專利名稱：基于快速分類提取技術檢測蜂蜜中抗生素殘留的方法
技術領域：
基于快速分類提取技術檢測蜂蜜中抗生素殘留的方法，屬于蜂蜜質量檢測技術領域。
背景技術：
蜂蜜是蜜蜂通過采集植物的花粉和活體植物的分泌液，經(jīng)自身所含有的特殊物質充分釀造而成的粘稠的、甜味的液體，是一種有益于人體健康的天然的甜味食品，作為甜味成分和功能成分，被廣泛用于食品、醫(yī)藥和保健品工業(yè)。我國年產(chǎn)蜂蜜30萬噸左右，全國現(xiàn)有蜂農(nóng)約30萬人，蜂產(chǎn)品加工企業(yè)2000余家， 年產(chǎn)值約80億元。目前在世界市場上，蜂蜜的年貿(mào)易量在23萬噸左右，我國年出口大約10 多萬噸，出口的蜂蜜原料約占國際蜂蜜市場總量的20%，占世界蜂蜜年貿(mào)易量的43%，居世界第一，中國已成世界上最大的蜂產(chǎn)品生產(chǎn)和出口國。我國蜂蜜主銷日本、歐盟、美國等國家和地區(qū)，年均創(chuàng)匯約1億美元，蜂蜜生產(chǎn)與出口對農(nóng)作物授粉、農(nóng)民致富和出口創(chuàng)匯起到了不可替代的積極作用。然而，近年來面對我國蜂產(chǎn)品出口的快速增長，歐美等國家紛紛對我國蜂產(chǎn)品采取各種限制措施，設置各種非關稅壁全，提出許多相當苛刻的蜂產(chǎn)品藥物殘留標準，例如氯霉素的控制限量為0. 1 μ g/kg，而蜂蜜中需要檢測的污染物種類更是多達100多種，在出口蜂蜜中任何一種污染物超標都會對我國蜂蜜出口造成重大的經(jīng)濟損失。例如1994年歐盟(EU)出臺了禁止在一切食用動物養(yǎng)殖中使用氯霉素的規(guī)定。在 2001年，歐盟在我國出口蝦仁中多次檢出氯霉素，隨后在蜂蜜等產(chǎn)品中也檢出氯霉素。以此為由，2002年1月，歐盟對包括蜂蜜在內的100多種中國產(chǎn)動物源性產(chǎn)品禁止進口，并引發(fā)美國、日本、加拿大、沙特、捷克等多個國家的連鎖反應。自此以后的數(shù)年間，我國蜂蜜、蜂王漿不能向歐盟出口，向美國、日本、加拿大等國家的出口也嚴重受阻，這給我國養(yǎng)蜂、蜂產(chǎn)品生產(chǎn)和出口企業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失，也給我國蜂業(yè)界，包括生產(chǎn)、銷售、外貿(mào)部門以及蜂產(chǎn)品經(jīng)營等方方面面敲起了警鐘。直到2006年，歐盟、美國等才相繼開放我國動物源產(chǎn)品的進口，但大幅度提高了對中國蜂產(chǎn)品藥物殘留的檢出限量要求。由于檢測標準提高到了十分苛刻的程度，使我國蜂產(chǎn)品出口仍然受到很大的限制。如何從源頭抓起，按歐盟等進口國要求建立殘留監(jiān)控體系，做到科學養(yǎng)蜂、合理用藥已成了蜂業(yè)界的共識和整個行業(yè)急需解決的重大問題。但是，由于我國蜜蜂養(yǎng)殖戶規(guī)模小，素質低，轉場頻繁，因而監(jiān)控難度大，農(nóng)藥、抗生素、重金屬等污染物超標現(xiàn)象時有發(fā)生。盡管目前我國和相關蜂產(chǎn)品進口國都相繼出臺了大量關于農(nóng)藥、抗生素等污染物檢測的國家標準和國際標準，但這些方法大都注重檢測的準確性而忽略了檢測的快速性和成本等因素，因而具有檢測速度慢、檢測品種少(一個標準一般只能檢測一種污染物)，檢測費用高等缺點。對于我國蜂蜜養(yǎng)殖戶小而分散的國情， 若對散戶銷售的蜂蜜每批都采用國標進行全面檢測顯然是行不通的。因為做一次污染物的全面檢測需要數(shù)萬元人民幣，而對于大多數(shù)散戶來說，其產(chǎn)品的全部銷售利潤可能還不夠支付檢測費。但若不能采取有效的檢測技術來及時剔除個別不法蜂農(nóng)混入的污染物超標的蜂蜜，而在最終的出口蜂蜜中檢測出某種違禁污染物的話，對蜂蜜出口企業(yè)來說其后果也將是非常嚴重的甚至是災難性的。因此，在蜂產(chǎn)品收購和半成品生產(chǎn)過程中，開發(fā)一種能快速檢測各種污染物的低成本檢測方法對于蜂產(chǎn)品加工企業(yè)提高產(chǎn)品質量、降低生產(chǎn)成本、 增加企業(yè)利潤具有非常重要的意義。蜂蜜中的抗生素主要是蜂農(nóng)為了治療蜂病而人為引入的。目前我國常見的抗生素有氯霉素類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內脂類、青霉素類、硝基咪唑類等。其中每一類抗生素又根據(jù)某些結構的變化而又有多種品種。因此，要對蜂蜜中的各種抗生素分別進行檢測在技術上是非常困難的，在經(jīng)濟上成本也是非常昂貴的。另一方面，盡管其種類繁多，但根據(jù)其在不同溶劑中的溶解性質，還是可以粗略地分為幾大類，例如根據(jù)抗生素的溶解性可以分為脂溶性污染物和水溶性抗生素兩大類，而在水溶性抗生素中，又可根據(jù)其電荷可分為陰離子性污染物和陽離子性抗生素等。在通常的提取過程中， 由于脂溶性溶劑與水不混溶，因而萃取液分為兩相，很容易分離。但脂溶性溶劑不能提取水溶性抗生素，不過大部分水溶性抗生素可以通過調節(jié)PH值將其轉化為水溶性較弱的狀態(tài)后再用脂溶性溶劑進行提取。一般來說，含有弱酸性陰離子解離基團的物質在酸性條件下會與氫離子結合而降低其離解度，從而降低其水溶性而增加脂溶性；相反，含有弱堿性陽離子解離基團的物質在堿性條件下也會降低其水溶性而增加脂溶性?；蛘哒fPH低有利于酸性物質在有機相中的分配，相反，PH高有利于堿性物質在有機相中的分配。經(jīng)過初步實驗， 我們發(fā)現(xiàn)大部分抗生素都可以通過脂溶性有機溶劑或在調節(jié)PH之后通過脂溶性有機溶劑萃取。例如青霉素鈉是水溶性很高的抗生素，但其分子中含有羧基，當PH低于3時，青霉素鈉分子中的羧基與氫離子結合，可大大降低其水溶性，從而可以用乙酸乙酯將其大部分提取出來。僅有少量品種如氨基糖苷類污染物因水溶性太大而無法采用脂溶性有機溶劑進行提取。對于這類污染物，可通過國標方法單獨檢測。在對蜂蜜中抗生素進行萃取時，對萃取劑需考慮以下條件①與目標物極性相近； ②與水不混溶；③毒性??；④沸點在45 80°C以便濃縮。綜合以上條件，本項目初步選擇乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷等為萃取劑，加NaCl鹽析，超聲或微波輔助萃取?？股氐膫鹘y(tǒng)高效液相色譜檢測技術都是通過分離提取某種抗生素，然后將其高效液相色譜圖譜與該抗生素的標準圖譜進行對照而進行各種定性或定量測定。而本項目所使用的原理剛好相反，首先是建立各種來源的無污染蜂蜜樣品(或稱為空白蜂蜜樣品)的標準圖譜庫，然后用分類提取的方法對待測樣品進行分類提取，提取液的高效液相色譜圖再與空白蜂蜜的標準圖譜庫進行比對，若在提取液中發(fā)現(xiàn)了比空白樣品中更多的峰，則該樣品就有可能是含有抗生素污染物的樣品，在此基礎上，再根據(jù)峰的位置和大小確定其可能的抗生素污染物種類。此外，由于蜂蜜本身含有大量的有機化合物，例如維生素、黃酮、 有機酸等，這些物質對人體具有較好的營養(yǎng)價值，是蜂蜜本身所具有的特征性物質，這些物質在一定條件下也有可能會被提取溶劑所抽提，而在高效液相色譜圖上以峰的形式表現(xiàn)出來。因此，為避免這些物質的干擾，還需要根據(jù)蜂蜜的特性提前制訂不含污染物的各品種空白蜂蜜的標準圖譜。在實際的檢測過程中，就可以通過與相應品種空白蜂蜜標準圖譜的比較，確定是否有多余的可疑污染物峰，再與各種標準抗生素的標準圖譜對照，從而確定可疑抗生素污染物的種類。然后，再采用國家標準測定方法確定具體抗生素污染物的品種和數(shù)量。應該指出的是，由于目前絕大多數(shù)蜂農(nóng)在蜜蜂的生產(chǎn)過程中都能堅持科學用藥， 并對少數(shù)用藥后生產(chǎn)的蜂蜜進行單獨處理，因此，目前含有抗生素的蜂蜜在所收購的蜂蜜中只占極少數(shù)，從數(shù)量上看，這少量的含抗生素污染物的蜂蜜所占比重微乎其微，但若一旦混入大量的正品蜂蜜中，將會嚴重影響正品蜂蜜的質量，其后果將是非常嚴重的。因此，本項目的目的就是要在數(shù)量眾多的正品蜂蜜中及時鑒別出含有抗生素污染物的劣質蜂蜜，以便對這些蜂蜜單獨進行處理。在實際的檢測過程中，只需提前建立各品種空白蜂蜜的標準圖譜庫，在收購的蜂蜜中若發(fā)現(xiàn)在相應空白蜂蜜色譜峰中增加了某個可疑色譜峰，即可懷疑這種蜂蜜含有某種抗生素污染物，應單獨存放再根據(jù)可疑色譜峰的位置用國標法進行檢測確證即可。因此，本項目所建立的蜂蜜中抗生素的快速檢測方法主要包括三個方面的內容 ①是提前制訂各種空白蜂蜜的標準圖譜，建立各種空白蜂蜜的標準圖譜庫；②是提前制訂各種抗生素的標準圖譜，建立各種抗生素的標準圖譜庫；③是項目的核心技術“蜂蜜中抗生素的分類提取技術”，主要就是根據(jù)抗生素的這些性質分別進行提取，可將常見的100多種抗生素歸類為少數(shù)幾種類型，僅采用幾類提取方法對蜂蜜進行提取，再與標準圖譜庫進行對照先與①中空白蜂蜜的標準圖譜庫進行對照，若沒有多余的峰則為合格，可混入大量蜂蜜中進行收混合加工；若有多余的峰則為可疑樣品，需要與②中的各種污染物的標準圖譜庫進行對照，或通過常規(guī)的國標法進行確認。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于快速分類提取技術檢測蜂蜜中抗生素殘留的方法，快速而低成本的將少部分含有抗生素的蜂蜜樣品鑒別出來，從而大大減少提取工作量， 縮短抗生素的提取時間，提高檢測效率，降低檢測成本，為出口蜂蜜的安全生產(chǎn)提供技術支撐。本發(fā)明的技術方案基于快速分類提取技術檢測蜂蜜中抗生素殘留的方法，步驟如下
①蜂蜜中抗生素殘留的分類提取
將蜂蜜樣品分別在中性PH7. 0、酸性pH2. 5、及堿性pH9. 0條件下用有機溶劑乙酸乙酯或二氯甲烷進行提取，將蜂蜜樣品中的大部分抗生素殘留提取到溶劑中，得到含有抗生素殘留的分類提取液，留待后續(xù)分析檢測；
②抗生素殘留的快速初篩檢測
將步驟①所得含有抗生素殘留的分類提取液采用高效液相色譜分離檢測技術、高效液相色譜一質譜聯(lián)用技術、便攜式氣相色譜儀或氣相色譜-質譜聯(lián)用技術進行檢測，獲得各種不同的檢測圖譜；
③各種空白蜂蜜的標準圖譜庫的建立
按照步驟①和步驟②所述的分類提取技術和抗生素殘留的快速初篩檢測技術對各種不含污染物的空白蜂蜜進行提取和檢測，得到各種空白蜂蜜的標準圖譜庫；
④各種抗生素殘留的標準圖譜庫的建立按照步驟①和步驟②所述的分類提取技術和抗生素殘留的快速初篩檢測技術對精確添加某種抗生素后的空白蜂蜜進行抗生素殘留的提取和檢測，得到含有某種抗生素的蜂蜜的標準圖譜庫；對逐一進行添加各種抗生素后的空白蜂蜜進行抗生素殘留的提取和檢測， 得到含有各種抗生素殘留的標準圖譜；
⑤然后將步驟②獲得的各種不同的檢測圖譜與步驟④抗生素殘留的標準圖譜、步驟③ 空白蜂蜜的標準圖譜進行對照，即獲得相應抗生素殘留的種類和含量方面的信息。⑥從被測蜂蜜的檢測圖譜中發(fā)現(xiàn)了比空白蜂蜜中有更多的峰，即根據(jù)出峰位置初步判斷含有某種抗生素殘留，然后再結合該種抗生素殘留的國標檢測方法進行確證。所述抗生素為氯霉素類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內脂類、 青霉素類和/或硝基咪唑類。上述抗生素具體為23種抗生素1、甲硝唑；2、磺胺嘧啶；3、磺胺吡啶；4、土霉素； 5、依諾沙星；6、磺胺甲嘧啶；7、氧氟沙星；8、諾氟沙星、氟羅沙星；9、四環(huán)素；10、培氟沙星； 11、環(huán)丙沙星、磺胺二甲嘧啶；12、洛美沙星；13、恩諾沙星；14、奧硝唑；15、加替沙星；16、司帕沙星；17、鹽酸金霉素；18、多西環(huán)素；19、磺胺甲基異噁唑、磺胺甲噁唑；20、氯霉素。綜上所述，本發(fā)明在提前建立相應的圖譜庫時工作量較大，但一旦成功地建立了圖譜庫，在后續(xù)的分析和檢測過程中將會非常的方便和快速，并能低成本而快速的從大量正常蜂蜜中鑒別出含有污染物的蜂蜜。本發(fā)明涉及到分析化學、儀器分析、食品化學、食品工藝學等多個技術領域，需相互交叉滲透，反復研究創(chuàng)新才能解決。本發(fā)明的有益效果由于大多數(shù)的蜂蜜都是合格的蜂蜜，在提前建立了標準圖譜庫的情況下，采用本發(fā)明的方法可以快速而低成本的將少部分含有污染物的樣品鑒別出來，從而大大減少提取工作量，縮短污染物的提取時間，提高檢測效率，降低檢測成本。綜上所述，將本發(fā)明研制的分類快速高通量檢測方法與國家標準檢測方法相結合，可以低成本而快速地檢測出蜂蜜中的多種污染物，為企業(yè)及時鑒別出可能有污染的蜂蜜提供了技術保障。本發(fā)明為出口蜂蜜企業(yè)建立快速、高通量、低成本的蜂蜜中污染物檢測監(jiān)控技術體系，改變目前蜂蜜中污染物檢測效率低、檢測目標單一、價格昂貴、檢測時間長等缺陷，提升企業(yè)的污染物檢測技術水平和監(jiān)控效率，為出口蜂蜜的安全生產(chǎn)提供技術支撐。


圖1蜂蜜的生產(chǎn)工藝流程圖。圖2蜂蜜中污染物的高通量快速初篩技術工藝流程圖。圖3某蜂蜜的空白蜂蜜的標準色譜圖。圖4 23種抗生素標準品混合物殘留色譜圖。
具體實施例方式實施例1某空白蜂蜜的標準圖譜 ①蜂蜜中抗生素殘留的分類提取
將某蜂蜜的空白蜂蜜樣品分別在PH7. 0、pH2. 5、及pH9. 0條件下用有機溶劑乙酸乙酯或二氯甲烷進行提取，將空白蜂蜜樣品中的大部分抗生素殘留提取到溶劑中，得到含有抗生素殘留的分類提取液，留待后續(xù)分析檢測； ②抗生素殘留的快速初篩檢測
將步驟①所得含有抗生素殘留的分類提取液采用高效液相色譜分離檢測技術、高效液相色譜一質譜聯(lián)用技術、便攜式氣相色譜儀或氣相色譜-質譜聯(lián)用技術進行檢測，獲得該蜂蜜的空白蜂蜜的標準圖譜，如圖3所示。實施例2抗生素殘留的標準圖譜庫
按照與實施例1相同的分類提取技術和抗生素殘留的快速檢測技術對在實施例1所用某蜂蜜的空白蜂蜜樣品中精確添加某種抗生素后的蜂蜜樣品進行抗生素殘留的提取和檢測，得到含有某種抗生素的蜂蜜的標準圖譜庫。對23種抗生素逐一進行添加后的空白蜂蜜進行抗生素殘留的提取和檢測，得到含有各種抗生素殘留的標準圖譜；23種抗生素標準品混合物殘留色譜圖，如圖4所示。23種抗生素的標準曲線數(shù)據(jù)如表1所示。所述23種抗生素為1、甲硝唑；2、磺胺嘧啶；3、磺胺吡啶；4、土霉素；5、依諾沙星；6、磺胺甲嘧啶；7、氧氟沙星；8、諾氟沙星、氟羅沙星；9、四環(huán)素；10、培氟沙星；11、環(huán)丙沙星、磺胺二甲嘧啶；12、洛美沙星；13、恩諾沙星；14、奧硝唑；15、加替沙星；16、司帕沙星； 17、鹽酸金霉素；18、多西環(huán)素；19、磺胺甲基異噁唑、磺胺甲噁唑；20、氯霉素。色譜條件(空白蜂蜜樣品與分別添加23種抗生素的蜂蜜樣品所采用的色譜條件均相同。)
色譜柱月旭 Ultimate AQ-C18 (250mmX4. 6mm) 流動相乙腈-水(pH 2.51) 流速lmL/min
檢測器紫外檢測器(雙波長模式) 檢測波長分別為274nm、315nm 柱溫30°C
流動相梯度如表2所示表1 23種抗生素標準曲線及線性范圍
抗生素種類線性方程線性范圍(yg/ml)相關系數(shù)甲硝唑y=45.744x+0. 71960. 2 - 20.9998奧硝唑y=20.411x+0. 45840. 2 - 20.9994氯霉素y=16.792x - 0. 00250. 2 - 20.9983土霉素y=12.810x - 0. 87040. 2 - 20. 9986四環(huán)素y=17. 934x - 0. 26540. 2 - 20.9995多西環(huán)素y=12. 049x+0. 99970. 2 - 20. 9992鹽酸金霉素y=10. 643x+l. 52450. 2 - 20. 9982司帕沙星y=29. 902x+2. 92490. 2 - 20.9987加替沙星y=20. 316x+l. 45560. 2 - 20.9995氧氟沙星y=12.804x+0. 53530. 2 - 20. 9996洛美沙星y=41.463x - 3. 40120. 2 - 20.9981環(huán)丙沙星y=20.900x - 0. 22050. 2 - 21.0000依諾沙星y=50.847x - 6. 92930. 2 - 20. 9999諾氟沙星y=55.755x - 11. 8320. 2 - 20.9979培氟沙星y=36. 711x - 0. 11900. 2 - 20.9982恩諾沙星y=28. 146x - 0. 57700. 2 - 20. 9999氟羅沙星y=22. 735x - 0. 43280. 2 - 20. 9998
權利要求
1.基于快速分類提取技術檢測蜂蜜中抗生素殘留的方法，其特征在于步驟如下①蜂蜜中抗生素殘留的分類提取將蜂蜜樣品分別在中性PH7. 0、酸性pH2. 5、及堿性pH9. 0條件下用有機溶劑乙酸乙酯或二氯甲烷進行提取，將蜂蜜樣品中的大部分抗生素殘留提取到溶劑中，得到含有抗生素殘留的分類提取液，留待后續(xù)分析檢測；②抗生素殘留的快速初篩檢測將步驟①所得含有抗生素殘留的分類提取液采用高效液相色譜分離檢測技術、高效液相色譜一質譜聯(lián)用技術、便攜式氣相色譜儀或氣相色譜-質譜聯(lián)用技術進行檢測，獲得各種不同的檢測圖譜；③各種空白蜂蜜的標準圖譜庫的建立按照步驟①和步驟②所述的分類提取技術和抗生素殘留的快速初篩檢測技術對各種不含污染物的空白蜂蜜進行提取和檢測，得到各種空白蜂蜜的標準圖譜庫；④各種抗生素殘留的標準圖譜庫的建立按照步驟①和步驟②所述的分類提取技術和抗生素殘留的快速初篩檢測技術對精確添加某種抗生素后的空白蜂蜜進行抗生素殘留的提取和檢測，得到含有某種抗生素的蜂蜜的標準圖譜庫；對逐一進行添加各種抗生素后的空白蜂蜜進行抗生素殘留的提取和檢測， 得到含有各種抗生素殘留的標準圖譜庫；⑤然后將步驟②獲得的各種不同的檢測圖譜與步驟④抗生素殘留的標準圖譜、步驟③ 空白蜂蜜的標準圖譜進行對照，即獲得相應抗生素殘留的種類和含量方面的信息；⑥從被測蜂蜜的檢測圖譜中發(fā)現(xiàn)了比空白蜂蜜中有更多的峰，即根據(jù)出峰位置初步判斷含有某種抗生素殘留，然后再結合該種抗生素殘留的國標檢測方法進行確證；所述抗生素為氯霉素類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內脂類、青霉素類和/或硝基咪唑類。
全文摘要
基于快速分類提取技術檢測蜂蜜中抗生素殘留的方法，屬于蜂蜜質量檢測技術領域。本發(fā)明主要通過先建立空白蜂蜜的標準圖譜庫以及精確添加某種抗生素后的抗生素殘留的標準圖譜庫為前提，再將待檢測的蜂蜜樣品的檢測圖與抗生素殘留的標準圖譜庫進行比較，判斷待檢測蜂蜜樣品中抗生素含量是否超標。本發(fā)明所述方法可以快速而低成本的將少部分含有污染物的樣品鑒別出來，大大減少提取工作量，縮短污染物的提取時間，提高檢測效率，降低檢測成本；為出口蜂蜜企業(yè)建立快速、高通量、低成本的蜂蜜中污染物檢測監(jiān)控技術體系，改變目前蜂蜜中污染物檢測效率低、檢測目標單一、價格昂貴、檢測時間長等缺陷，為出口蜂蜜的安全生產(chǎn)提供技術支撐。
文檔編號G01N30/02GK102183596SQ20111004912
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權日2011年3月2日
發(fā)明者盧坤, 童群義, 陳大偉, 陳金林 申請人:江南大學, 江蘇省慶緣康生物科技有限公司