專利名稱：一種用比色法測定生物組織內(nèi)草酰乙酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種草酰こ酸的測定方法，屬于有機酸代謝物生物化學(xué)檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
草酰こ酸是三羧酸循環(huán)中間體之一，也是生物代謝中的ー個重要物質(zhì)。在體內(nèi)是以羧酸根離子的形式存在。草酰こ酸在生物體的碳、氮代謝起著重要的作用。草酰こ酸可以發(fā)生α轉(zhuǎn)氨基作用，形成天冬氨酸，并進一歩合成多種氨基酸，從而參與氮代謝；草酰こ酸與こ酰輔酶A縮合，形成檸檬酸，這是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵反應(yīng)之一，也是啟動循環(huán)的一步，是碳代謝的主要中間物質(zhì)；另外，草酰こ酸還參與糖異生作用；參與三羧酸循環(huán)的碳回補作用等等?？傊蒗￥乘嵩谏矬w的碳氮代謝和能量代謝過程中起著不可缺少的作用。測定草酰こ酸的含量對于理解細胞內(nèi)的碳氮代謝過程具有重要的意義。
目前，草酰こ酸的測定主要有兩類方法一類是高效液相色譜法(見分析化學(xué)，2005，33 :527-530)，該方法測定精度高，檢測限低，但是液相色譜儀比較昂貴，多數(shù)實驗室沒有該設(shè)備；另ー類就是基于酶偶聯(lián)比色測定的方法其中ー種方法是將草酰こ酸在蘋果酸脫氫酶的作用下形成蘋果酸，這ー過程需要NADH作為輔酶，形成MD，而NADH在340nm具有特異的吸收峰，通過測定NADH的量,可以計算草酰こ酸的含量(見Arch BiochemistryBiophysics 1976,175:39-53)。另ー種方法就是將草酰こ酸在草酰こ酸脫羧酶作用下，形成丙酮酸，然后利用丙酮酸的酶聯(lián)測定方法測定丙酮酸的含量(見ClinicalBiochemistry 2006, 39 :74-77),從而推算草酰こ酸的含量。即用丙酮酸氧化酶將丙酮酸氧化形成過氧化氫，再利用過氧化物酶將過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水，在這ー過程中加入ー特異的電子受體，被氧化后形成粉紅色物質(zhì)，570nm比色法或用熒光(Ex/Em = 535/587)檢測方法可以測定草酰こ酸的含量。利用酶法偶聯(lián)就需要購買較昂貴的生化酶和相應(yīng)的底物，而且測定步驟較多。目前，缺乏快速準確地測定組織、器官中草酰こ酸的含量的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種寬范圍、成本低、便于普及的測定生物組織和器官中草酰こ酸含量的方法。本發(fā)明是通過如下步驟實現(xiàn)的草酰こ酸與固紫B(Fast Violet B)直接反應(yīng)形成一種穩(wěn)定的紅色的微溶于水的物質(zhì)。反應(yīng)一定時間后，加入有機溶劑，充分溶解紅色的物質(zhì)。然后利用分光光度計直接測定以上混合物在520nm的吸光值，根據(jù)草酰こ酸標準樣品制作的標準曲線即可得到未知樣品草酰こ酸的濃度。用于溶解草酰こ酸和固紫B反應(yīng)生成的紅色物質(zhì)的有機溶劑可以是こ醇、丙酮或甲醇中的ー種。
固紫B用去離子水直接溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。濃度范圍為2-50mg/mL，樣品草酰こ酸含量高時使用低濃度固紫B，樣品草酰こ酸含量低時使用高濃度固紫B;制作標準曲線和樣品測定須使用同樣濃度的固紫B。
本發(fā)明利用草酰こ酸的直接顯色方法替代常規(guī)生化方法中需要其他酶進行偶聯(lián)再比色的方法來測定草酰こ酸的含量。測量的步驟更加簡便，測定更加迅速，在25分鐘就可以完成測定，所需的設(shè)備也比較簡單，所需的藥品種類少，測定成本低。


圖I本發(fā)明提供的方法利用草酰こ酸標準樣品測定的低濃度范圍標準曲線圖2本發(fā)明提供的方法利用草酰こ酸標準樣品測定的高濃度范圍標準曲線
具體實施例方式以下結(jié)合具體實例進ー步說明本發(fā)明。實施例一低濃度草酰こ酸標準曲線的制作稱取O. 132克草酰こ酸，用50mL去離子水溶解，定容至IOOOmL,得到ImM的草酰こ酸母液。按照表I配制標準曲線制作所需的各種濃度的草酰こ酸樣品。表I低濃度草酰こ酸標準曲線制作(IOO-IOOOuM)
權(quán)利要求
1.一種用比色法測定生物組織內(nèi)草酰乙酸含量的方法，其特征在于草酰乙酸與固紫B反應(yīng)形成穩(wěn)定的紅色沉淀，加入有機溶劑，充分溶解沉淀物，測定溶液在520納米的吸光值，根據(jù)草酰乙酸標準樣品制作的標準曲線即可得到樣品草酰乙酸的濃度。
2.如權(quán)利要求I所述的測定草酰乙酸含量的方法，其特征在于所述的有機溶劑指乙醇、丙酮或甲醇中的一種。
3.如權(quán)利要求I所述的測定草酰乙酸含量的方法，其特征在于所述標準曲線包含低濃度范圍和高濃度范圍兩種，分別為O-ImM和10-100mM。
4.如權(quán)利要求I所述的測定草酰乙酸含量的方法，其特征在于所述的固紫B的濃度范圍為 2_50mg/mL。
全文摘要
一種用比色法測定生物組織內(nèi)草酰乙酸含量的方法，利用草酰乙酸與固紫B結(jié)合形成紅色沉淀物質(zhì)，加入有機溶劑溶解沉淀后，520nm比色法測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算樣品中草酰乙酸的含量。本發(fā)明用草酰乙酸的直接顯色反應(yīng)替換常規(guī)方法中的酶聯(lián)顯色，使測定過程更加簡便，實用，檢測成本也更加低廉。
文檔編號G01N21/82GK102680415SQ20111006272
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者丁在松, 周寶元, 黃素華 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所