專利名稱：一種基于陽(yáng)離子交換膜的酶固定化方法及酶微反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)酶解技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于陽(yáng)離子交換膜的酶固定化方法及酶微反應(yīng)器。
背景技術(shù)：
“鳥槍”法是一種被廣泛使用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略，通常包括蛋白質(zhì)酶解、多肽分離及質(zhì)譜檢測(cè)三個(gè)步驟，其中，高效完全的酶解是保障研究結(jié)果準(zhǔn)確可靠的重要前提。傳統(tǒng)溶液酶解存在的一些不足之處，如酶解時(shí)間長(zhǎng)、酶的自身降解等，使得它已不可能滿足蛋白質(zhì)組學(xué)高效率、高通量的發(fā)展要求。酶的固定化技術(shù)很好地克服了溶液酶解的這些不足， 酶固定到載體上后，酶的局部濃度增加，提高了酶解效率；同時(shí)酶的自身降解減少，酶的穩(wěn)定性提高，而且固定化酶可以重復(fù)利用。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酶微反應(yīng)器，將酶固定化技術(shù)與微反應(yīng)器技術(shù)相結(jié)合，在實(shí)現(xiàn)酶固定化的同時(shí)，還充分利用了微反應(yīng)器的諸多優(yōu)點(diǎn)，如比表面積大、傳質(zhì)速度快、通量高、樣品消耗量少等，為蛋白質(zhì)快速高效酶解提供了理想的技術(shù)
D ο通常，酶在微反應(yīng)器中的固定化方法有物理吸附、共價(jià)結(jié)合、靜電結(jié)合等，所采用的載體有填充顆粒、整體柱、膜、毛細(xì)管或芯片通道的內(nèi)壁等。其中，整體柱因其柱壓低、傳質(zhì)速度快等特點(diǎn)應(yīng)用最為廣泛。然而整體柱通常是自行制備，與之相比，有許多種類已商品化的膜，如聚二氟乙烯多孔膜(PVDF)、等離子聚合膜(PPF)、纖維素膜、尼龍膜等，可以購(gòu)買直接使用；并且以膜為載體，具有內(nèi)表面大、局部酶濃度高的優(yōu)點(diǎn)，因此，以膜作為固定化酶的載體有著良好的應(yīng)用前景。在各種酶固定化方法中，靜電結(jié)合用于酶的固定，與物理吸附相比作用力強(qiáng)，可以減少酶的流失。盡管共價(jià)結(jié)合是相對(duì)最為牢固的固定化方法，然而通常需要多步驟的反應(yīng)， 過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，而且可能造成酶活性的損失。相比之下，靜電結(jié)合，固定化過(guò)程簡(jiǎn)單快速，對(duì)酶活性影響較少，因此，靜電結(jié)合是更為理想的酶固定化方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)溶液酶解和現(xiàn)有的酶微反應(yīng)器技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種基于陽(yáng)離子交換膜的快速酶固定化方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新型酶微反應(yīng)器，采用以陽(yáng)離子交換膜為載體的酶固定化方法，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供快速高效的蛋白質(zhì)酶解技術(shù)手段。本發(fā)明酶固定化方法以陽(yáng)離子交換膜為載體，靜電結(jié)合用于酶的固定。本發(fā)明酶微反應(yīng)器的核心組件-反應(yīng)腔由第一陽(yáng)離子交換膜1、聚醚醚酮(PEEK) 薄膜2 (50 200 μ m厚)和第二陽(yáng)離子交換膜3組成，如

圖1所示。PEEK薄膜2上刻蝕有微通道4，微通道4穿透PEEK薄膜2的上下表面。通過(guò)機(jī)械壓力或者粘合劑，PEEK薄膜2 的上表面與第一陽(yáng)離子交換膜1的下表面緊密貼合，并且PEEK薄膜2的下表面與第二陽(yáng)離子交換膜3的上表面緊密貼合。PEEK薄膜2和與其緊密貼合的第一和第二陽(yáng)離子交換膜1和3的膜表面組成的腔體即為酶微反應(yīng)器的反應(yīng)腔。第一和第二 PEEK管5和6分別與微通道4的兩端相通，作為微通道4的入口和出口管路。微通道4以及第一和第二 PEEK管 5和6都采用PEEK材料來(lái)減少酶、被分析蛋白質(zhì)以及酶解產(chǎn)生的多肽在這些部位的非特異吸附。此外，本發(fā)明設(shè)計(jì)的微通道4的流路與膜平行，酶或蛋白質(zhì)溶液即使以較高流速通過(guò)時(shí)，系統(tǒng)也可以維持較低壓力。本發(fā)明所述的酶微反應(yīng)器的操作流程包括以下三步1.酶固定化。胰蛋白酶溶解于pH為7. 5 8. 5的緩沖溶液中，胰蛋白酶溶液連續(xù)通過(guò)酶微反應(yīng)器2-10分鐘即可完成酶固定化。胰蛋白酶的pi值為10. 5，在pH值7. 5 8. 5的緩沖溶液中帶正電荷，通過(guò)靜電作用與陽(yáng)離子交換膜相結(jié)合，此外，陽(yáng)離子交換膜的高聚物基質(zhì)還可以通過(guò)疏水作用吸附酶。2.蛋白質(zhì)酶解。經(jīng)過(guò)變性或其他方式處理過(guò)的蛋白質(zhì)溶液連續(xù)通過(guò)酶微反應(yīng)器， 蛋白質(zhì)在通過(guò)微反應(yīng)腔的數(shù)秒內(nèi)即可完成酶解。流出物收集在樣品瓶或者其他接受裝置中，然后經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜(LC/MQ對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過(guò)得到的多肽信息對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。3.酶微反應(yīng)器的再生。在完成一次蛋白質(zhì)樣品酶解后，依次通過(guò)含NaOH的NaCl 水溶液、HCl水溶液和純水對(duì)酶微反應(yīng)器進(jìn)行再生。再生后的酶微反應(yīng)器重復(fù)1 3操作對(duì)另一個(gè)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分析。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于a.酶通過(guò)靜電作用和疏水作用固定在陽(yáng)離子交換膜上，固定化過(guò)程對(duì)酶活性影響較小，而且只需要數(shù)分鐘，與已報(bào)道的酶固定化技術(shù)相比時(shí)間大大縮短；b.蛋白質(zhì)溶液連續(xù)通過(guò)酶微反應(yīng)器，在數(shù)秒內(nèi)即可完成酶解，酶解過(guò)程簡(jiǎn)單快速；c.酶微反應(yīng)器在完成一次蛋白質(zhì)酶解后快速再生，完全避免了不同蛋白質(zhì)酶解結(jié)果的干擾，提高了蛋白質(zhì)分析的準(zhǔn)確性；d.酶微反應(yīng)器易于與其他蛋白質(zhì)樣品處理或多肽分離分析技術(shù)在線聯(lián)用，可以為蛋白質(zhì)分析提供高效、自動(dòng)化程度高的技術(shù)平臺(tái)。下面通過(guò)酶微反應(yīng)器在酶固定量、酶活性和酶解反應(yīng)的重復(fù)性等方面以及酶微反應(yīng)器與LC/MS在線聯(lián)用系統(tǒng)在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用方面的研究證明本發(fā)明的有益效果和實(shí)用性。一.酶微反應(yīng)器的酶固定量及酶活性的研究胰蛋白酶溶液(lmg/mL，緩沖溶液:50mMTris, 20mM CaCl2,HCl 調(diào)節(jié) pH 至 8. 0)以 5 μ L/min的流速連續(xù)通過(guò)酶微反應(yīng)器(微通道4尺寸40mm長(zhǎng)，240 μ m寬，50 μ m深)2分鐘，通過(guò)LC/MS測(cè)定酶溶液通過(guò)酶微反應(yīng)器前后減少的酶量，計(jì)算得出經(jīng)過(guò)2分鐘的固定化過(guò)程，酶在酶微反應(yīng)器中的固定量為2. 6 μ g。已知微通道4接觸的上下兩層陽(yáng)離子交換膜1和3的膜表面積總和為0. 192cm2，故酶在膜上的吸附量為13. 5μ g/cm2。選用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)研究了固定化酶的活性，并將其與溶液中酶的活性進(jìn)行了比較。BAEE及其酶解產(chǎn)物N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)由配置有紫外(UV) 檢測(cè)器的LC分析，實(shí)驗(yàn)條件如下色譜柱為C8反相色譜柱(柱長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑2. Imm,填料粒徑5μπι)；流動(dòng)相為75%乙腈/25%水(含0. 5%三氟乙酸)，流速為0. 2mL/min ；UV波長(zhǎng) % 254nm0實(shí)驗(yàn)得到的典型色譜圖如圖2 (a)所示。五個(gè)濃度的BAEE (5、10、20、50、IOOmM, 溶解于50mM NH4HCO3)分別以2 μ L/min的流速通過(guò)再生后的酶微反應(yīng)器(恒溫于37°C水浴中，酶解時(shí)間14.4秒)，收集流出物由^/而分析8々生成量。用以對(duì)照的溶液酶解的酶解時(shí)間為10分鐘，酶解溫度為37°C。圖2(b)和(c)分別為微反應(yīng)器固定化酶和溶液中酶的Lineweave-Burk方程回歸直線，計(jì)算得到的Km值分別為20. 7和4. 8mM，每μ g酶對(duì)應(yīng)的 Vmax分別為155. 7和1. 5mM/s，可見(jiàn)微反應(yīng)器酶的Vmax是溶液中酶的100多倍，證明了酶微反應(yīng)器快速高效的酶解能力。二.酶微反應(yīng)器的酶解反應(yīng)重復(fù)性的研究本研究先考察了所采用的再生條件的有效性。完成0. lmg/mL細(xì)胞色素C(CYC) 酶解的酶微反應(yīng)器經(jīng)過(guò)再生后，依次以2 μ L/min的流速通過(guò)50mM NH4HCO3和0. lmg/mL CYC (溶液通過(guò)微反應(yīng)器時(shí)間為14. 4秒)，收集流出物由LC/MS分析，LC實(shí)驗(yàn)條件如下色譜柱為C18反相色譜柱(柱長(zhǎng)150_，內(nèi)徑2. Imm,填料粒徑5 μ m)；流動(dòng)相A相為水(含0. 1 % 甲酸)，B相為乙腈(含0. 甲酸)，洗脫程序0-15分鐘5% B, 15-65分鐘5% -60% B， 65. 5-80 分鐘 95% B，80. 5-95 分鐘 5% B，流速為 0. 2mL/min。采集到的 MS/MS 數(shù)據(jù)由 Moscot 檢索多肽信息，在NH4HCO3和CYC的流出物中都未檢測(cè)到CYC酶解產(chǎn)生的多肽片段，證明經(jīng)過(guò)再生步驟，酶、非特異吸附的蛋白質(zhì)和多肽都被除去。進(jìn)一步選擇CYC作為模型蛋白連續(xù)進(jìn)行10次酶解，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯觯?檢測(cè)到的匹配的多肽數(shù)量及序列覆蓋率(RSD 3.2%)都有較好的重復(fù)性，證明了酶微反應(yīng)器的可靠性。三.酶微反應(yīng)器/LC/MS在線聯(lián)用系統(tǒng)在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用酶微反應(yīng)器/LC/MS在線聯(lián)用系統(tǒng)由流動(dòng)注射泵7、酶微反應(yīng)器8、帶有20 μ L樣品定量環(huán)的六通閥9、LC梯度洗脫高壓泵10、LC色譜柱11和質(zhì)譜儀12組成，裝置示意圖如圖 4所示，通過(guò)六通閥9的切換可以實(shí)現(xiàn)在線的蛋白質(zhì)酶解、多肽的分離與檢測(cè)。選擇三種模型蛋白質(zhì)，包括CYC、肌球蛋白(MYG)和牛血清蛋白(BSA)，研究了在線聯(lián)用系統(tǒng)的實(shí)用性。酶解之前，MYG經(jīng)8M尿素變性后稀釋至0. 3mg/mL ；BSA依次經(jīng)二硫蘇糖醇(DTT) 還原和碘乙酸(IAA)烷基化反應(yīng)后稀釋至0. 3mg/mL ；0. lmg/mL CYC未經(jīng)過(guò)變性直接用于酶解。三種蛋白質(zhì)分別經(jīng)過(guò)酶微反應(yīng)器(酶固定化條件同“酶固定量的研究”部分)和溶液酶解(蛋白質(zhì)與酶質(zhì)量比為50 1)，酶解時(shí)間分別為14. 4秒和6小時(shí)，酶解產(chǎn)物由LC/MS 進(jìn)行分析，CYC實(shí)驗(yàn)條件與“酶微反應(yīng)器的酶解反應(yīng)重復(fù)性的研究”相同，MYG和BSA的流動(dòng)相洗脫程序?yàn)?0-15 分鐘 5% B, 15-90 分鐘 5% -60% B,90. 5-105 分鐘 95% B, 105. 5-120 分鐘5% B，其他條件與CYC相同。三種蛋白質(zhì)通過(guò)在線聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行酶解和6小時(shí)溶液酶解得到的多肽數(shù)量及序列覆蓋率如表1所示，可以看出，在線聯(lián)用系統(tǒng)酶解蛋白質(zhì)序列覆蓋率與溶液酶解相當(dāng)或者更高，然而酶解時(shí)間大大縮短，證明了酶微反應(yīng)器的有益效果和實(shí)用性。表1三種蛋白質(zhì)通過(guò)酶微反應(yīng)器進(jìn)行酶解和溶液酶解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種酶固定化方法，以膜作為酶固定化的載體，靜電結(jié)合用于酶固定，其特征在于， 所述載體為陽(yáng)離子交換膜。
2.一種酶微反應(yīng)器，其特征在于，酶微反應(yīng)器的反應(yīng)腔由第一陽(yáng)離子交換膜、第二陽(yáng)離子交換膜以及一片刻蝕有微通道的聚醚醚酮(PEEK)薄膜組成，所述PEEK薄膜夾在所述第一和第二陽(yáng)離子交換膜之間。
3.如權(quán)利要求2所述的酶微反應(yīng)器，其特征在于，所述PEEK薄膜的厚度為百微米量級(jí)， 所述微通道穿透所述PEEK薄膜的上、下表面。
4.如權(quán)利要求2所述的酶微反應(yīng)器，其特征在于，通過(guò)機(jī)械壓力或者粘合劑，所述PEEK 薄膜的上表面與所述第一陽(yáng)離子交換膜的下表面緊密貼合，并且所述PEEK薄膜的下表面與所述第二陽(yáng)離子交換膜的上表面緊密貼合。
5.如權(quán)利要求2所述的酶微反應(yīng)器，其特征在于，所述第一和第二陽(yáng)離子交換膜的外側(cè)各緊密貼合第一和第二聚碳酸酯(PC)薄片用以支撐和固定膜，所述第二陽(yáng)離子交換膜的長(zhǎng)度小于所述第二 PC薄片的長(zhǎng)度，所述第一和第二陽(yáng)離子交換膜位于所述第一和第二 PC薄片的中間位置處。
6.如權(quán)利要求5所述的酶微反應(yīng)器，其特征在于，在所述第二PC薄片的上表面具有機(jī)械加工的相同尺寸的第一微槽和第二微槽，所述第一和第二微槽的一端對(duì)應(yīng)于所述微通道的端點(diǎn)，另一端為所述第二 PC薄片的邊緣。
7.如權(quán)利要求6所述的酶微反應(yīng)器，其特征在于，通過(guò)在第二陽(yáng)離子交換膜的上表面指壓一根毛細(xì)管將所述第二陽(yáng)離子交換膜對(duì)應(yīng)于所述第一和第二微槽的部分膜分別內(nèi)陷于所述第一和第二微槽中，將第一 PEEK管和第二 PEEK管分別放置于所述第一和第二微槽中，所述第一和第二 PEEK管的一部分位于陷入微槽的第二陽(yáng)離子交換膜的上表面，用環(huán)氧樹脂結(jié)構(gòu)膠將所述第一和第二 PEEK管位于所述第一和第二微槽的部分固定在所述第一和第二微槽中，所述PEEK薄膜與所述第二陽(yáng)離子交換膜緊密貼合后，所述第一和第二 PEEK管與所述微通道相通。
8.如權(quán)利要求2至7所述的酶微反應(yīng)器，其特征在于，所有上述結(jié)構(gòu)夾在兩個(gè)鋁塊之間的中間位置處，四角分別用長(zhǎng)度大于兩個(gè)鋁塊與上述結(jié)構(gòu)的總厚度的螺絲固定。
9.如權(quán)利要求2所述的酶微反應(yīng)器，其特征在于，所述酶微反應(yīng)器在完成一次蛋白質(zhì)樣品酶解后，依次通過(guò)含NaOH的NaCl、HCl和純水，使所述酶微反應(yīng)器再生。
10.如權(quán)利要求2所述的酶微反應(yīng)器應(yīng)用于液相色譜(LC)/質(zhì)譜(MS)在線聯(lián)用系統(tǒng)中，該系統(tǒng)包括流動(dòng)注射泵、權(quán)利要求2所述的酶微反應(yīng)器、六通閥、LC梯度洗脫高壓泵、LC 色譜柱和質(zhì)譜儀，其中，酶微反應(yīng)器分別與流動(dòng)注射泵和六通閥連接，六通閥又分別與LC 梯度洗脫高壓泵和LC色譜柱連接，通過(guò)六通閥的切換實(shí)現(xiàn)在線的蛋白質(zhì)酶解、多肽的分離與檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于陽(yáng)離子交換膜的酶固定化方法及酶微反應(yīng)器，屬于蛋白質(zhì)酶解技術(shù)領(lǐng)域。以陽(yáng)離子交換膜作為酶固定化的載體，實(shí)現(xiàn)該方法的酶微反應(yīng)器的核心組件-反應(yīng)腔由第一和第二陽(yáng)離子交換膜(1)、(3)和聚醚醚酮薄膜(2)組成，聚醚醚酮薄膜(2)夾在第一和第二陽(yáng)離子交換膜(1)和(3)之間。聚醚醚酮薄膜(2)上刻蝕的微通道(4)穿透聚醚醚酮薄膜(2)的上下表面。酶溶液連續(xù)通過(guò)酶微反應(yīng)器2-10分鐘即可完成酶固定化過(guò)程，酶通過(guò)靜電作用和疏水作用固定在陽(yáng)離子交換膜上。蛋白質(zhì)溶液連續(xù)通過(guò)酶微反應(yīng)器，在數(shù)秒內(nèi)即可完成酶解。酶微反應(yīng)器在每一次酶解后快速再生，完全避免了不同蛋白質(zhì)酶解結(jié)果的干擾。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102206621SQ201110063769
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者劉虎威, 周宇, 周志貴, 白玉 申請(qǐng)人:北京大學(xué)