專利名稱：一種測定堿性蛋白酶活力的酶譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物蛋白酶檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種測定堿性蛋白酶活力的酶譜方法。
背景技術(shù)：
酶譜法(zymography)是一種在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)的基礎(chǔ)上通過特異性底物和丙烯酰胺共聚合來測定酶活性的電泳檢測技術(shù)。明膠酶譜法是測定蛋白酶活性的一種常用手段，因該技術(shù)能測定多種降解明膠的蛋白酶活性，且具有方法簡單、 檢測結(jié)果直觀和定量等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用于生物蛋白酶檢測技術(shù)領(lǐng)域。然而，大量的檢測數(shù)據(jù)顯示該方法仍存在一些缺點(diǎn)。如1、缺乏一種能夠適用于多數(shù)蛋白酶的通用方法。2、缺乏特異性更高且能和丙烯酰胺偶聯(lián)的底物。3、難以測定一些 SDS敏感蛋白酶的活性。4、難以測定一些含堿性蛋白酶的組分的活性。相關(guān)文獻(xiàn)
相關(guān)的美國專利包括7，153，660 B2, US2003/0171271 Al。相關(guān)日本專利包括 JP20010023781, JP20010131, JP20040299951, JP20041014。相關(guān)文獻(xiàn)包括Choi NS et al. ， 2006， J. Microbiol. Biotechnol. 16:457-464; Boonyaras Kim SH and Choi NS, 2000，Biosci.，Biotechnol. , Biochem. 64:1722—1725; Cristiane Μ. C. de Salles et al. , 2006, Anal. Biochem. 357:153-155; Christa Heussen and Eugene B. Dowdle, 1980, Anal. Biochem. 102:196-202; Eiichi Saitoh et al. , 2007, Anal. Chem. Insights 2:51-59; Choi NS and Kim SH, 2000， Anal. Biochem. 281(2):236-8; Choi NS et al. , 2005, J. Microbiol. Biotechnol. 15:35-39; Jeff Wilkesman and Liliana Kurz, 2009, Recent Pat. Biotechnol. 3:175-184; Choi NS et al., 2009, Anal. Biochem. 386:121-122; Choi NS et al. , 2001, J. Biochem. Mol. Biol. 34:531-536;Choi NS et al. ， 2003， J. Biochem. Mol. Biol. 37:298-303; PA Snoek-van Beurden and Jff Von den Hoff, 2005， BIOTECHNIQUES 38:73—83; Choi NS et al. ， 2005， J. Microbiol. Biotechnol. 15:537—543; R. Porcel et al. ， 2001， J. Colloid Interface Sci. 239:568-576； A Granel1i-Piperno and E Reich, 1978, J. Exp. Med. ； TM Leber and FR Balkwill, 1997，249:24-28;騫愛榮等，2003，解放軍醫(yī)學(xué)雜志，28 =282-283;姜微波等，2002，植物學(xué)通報(bào)，19:607-610。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于解決酶譜測定時(shí)堿性蛋白酶活性難以檢測的問題，對現(xiàn)有基于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)基礎(chǔ)上的酶譜方法進(jìn)行了改進(jìn)，提供了一種檢測堿性蛋白酶活性的方法。該方法的效果要明顯好于用增加電泳時(shí)間來檢測堿性蛋白酶的酶譜改進(jìn)方法。技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案為一種測定堿性蛋白酶活力的酶譜方法，包括凝膠配制步驟和電泳步驟，電泳用聚丙烯酰胺凝膠由兩種不同組分配比的聚丙烯酰胺凝膠組成
a.聚丙烯酰胺凝膠I由7質(zhì)量份丙烯酰胺混合溶液I和1質(zhì)量份濃縮膠緩沖液組成， 其中
(1)丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯酰胺質(zhì)量體積比為6. 67%、過硫酸銨質(zhì)量體積比0. 133%、 N, N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質(zhì)量體積比0. 133%。(2)濃縮膠緩沖液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質(zhì)量體積比為2. 7%，冰乙酸體積比為2. 87%，ρΗ6· 7。b.聚丙烯酰胺凝膠II由7質(zhì)量份丙烯酰胺混合溶液II和1質(zhì)量份分離膠緩沖液組成，其中
(1)丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯酰胺質(zhì)量體積比為13. 33%、過硫酸銨質(zhì)量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質(zhì)量體積比0. 133%、明膠質(zhì)量體積比 0. 133%。(2)分離膠緩沖液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質(zhì)量體積比為2. 7%，冰乙酸體積比為17. 2%，ρΗ4· 3。c.上述兩種聚丙烯酰胺凝膠分別配制完成后，按照體積比聚丙烯酰胺凝膠I 聚丙烯酰胺凝膠11=2 5，用于制備電泳用聚丙烯酰胺凝膠。本發(fā)明的技術(shù)方案所述的測定堿性蛋白酶活力的酶譜方法，樣品緩沖液中含有質(zhì)量體積比為1%的十六烷基三甲基，體積比為25%的甘油，質(zhì)量體積比為0. 002%甲基綠，體積比為12. 5%濃縮膠緩沖液，ρΗ6· 7。凝膠制好后，按照生物化學(xué)常規(guī)電泳方法制備所需要的其它溶液，并參照常規(guī)操作或根據(jù)情況適當(dāng)調(diào)整進(jìn)行蛋白酶電泳和酶譜分析。本發(fā)明可以應(yīng)用于微生物、植物和動(dòng)物體中得到的堿性蛋白酶的電泳和酶譜分析。有益效果本發(fā)明提供了一種檢測堿性蛋白酶活性的方法，解決了用普通 SDS-PAGE進(jìn)行酶譜實(shí)驗(yàn)后無法正常檢測到堿性蛋白酶活性的問題。本方法能夠有效專一靈敏的檢測堿性蛋白酶活力。


圖1基于SDS-PAGE的酶譜法測定堿性蛋白酶活性(泳道Α、Β)。圖1 (泳道Α)簡稱為圖1 (Α)，圖1 (泳道B)簡稱為圖1 (B)。圖2基于SDS-PAGE的酶譜法測定非堿性蛋白酶和堿性蛋白酶活性。符號M以下的蛋白條帶為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記，圖左邊和符號M下面的蛋白條帶對應(yīng)的數(shù)字標(biāo)記出了各蛋白條帶的分子量大小。圖2 (泳道A)簡稱為圖2 (A)，該泳道蛋白為非堿性蛋白酶，圖2 (泳道B)簡稱為圖2 (B)，該泳道蛋白為堿性蛋白酶。圖3本方法檢測堿性蛋白酶的活性。圖3 (泳道A)簡稱為圖3 (A)，該泳道蛋白為非堿性蛋白酶，圖3 (泳道B)簡稱為圖3 (B)，該泳道蛋白為非堿性蛋白酶，圖3 (泳道C) 簡稱為圖3 (C)，該泳道蛋白為堿性蛋白酶，圖3 (泳道D)簡稱為圖3 (D)，該泳道蛋白為堿性蛋白酶。
具體實(shí)施例方式文中所述質(zhì)量體積比單位為g/mL，體積比單位為mL/mL。實(shí)施例1
現(xiàn)采用該方法，對蛋白酶粗酶液經(jīng)層析純化后各組分進(jìn)行酶譜檢測，并比較了不同方法對不同蛋白酶組分分析的差異，作為該方法檢測實(shí)例。菌株一株地衣芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 807)，這些菌株均為普通微生物保藏中心可以購買到的菌株。培養(yǎng)條件55°C培養(yǎng)M小時(shí)。發(fā)酵產(chǎn)酶條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)48小時(shí)左右。樣品制備用基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵地衣芽孢桿菌(CGMCC No. 1. 807)，培養(yǎng)48小時(shí)后將菌液離心收集粗酶液。粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀后，通過層析分離到耐熱蛋白酶組分。粗酶液和經(jīng)層析得到的蛋白組分中包含堿性蛋白酶和中性蛋白酶，用普通SDS-PAGE進(jìn)行酶譜實(shí)驗(yàn)后無法正常檢測到堿性蛋白酶活性，因?yàn)閴A性蛋白酶會(huì)在膠頂端形成一個(gè)“綁定”區(qū)域， 無法跑入膠中進(jìn)行分離。蛋白酶活性檢測
1、聚丙烯酰胺凝膠的配制
a.聚丙烯酰胺凝膠I由3質(zhì)量份丙烯酰胺混合溶液I和1質(zhì)量份濃縮膠緩沖液組成， 其中
(1)丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯酰胺質(zhì)量體積比為6. 67%、過硫酸銨質(zhì)量體積比0. 133%、 N, N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質(zhì)量體積比0. 133%。(2)濃縮膠緩沖液為 0. 5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 6. 8。b.聚丙烯酰胺凝膠II由3質(zhì)量份丙烯酰胺混合溶液II和1質(zhì)量份濃縮膠緩沖液組成，其中
(1)丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯酰胺質(zhì)量體積比為13. 33%、過硫酸銨質(zhì)量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質(zhì)量體積比0. 133%、明膠質(zhì)量體積比 0. 133%。(2)分離膠緩沖液為 0. 5 mol/L Tris-HCL 溶液，pH 8. 8。
0032]c.上述兩種聚丙烯酰胺凝膠分別配制完成后，按照體積比聚丙烯酰胺凝膠I 聚丙烯酰胺凝膠11=2:5，用于制備電泳用聚丙烯酰胺凝膠。
2、凝膠制好后，取樣品與樣品緩沖液(樣品緩沖液由蔗糖、溴酚藍(lán)、Tris-HCl組成，該溶液中蔗糖質(zhì)量體積比為2%，溴酚藍(lán)質(zhì)量體積比為0.2% ； Tris堿質(zhì)量體積比為 0.6%，pH 6.8) —比一混合均勻后點(diǎn)樣。上樣后，將冰浴的電泳槽放入4°C冰箱，以60V電壓使樣品壓成一條直線并進(jìn)入分離膠，然后將電壓增至100V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)前沿泳出分離膠時(shí)，停止電泳。取下凝膠，將膠置于洗脫液(該溶液由聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),CaCl2Jris-HCl組成，其中Triton X-100質(zhì)量體積比為2. 5%，Tris堿質(zhì)量體積比為0. 6%，CaCl2質(zhì)量體積比為0. 05%, pH7. 5)中振蕩洗脫2次，每次30分鐘，然后用漂洗液(除不含TritonX-IOO外其余同洗脫液)漂洗2次，每次10分鐘，接著將膠置于孵育液 (該溶液由CaCl2、NaCUTris-HCl組成，其中CaCl2質(zhì)量體積比為0. 05%, Tris堿質(zhì)量體積比為0. 6% NaCl質(zhì)量體積比為0. 87%，pH7. 5)中55°C恒溫孵育池。孵育結(jié)束后經(jīng)染色液(該溶液由考馬斯亮藍(lán)、甲醇、冰乙酸組成，其中考馬斯亮藍(lán)質(zhì)量體積比為0. 1%、甲醇質(zhì)量體積比為45%、乙酸質(zhì)量體積比為10%)染色20min，及脫色液A、B(甲醇體積濃度分別為 30%,20%，乙酸體積濃度分別為10%、10%)分別脫色0. 5hUh后，顯示出蛋白酶為位于深色背景上的清晰透亮條帶，條帶亮度的強(qiáng)弱和面積大小經(jīng)過濃度分析后可以定量地表征蛋白酶的活性高低。于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集見圖ι (A)，圖1 (B)，圖2 (A),圖2 (B)0圖 1 (A)為上樣緩沖液中添加SDS的堿性蛋白酶組分，圖1 (B)為上樣緩沖液中不添加SDS的堿性蛋白酶組分。由圖I(A)和(B)中蛋白條帶可見堿性蛋白酶在基于SDS-PAGE的酶譜檢測中會(huì)在分離膠頂端堆積，形成一塊“綁定”區(qū)域無法有效分離，這是由于其等電點(diǎn)高于分離膠的等電點(diǎn)，而活性染色不能用加熱的方法使蛋白完全變性，導(dǎo)致蛋白樣品上的負(fù)電荷不足。圖2 (A)為非堿性蛋白酶，圖2(B)為堿性蛋白酶。3、聚丙烯酰胺凝膠的配制
a.聚丙烯酰胺凝膠I由7質(zhì)量份丙烯酰胺混合溶液I和1質(zhì)量份濃縮膠緩沖液組成， 其中
(1)丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯酰胺質(zhì)量體積比為6. 67%、過硫酸銨質(zhì)量體積比0. 133%、 N, N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質(zhì)量體積比0. 133%。(2)濃縮膠緩沖液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質(zhì)量體積比為2. 7%，冰乙酸體積比為2. 87%，ρΗ6· 7。b.聚丙烯酰胺凝膠II由7質(zhì)量份丙烯酰胺混合溶液II和1質(zhì)量份分離膠緩沖液組成，其中
(1)丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯酰胺質(zhì)量體積比為13. 33%、過硫酸銨質(zhì)量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質(zhì)量體積比0. 133%、明膠質(zhì)量體積比 0. 133%。(2)分離膠緩沖液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質(zhì)量體積比為2. 7%，冰乙酸體積比為17. 2%，ρΗ4· 3。c.上述兩種聚丙烯酰胺凝膠分別配制完成后，按照體積比聚丙烯酰胺凝膠I 聚丙烯酰胺凝膠11=2:5，用于制備電泳用聚丙烯酰胺凝膠。4、凝膠制好后，取樣品與以甲基綠為示蹤劑，以CTAB為助溶劑的樣品緩沖液(樣品緩沖液中含有質(zhì)量體積比為1%的十六烷基三甲基，體積比為25%的甘油，質(zhì)量體積比為 0.002%甲基綠，體積比為12.5%濃縮膠緩沖液，pH6. 7)混合均勻后點(diǎn)樣。上樣后，將冰浴的電泳槽放入4°C冰箱，以60V電壓使樣品壓成一條直線并進(jìn)入分離膠，然后將電壓增至 100V，繼續(xù)電泳至甲基綠前沿泳出分離膠時(shí)，停止電泳。取下凝膠，將膠置于洗脫液(該溶液由聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、CaCl2、iTris-HCl組成，其中Triton X-100質(zhì)量體積比為2. 5%，Tris堿質(zhì)量體積比為0. 6%，CaCl2質(zhì)量體積比為0. 05%, ρΗ7· 5)中振蕩洗脫2次，每次30分鐘，然后用漂洗液漂洗2次，每次10分鐘，接著將膠置于孵育液(該溶液由CaCl2、NaCl、Tris-HCl組成，其中CaCl2質(zhì)量體積比為0. 05%, Tris堿質(zhì)量體積比為0. 6% NaCl質(zhì)量體積比為0. 87%，pH7. 5)中55°C恒溫孵育池。孵育結(jié)束后經(jīng)染色液(該溶液由考馬斯亮藍(lán)、甲醇、冰乙酸組成，其中考馬斯亮藍(lán)質(zhì)量體積比為0. 1%、甲醇質(zhì)量體積比為 45%、乙酸質(zhì)量體積比為10%)染色20min，及脫色液A、B(甲醇體積濃度分別為30%、20%， 乙酸體積濃度分別為10%、10%)分別脫色0. 5h、lh后，顯示出蛋白酶為位于深色背景上的清晰透亮條帶。于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集見圖3。圖3泳道A、B中的蛋白均為通過層析分離到非堿性蛋白酶組分，該組分能在基于SDS-PAGE的酶譜中正常檢測，但無法在用于檢測堿性蛋白酶活力的本方法中被檢測到。圖3泳道C、D分別為上樣緩沖液添加CTAB的堿性蛋白酶組分和上樣緩沖液中不添加CTAB的堿性蛋白酶組分。由圖3可見，無論是否添加 CTAB，堿性蛋白酶樣品都在背景上留下了清晰透露的條帶，而添加CTAB后酶譜效果更佳。 證明了本方法能夠有效專一靈敏的檢測堿性蛋白酶活力。
權(quán)利要求
1.一種測定堿性蛋白酶活力的酶譜方法，包括凝膠配制步驟和電泳步驟，其特征在于電泳用聚丙烯酰胺凝膠由兩種不同組分配比的聚丙烯酰胺凝膠組成a.聚丙烯酰胺凝膠I由7質(zhì)量份丙烯酰胺混合溶液I和1質(zhì)量份濃縮膠緩沖液組成， 其中(1)丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、過硫酸銨、N，N，N',N'-四甲基二乙胺(TEMED) 和超純水組成，該溶液中丙烯酰胺質(zhì)量體積比為6. 67%、過硫酸銨質(zhì)量體積比0. 133%、 N，N，N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質(zhì)量體積比0. 133%;(2)濃縮膠緩沖液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質(zhì)量體積比為 2. 7%，冰乙酸體積比為2. 87%，ρΗ6· 7 ；b.聚丙烯酰胺凝膠II由7質(zhì)量份丙烯酰胺混合溶液II和1質(zhì)量份分離膠緩沖液組成，其中(1)丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明膠、過硫酸銨、N，N，N',N'-四甲基二乙胺(TEMED)和超純水組成，該溶液中丙烯酰胺質(zhì)量體積比為13. 33%、過硫酸銨質(zhì)量體積比0. 133%、N, N, N' ,N'-四甲基二乙胺(TEMED)質(zhì)量體積比0. 133%、明膠質(zhì)量體積比 0. 133% ；(2)分離膠緩沖液由氫氧化鉀、冰乙酸和超純水組成，該溶液中氫氧化鉀質(zhì)量體積比為 2. 7%，冰乙酸體積比為17. 2%，ρΗ4· 3 ；c.上述兩種聚丙烯酰胺凝膠分別配制完成后，按照體積比聚丙烯酰胺凝膠I 聚丙烯酰胺凝膠11=2 5，用于制備電泳用聚丙烯酰胺凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定堿性蛋白酶活力的酶譜方法，其特征在于樣品緩沖液中含有質(zhì)量體積比為1%的十六烷基三甲基，體積比為25%的甘油，質(zhì)量體積比為0. 002%甲基綠，體積比為12. 5%濃縮膠緩沖液，ρΗ6· 7。
全文摘要
一種測定堿性蛋白酶活力的酶譜方法，包括凝膠配制步驟和電泳步驟，電泳用聚丙烯酰胺凝膠由兩種不同組分配比的聚丙烯酰胺凝膠組成。本發(fā)明提供的方法，解決了用普通SDS-PAGE進(jìn)行酶譜實(shí)驗(yàn)后無法正常檢測到堿性蛋白酶活性的問題。本方法能夠有效專一靈敏的檢測堿性蛋白酶活力。
文檔編號G01N27/447GK102174641SQ201110052578
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者朱泓, 林先貴, 王一明 申請人:中國科學(xué)院南京土壤研究所