專利名稱：檢測腦心肌炎病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種酶聯(lián)免疫試劑盒，特別涉及一種能夠檢測腦心肌炎病毒抗體的酶 聯(lián)免疫試劑盒，本發(fā)明還涉及這種酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測人和動物腦心肌炎病毒抗體中的應用。
背景技術：
腦心肌炎病毒(EMCV)是一種重要的人畜共患病病原，是可以引起豬和某些哺乳 動物、嚙齒動物乃至靈長類動物的一種以腦炎、心肌炎或心肌周圍炎為主要特征的急性傳 染病。EMCV感染可引起仔豬致死性心肌炎，造成急性死亡，死亡率最高可達100%、可導致懷 孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎；該病在全世界廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟 損失；它除了感染動物外，人體內(nèi)也已檢測到；此外，EMCV還以亞臨床感染的形式存在。所 以作好該病的診斷及預防極為重要。酶聯(lián)免疫法操作簡便、快速，因而成為臨床免疫檢驗中的主導技術?，F(xiàn)有的用酶聯(lián) 免疫法檢測EMCV抗體的方法只有間接酶聯(lián)免疫法，其操作步驟為
(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。 (2)加稀釋的受檢血清其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌 后，固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在 洗滌過程中被洗去。(3)加酶標抗抗體與固相復合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地 標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。(4)加底物顯色顏色深度 代表標本中受檢抗體的量。在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術至少存在以下問題
(1)專屬性太強，應用不廣泛現(xiàn)有的試劑盒只能檢測單一種屬動物或人；
(2)靈敏度與特異性不高；
(3)假陽性多，準確性不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實施例的目的是針對上述現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種能通用檢測人和動 物、靈敏度高、特異性強、準確性高的檢測EMCV抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒；為此，本發(fā)明還提 供該試劑盒在檢測人和動物EMCV抗體中的應用。本發(fā)明提供一種利用雙抗原夾心法來檢測人和動物EMCV抗體的酶聯(lián)免疫試劑 盒，該試劑盒的實驗原理是
(1)將特異性抗原與固相載體結(jié)合，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)；
(2)加受檢標本，使之與固相抗原接觸反應一段時間，讓標本中的抗體與固相載體上的 抗原結(jié)合，形成固相抗體復合物，洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)；(3)加酶標抗原使固相抗 體復合物上的抗體與酶標抗原結(jié)合，徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗原，此時固相載體上帶有的 酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關；(4)加底物夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反應的程度進行該抗體的定性或定量。為了實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術方案是
提供一種檢測EMCV抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括包被EMCV重組抗原的酶標 板、酶標記的EMCV抗原工作液、EMCV抗體陽性對照、EMCV抗體陰性對照、洗液、顯色劑A、顯 色劑B和終止液。其中所述EMCV重組抗原的蛋白濃度為300ng/ml 60 μ g/ml，是由相同蛋白濃度 的EMCV-VPl重組蛋白、EMCV-VP2重組蛋白和EMCV-2C重組蛋白組成。優(yōu)選地，EMCV重組抗原的蛋白濃度為30 μ g/ml。所述包被EMCV重組抗原的酶標板的制備包括封閉包被的EMCV重組抗原步驟，所 述封閉包被的EMCV重組抗原步驟中所用封閉材料為含5g/L的魚蛋白胨、100g/L蔗糖，pH 值為7. 2 7. 8的磷酸鹽緩沖液或含100g/L馬血清、100g/L蔗糖，pH值為7. 2 7. 8的 磷酸鹽緩沖液。酶標記的EMCV抗原工作液是按照以下步驟制備的
1).酶的活化將5mg酶溶于Iml純化水中，加入0.06mol/L過碘酸鈉溶液0. 5ml，冰 浴避光攪拌30分鐘，加入0. 16mol/L乙二醇0. 5ml，冰浴避光攪拌30分鐘，2_8°C保存；
2).酶標記EMCV抗原的制備用0.2mol/L碳酸鹽緩沖液將活化后的酶的pH調(diào)至 9. 0-9. 5，加入5mgEMCV抗原，冰浴避光攪拌30分鐘，置0. 05mol/L，pH9. 5碳酸鹽緩沖液溶 液中透析，2-8°C透析10_14h，加入5mg/ml硼氫化鈉溶液0. aiil，冰浴避光攪拌60分鐘，加 入等體積飽和度為50%的硫酸銨溶液，2-8°C靜置30分鐘后，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心 20分鐘，所得沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解后，Sepharose-4FF柱層析，收集第一峰，加入體積 百分數(shù)50%中性甘油，-20°C _30°C保存；
3).將酶標記EMCV抗原與酶稀釋液按體積比1:200 1:800混合。其中，酶標記的EMCV抗原工作液中的酶為辣根過氧化物酶。所述酶標記EMCV抗原的制備步驟中EMCV抗原是先滅活再用酶標記的。優(yōu)選地，酶標記EMCV抗原與酶稀釋液的體積比為1:400。本發(fā)明還提供上述試劑盒在檢測人和動物EMCV抗體中的應用。試劑盒在檢測人和動物EMCV抗體中應用的具體步驟為
a.取出包被EMCV重組抗原的酶標板，在孔中分別加待測樣品、陰性對照、陽性對照各 100 μ L，充分混勻，封板，封板后將酶標板置37°C水浴中反應40分鐘；
b.棄去各孔內(nèi)液體，用稀釋20倍后的洗液沖洗，拍干；
c.加入酶標記EMCV抗原工作液100μ L，封板，置37°C反應30分鐘；
d.棄去各孔內(nèi)液體，用稀釋20倍后的洗液沖洗，拍干；
e.每孔按順序分別加入顯色劑A、顯色劑B各50μ L，置37°C顯色15分鐘；
f.每孔加終止液50μ L，測定各孔OD值。本發(fā)明提出的檢測腦心肌炎病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒不受種屬差異的限制， 能夠通用檢測人和動物的腦心肌炎病毒抗體；試劑盒對內(nèi)部參考品陰陽性進行檢測，合格 率為100%，因此試劑盒的靈敏度高、特異性強；試劑盒加熱后，對內(nèi)部參考品陰陽性進行測 定，其合格率為100%，因此試劑盒具有很好的熱穩(wěn)定性；通過對人血清和豬血清進行檢測， 99.6%以上能直接判斷出陰陽性，具有很好的實用效果。而且本試劑盒操作簡單，檢測成本低，檢測時間短，1. 5個小時即可完成檢測操作，適用于大批量檢測腦心肌炎病毒抗體。
具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的主要試劑
1.敘利亞地鼠腎傳代細胞(BHK-21細胞)購自甘肅省動物細胞工程技術研究中心；
2.腦心肌炎病毒抗原(未滅活)、兔抗腦心肌炎病毒血清、腦心肌炎病毒VPl重組蛋白 (EMCV-VPl)、腦心肌炎病毒VP2重組蛋白(EMCV-VP2)由西北民族大學生物工程與技術國家 民委重點實驗室提供；
3.腦心肌炎病毒2C重組蛋白(EMCV-2C)由深圳菲鵬生物股份有限公司提供；
4.馬血清、新生小牛血清由中美合資蘭州民海生物工程有限公司提供；
5.辣根過氧化物酶(HRP)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自Sigma公司；
6.Sepharose-4FF, NaIO4, NaBH4等試劑均購自蘭州鵬程生物技術有限公司；
7.酶標板(96孔)購自廈門云鵬公司；
8.DMEM培養(yǎng)液購自美國GIBCO公司；
9.未免疫兔細胞由蘭州大學醫(yī)學部提供；
10.未免疫豬細胞購自黃泥灣豬場；
11.酶稀釋液含質(zhì)量濃度21的聚乙二醇、0.05%的硫柳汞鈉、pH值為6. 8 8. 0的磷 酸鹽緩沖液。下述實施例中的主要儀器設備
(1)酶標定量測定儀購自美國熱電型號MK3;
(2)酶標洗板機購自北京天石型號ZMX-988B ；
(3)隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海躍進醫(yī)療器械；
(4)微型混和器購自江蘇南通無線電儀器廠；
(5)二氧化碳氣體培養(yǎng)箱 購自美國Thermo Fisher型號3111型；
(6)研究級熒光倒置顯微鏡購自Olympus 型號1X71型。實施例1
一、配制檢測EMCV抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒
(1)包被EMCV重組抗原的酶標板；
(2)酶標記EMCV抗原工作液；
(3)EMCV抗體陽性對照；
(4)EMCV抗體陰性對照；
(5)洗液；
(6)顯色劑A;
(7)顯色劑B;
(8)終止液。(一)包被EMCV重組抗原的酶標板的制備
(1) EMCV重組抗原的制備將EMCV-VPl重組蛋白、EMCV-VP2重組蛋白、EMCV-2C重組 蛋白相同蛋白濃度混合；(2)包被EMCV重組抗原用pH值9.6,0. 05M的碳酸鈉緩沖液將EMCV重組抗原蛋白濃 度稀釋至30μ g/ml，按100μ L /孔加入酶標板的微孔中，放置吸附、甩干；
(3)封閉包被的EMCV重組抗原用含5g/L魚蛋白胨、100g/L蔗糖，pH值為7.5的磷酸 鈉緩沖液，按150 μ L /孔封閉、甩干；
(4)干燥置37°C干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中密封5°C保存。(二)酶標記EMCV抗原工作液的制備
a.辣根過氧化物酶的活化將5mg辣根過氧化物酶溶于Iml純化水中，加入0. 06mol/ L過碘酸鈉溶液0. 5ml，冰浴避光輕輕攪拌30分鐘，加入0. 16mol/L乙二醇0. 5ml，冰浴避光 輕輕攪拌30min，2°C保存；
b.酶標記EMCV抗原的制備
將EMCV抗原于56°C滅活半小時，用0. 2mol/L碳酸鉀緩沖液將步驟a中得到活化后的 辣根過氧化物酶的PH值調(diào)至9. 0，加入5mg滅活后的EMCV抗原，冰浴避光輕輕攪拌30min， 置于0. 05mol/L、pH值9. 5碳酸鉀緩沖液溶液中透析，2°C透析10小時，加入5mg/ml硼氫 化鈉溶液0. anl，冰浴避光輕輕攪拌60分鐘，加入等體積飽和度為50%的硫酸銨溶液，2°C 靜置30分鐘后，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心20分鐘，所得沉淀用磷酸鉀緩沖液溶解后， Sepharose-4FF柱層析，收集第一峰，加入體積百分數(shù)為50%中性甘油，_25°C保存；
c.將酶標記EMCV抗原與酶稀釋液按體積比1 400混合，完成酶標記EMCV抗原工作液 的制備。(三)制備EMCV抗體陽性對照
EMCV抗體陽性對照選自內(nèi)部參考品(具體制備方法見本實施例三-1)中OD值> 2. 0的 陽性參考品。(四)制備EMCV抗體陰性對照
EMCV抗體陰性對照選自內(nèi)部參考品(具體制備方法見本實施例三-1)中OD值< 0. 1的 陰性參考品。(五)制備洗液
洗液配制PH值為7. 4，終濃度為0. 2mol/L的磷酸鈉緩沖液，其中含10g/L的吐溫20， 2°C存放。(六)制備顯色劑A
配制PH值為5. 0，終濃度為0. lmol/L的磷酸-檸檬酸鈉緩沖液，其中含12mmol/L的 H2O2，溶解后加甘油避光存放。(七)制備顯色劑B
配制PH值為2. 0，終濃度為0. 25g/L的檸檬酸-乙酸鈉緩沖液，其中含0. 25g/L的TMB 鹽酸鈉，溶解后加甘油避光存放。(A)制備終止液
配制2M的&S04，完成終止液的制備。二、本試劑盒可用于檢測人和動物的EMCV抗體，具體檢測步驟如下
a.取出包被EMCV重組抗原的酶標板，在孔中分別加待測樣品、陰性對照、陽性對照各 100 μ L，其中待測樣品1孔，陰性對照3孔，陽性對照2孔；充分混勻，用不干膠片封板，封板 后將酶標板置37°C水浴中反應40分鐘；b.棄去各孔內(nèi)液體，用稀釋20倍后的洗液注滿各孔，靜置30秒，甩干，重復6次，用吸 水紙拍干；
c.加入酶標記的EMCV抗原工作液100μ L，用不干膠片封板，置37°C反應30分鐘；
d.棄去各孔內(nèi)液體，用稀釋20倍后的洗液注滿各孔，靜置30秒，甩干，重復6次，用吸 水紙拍干；
e.每孔按順序分別加入顯色劑A、顯色劑B各50μ L，置37°C顯色15分鐘；
f.每孔加終止液50微升，振蕩混勻。選擇酶標儀波長450nm，參考波長630nm，測定各 孔OD值。結(jié)果判斷待測樣品OD值彡2. 1 X陰性對照平均OD值，則待測樣品為EMCV抗體 陽性，待測樣品OD值<2. 1 X陰性對照平均OD值，則待測樣品為EMCV抗體陰性，其中陰性 對照平均OD值小于0. 05按0. 05計。三、本發(fā)明試劑盒性能的評估
本發(fā)明建立了內(nèi)部參考品用以評估本試劑盒的性能。一、內(nèi)部參考品的制備
a、陽性參考品的制備將3份兔抗EMCV血清等體積混合，將混合后血清與磷酸鹽緩沖 液按體積比1 50、1 100、1 200、1 400稀釋，按上述稀釋順序?qū)⑵渚幪枮镻l、P2、P3、P4 ；用 本發(fā)明所制備的試劑盒檢測豬血清，選取EMCV抗體陽性的豬血清2份，其中OD值> 2. 0的 豬血清編號為P5，2. 0 > OD值彡1. 0的豬血清編號P6 ；將P1-P6構成陽性參考品。b、陰性參考品的制備用本發(fā)明所制備的試劑盒測得OD值< 0. 10的未免疫兔血 清1份(編號m)、標準馬血清1份(編號N2)、未免疫豬血清4份(編號N3、N4、N5、N6)；將 m-N6作為陰性參考品。C、滅活將以上各份血清用0. 22 μ M濾膜過濾除菌，用鈷_60滅活，劑量為10 20kgy，滅活4 6小時，以殺滅其中的致病因子。d、將滅活后的血清加入體積百分含量0. 02%的妝隊，無菌過濾，_20°C保存，完成內(nèi) 部參考品的制備。二、內(nèi)部參考品陰陽性的確定
如表1所示用酶稀釋劑將EMCV抗原分別稀釋至原質(zhì)量濃度的10-3、10-4、10_5、10_6、 10_7，將不同內(nèi)部參考品加入到不同濃度溶液中，形成待中和溶液。用DMEM培養(yǎng)液按 相同稀釋度稀釋EMCV抗原作為陽性對照，用DMEM培養(yǎng)液作為陰性對照，以各內(nèi)部參考品 自身作空白對照，于2 8°C中和10小時，將上述各份溶液按100μ L /孔接種至長滿單 層ΒΗΚ-21細胞的96孔細胞培養(yǎng)板上，2小時后吸盡各孔液體，每孔加入180 μ L含體積百 分含量5%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37°C、體積濃度為5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)4天， 觀察細胞病變情況，判斷中和結(jié)果以陰性對照呈陰性、陽性對照呈陽性且空白對照呈陰性 者，實驗成立。以陽性對照成立的最大稀釋度作為細胞病變陽性的判斷標準，血清中和后細 胞病變陽性者，則內(nèi)部參考品為EMCV-Ab陰性；反之，細胞病變?yōu)殛幮哉?，則內(nèi)部參考品為 EMCV-Ab陽性。實驗結(jié)果如表1所示6份陰性內(nèi)部參考品均未能中和EMCV抗原，中和實驗 結(jié)果均為陽性，故其EMCV-Ab為陰性；陽性內(nèi)部參考品均能中病毒，為EMCV-Ab陽性，但P3 未能中和10_3病毒，P4也只能中和10_6和10_5病毒，未能中和 1(Γ4、1(Γ3的病毒，因此，Ρ3和Ρ4為EMCV-Ab弱陽性。
表1內(nèi)部參考品血清中和實驗結(jié)果
權利要求
1.一種檢測EMCV抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括包被EMCV重組抗原的酶標板、酶標記的EMCV抗原工作液、EMCV抗體陽性對照、EMCV抗 體陰性對照、洗液、顯色劑A、顯色劑B和終止液。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述EMCV重組抗原的蛋白濃度為 300ng/ml 60 μ g/ml，是由相同蛋白濃度的EMCV-VPl重組蛋白、EMCV-VP2重組蛋白和 EMCV-2C重組蛋白組成。
3.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述EMCV重組抗原的蛋白濃度為 30 μ g/mlο
4.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述包被EMCV重組抗原的酶標板的制 備包括封閉包被的EMCV重組抗原步驟，所述封閉包被的EMCV重組抗原步驟中所用封閉材 料為含5g/L的魚蛋白胨、100g/L蔗糖，pH值為7. 2 7. 8的磷酸鹽緩沖液或含100g/L馬 血清、100g/L蔗糖，pH值為7. 2 7. 8的磷酸鹽緩沖液。
5.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述酶標記的EMCV抗原工作液是按照 以下步驟制備的1).酶的活化將5mg酶溶于Iml純化水中，加入0.06mol/L過碘酸鈉溶液0. 5ml，冰 浴避光攪拌30分鐘，加入0. 16mol/L乙二醇0. 5ml，冰浴避光攪拌30分鐘，2_8°C保存；2).酶標記EMCV抗原的制備用0.2mol/L碳酸鹽緩沖液將活化后的酶的pH調(diào)至 9. 0-9. 5，加入5mgEMCV抗原，冰浴避光攪拌30分鐘，置0. 05mol/L，pH9. 5碳酸鹽緩沖液溶 液中透析，2-8°C透析10_14h，加入5mg/ml硼氫化鈉溶液0. aiil，冰浴避光攪拌60分鐘，加 入等體積飽和度為50%的硫酸銨溶液，2-8°C靜置30分鐘后，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心 20分鐘，所得沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解后，Sepharose-4FF柱層析，收集第一峰，加入體積 百分數(shù)50%中性甘油，-20°C _30°C保存；3).將酶標記EMCV抗原與酶稀釋液按體積比1:200 1:800混合。
6.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述酶標記的EMCV抗原工作液中的酶 為辣根過氧化物酶。
7.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述酶標記EMCV抗原的制備步驟中 EMCV抗原是先滅活再用酶標記的。
8.根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述酶標記EMCV抗原與酶稀釋液的體 積比為1:400。
9.權利要求1-8中任何一項所述的試劑盒在檢測人和動物EMCV抗體中的應用。
10.根據(jù)權利要求9所述的試劑盒在檢測人和動物EMCV抗體中的應用，其特征在于 所述應用的具體步驟為a.取出包被EMCV重組抗原的酶標板，在孔中分別加待測樣品、陰性對照、陽性對照各 100 μ L，充分混勻，封板，封板后將酶標板置37°C水浴中反應40分鐘；b.棄去各孔內(nèi)液體，用稀釋20倍后的洗液沖洗，拍干；c.加入酶標記EMCV抗原工作液100 μ L，封板，置37°C反應30分鐘；d.棄去各孔內(nèi)液體，用稀釋20倍后的洗液沖洗，拍干；e.每孔按順序分別加入顯色劑A、顯色劑B各50μ L，置37°C顯色15分鐘；f.每孔加終止液50 μ L，測定各孔OD值。
全文摘要
檢測腦心肌炎病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用，本發(fā)明公開了一種檢測EMCV抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述試劑盒包括包被EMCV重組抗原的酶標板、酶標記的EMCV抗原工作液、EMCV抗體陽性對照、EMCV抗體陰性對照、洗液、顯色劑A、顯色劑B和終止液；本發(fā)明還涉及該試劑盒在檢測人和動物EMCV抗體中的應用。該試劑盒能對人和動物進行檢測，靈敏度高，特異性強，熱穩(wěn)定性好，檢測成本低，檢測時間短，適用于大批量的EMCV抗體的檢測；經(jīng)試驗，99.6%的血清能直接判斷出陰陽性，具有很好的實用效果。
文檔編號G01N33/569GK102087282SQ20111003978
公開日2011年6月8日 申請日期2011年2月17日 優(yōu)先權日2011年2月17日
發(fā)明者喬自林, 馮若飛, 李向茸, 李明生, 樊得英, 馬忠仁 申請人:馮若飛, 馬忠仁