專利名稱：用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的電極及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及電分析化學(xué)、生物傳感器、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域中的電化學(xué)傳感器，特別涉及用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的電極及其制備方法，以及由該電極組裝得到的可用于水中揮發(fā)酚檢測(cè)的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置和電化學(xué)傳感器。
背景技術(shù)：
酚類物質(zhì)指帶有苯酚基的有機(jī)物，其檢測(cè)備受關(guān)注，尤其是水中揮發(fā)酚類的檢測(cè)。水中酚類主要來自煉油、煤氣洗滌、煉焦、造紙、合成氨、木材防腐和化工等廢水。人體攝入一定量時(shí)，可出現(xiàn)急性中毒癥狀；長(zhǎng)期飲用被酚污染的水，可引起頭暈、出疹、瘙癢、貧血及各種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。水中含低質(zhì)量濃度(O. 11 O. 2mg/L)酚類時(shí)，可使水中魚的魚肉有異味，含高質(zhì)量濃度(>5mg/L)酚類時(shí)，則造成魚中毒死亡。含酚濃度高的廢水 不宣用于農(nóng)田灌溉，否則會(huì)使農(nóng)作物枯死或減產(chǎn)。因此，準(zhǔn)確測(cè)定水中揮發(fā)酚的含量，對(duì)人類健康和環(huán)境監(jiān)測(cè)都有重要意義。酚類是指苯及其稠環(huán)的羥基衍生物。酚類化合物種類繁多，不同的酚類化合物具有不同的沸點(diǎn)。水中揮發(fā)酚，是以沸點(diǎn)低于230°C，且在蒸餾時(shí)能與水蒸氣ー并揮發(fā)餾出的這ー類酚類化合物。水中揮發(fā)酚的分析方法有氣相色譜法、溴化容量法、4氨基安替比林(以下簡(jiǎn)稱4-AAP)分光光度法、酚試劑(MBTH)法、紫外差值分光光度法、原子吸收分光光度測(cè)定法等，我國(guó)普遍采用的是4-AAP分光光度法(GB 7490-1987)，日本、美國(guó)等也采用。由于不同的酚類化合物所產(chǎn)生色澤的最大吸收在同一波長(zhǎng)，4-AAP分光光度法尤其適用測(cè)定水中低濃度酚總量。在測(cè)定水中揮發(fā)酚中，影響因素很多，如樣品采集及固定，樣品預(yù)處理，4-AAP處理等等(指4-AAP分光光度法的實(shí)驗(yàn)操作中的顯色處理)。在測(cè)定過程中，若操作不當(dāng)均會(huì)給分析結(jié)果帶來誤差。而且4-AAP分光光度法操作步驟多，耗時(shí)較長(zhǎng)，且有外加試劑消耗，因此酚類物質(zhì)的電化學(xué)傳感器和水中揮發(fā)酚的即時(shí)檢測(cè)技術(shù)有廣大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供作為工作電極應(yīng)用于檢測(cè)水中揮發(fā)酚類物質(zhì)的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極及其制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供以納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極組裝得到的用于檢測(cè)水中揮發(fā)酚類物質(zhì)的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置。本發(fā)明的還一目的是提供以納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極組裝得到的用于檢測(cè)水中揮發(fā)酚類物質(zhì)的電化學(xué)傳感器。檢測(cè)水中揮發(fā)酚類物質(zhì)所使用的工作電極可采用酪氨酸酶、漆酶等作為活性物。由于酪氨酸酶有活性高及選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明采用酪氨酸酶為活性物來修飾硼摻雜金剛石薄膜電極，制備了納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極，并將該電極作為檢測(cè)水中揮發(fā)酚類物質(zhì)的工作電極，并進(jìn)一步以此工作電極組裝成一種用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置及電化學(xué)傳感器。本發(fā)明的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置及電化學(xué)傳感器在測(cè)定酚類物質(zhì)時(shí)具有準(zhǔn)確、微量、快速、簡(jiǎn)便、靈敏、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，此外所述的電化學(xué)傳感器還有易于實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的電極是以硼摻雜金剛石薄膜為電極基底，是ー種由納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極(即在硼摻雜金剛石薄膜電極的表面共同修飾有納米粒子與酪氨酸酶)。所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極的表面固定有酪氨酸酶。所述的納米粒子是粒徑為50_500nm的納米金剛石,或是粒徑為50_500nm的納米金剛石與粒徑為10-50nm的納米金顆粒的混合物。所述的混合物中的粒徑為50-500nm的納米金剛石與粒徑為10_50nm的納米金顆粒的質(zhì)量比為1:1。本發(fā)明的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極可由以下兩種方法制備得到方法一將酪氨酸酶溶解于pH = 7的O. OlM磷酸緩沖液中得到100mg/ml的酪氨酸酶溶液，將所述的酪氨酸酶溶液與10mg/ml的納米金剛石分散液按體積比為I : I的比例混合(所述的納米金剛石分散液是納米金剛石在超純水中超聲分散得到的，所述納米金剛石的粒徑為50-500nm)，得到酪氨酸酶與納米金剛石的混合溶液，在溫度為4°C下冷藏放置8小吋，加入與所述的酪氨酸酶與納米金剛石的混合溶液等體積的質(zhì)量濃度為2. 5%的戊ニ醛水溶液，混合均勻，立即滴于氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面，在溫度為4°C下冷藏8-12小時(shí)后取出，在室溫下干燥至氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面形成一層均勻的固化膜，用pH = 7的O. OlM磷酸緩沖液沖洗后晾干，得到所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。方法ニ將酪氨酸酶溶解于pH = 7的O. OlM磷酸緩沖液中得到100mg/ml酪氨酸酶溶液，將所述的酪氨酸酶溶液與10mg/ml的納米金剛石分散液按體積比為I : I的比例混合(所述的納米金剛石分散液是納米金剛石在超純水中超聲分散得到的；所述納米金剛石的粒徑為50-500nm)，得到酪氨酸酶與納米金剛石的混合溶液，在溫度為4°C下冷藏放置8小吋，依次加入與所述的酪氨酸酶與納米金剛石的混合溶液等體積的質(zhì)量濃度為2. 5%的戊ニ醛水溶液和質(zhì)量濃度為O. 01%的納米金溶膠(所述的納米金溶膠的制備方法可參照文獻(xiàn)“G. Frens, Nature Phys. Sci. 241 (1973) 20”所述的納米金溶膠中的納米金顆粒的粒徑為10-50nm)，混合均勻，立即滴于氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面，在溫度為4°C下冷藏8小時(shí)后取出，在室溫下干燥至氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面形成一層均勻的固化膜，用PH = 7的O. OlM磷酸緩沖液沖洗后晾干，得到所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。所述的氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜電極是利用光化學(xué)方法在硼摻雜金剛石薄膜上修飾氨基得到的；其具體制備方法可為將硼摻雜金剛石薄膜浸泡在烯丙胺中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下被254nm的紫外光照射6_8小時(shí)，取出后用こ醇洗凈后得到所述的氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜。
上述方法一和方法ニ的制備過程中都采用了戊ニ醛為交聯(lián)劑，從而使所述的酪氨酸酶固定在所述的兩種納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極的表面；所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極可作為對(duì)水中的酚類物質(zhì)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置中的工作電極，或作為對(duì)水中的酚類物質(zhì)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的電化學(xué)傳感器中的工作電極，所述工作電極與電化學(xué)工作站連接。本發(fā)明的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的結(jié)構(gòu)為在一底部有圓形小孔的石英電解池的底部外面固定有所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極(可通過ー個(gè)不銹鋼架子被夾到該底部有圓形小孔的石英電解池的底部外面)，在該納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極的另一面相接有一不銹鋼底板；所述納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極與所述石英電解池之間有橡膠密封圈(橡膠密封圈內(nèi)的面積即為有效工作電極面積)；將對(duì)電極(如鉬電極)和參比 電極(如銀/氯化銀電極)置于所述石英電解池之中，以所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為工作電極；電化學(xué)檢測(cè)裝置組裝完成后，由下到上依次為不銹鋼底板、工作電極、橡膠密封圈、石英電解池。所述的工作電極可通過導(dǎo)電的所述不銹鋼底板與電化學(xué)工作站相互連接。本發(fā)明的電化學(xué)傳感器(結(jié)構(gòu)如圖I所示)包括電極帽、橡膠密封圈、工作電極、導(dǎo)電基片、對(duì)電極、電極桿、對(duì)電極導(dǎo)線和工作電極導(dǎo)線等；所述的電化學(xué)傳感器中的所述的電極桿是一形狀為凸形形狀的圓柱體管，在該凸形形狀的圓柱體管的小直徑的圓柱體的表面帶有螺紋，且在小直徑的圓柱體的頂端開有凹槽；在該凸形形狀的圓柱體管的大直徑的圓柱體的側(cè)壁內(nèi)，并且沿著所述的大直徑的圓柱體的縱向方向(中軸線方向)，開有貫通所述的大直徑的圓柱體的直孔；所述的導(dǎo)電基片安插在所述的凹槽中；與所述的導(dǎo)電基片相連接的所述的工作電極導(dǎo)線從所述的凸形形狀的圓柱體管的中間的孔道中穿出凸形形狀的圓柱體管外；所述的導(dǎo)電基片的另一面連接有所述的工作電極；所述的對(duì)電極為圓環(huán)形金屬圈(材料可為不銹鋼、鉬等在電化學(xué)領(lǐng)域常用的對(duì)電極材料)，其套在所述的小直徑的圓柱體與大直徑的圓柱體分界處的小直徑的圓柱體上(落在所述的小直徑的圓柱體與大直徑的圓柱體分界處的大直徑的圓柱體的端面上)，所述的對(duì)電極導(dǎo)線穿過所述的大直徑的圓柱體上的直孔與所述的對(duì)電極連接(可通過焊接)；所述的電極帽是一具有內(nèi)螺紋，且中心有圓孔的蓋型螺帽；所述的蓋型螺帽的螺帽蓋與所述的工作電極之間有橡膠密封圈；所述的電極帽通過其內(nèi)螺紋與所述的電極桿的小直徑的圓柱體表面帶有的外螺紋螺合。所述的工作電極是納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。所述的工作電極與所述的橡膠密封圈接觸的一面為所述的工作電極的有效作用面。所述的電極帽、橡膠密封圈、工作電極和電極桿上的導(dǎo)電基片兩兩之間依次緊密連接；所述的電極桿的材料可為聚四氟こ烯管。本發(fā)明的用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的電極在對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)時(shí)的原理為水中的酚類物質(zhì)在所述的工作電極上的酪氨酸酶的催化作用下，被水中的溶解氧氧化成為醌，所述的醌是ー種具有電化學(xué)活性的物質(zhì)，能夠在一定的電壓下進(jìn)行電化學(xué)還原并產(chǎn)生電化學(xué)還原電流信號(hào)，所述的醌的電化學(xué)還原電流信號(hào)與水中的酚類物質(zhì)的濃度之間有數(shù)量關(guān)系，根據(jù)所述的醌的電化學(xué)還原電流信號(hào)與水中的酚類物質(zhì)的濃度之間的數(shù)量關(guān)系能夠計(jì)算出水中的酚類物質(zhì)的濃度。本發(fā)明的用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置和電化學(xué)傳感器在對(duì)水中的酚類物質(zhì)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)時(shí)的方法可以為將所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置，或者所述的電化學(xué)傳感器中所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜工作電極正確連接至電化學(xué)工作站，在-O. 05V(vs.Ag/AgCl)的工作電壓下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，從而檢測(cè)出含有不同濃度的酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的還原電流信號(hào)，通過excel, origin等數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行線性擬合，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到表征還原電流信號(hào)與所述的pH = 6. 5的標(biāo)準(zhǔn)溶液中的酚類物質(zhì)的濃度的數(shù)量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)方程I = ax+b，其中，
a、b為線性擬合所得到的參數(shù)，X為所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液中的酚類物質(zhì)的濃度，y為與所述的標(biāo) 準(zhǔn)溶液的酚類物質(zhì)的濃度相對(duì)應(yīng)的還原電流信號(hào)；然后再通過恒電壓計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)含有未知濃度的酚類物質(zhì)的即待測(cè)溶液的還原電流信號(hào)ix，代入所述標(biāo)準(zhǔn)方程y = ax+b，得到ix = ax+b，可計(jì)算得到含有未知濃度的酚類物質(zhì)的待測(cè)溶液所含的酚類物質(zhì)的濃度X =(ix_b) /a。本發(fā)明的用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置和電化學(xué)傳感器在應(yīng)用于電化學(xué)檢測(cè)pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液中的苯酚時(shí)，最佳條件下檢測(cè)范圍為O. 05-0. 4mg/L，檢出限達(dá)到O. 002mg/L。所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜工作電極，在室溫下、pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液中可以連續(xù)使用約3天，在4°C的pH = 6. 5的磷酸緩沖液中可以保存約10周。本發(fā)明采用納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜作為用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置和電化學(xué)傳感器中的工作電極，使該用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置和電化學(xué)傳感器對(duì)水中的酚類物質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)靈敏度高，檢出限低，重復(fù)性好。所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置和電化學(xué)傳感器具有密封性好、干擾電流小、操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、工作電極可以拆換的優(yōu)勢(shì)。


圖I.本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的側(cè)視圖。圖2.本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的側(cè)面透視圖。圖3.本發(fā)明電化學(xué)傳感器的縱向拆解圖。圖4.本發(fā)明電化學(xué)傳感器的電極帽的橫向剖視圖。圖5.本發(fā)明實(shí)施例I的恒電壓計(jì)時(shí)電流曲線，工作電壓為-O. 05V(vs. Ag/AgCl)。圖6.本發(fā)明實(shí)施例I的苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7.本發(fā)明實(shí)施例2的恒電壓計(jì)時(shí)電流曲線，工作電壓為-O. 05V(vs. Ag/AgCl)。圖8.本發(fā)明實(shí)施例2的苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖9.本發(fā)明實(shí)施例3的恒電壓計(jì)時(shí)電流曲線，工作電壓為-O. 05V(vs.Ag/AgCl)。圖10.本發(fā)明實(shí)施例3的苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖11.本發(fā)明實(shí)施例4的苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖12.本發(fā)明實(shí)施例5的苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。附圖標(biāo)記I.電極帽 2.密封圈 3.工作電極 4.導(dǎo)電基片5.對(duì)電極 6.電極桿 7.空隙8.對(duì)電極導(dǎo)線9.空隙 10.空隙 11.工作電極導(dǎo)線
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I : 一、工作電極的制備所述工作電極為納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。作為所述工作電極的基底的硼摻雜金剛石薄膜是通過熱絲化學(xué)氣相沉積方法(熱絲化學(xué)氣相沉積裝置由上海交通大學(xué)交友鉆石涂層有限公司、上海東貝真空設(shè)備有限公司聯(lián)合研制)，在硅(100)片上沉積硼摻雜微米級(jí)金剛石顆粒而成，所述硼摻雜金剛石薄膜被切割成 的正萬形。將上述硼摻雜金剛石薄膜依次在IOml的水(本發(fā)明中的各實(shí)施例中所用的水均由Millipore Milli-Q純水儀制備)、こ醇、丙酮中各超聲10分鐘洗凈后，在空氣中晾干。然后將所述硼摻雜金剛石薄膜浸泡于烯丙胺中，在室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下、紫外光(254nm)照射6小時(shí)后，取出，用こ醇沖洗后晾干，得到氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜。用磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鈉和水分別配制pH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液和pH =6. 5的O. IM磷酸緩沖液。配制含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。
配制含有O. 2mg/L苯酚的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液作為待測(cè)溶液。稱取O. Olg粒徑為IOOnm的納米金剛石粉末，超聲分散于Iml水中，得到納米金剛
石分散液。稱取Img酪氨酸酶(購(gòu)買自沃辛頓生化，規(guī)格為> 1000ku/mg)，溶解于10 μ L的pH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液中，得到酪氨酸酶溶液，將所述的酪氨酸酶溶液與10 μ L所述的納米金剛石分散液混合均勻，得到酪氨酸酶與納米金剛石的混合溶液，在溫度為4°C下冷藏放置8小時(shí)，加入20 μ L的質(zhì)量濃度為2. 5%的戊ニ醛水溶液混合均勻，立即取5 μ L的所述的納米粒子與酪氨酸酶的混合液，滴加于所述的氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面，在溫度為4°C下冷藏8小時(shí)后取出，在室溫下干燥I小時(shí)，在所述的氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面形成ー層均勻的酪氨酸酶修飾層，用pH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液沖洗后晾干，得到所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極，即為所述工作電扱。ニ、三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的組裝在一底部有圓形小孔的石英電解池的底部外面，通過ー個(gè)不銹鋼架子固定有一所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極，在該納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極的另一面相接有一不銹鋼底板；所述納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極與所述石英電解池之間用橡膠密封圈(橡膠密封圈的外徑不大于工作電極的邊長(zhǎng))進(jìn)行密封；將作為對(duì)電極的鉬電極和作為參比電極的銀/氯化銀電極置于所述石英電解池之中，以所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為工作電極；電化學(xué)檢測(cè)裝置組裝完成后，由下到上依次為不銹鋼底板、工作電極、橡膠密封圈、石英電解池。三、苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線將上述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為工作電極，鉬電極作為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電極線與電化學(xué)工作站(美國(guó)普林斯頓Potetentiostat/Galvanostat Model263A)連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中加入IOmL的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù) 設(shè)定工作電壓為-O. 05V(vs. Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待基線電流穩(wěn)定后，向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中的IOmL的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液中加入4 μ L的含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)ー個(gè)還原電流信號(hào)，在電流-吋間曲線上(圖5)顯示為ー個(gè)電流越階，當(dāng)所述的還原電流信號(hào)穩(wěn)定后，依照上述步驟重復(fù)加入4 μ L的含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液，總共加入7次，得到顯示出7個(gè)電流越階的電流-時(shí)間(圖5)曲線，所述的電流-吋間(圖5)曲線的基線為背景電流信號(hào)，對(duì)應(yīng)pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液中的苯酚濃度為0mg/L(即pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液中不含苯酚)，所述的電流-時(shí)間(圖5)曲線上的7個(gè)電流越階所顯示的還原電流信號(hào)按照時(shí)間順序?qū)?yīng)著pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液的苯酚濃度依次為 0. 04,0. 08,0. 12,0. 16,0. 2,0. 24,0. 28mg/L。使用數(shù)據(jù)處理軟件0rigin6. O進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以所述的電流-時(shí)間(圖5)曲線顯示的背景電流信號(hào)和7個(gè)電流越階所顯示的還原電流信號(hào)為縱坐標(biāo)(y)，以0、0. 04,0. 08、O. 12,0. 16,0. 2,0. 24,0. 28mg/L為橫坐標(biāo)(x)作圖，得到圖6所示的8數(shù)據(jù)點(diǎn)，對(duì)上述8數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，得到pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液中的苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)及標(biāo)準(zhǔn)方程y = 10. 20+213. 45x,線性因子R = O. 9997，線性范圍為O. 04-0. 28mg/L,檢出限(信噪比=3/1)為 0. lmg/Lo四、待測(cè)溶液苯酚濃度的檢測(cè)將上述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為工作電極，鉬電極作為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電極線與電化學(xué)工作站(美國(guó)普林斯頓Potetentiostat/Galvanostat Model263A)連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中加入5-10mL的待測(cè)溶液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為-0. 05V (vs. Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待電流穩(wěn)定后，讀出電流值ix =55. 2nA，即待測(cè)溶液所含苯酚濃度對(duì)應(yīng)的還原電流信號(hào)，將ix = 55. 2代入所述標(biāo)準(zhǔn)方程y=10. 20+213. 45x，得到ix = y = 10. 20+213. 45x，可計(jì)算得到含有未知濃度的酚類物質(zhì)的待測(cè)溶液所含的酚類物質(zhì)的濃度X = (ix-10. 20)/213. 45 = O. 21082 (mg/L)。實(shí)施例2
一、工作電極的制備所述工作電極為納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。作為所述工作電極的基底的硼摻雜金剛石薄膜是通過熱絲化學(xué)氣相沉積方法(熱絲化學(xué)氣相沉積裝置由上海交通大學(xué)交友鉆石涂層有限公司、上海東貝真空設(shè)備有限公司聯(lián)合研制)，在硅(100)片上沉積硼摻雜微米級(jí)金剛石顆粒而成，所述硼摻雜金剛石薄膜被切割成
的正萬形。將上述硼摻雜金剛石薄膜依次在IOml的水(本實(shí)施例中所用的水均由MiIIiporeMilli-Q純水儀制備)、こ醇、丙酮中各超聲10分鐘洗凈后，在空氣中晾干。然后將所述硼摻雜金剛石薄膜浸泡于烯丙胺中，在室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下、紫外光(254nm)照射6小時(shí)后，取出，用こ醇沖洗后晾干，得到氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜。用磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鈉和水分別配制pH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液和pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液。配制含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制含有O. 2mg/L苯酚的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液作為待測(cè)溶液。采用檸檬酸三鈉還原法制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 01%的納米金溶膠(具體方法可參照文獻(xiàn)“G. Frens, Nature Phys. Sci. 241 (1973) 20”)，所述納米金溶膠的粒徑為 10_50nm。稱取O. Olg粒徑為IOOnm的納米金剛石粉末，超聲分散于Iml的水中，得到納米金剛石分散液。稱取Img酪氨酸酶(購(gòu)買自沃辛頓生化，規(guī)格為> 1000ku/mg)，溶解于10 μ L的PH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液中，得到酪氨酸酶溶液，將所述酪氨酸酶溶液與10 μ L的所述的納米金剛石分散液混合均勻，4°C冷藏放置8小吋，依次加入20 μ L的質(zhì)量濃度為2. 5%的戊ニ醛水溶液和20 μ L的質(zhì)量濃度為O. 01%的納米金溶膠，混合均勻，立即取10 μ L的所述的納米粒子與酪氨酸酶的混合液，滴加于所述的氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面，4°C冷藏8小時(shí)后在室溫下干燥至所述硼摻雜金剛石薄膜的表面形成一層均勻的酪氨酸酶修飾層，用pH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液沖洗后晾干，得到納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極，即為所述工作電極。ニ、三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的組裝組裝方法及組裝出的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置同實(shí)施例I。三、苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線將上述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為工作電極，鉬電極作為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極(上海雷磁218型)作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電極線與電化學(xué)工作站(美國(guó)普林斯頓Potetentiostat/Galvanostat Model 263A)連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中加入IOmL的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為-0. 05V(vs. Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待基線電流穩(wěn)定后，向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中的IOmL的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液中加入5 μ L的含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)ー個(gè)還原電流信號(hào)，在電流-吋間曲線上(圖7)顯示為一個(gè)電流越階，當(dāng)所述的還原電流信號(hào)穩(wěn)定后，依照上述步驟重復(fù)加入5 μ L的含有100mg/L苯酚的pH=6. 5的O. IM磷酸緩沖液，總共加入8次，得到顯示出8個(gè)電流越階的電流-時(shí)間(圖7)曲線，所述的電流-時(shí)間(圖7)曲線的基線為背景電流信號(hào)，對(duì)應(yīng)pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液中的苯酚濃度為Omg/L，所述的電流-時(shí)間(圖7)曲線上的8個(gè)電流越階所顯示的還原電流信號(hào)按照時(shí)間順序?qū)?yīng)著pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液的苯酚濃度依次為O. 05、O. 1、0· 15、0· 2、0· 25、0· 3、0. 35、0. 4mg/L。使用數(shù)據(jù)處理軟件0rigin6. O進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以所述的電流-時(shí)間(圖7)曲線顯示的背景電流信號(hào)和8個(gè)電流越階所顯示的還原電流信號(hào)為縱坐標(biāo)(y)，以0、0. 05,0. I、O. 15、O. 2、O. 25、O. 3、O. 35、O. 4mg/L為橫坐標(biāo)(x)作圖，得到圖8所示的9個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，對(duì)上述9個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，得到pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液中的苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)及標(biāo)準(zhǔn)方程y = -I. 92+330. 27x，線性因子R = O. 9987，線性范圍為O. 05-0. 4mg/L，檢出限(信噪比=3/1)為 O. 002mg/L。四、待測(cè)溶液苯酚濃度的檢測(cè)將上述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為工作電極，鉬電極作為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電極線與電化學(xué)工作站(美國(guó)普林斯頓Potetentiostat/Galvanostat Model263A)連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中加入5-10mL的待測(cè)溶液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為-0. 05V (vs. Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待電流穩(wěn)定后，讀出電流值ix =63. 3nA，即待測(cè)溶液所含苯酚濃度對(duì)應(yīng)的還原電流信號(hào)，將ix = 63. 3代入所述標(biāo)準(zhǔn)方程y=-I. 92+330. 27x，得到ix = -I. 92+330. 27x，可計(jì)算得到含有未知濃度的酚類物質(zhì)的待測(cè)溶液所含的酚類物質(zhì)的濃度X = (ix+l. 92)/330. 27 = O. 1975 (mg/L)。實(shí)施例3 一、工作電極的制備所述工作電極為納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。作為所述工作電極的基底的硼摻雜金剛石薄膜是通過熱絲化學(xué)氣相沉積方法(熱絲化學(xué)氣相沉積裝置由上海交通大學(xué)交友鉆石涂層有限公司、上海東貝真空設(shè)備有限公司聯(lián)合研制)，在硅(100)片上沉積硼摻雜微米級(jí)金剛石顆粒而成，所述硼摻雜金剛石薄膜被切割成
的正萬形。將上述硼摻雜金剛石薄膜依次在IOml的水(本實(shí)施例中所用的水均由MiIIiporeMilli-Q純水儀制備)、こ醇、丙酮中各超聲10分鐘洗凈后，在空氣中晾干。然后將所述硼摻雜金剛石薄膜浸泡于烯丙胺中，在室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下、紫外光(254nm)照射6小時(shí)后，取出，用こ醇沖洗后晾干，得到氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜。用磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鈉和水分別配制pH = 7. O的0. OlM磷酸緩沖液和pH =6. 5的0. IM磷酸緩沖液。配制含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制含有0. 2mg/L苯酚的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液作為待測(cè)溶液。
稱取0. Olg粒徑為IOOnm的納米金剛石粉末，超聲分散于Iml的水中，得到納米金剛石分散液。采用檸檬酸三鈉還原法制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 01%的納米金溶膠(具體方法可參照文獻(xiàn)“G. Frens, Nature Phys. Sci. 241 (1973) 20”)，所述納米金溶膠的粒徑為 10_50nm。稱取Img酪氨酸酶(購(gòu)買自沃辛頓生化,規(guī)格為> 1000ku/mg),溶解于10 μ L的PH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液中，得到酪氨酸酶溶液，將所述酪氨酸酶溶液與10 μ L的所述的納米金剛石分散液混合均勻，4°C冷藏放置8小吋，依次加入20 μ L的質(zhì)量濃度為2. 5%的戊ニ醛水溶液和20 μ L的質(zhì)量濃度為O. 01%的納米金溶膠，混合均勻，立即取10 μ L的所述的納米粒子與酪氨酸酶的混合液，滴加于所述的氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面，4°C冷藏8小時(shí)后在室溫下干燥至所述硼摻雜金剛石薄膜的表面形成一層均勻的酪氨酸酶修飾層，用pH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液沖洗后晾干，得到納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極，即為所述工作電極。ニ、電化學(xué)傳感器的組裝 請(qǐng)參見圖1、2、3。所述的電化學(xué)傳感器包括電極帽I、橡膠密封圈2、工作電極3、導(dǎo)電基片4、對(duì)電極5、電極桿6、對(duì)電極導(dǎo)線8和工作電極導(dǎo)線11等。所述的電化學(xué)傳感器中的所述的電極桿6是ー形狀為凸形形狀的圓柱體中空聚四氟こ烯管，其外直徑為20mm，總長(zhǎng)度為80mm;在該中空聚四氟こ烯管一端的小直徑的圓柱體(其外直徑為12mm，外螺紋部分長(zhǎng)度為15mm)的表面帶有螺紋，且在小直徑的圓柱體的頂端中心開有圓形凹槽(半徑大小在所述中空聚四氟こ烯管的中間的孔道(可為l_2mm)與所述中空聚四氟こ烯管一端的小直徑的圓柱體的外直徑之間，深度可為1-3_);在該中空聚四氟こ烯管另一端的大直徑的圓柱體的側(cè)壁內(nèi)，并且沿著所述的大直徑的圓柱體的縱向方向(中軸線方向)，有一個(gè)打通了所述的大直徑的圓柱體的內(nèi)直徑為l_2mm的直孔。所述的導(dǎo)電基片4可為銅等導(dǎo)電金屬制成的表面平整的圓形薄片，直徑等于所述形狀為凸形形狀的圓柱體中空聚四氟こ烯管上的所述圓形凹槽的直徑，厚度略大于所述形狀為凸形形狀的圓柱體中空聚四氟こ烯管上的所述凹槽的深度(厚2-4mm)，所述導(dǎo)電基片4穩(wěn)定安插在所述的圓形凹槽中；所述工作電極導(dǎo)線11的一端通過導(dǎo)電銀膠與放置在所述圓形凹槽內(nèi)的所述導(dǎo)電基片4牢固粘結(jié)在一起，所述工作電極導(dǎo)線11的另一端沿所述的凸形形狀的圓柱體中空聚四氟こ烯管的中間的孔道穿出凸形形狀的圓柱體中空聚四氟こ烯管外，并且所述工作電極導(dǎo)線11與所述中空聚四氟こ烯管的中間的孔道之間的第三空隙10用絕緣膠密封；所述導(dǎo)電基片4的上面連接有所述工作電極3。所述的對(duì)電極5為圓環(huán)形不銹鋼圈，其外直徑為20mm，內(nèi)直徑略大于所述小直徑的圓柱體的外徑(能套過小直徑的圓柱體即可)，厚度為3mm ;所述的對(duì)電極導(dǎo)線8 (銅絲)的一端通過錫焊與套在所述的小直徑的圓柱體與大直徑的圓柱體分界處的小直徑的圓柱體上的對(duì)電極相連接，另一端沿所述的大直徑的圓柱體上的直孔伸出所述中空聚四氟こ烯管外；所述的錫焊的焊點(diǎn)、對(duì)電極導(dǎo)線8與所述的大直徑的圓柱體上的直孔之間的第一空隙7、以及所述的大直徑的圓柱體上的直孔與對(duì)電極5之間的第二空隙9，均用硅橡膠密封并粘結(jié)牢固。請(qǐng)參見圖4。所述的電極帽I是ー具有內(nèi)螺紋,且中心有圓孔(直徑3_4mm)的聚四氟こ烯內(nèi)螺紋蓋型六角螺帽，所述聚四氟こ烯內(nèi)螺紋蓋型六角螺帽的對(duì)邊距為20mm，內(nèi)螺紋的直徑可為8-14mm，高可為8_15mm ;所述圓孔的幾何中心位于所述聚四氟こ烯內(nèi)螺紋蓋型六角螺帽的中軸線上；所述的蓋型六角螺帽的螺帽蓋與所述的工作電極3之間有橡膠密封圈2 ;所述電極帽I的內(nèi)螺紋應(yīng)與所述的小直徑的圓柱體表面帶有的外螺紋互相匹配，能夠形成緊固連接。所述的工作電極是納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。將所述電極桿6垂直放置，使導(dǎo)電基片4水平向上，將所述工作電極(5mm*5mm)3、橡膠密墊圈2 (內(nèi)徑為3mm，外徑為5mm)依次疊放于導(dǎo)電基片4上，蓋上電極帽I并旋緊，使所述電極帽I與所述電極桿6通過螺紋緊固連接，且電極帽內(nèi)底、橡膠密封圈2、工作電極3、導(dǎo)電基片4間緊密接觸且密封隔水。三、苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線將上述的電化學(xué)傳感器的工作電極導(dǎo)線11和對(duì)電極導(dǎo)線8分別通過工作電極接線和對(duì)電極接線與電化學(xué)工作站(美國(guó)普林斯頓Potetentiostat/Galvanostat Model263A)連接，將銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極通過參比電極接線與電化學(xué)工作 站(美國(guó)普林斯頓 Potetentiostat/Galvanostat Model 263A)連接。用一個(gè) 50ml 燒杯作為檢測(cè)容器，向所述的50ml燒杯中加入IOmL的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液，將所述的電化學(xué)傳感器的電極帽I和對(duì)電極5部分和銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極的前端一同浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為-0. 05V(vs. Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待基線電流穩(wěn)定后，向所述的50ml燒杯中的IOmL的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液中加入5 μ L的含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)ー個(gè)還原電流信號(hào)，在電流-吋間曲線上(圖9)顯示為ー個(gè)電流越階，當(dāng)所述的還原電流信號(hào)穩(wěn)定后，依照上述步驟重復(fù)加入5 μ L的含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液，總共加入8次，得到顯示出8個(gè)電流越階的電流-時(shí)間(圖9)曲線，所述的電流-時(shí)間(圖9)曲線的基線為背景電流信號(hào)，對(duì)應(yīng)pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液中的苯酚濃度為0mg/L，所述的電流-時(shí)間(圖9)曲線上的8個(gè)電流越階所顯示的還原電流信號(hào)按照時(shí)間順序?qū)?yīng)著pH=6. 5 的 0. IM 磷酸緩沖液的苯酚濃度依次為 0. 05,0. 1,0. 15,0. 2,0. 25,0. 3,0. 35,0. 4mg/
し使用數(shù)據(jù)處理軟件0rigin6. O進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以所述的電流_時(shí)間(current-t)(圖9)曲線顯示的背景電流信號(hào)和8個(gè)電流越階所顯示的還原電流信號(hào)為縱坐標(biāo)(y)，以 0、0· 05,0. 1、0· 15,0. 2,0. 25、0· 3、0· 35,0. 4mg/L 為橫坐標(biāo)(x)作圖，得到圖 10 所示的 9個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，對(duì)上述9個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合,得到pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液中的苯酹的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖10)及標(biāo)準(zhǔn)方程y = 88. 15+373. 37x，線性因子R = 0. 9932，線性范圍為0. 05-0. 4mg/L，檢出限(信噪比=3/1)為 0. 004mg/L。四、待測(cè)溶液苯酚濃度的檢測(cè)將上述的電化學(xué)傳感器的工作電極導(dǎo)線8和對(duì)電極導(dǎo)線11分別通過工作電極接線和對(duì)電極接線與電化學(xué)工作站(美國(guó)普林斯頓Potetentiostat/Galvanostat Model263A)連接，將銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極通過參比電極接線與電化學(xué)工作站(美國(guó)普林斯頓 Potetentiostat/Galvanostat Model 263A)連接。用一個(gè) 50ml 燒杯作為檢測(cè)容器，向所述的50ml燒杯中加入5-10mL的待測(cè)溶液，將所述的電化學(xué)傳感器的電極帽I和對(duì)電極5部分和銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極的前端一同浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為-O. 05V(vs. Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待電流穩(wěn)定后，讀出電流值ix = 156. 9nA，即待測(cè)溶液所含苯酚濃度對(duì)應(yīng)的還原電流信號(hào)，將ix = 156. 9代入所述標(biāo)準(zhǔn)方程y = 88. 15+373. 37x，得到ix = 88. 15+373. 37x，可計(jì)算得到含有未知濃度的酚類物質(zhì)的待測(cè)溶液所含的酚類物質(zhì)的濃度X = (ix-88. 15)/373. 37 = O. 1843 (mg/L)。實(shí)施例4:一、工作電極的制備所述工作電極為納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。作為所述工作電極的基底的硼摻雜金剛石薄膜是通過熱絲化學(xué)氣相沉積方法(熱絲化學(xué)氣相沉積裝置由上海交通大學(xué)交友鉆石涂層有限公司、上海東貝真空設(shè)備有限公司聯(lián)合研制)，在硅(100)片上沉積硼摻雜微米級(jí)金剛石顆粒而成，所述硼摻雜金剛石薄膜被切割成5mm*5mm的正萬形。
將上述硼摻雜金剛石薄膜依次在IOml的水(本實(shí)施例中所用的水均由MiIIiporeMilli-Q純水儀制備)、こ醇、丙酮中各超聲10分鐘洗凈后，在空氣中晾干。然后將所述硼摻雜金剛石薄膜浸泡于烯丙胺中，在室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下、紫外光(254nm)照射6小時(shí)后，取出，用こ醇沖洗后晾干，得到氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜。用磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鈉和水分別配制pH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液和pH =6. 5的O. IM磷酸緩沖液。配制含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制含有O. 2mg/L苯酚的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液作為待測(cè)溶液。采用檸檬酸三鈉還原法制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 01%的納米金溶膠(具體方法可參照文獻(xiàn)“G. Frens, Nature Phys. Sci. 241 (1973) 20”)，所述納米金溶膠的粒徑為 10_50nm。稱取O. Olg粒徑為50nm的納米金剛石粉末,超聲分散于Iml的水中，得到納米金剛石分散液。稱取Img酪氨酸酶(購(gòu)買自沃辛頓生化,規(guī)格為> 1000ku/mg),溶解于10 μ L的PH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液中，得到酪氨酸酶溶液，將所述酪氨酸酶溶液與10 μ L的所述的納米金剛石分散液混合均勻，4°C冷藏放置8小吋，依次加入20 μ L的質(zhì)量濃度為2. 5%的戊ニ醛水溶液和20 μ L的質(zhì)量濃度為O. 01%的納米金溶膠，混合均勻，立即取10 μ L的所述的納米粒子與酪氨酸酶的混合液，滴加于所述的氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面，4°C冷藏8小時(shí)后在室溫下干燥至所述硼摻雜金剛石薄膜的表面形成一層均勻的酪氨酸酶修飾層，用pH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液沖洗后晾干，得到納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極，即為所述工作電極。ニ、三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的組裝組裝方法及組裝出的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置同實(shí)施例I。三、苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線將上述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為工作電極，鉬電極作為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極(上海雷磁218型)作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電極線與電化學(xué)工作站(美國(guó)普林斯頓Potetentiostat/Galvanostat Model 263A)連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中加入IOmL的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為-O. 05V(vs. Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待基線電流穩(wěn)定后，向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中的IOmL的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液中加入5 μ L的含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)ー個(gè)還原電流信號(hào)，在電流-吋間曲線上顯示為ー個(gè)電流越階，當(dāng)所述的還原電流信號(hào)穩(wěn)定后，依照上述步驟重復(fù)加入5 μ L的含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液，總共加入8次，得到顯示出8個(gè)電流越階的電流-時(shí)間曲線，所述的電流-吋間曲線的基線為背景電流信號(hào)，對(duì)應(yīng)pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液中的苯酚濃度為Omg/L,所述的電流-時(shí)間曲線上的8個(gè)電流越階所顯示的還原電流信號(hào)按照時(shí)間順序?qū)?yīng)著pH = 6.5的O. IM磷酸緩沖液的苯酚濃度依次為O. 05,0. 1,0. 15,0. 2,0. 25,0. 3,0. 35、0. 4mg/L。使用數(shù)據(jù)處理軟件0rigin6. O進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以所述的電流-時(shí)間曲線顯示的背景電流信號(hào)和8個(gè)電流越階所顯示的還原電流信號(hào)為縱坐標(biāo)(y)，以0、0. 05,0. 1,0. 15、0. 2、0· 25、0· 3、0· 35、O. 4mg/L為橫坐標(biāo)(x)作圖，得到圖11所示的9個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，對(duì)上述9個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，得到pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液中的苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖11)及標(biāo)準(zhǔn)方程y = -10. 23+337. 98x，線性因子R = 0. 9921，線性范圍為0. 05-0. 4mg/L，檢出限(信噪比=3/1)為 0.004mg/L。四、待測(cè)溶液苯酚濃度的檢測(cè)將上述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為工作電極，鉬電極作為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電極線與電化學(xué)工作站(美國(guó)普林斯頓Potetentiostat/Galvanostat Model263A)連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中加入5-10mL的待測(cè)溶液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑瑢?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為-0. 05V (vs. Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待電流穩(wěn)定后，讀出電流值ix =53. 6nA，即待測(cè)溶液所含苯酚濃度對(duì)應(yīng)的還原電流信號(hào)，將ix = 53. 6代入所述標(biāo)準(zhǔn)方程y=-10. 23+337. 98x，得到ix = -10. 23+337. 98x x，可計(jì)算得到含有未知濃度的酚類物質(zhì)的待測(cè)溶液所含的酚類物質(zhì)的濃度X = (ix+10. 23)/330. 27 = O. 1889 (mg/L)。實(shí)施例5:一、工作電極的制備所述工作電極為納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。作為所述工作電極的基底的硼摻雜金剛石薄膜是通過熱絲化學(xué)氣相沉積方法(熱絲化學(xué)氣相沉積裝置由上海交通大學(xué)交友鉆石涂層有限公司、上海東貝真空設(shè)備有限公司聯(lián)合研制)，在硅(100)片上沉積硼摻雜微米級(jí)金剛石顆粒而成，所述硼摻雜金剛石薄膜被切割成
的正萬形。將上述硼摻雜金剛石薄膜依次在IOml的水(本實(shí)施例中所用的水均由MiIIiporeMilli-Q純水儀制備)、こ醇、丙酮中各超聲10分鐘洗凈后，在空氣中晾干。然后將所述硼摻 雜金剛石薄膜浸泡于烯丙胺中，在室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下、紫外光(254nm)照射6小時(shí)后，取出，用こ醇沖洗后晾干，得到氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜。
用磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鈉和水分別配制pH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液和pH =
6.5的O. IM磷酸緩沖液。配制含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制含有O. 2mg/L苯酚的pH = 6. 5的O. IM磷酸緩沖液作為待測(cè)溶液。采用檸檬酸三鈉還原法制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 01%的納米金溶膠(具體方法可參照文獻(xiàn)“G. Frens, Nature Phys. Sci. 241 (1973) 20”)，所述納米金溶膠的粒徑為 10_50nm。稱取O. Olg粒徑為500nm的納米金剛石粉末,超聲分散于Iml的水中，得到納米金剛石分散液。稱取Img酪氨酸酶(購(gòu)買自沃辛頓生化，規(guī)格為> 1000ku/mg)，溶解于10 μ L的 PH = 7. O的O. OlM磷酸緩沖液中，得到酪氨酸酶溶液，將所述酪氨酸酶溶液與10 μ L的所述的納米金剛石分散液混合均勻，4°C冷藏放置8小吋，依次加入20 μ L的質(zhì)量濃度為2. 5%的戊ニ醛水溶液和20 μ L的質(zhì)量濃度為0. 01%的納米金溶膠，混合均勻，立即取10 μ L的所述的納米粒子與酪氨酸酶的混合液，滴加于所述的氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面，4°C冷藏8小時(shí)后在室溫下干燥至所述硼摻雜金剛石薄膜的表面形成一層均勻的酪氨酸酶修飾層，用pH = 7. O的0. OlM磷酸緩沖液沖洗后晾干，得到納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極，即為所述工作電極。ニ、三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的組裝組裝方法及組裝出的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置同實(shí)施例I。三、苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線將上述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為工作電極，鉬電極作為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極(上海雷磁218型)作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電極線與電化學(xué)工作站(美國(guó)普林斯頓Potetentiostat/Galvanostat Model 263A)連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中加入IOmL的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為-0. 05V(vs. Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待基線電流穩(wěn)定后，向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中的IOmL的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液中加入5 μ L的含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)ー個(gè)還原電流信號(hào)，在電流-吋間曲線上顯示為ー個(gè)電流越階，當(dāng)所述的還原電流信號(hào)穩(wěn)定后，依照上述步驟重復(fù)加入5 μ L的含有100mg/L苯酚的pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液，總共加入6次，得到顯示出6個(gè)電流越階的電流-時(shí)間曲線，所述的電流-吋間曲線的基線為背景電流信號(hào)，對(duì)應(yīng)pH = 6.5的0. IM磷酸緩沖液中的苯酚濃度為0mg/L,所述的電流-時(shí)間曲線上的6個(gè)電流越階所顯示的還原電流信號(hào)按照時(shí)間順序?qū)?yīng)著pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液的苯酚濃度依次為0. 05,0. 1,0. 15,0. 2,0. 25,0. 3mg/L。使用數(shù)據(jù)處理軟件0rigin6. O進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以所述的電流-時(shí)間曲線顯示的背景電流信號(hào)和6個(gè)電流越階所顯示的還原電流信號(hào)為縱坐標(biāo)(y)，以0、0. 05,0. 1,0. 15、0.2,0. 25,0. 3mg/L為橫坐標(biāo)(x)作圖，得到圖12所示的7個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，對(duì)上述9個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，得到pH = 6. 5的0. IM磷酸緩沖液中的苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖12)及標(biāo)準(zhǔn)方程y=25. 9+275. 71x，線性因子R = 0. 9905，線性范圍為0. 05-0. 3mg/L，檢出限(信噪比=3/1)為 O. 007mg/L。四、待測(cè)溶液苯酚濃度的檢測(cè)將上述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為工作電極，鉬電極作為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電極線與電化學(xué)工作站(美國(guó)普林斯頓Potetentiostat/Galvanostat Model263A)連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的石英電解池中加入5-10mL的待測(cè)溶液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑瑢?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為-O. 05V (vs. Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待電流穩(wěn)定后，讀出電流值ix =79. 4nA，即待測(cè)溶液所含苯酚濃度對(duì)應(yīng)的還原電流信號(hào)，將ix = 79. 4代入所述標(biāo)準(zhǔn)方程y =25. 9+275. 71x，得到ix = 25. 9+275. 71x，可計(jì)算得到含有未知濃度的酚類物質(zhì)的待測(cè)溶液所含的酚類物質(zhì)的濃度X = (ix-25. 9)/275. 71 = O. 1940 (mg/L)。
權(quán)利要求
1.ー種用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的電極，其特征是所述的電極是由納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極； 所述的納米粒子是粒徑為50-500nm的納米金剛石,或是粒徑為50_500nm的納米金剛石與粒徑為10-50nm的納米金顆粒的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的電極，其特征是所述的混合物中的粒徑為50-500nm的納米金剛石與粒徑為10_50nm的納米金顆粒的質(zhì)量比為1:1。
3.ー種根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的電極的制備方法，其特征是 將酪氨酸酶溶解于PH= 7的O. OlM磷酸緩沖液中得到100mg/ml的酪氨酸酶溶液，將所述的酪氨酸酶溶液與10mg/ml的納米金剛石分散液按體積比為I : I的比例混合，得到酪氨酸酶與納米金剛石的混合溶液，其中所述納米金剛石的粒徑為50-500nm ;在溫度為4°C下冷藏放置8小時(shí)，加入與所述的酪氨酸酶與納米金剛石的混合溶液等體積的質(zhì)量濃度為2.5 %的戊ニ醛水溶液，混合均勻，立即滴于氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面，在溫度為4°C下冷藏8-12小時(shí)后取出，在室溫下干燥至氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面形成一層均勻的固化膜，用PH = 7的O. OlM磷酸緩沖液沖洗后晾干，得到所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。
4.ー種根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的電極的制備方法，其特征是 將酪氨酸酶溶解于pH = 7的O. OlM磷酸緩沖液中得到100mg/ml酪氨酸酶溶液，將所述的酪氨酸酶溶液與10mg/ml的納米金剛石分散液按體積比為I : I的比例混合，得到酪氨酸酶與納米金剛石的混合溶液，其中所述納米金剛石的粒徑為50-500nm ;在溫度為4°C下冷藏放置8小時(shí)，依次加入與所述的酪氨酸酶與納米金剛石的混合溶液等體積的質(zhì)量濃度為2. 5%的戊ニ醛水溶液和質(zhì)量濃度為O. 01%的納米金溶膠，混合均勻，立即滴于氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面，其中所述的納米金溶膠中的納米金顆粒的粒徑為10-50nm ;在溫度為4°C下冷藏8小時(shí)后取出，在室溫下干燥至氨基終端的硼摻雜金剛石薄膜的表面形成一層均勻的固化膜，用PH = 7的O. OlM磷酸緩沖液沖洗后晾干，得到所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。
5.ー種根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的電極的應(yīng)用，其特征是所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為對(duì)水中的酚類物質(zhì)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置中的工作電極，或作為對(duì)水中的酚類物質(zhì)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的電化學(xué)傳感器中的工作電極。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的結(jié)構(gòu)為在一底部有圓形小孔的石英電解池的底部外面固定有所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極，在該納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極的另一面相接有一不銹鋼底板；所述納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極與所述石英電解池之間有橡膠密封圈；將作為對(duì)電極的鉬電極和作為參比電極的銀/氯化銀電極置于所述石英電解池之中，以所述的納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極作為工作電極。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述的電化學(xué)傳感器包括電極帽、橡膠密封圈、工作電極、導(dǎo)電基片、對(duì)電扱、電極桿、對(duì)電極導(dǎo)線和工作電極導(dǎo)線；其特征是 所述的電化學(xué)傳感器中的所述的電極桿是一形狀為凸形形狀的圓柱體管，在該凸形形狀的圓柱體管的小直徑的圓柱體的表面帶有螺紋，且在小直徑的圓柱體的頂端開有凹槽；在該凸形形狀的圓柱體管的大直徑的圓柱體的側(cè)壁內(nèi)，并且沿著所述的大直徑的圓柱體的縱向方向，開有貫通所述的大直徑的圓柱體的直孔； 所述的導(dǎo)電基片安插在所述的凹槽中；與所述的導(dǎo)電基片相連接的所述的工作電極導(dǎo)線從所述的凸形形狀的圓柱體管的中間的孔道中穿出凸形形狀的圓柱體管外；所述的導(dǎo)電基片的另一面連接有所述的工作電極； 所述的對(duì)電極為圓環(huán)形金屬圈，其套在所述的小直徑的圓柱體與大直徑的圓柱體分界處的小直徑的圓柱體上，所述的對(duì)電極導(dǎo)線穿過所述的大直徑的圓柱體上的直孔與所述的對(duì)電極連接； 所述的電極帽是一具有內(nèi)螺紋，且中心有圓孔的蓋型螺帽；所述的蓋型螺帽的螺帽蓋與所述的工作電極之間有橡膠密封圈； 所述的電極帽通過其內(nèi)螺紋與所述的小直徑的圓柱體表面的外螺紋螺合； 所述的工作電極是納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是所述的電極桿的材料為聚四氟こ烯管。
全文摘要
本發(fā)明涉及電分析化學(xué)、生物傳感器、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域中的電化學(xué)傳感器，特別涉及用于檢測(cè)水中酚類物質(zhì)的電極及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的電極是由納米粒子與酪氨酸酶共同修飾的硼摻雜金剛石薄膜電極，所述納米粒子是粒徑為50-500nm的納米金剛石，或是粒徑為50-500nm的納米金剛石與粒徑為10-50nm的納米金顆粒的混合物。由該電極作為工作電極，可組裝得到用于水中揮發(fā)酚檢測(cè)的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置和電化學(xué)傳感器。該三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置和電化學(xué)傳感器對(duì)水中的酚類物質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)靈敏度高，檢出限低，重復(fù)性好；且具有密封性好、干擾電流小、操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、工作電極可以拆換的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)G01N27/30GK102680547SQ20111005971
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月11日
發(fā)明者只金芳, 王鈺寧 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所