30a_MPB83 的雙酶切鑒定；M為DNAMarker DL2000。圖4為重組表達質(zhì)粒pET30a-MPB70的雙酶切鑒定，其中1 2為重組質(zhì)粒 pET30a-MPB70 的雙酶切鑒定；M 為 DNA MarkerDL2000。圖5為重組質(zhì)粒pET30a-ESAT6的酶切鑒定，其中1 2為重組質(zhì)粒pET30a_ESAT6 的雙酶切鑒定；M為DNAMarker DL2000。圖 6 為重組蛋白 CFPlO 的 SDS-PAGE 分析,其中，1-4. pET30a_CFP10/BL21 (DE3)誘導(dǎo)后4小時菌體蛋白；5-6. pET30a-CFP10/BL21 (DE3)誘導(dǎo)前0小時菌體蛋白；7. pET_30a/ BL21的菌體蛋白；M 低分子量蛋白Marker。圖7為重組蛋白MPB83的SDS-PAGE分析，其中，1 :pET_30a/BL21的菌體蛋白；2 pET-30a/BL21 (DE3)誘導(dǎo)后 4 小時；M 低分子量蛋白 Marker ；3 :pET30a_MPB83/BL21 (DE3) 誘導(dǎo)前0小時菌體蛋白；4 :pET30a-MPB83/BL21 (DE3)誘導(dǎo)后4小時菌體蛋白。圖 8 為重組蛋白 MPB70 的 SDS-PAGE 分析，其中，1、2、3 :PET30a_MPB70/BL21 (DE3) 誘導(dǎo)后4h菌體蛋白；4 :PET30a-MPB70/BL21(DE;3)誘導(dǎo)前Oh菌體蛋白；M 低分子量蛋白 Marker0圖9為重組蛋白ESAT6的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白Marker ； 1禾口 2 為 pET30a-ESAT6/BL21 (DE3)誘導(dǎo) 4 小時菌體蛋白；3 :pET30a_ESAT6/BL21 (DE3)誘導(dǎo) 2 小時菌體蛋白；4 :pET30a-ESAT6/BL21 (DE3)誘導(dǎo)0小時菌體蛋白；5 :pET30a/BL21 (DE3)誘導(dǎo) 2小時菌體蛋白。圖10為重組蛋白CFPlO純化后SDS-PAGE分析，其中，M為低分子質(zhì)量蛋白預(yù)染 Marker ；1為純化的重組蛋白。圖11為重組蛋白MPB70純化后SDS-PAGE分析，其中M為低分子質(zhì)量蛋白預(yù)染 Marker ；1為包含體裂解后上清；2純化的重組蛋白。圖12為重組蛋白MPB83純化后SDS-PAGE分析，其中，M為低分子質(zhì)量蛋白Marker ； 1 3為純化的重組蛋白。圖13為重組蛋白ESAT6純化后SDS-PAGE分析，其中，M為低分子質(zhì)量蛋白Marker ； 1 2為純化的重組蛋白。圖 14 為牛 IFN-Y 基因的 PCR 擴增，其中，M :DNA MarkerDL2000 ；1、2. PCR 產(chǎn)物。圖 15 為牛 pET 30-IFN-γPCR鑒定結(jié)果，其中，M:DNA MarkerDL2000 ；1、2、3、4、5 PCR產(chǎn)物。圖16為牛IFN-Y重組蛋白表達結(jié)果，其中，1 空白對照；M 低分子蛋白Marker ；2 :37°C誘導(dǎo)表達；3 :18°C誘導(dǎo)表達。圖17為牛IFN-Y重組蛋白純化結(jié)果，其中，1 純化結(jié)果；M 低分子蛋白Marker ； 2:空白組；3:純化前誘導(dǎo)表達。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1基因工程菌的構(gòu)建根據(jù)已發(fā)表的牛分枝桿菌MPB83、MPB70 ；結(jié)核分枝桿菌ESAT6、CFPlO基因序列設(shè)計特異性引物。引物序列如SEQ ID No. 1 8所示表1擴增MPB83、MPB70、ESAT6、CFPlO基因的引物序列
權(quán)利要求
1.牛結(jié)核病抗原特異性Y-干擾素ELISA試劑盒，其包括1)包被牛Y干擾素單克隆抗體的酶標(biāo)板；2)酶標(biāo)記牛Y干擾素單克隆抗體；3)含有牛分枝桿菌MPB83、MPB70,結(jié)核分枝桿菌ESAT6和CFPlO的蛋白液；其中，包被在酶標(biāo)板的牛Y干擾素單克隆抗體與酶標(biāo)記牛Y干擾素單克隆抗體分別針對牛Y干擾素不同的抗原表位。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其還包括以下試劑中的一種或多種洗滌液、二抗稀釋液、底物顯色液、終止液。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的含有牛分枝桿菌MPB83、 MPB70，結(jié)核分枝桿菌ESAT6和CFPlO的蛋白液的濃度為3 μ g/ml。
4.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的牛分枝桿菌MPB83、MPB70, 結(jié)核分枝桿菌ESAT6和CFPlO的蛋白液中MPB83、MPB70、ESAT6和CFPlO的質(zhì)量比為 1:1:1:1。
5.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶標(biāo)記牛γ干擾素單克隆抗體的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶。
6.權(quán)利要求1 5任一項所述的試劑盒在牛γ干擾素檢測中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟1)用所述的MPB83、MPB70、ESAT6和CFPlO蛋白液刺激所采集的待測牛的血液，37°C培養(yǎng)16 Mh，收集上清；2)包被將單克隆抗體用包被液稀釋為1.0yg/mL，100yL/孔，4°C放置過夜，取出后用PBST洗滌3次，3min/次；3)封閉用5%小牛血清封閉，100μ L/孔，于37°C放置Ih ；封閉后，用PBST洗滌3次， 3min/ 次；4)加樣將步驟1)制備的檢測樣品與陰陽性對照分別按1 2稀釋，100yL/^L，37°C 反應(yīng)60min ；反應(yīng)完畢后，用PBST洗滌3次，3min/次；5)加酶標(biāo)記單抗將識別的抗原表位與步驟2)中包被的單克隆抗體所識別的抗原表位不同的酶標(biāo)單克隆抗體用稀釋液稀釋成2.5 μ g/mL，100 μ L/孔，37°C反應(yīng)45min ；反應(yīng)完畢后，用PBST洗滌3次，3min/次；6)顯色加入新鮮配制的TMB底物，100μ L/孔，37°C反應(yīng)15min ；7)終止底物反應(yīng)完后，加入終止液，每孔加入50μL 2M的硫酸終止；8)測值于酶標(biāo)儀上讀數(shù)，測定各孔0D450nm值，并判定結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供一種牛結(jié)核病抗原特異性γ-干擾素ELISA試劑盒，其包括包被牛γ干擾素單克隆抗體的酶標(biāo)板；酶標(biāo)記牛γ干擾素單克隆抗體；含有牛分枝桿菌MPB83、MPB70，結(jié)核分枝桿菌ESAT6和CFP10的蛋白液。捕獲抗體和檢測抗體分別針對γ-干擾素不同的抗原表面。本發(fā)明用牛分枝桿菌重組蛋白MPB83，MPB70和結(jié)核分枝桿菌重組蛋白ESAT6和CFP10，建立的牛結(jié)核病抗原特異性γ-干擾素ELISA檢測方法比較穩(wěn)定，其特異性為96％，敏感性為88.6％，大大提高γ-干擾素ELISA檢測牛結(jié)核病方法的特異性和敏感性。
文檔編號G01N33/535GK102183649SQ20111003419
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月31日
發(fā)明者周向梅, 尹曉敏, 張奧, 李麗好, 李澤盛, 楊利峰, 楊楊, 王志剛, 王洋, 趙德明, 邵安文, 魯龍翔 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)