專利名稱：一種用于卷煙接裝紙生物學(xué)評價的中性紅細胞毒性試驗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于卷煙接裝紙生物學(xué)評價的中性紅細胞毒性試驗方法，屬煙草技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
卷煙接裝紙雖不參加燃燒，但是卻直接與消費者口腔接觸。目前，對卷煙接裝紙的關(guān)注主要集中于對其物理指標、微生物指標、重金屬和品質(zhì)指標的規(guī)范[1 2]。隨著減害降焦的不斷深入，新型卷煙接裝紙不斷出現(xiàn)，需要深入開展卷煙接裝紙安全性研究，從而為卷煙材料監(jiān)管提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支撐。用于卷煙接裝紙生物學(xué)評價的樣品制備方法，雖然不是安全性評價工作的核心， 但卻是所有分析檢測工作最初的一步。準確模擬實際暴露條件，制備卷煙接裝紙在人工唾液中的遷移樣品是影響后續(xù)安全性評價客觀性、準確性及可靠性的關(guān)鍵因素和基本前提。迄今為止，在國內(nèi)外未見模擬卷煙接裝紙與口腔接觸的實際狀況，進行接裝紙生物學(xué)評價的中性紅細胞毒性試驗方法的公開報道。參考文獻[1]中華人民共和國煙草行業(yè)標準YC 170-2002《煙用接裝紙原紙》.[2]中華人民共和國煙草行業(yè)標準YC 171-2002《煙用接裝紙》.[3]宋瑜冰，宗永立，馬驥，李鵬，張杰，彭書海.一種測定無煙氣煙草制品中非極性或弱極性香味成分釋放率的方法.專利申請?zhí)?00910227274. 3.[4]中華人民共和國國家標準GB/T 16886. 15-2003/IS0 10993-15 :2000《醫(yī)療器
械生物學(xué)評價第15部分金屬與合金降解產(chǎn)物的定性與定量》.[5]毛友安，李軍，古君品，劉巍，鐘科軍，魏萬之.模擬人體口腔對吸煙過程中主流煙氣吸收的裝置.專利申請?zhí)?00910226704. X.[6]李雪梅，曾曉鷹，崔楊，楊葉昆，者為，段焰青，耿永勤，王明峰.一種全煙氣捕集及其PH值測定的方法·專利申請?zhí)?01010123588. 1.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡便、實用的用于卷煙接裝紙生物學(xué)評價的中性紅細胞毒性試驗方法。用于卷煙接裝紙生物學(xué)評價的中性紅細胞毒性試驗方法，其特征在于用于卷煙接裝紙生物學(xué)評價的中性紅細胞毒性試驗方法的具體步驟如下a.采用中華人民共和國國家標準GB/T 16886. 15-2003/IS0 10993-15:2000《醫(yī)
療器械生物學(xué)評價第15部分金屬與合金降解產(chǎn)物的定性與定量》規(guī)定的人工唾液作為卷煙接裝紙的浸提液；b.量取一定面積(如量取卷煙接裝紙600cmX6cm，相當于500支卷煙的接裝紙用量；量取300CmX6Cm，相當于250支卷煙的接裝紙用量；量取卷煙接裝紙240cmX6cm，相當于200支卷煙的接裝紙用量；量取卷煙接裝紙120cmX6cm，相當于100支卷煙的接裝紙用量；量取60cmX6cm，相當于50支卷煙的接裝紙用量)的卷煙接裝紙，剪成lcmX6cm的條狀，置于具有磨口塞的50 250mL錐形瓶中備用；c.按照接裝紙面積/浸提液比例為M 36cm2/mL向裝有接裝紙的錐形瓶中注入浸提液，接裝紙全部浸入后蓋好塞子；d.模擬實際暴露條件，設(shè)置浸提溫度為37士 1°C ；e.將該錐形瓶置于37士 1°C的水浴震蕩器中震蕩浸提5 180min，得到樣品原液；f.將e步驟得到的樣品原液進行中性紅細胞毒性試驗，即將生長良好的中國倉鼠卵巢細胞系接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔IX IO4個細胞，置于條件設(shè)置為37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育Mh;棄掉培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入不同劑量的樣品原液，每mL培養(yǎng)基中受試樣品原液的劑量依次為l、5、10、25、50、100、200、300、500mg，繼續(xù)孵育24h，每一組劑量做6孔平行；棄掉培養(yǎng)板中的溶液，按100 μ g/mL加入中性紅溶液，每孔200 μ L，置于培養(yǎng)箱中孵育池；棄掉培養(yǎng)板中的溶液，加入(ν/ν)甲醛溶液，每孔200 μ L，固定1 2min ；棄掉甲醛溶液，加入(ν/ν)酸性乙醇溶液，酸性乙醇溶液為冰醋酸無水乙醇 水=1 50 49，每孔200 μ L，置于微板振蕩器內(nèi)震蕩IOmin ；在酶標儀上測定MOnm波長的每孔吸收值，試驗重復(fù)兩次；g.根據(jù)中性紅細胞毒性試驗結(jié)果評價卷煙接裝紙的安全性。本發(fā)明的優(yōu)點在于能有效模擬抽吸卷煙時接裝紙與口腔接觸的實際狀況制備樣品，所選擇的用于中性紅細胞毒性試驗的樣品原液劑量范圍合適，方法實用、簡便。


附圖為用于卷煙接裝紙生物學(xué)評價的中性紅細胞毒性試驗方法技術(shù)路線圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細描述，但并不限制本發(fā)明。實例一用于HH卷煙接裝紙評價1實驗部分1. 1主要儀器與試劑Series II CO2培養(yǎng)箱(ThermoR)rma公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；酶標儀(Bio-Rad公司)；96孔細胞培養(yǎng)板(Corning公司)；細胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)。DMEM(Dulbecco' s modification of Eagle' s medium, Solarbio ^ 司)；胎牛血清(Clark公司)；磷酸緩沖液(CMF-PBS，Solarbio公司)；胰蛋白酶(Solarbio 公司)；中性紅染料(Sigma公司)；青霉素-鏈霉素(Solarbio公司)；甲醛；乙醇；冰醋酸； 有機溶劑均為分析純。細胞培養(yǎng)基的配制是DMEM培養(yǎng)基中加入10% (ν/ν)胎牛血清和100單位/mL的青霉素-鏈霉素。中性紅溶液是用DMEM培養(yǎng)基配制，濃度為100 μ g/mL。酸性乙醇溶液是按體積比，冰醋酸無水乙醇水=1 50 49配制。
1. 2受試細胞中國倉鼠卵巢細胞系(Chinese hamster ovary cell line, CHO細胞)購自中國科學(xué)院昆明動物所細胞庫。1.3樣品制備參照中華人民共和國國家標準GB/T 16886. 15-2003/IS0 10993-15 :2000《醫(yī)療器
械生物學(xué)評價第15部分金屬與合金降解產(chǎn)物的定性與定量》規(guī)定的人工唾液制備方法， 配制與口腔接觸的卷煙接裝紙的浸提液。量取HH卷煙接裝紙600cmX6cm(相當于500支卷煙的接裝紙用量)，剪成約 IcmX 6cm細條狀，置于具磨口塞的250mL錐形瓶中。往裝有HH卷煙接裝紙的錐形瓶中注入配制好的人工唾液IOOmL,致使接裝紙條全部浸入(接裝紙面積/浸提液的比例為36cm2/ mL，相當于用ImL浸提液浸提5支卷煙的接裝紙)，蓋好塞子。模擬實際暴露條件，設(shè)置浸提溫度為37士 VC ；根據(jù)中華人民共和國煙草行業(yè)標準《煙用接裝紙原紙》(YC 170-2002)及 《煙用接裝紙》(YC 171-2002)中規(guī)定的褪色浸泡時間，設(shè)置浸提時間為池。將該錐形瓶置于37士 1°C的水浴震蕩器中震蕩浸提2h (震蕩速度200r/min)，制備接裝紙樣品原液。1. 4試驗方法試驗時，將生長良好的中國倉鼠卵巢細胞系接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔 1 X IO4個細胞，置于培養(yǎng)箱(37 士 1 °C，5 % CO2)中孵育Mh ；棄掉培養(yǎng)板中的溶液，加入不同劑量的樣品原液，每mL細胞培養(yǎng)基中受試樣品原液的劑量依次是1、5、10、25、50、100、200、 300、500mg，繼續(xù)孵育Mh，每一組劑量做6孔平行；棄掉培養(yǎng)板中的溶液，加入中性紅溶液， 每孔200 μ L，置于培養(yǎng)箱中孵育池；棄掉培養(yǎng)板中的溶液，加入(ν/ν)甲醛溶液，每孔 20(^1^固定1 &^11;棄掉甲醛溶液，加入1(% (ν/ν)酸性乙醇溶液，每孔200 μ L，置于微板振蕩器內(nèi)震蕩IOmin ；在酶標儀上測定540nm波長的每孔吸收值。試驗重復(fù)兩次。2、結(jié)果由表1知，HH卷煙接裝紙樣品原液對CHO細胞有輕微的抑制作用，隨著樣品劑量從lmg/mL至500mg/mL增加，其細胞抑制率也隨之增大，呈顯著的劑量反應(yīng)關(guān)系。表IHH卷煙接裝紙樣品原液中性紅細胞毒性試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種用于卷煙接裝紙生物學(xué)評價的中性紅細胞毒性試驗方法，其特征在于用于卷煙接裝紙生物學(xué)評價的中性紅細胞毒性試驗方法的具體步驟如下a.采用醫(yī)療器械生物學(xué)評價研究中常用的人工唾液作為卷煙接裝紙的浸提液；b.量取一定面積的卷煙接裝紙，剪成IcmX6cm的條狀，置于具有磨口塞的50 250mL 錐形瓶中備用；c.按照接裝紙面積/浸提液比例為M 36cm2/mL向裝有接裝紙的錐形瓶中注入浸提液，接裝紙全部浸入后蓋好塞子；d.模擬實際暴露條件，設(shè)置浸提溫度為37士1°C ；e.將該錐形瓶置于37士1°C的水浴震蕩器中震蕩浸提5 180min，得到樣品原液；f.將e步驟得到的樣品原液進行中性紅細胞毒性試驗，即將生長良好的中國倉鼠卵巢細胞系接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1 X IO4個細胞，置于條件設(shè)置為37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育Mh;棄掉培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入不同劑量的樣品原液，每mL培養(yǎng)基中受試樣品原液的劑量依次為l、5、10、25、50、100、200、300、500mg，繼續(xù)孵育Mh，每一組劑量做 6孔平行；棄掉培養(yǎng)板中的溶液，按100 μ g/mL加入中性紅溶液，每孔200 μ L，置于培養(yǎng)箱中孵育池；棄掉培養(yǎng)板中的溶液，加入(ν/ν)甲醛溶液，每孔200yL，固定1 aiiin; 棄掉甲醛溶液，加入酸性乙醇溶液(v/v)，酸性乙醇溶液為冰醋酸無水乙醇水= 1 50 49，每孔200 μ L，置于微板振蕩器內(nèi)震蕩IOmin ；在酶標儀上測定MOnm波長的每孔吸收值，試驗重復(fù)兩次；g.根據(jù)中性紅細胞毒性試驗結(jié)果評價卷煙接裝紙的安全性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于卷煙接裝紙生物學(xué)評價的中性紅細胞毒性試驗方法，屬煙草技術(shù)領(lǐng)域。具體方法如下采用人工唾液作為接裝紙浸提液；量取一定面積接裝紙，剪成1cm×6cm條狀，置于具有磨口塞的50～250mL錐形瓶中備用；按照裝紙面積/浸提液比例為24～36cm2/mL向錐形瓶中注入浸提液，蓋好塞子；將該錐形瓶置于37±1℃的水浴震蕩器中震蕩浸提5～180min，制備樣品原液；并進行中性紅細胞毒性試驗；每mL培養(yǎng)液中樣品原液劑量依次為1、5、10、25、50、100、200、300、400、500mg；根據(jù)中性紅細胞毒性試驗結(jié)果評價接裝紙的安全性。本發(fā)明的優(yōu)點在于有效模擬接裝紙與口腔接觸的實際狀況制備樣品，用于中性紅細胞毒性試驗的樣品原液劑量范圍合適，方法實用、簡便。
文檔編號G01N33/48GK102156188SQ20111003535
公開日2011年8月17日 申請日期2011年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月10日
發(fā)明者唐萍, 夭建華, 李雪梅, 楊葉昆, 米其利, 繆明明, 魏玉玲, 黃海濤 申請人:云南煙草科學(xué)研究院