專利名稱：豬圓環(huán)病毒2型elisa抗體檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原，該病主要以患畜生長緩慢、進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病例損傷為特征。除了引發(fā)PMWS外，PCV2還與仔豬先天性震顫、豬皮炎腎炎綜合征、豬呼吸道綜合征(PDNS)、母豬繁殖障礙等疾病相關(guān)。自1996 年在加拿大首次發(fā)現(xiàn)PMWS以來，PCV2感染引起的相關(guān)疾病已經(jīng)在全世界廣泛存在。隨著我國養(yǎng)豬業(yè)受到PCV2感染的危害日益嚴(yán)峻，研制PCV2血清抗體檢測試劑盒的臨床需求迫切。 PCV基因組由一條共價閉合環(huán)狀單股DNA構(gòu)成，包含兩個大的開放閱讀框架ORFl和0RF2， 分別編碼病毒蛋白復(fù)制酶(Itep)和病毒衣殼蛋白(Cap)。Cap蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白， 含有4個抗原表位，具有較好的免疫原性和抗原性，是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原。由于該病毒在體外培養(yǎng)不產(chǎn)生細(xì)胞病變，病毒繁殖能力低，難于獲得高產(chǎn)量的病毒抗原用于診斷目的。而昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)以其表達(dá)外源蛋白產(chǎn)量高、免疫活性好、產(chǎn)物易純化、反應(yīng)背景低等優(yōu)點，在多種動物疫病診斷中得到應(yīng)用。檢測PCV2的衣殼蛋白抗體可以反映PCV2的抗體水平，對豬群PCV2抗體水平進(jìn)行監(jiān)測，可確切了解豬體免疫水平或感染狀況，制定最適免疫程序或淘汰選育，有效預(yù)防和控制PCV2的侵襲和傳播，避免因此而引起的重大經(jīng)濟(jì)損失。目前，國內(nèi)外采用的PCV2檢測技術(shù)主要有病毒分離培養(yǎng)，間接免疫熒光，免疫酶單層實驗(IMPA)，原位雜交(ISH)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等等。上述技術(shù)和方法雖然可以檢測PCV2或抗體水平，在實踐中也取得一定的效果。但均存在試驗操作復(fù)雜，耗時長，需要特定的專業(yè)技能和儀器設(shè)備等，成品昂貴等缺點，不易在基層單位普及。中國專利公開號為 CN1584597A的專利申請公開了一種豬圓環(huán)病毒2型抗原或抗體ELISA檢測試劑盒。上述專利抗體檢測試劑盒所用檢測板包被的抗原為原核表達(dá)的蛋白，且二抗為羊抗豬多克隆抗體。本發(fā)明采用雙單抗結(jié)合技術(shù)檢測抗體，特異性更強(qiáng)，靈敏度更高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬圓環(huán)病毒2型(PCV2) ELISA抗體檢測試劑盒，本發(fā)明采用單克隆抗體包被法間接包被基因工程抗原制備反應(yīng)板，進(jìn)而組成用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的試劑盒，本試劑盒除了具有普通ELISA試劑盒的優(yōu)點外，還彌補(bǔ)了由于抗原問題而導(dǎo)致的靈敏度低的缺點，從而提高檢測的靈敏度和特異性。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包含有預(yù)包被豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)單克隆抗體和豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2_Cap)的酶標(biāo)板、封閉液、樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、酶結(jié)合物、濃縮洗滌液、酶底物溶液和終止液，酶標(biāo)板預(yù)先包被PCV2-cap蛋白單克隆抗體，包被緩沖液0. 05M pH9. 6的碳酸鹽緩沖液，1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量為每孔0. I-Iug ；封閉液為質(zhì)量濃度是1-10%的BSA或脫脂牛奶；封閉完再包被PCV2-cap蛋白，包被量為每孔0. I-Iug ；樣品稀釋液為含有質(zhì)量濃度0. 1-10%牛血清白蛋白BSA和含有質(zhì)量濃度0. 01-0. 05% NaN3 的O.Olmol/L及pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液(PBQ ；酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶-小鼠抗豬IgG酶結(jié)合物；濃縮洗滌液為含體積濃度0. 05%吐溫-20的0. 01mol/L及pH7. 2-7. 4的 PBS ；酶底物A溶液為3，3’-5，5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液，酶底物B溶液為雙氧水溶液；終止液為lmol/L H2SO4溶液，陽性對照、陰性對照放置在盒內(nèi)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的是小鼠抗豬IgG單克隆抗體。上述各種溶液的配制①樣品稀釋液0. 1-10 % BSA, 0. 01-0. 05 % NaN3的 0. 01mol/L, ρΗ7· 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；②洗滌液在1000ml的0. OlM PBS溶液中加0. 5ml吐溫-20 (Tween-20)；③酶底物3，3，-5，5，-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液:i)底物A 液稱取TMBlOOmg加入IOml 二甲基亞砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物濃縮液；ii)底物B液稱取乙酸鈉IOg溶于IL純化水，用乙酸調(diào)PH值為5. 0，加入濃度為30% H202400ul即得；④終止液取54. 3ml濃度為95-98%濃硫酸加蒸餾水至1000ml即可。所述重組PCV2_Cap蛋白的制備方法為利用基因工程技術(shù)Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)PCV2-0RF2基因(Cap蛋白)的重組桿狀病毒，根據(jù)PCV2的基因序列設(shè)計Cap特異性引物上游引物 1 :5，-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，，下游引物 1 :5，-GCGAAGCTTTA AGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，上游引物 2 :5，-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，下游引物 2:5，-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，以 PCR 從 PCV2 基因組中擴(kuò)增出 0RF2 基因全序列，將其亞克隆至桿狀病毒穿梭載體PFastBac-Dual中，構(gòu)建0RF2基因雙拷貝的重組質(zhì)粒pFastBac-Dual-0RF2 (2X),將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac，獲得重組bacmid，將重組l^acmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒rBac-0RF2 (2X)0將該重組桿狀病毒感染 Sf9細(xì)胞，即可表達(dá)Cap蛋白，并且該蛋白可自我組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)，收集Cap蛋白，通過超速離心和CsCl密度梯度離心，即可獲得純化的形成病毒樣顆粒的Cap蛋白。本發(fā)明還提供了豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的制備方法，其中所述抗原酶標(biāo)板制備方法是先包被豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)單克隆抗體，再結(jié)合純化的豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)。


圖1為本發(fā)明工藝流程圖。圖2為本發(fā)明檢測原理示意圖。圖3為表達(dá)的PCV2_cap蛋白SDS-PAGE分析圖。其中M是Marker，1是純化的 PCV2-cap 蛋白。
具體實施例方式實施例一.豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的制備方法
1.獲得PCV2-cap蛋白單克隆抗體PCV2-cap蛋白單克隆抗體抗體可商購，也可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，制備已知抗原的抗體的方法是本領(lǐng)域公知的；本發(fā)明中使用的 PCV2-cap 蛋白單克隆抗體購自 RuralTechnologies, Incorporated ；2.獲得辣根過氧化物酶(HRP)-小鼠抗豬IgG酶結(jié)合物小鼠抗豬IgG單克隆抗體可商購，也可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法制備；本發(fā)明中使用的小鼠抗豬IgG單克隆抗體購自洛陽賽爾維實驗器材公司；然后用改良的過碘酸鈉氧化法進(jìn)行標(biāo)記；最后酶標(biāo)記物加入
牛血清白蛋白、酪蛋白和50%的中性甘油，測定工作濃度后，-20°C保存?zhèn)溆茫?.所述重組PCV2_Cap蛋白的制備方法為利用基因工程技術(shù)Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)PCV2-0RF2基因(Cap蛋白)的重組桿狀病毒，根據(jù)PCV2的基因序列設(shè)計Cap特異性引物上游引物 1 :5，-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，，下游引物 1 :5，-GCGAAGCTT TAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，上游引物 2 5，-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，下游引物 2 :5，-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，以 PCR 從 PCV2 基因組中擴(kuò)增出 0RF2 基因全序列，將其亞克隆至桿狀病毒穿梭載體pFastBac-Dual中，構(gòu)建0RF2基因雙拷貝的重組質(zhì)粒pFastBac-Dual-0RF2 (2X),將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac，獲得重組bacmid， 將重組bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒rBac-0RF2 (2X)0將該重組桿狀病毒感染 Sf9細(xì)胞，即可表達(dá)Cap蛋白，并且該蛋白可自我組裝形成病毒樣顆粒，收集Cap蛋白，通過超速離心和CsCl密度梯度離心，即可獲得純化的形成病毒樣顆粒的Cap蛋白作為包被用抗原。4.將PCV2_cap單克隆抗體均勻的包被在酶標(biāo)板孔上，包被緩沖液為0. 05M pH9. 6 的碳酸鹽緩沖液，即1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93gNaHC03，包被量為每孔0. I-Iug ；封閉液為BSA或脫脂牛奶，濃度是1-10% ；封閉完再包被的是PCV2-cap蛋白，包被量為每孔 0.I-Iug ；5.試劑盒其他溶液配制①樣品稀釋液1% BSA，0.05% Ne^3的O.Olmol/L， pH7. 2的磷酸鹽緩沖液(PBS)；②洗滌液在1000ml的0. OlM PBS溶液中加0. 5ml吐溫-20 (Tween-20)；③酶底物3，3’-5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液i)底物A液稱取 TMBlOOmg加入IOml 二甲基亞砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物濃縮液；ii)底物B液稱取乙酸鈉IOg溶于IL純化水，用乙酸調(diào)PH值為5. 0，加入濃度為30% H202400ul即得；④終止液取54. 3ml濃度為95%濃硫酸加蒸餾水至1000ml即可。實施例二 .豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的操作步驟1.將待檢樣本用樣本稀釋液100倍稀釋，每孔加lOOul，同時加入陽性和陰性對照液，設(shè)空白對照。置37°C孵育1小時，洗滌液洗板5次，甩干，每孔加酶標(biāo)抗體100ul，37°C 孵育1小時；洗滌液洗板5次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100 μ 1，避光顯色5-10分鐘，加入終止液，每孔50 μ 1。利用酶標(biāo)儀在450nm測定光吸收值A(chǔ)45tlnm.2.結(jié)果判定Cut Off(C0值)=陰性對照光吸收值A(chǔ)45tlnmX 2. 1倍，樣品值=樣品光吸收值A(chǔ)45cinmAX)值，樣品值大于1判為陽性；樣品值小于1和等于1判為陰性。實施例三實驗結(jié)果及分析1.特異性檢測用本發(fā)明制造的試劑盒分別檢測豬PCV2滅活疫苗免疫血清，豬 PCV2感染血清、豬PCVl感染血清、豬藍(lán)耳病毒抗體陽性血清、豬瘟病毒抗體陽性血清、豬偽狂犬病毒陽性血清、豬PCV2陰性血清，操作和判定按照具體實施方式
中豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的操作步驟進(jìn)行，結(jié)果顯示，豬PCV2免疫血清和感染血清檢測為陽性，其他樣品檢測為陰性，特異性為100%。2.靈敏度檢測用本發(fā)明制造的試劑盒檢測不同稀釋度的陽性參考血清，操作和判定按照具體實施方式
中豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的操作步驟進(jìn)行，檢測結(jié)果為最高檢測到陽性參考樣品的稀釋度為1 800。3.與現(xiàn)有試劑盒的實驗結(jié)果的比較實驗用本發(fā)明制造的試劑盒與同類試劑盒同時檢測豬PCV2免疫血清5份、豬PCV2抗體陰性血清和不同稀釋度的PCV2抗體陽性參考血清。操作和判定按照具體實施方式
中豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的操作步驟進(jìn)行，檢測結(jié)果顯示本發(fā)明中的試劑盒檢測靈敏度顯著高于其他同類產(chǎn)品。(見下表)
檢測樣品試劑盒1試劑盒2試劑盒3本發(fā)明試劑合 JIO-檢測板所包被抗原PCV2合成肽抗原原核表達(dá)的 PCV2-Cap 蛋白PCV2全病毒PCV2-Cap VLP顆粒檢測樣品稀釋倍數(shù)1: 51: 101: 51: 100豬 PCV2 免疫血清10. 5990. 8900. 4211. 20120. 6020. 5990. 5011. 32130. 5780. 5670. 4871. 10340. 5590. 5440. 4911. 22150. 5010. 4890. 4231. 099PCV2抗體陽性參考血清1: 100. 6021. 2010. 4981. 8971: 1000. 3240. 5690. 1991. 2561: 5000. 1210. 3760. 0991. 2011: 10000. 0870. 1210. 0650. 998豬 PCV2 抗體陰性血清1: 1000. 0760. 0870. 1210. 099序列表<110>武漢中博生物股份有限公司<120>豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒<160>4<210>1<211>29<212>DNA
<213>人工序列<400>1tctggatcca tgacgtatcc aaggaggcg 29<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>2gcgaagcttt aagggttaag tggggggtc 29<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3tctctcgaga tgacgtatcc aaggaggcg 29<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4gcgggtacct aagggttaag tggggggtc 29
權(quán)利要求
1.一種豬圓環(huán)病毒2型(PCM)ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于所述檢測試劑盒包含有預(yù)包被豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)單克隆抗體和豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白的酶標(biāo)板、封閉液、樣品稀釋液、酶結(jié)合物、濃縮洗滌液、酶底物溶液和終止液，其中所述的核衣殼蛋白是純化的形成病毒樣顆粒的Cap蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述PCV2-Cap蛋白已自我組裝形成病毒樣顆粒，并通過CsCl密度梯度離心純化獲得。
3.權(quán)利要求1或2所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的PCV2-Cap蛋白通過如下方法制備提取豬圓環(huán)病毒2型基因組，通過特異性引物擴(kuò)增PCV2-Cap基因片段，利用 Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建能表達(dá)PCV2_Cap基因的重組桿狀病毒，將所述重組桿狀病毒感染Sf9 細(xì)胞，收獲表達(dá)的Cap蛋白，通過CsCl密度梯度離心純化后作為包被用PCV2-Cap蛋白抗原。
4.權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的特異性引物是上游引物1:5’ -TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，，下游引物 1 :5，-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，上游引物 2 :5，-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，下游引物 2 :5，-GCGGGTACCTAAGG GTTAAGTGGGGGGTC-3’。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的檢測試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板預(yù)先包被PCV2-cap蛋白單克隆抗體，包被緩沖液是0. 05M pH9. 6的碳酸鹽緩沖液，1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量為每孔0. I-Iug ；封閉液為質(zhì)量濃度是的牛血清白蛋白BSA或脫脂牛奶；封閉完再包被純化的PCV2-Cap蛋白，包被量為每孔0. I-Iug ；樣品稀釋液為含有質(zhì)量濃度0. 1-10%牛血清白蛋白BSA和含有質(zhì)量濃度0.01-0. 05% NaN3的O.Olmol/L及 PH7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBQ ；酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶(HRP)-小鼠抗豬IgG單抗酶結(jié)合物；濃縮洗滌液為含體積濃度0. 05%吐溫-20的0. Olmol/L及pH7. 2-7. 4的PBS ；酶底物A溶液為3，3’ -5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB)，酶底物B溶液為雙氧水溶液；終止液為 lmol/L H2SO4 溶液。
6.權(quán)利要求1-4任一項所述的檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包含陽性對照和陰性對照。
7.制備如權(quán)利要求1-4任一項所述的試劑盒的方法，其特征在于所述抗原酶標(biāo)板制備方法是先包被豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)單克隆抗體，再結(jié)合純化的豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)。
全文摘要
本發(fā)明涉及豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)ELISA抗體檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包含有預(yù)包被豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)單克隆抗體和豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap)的酶標(biāo)板、封閉液、樣品稀釋液、酶結(jié)合物、濃縮洗滌液、酶底物溶液和終止液，其中所述的核衣殼蛋白是純化的形成病毒樣顆粒的Cap蛋白。本發(fā)明試劑盒的特異性達(dá)100％；靈敏度為1∶800。本試劑盒用于對豬群PCV2抗體水平進(jìn)行監(jiān)測，確切了解豬體免疫水平或感染狀況。
文檔編號G01N33/577GK102183650SQ20111003828
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月15日
發(fā)明者劉漢平, 廖園園, 朱薇, 熊媛媛, 靖志強(qiáng) 申請人:武漢中博生物股份有限公司