專利名稱：利用hbha來檢測肺結核和由結核分枝桿菌引起的感染的制作方法
利用HBHA來檢測肺結核和由結核分枝桿菌引起的感染本申請是原申請的申請日為2005年6月30日，申請?zhí)枮?00580022103. 7，發(fā)明名稱為《利用HBHA來檢測肺結核和由結核分枝桿菌(MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS)引起的感染》的中國專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及哺乳動物由結核分枝桿菌引起的感染的體外檢測方法，以及體外區(qū)分明確由結核分枝桿菌引起感染的哺乳動物(主動形式)和被感染但無癥狀的哺乳動物(潛在形式)的方法，以及體外區(qū)分表現(xiàn)主動形式的肺結核的哺乳動物和未被結核分枝桿菌 (M. tuberculosis)感染或表現(xiàn)潛在形式的肺結核的哺乳動物的方法。本發(fā)明還涉及用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)肺結核癥狀的被感染哺乳動物和未發(fā)病的被感染哺乳動物的試劑盒，以及區(qū)分表現(xiàn)主動形式的肺結核的哺乳動物和未被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染或表現(xiàn)潛在形式的肺結核的哺乳動物的試劑盒。肺結核是一種主要感染肺的細菌性疾病(肺結核)；身體的其它部分也可能被感染，例如淋巴結、胸膜肋膜的間隔)、關節(jié)、骨、生殖泌尿道、腦脊膜腹膜、胃腸道、中樞神經系統(tǒng)、腎上腺或心包(肺外器官結核病)。肺結核是在空氣中通過暴露于存在于傳播疾病或與感染者相接觸的哺乳動物的唾液和肺的咳出物(例如當咳嗽或打噴嚏時)中的細菌來傳播的。肺結核的癥狀是發(fā)燒、 盜汗、疲勞、減重、食欲不振和持續(xù)的咳嗽。在2004年，肺結核仍然表現(xiàn)為一種主要的公共衛(wèi)生問題，因為其每年在世界范圍內導致超過二百萬人死亡，是影響全世界人的第三大責任因素，結核分枝桿菌，通常被稱為 Koch氏菌或KB。因而，肺結核是由傳染病引起的第二大死亡原因，僅排在由艾滋病毒感染之后(1)。因此，世界衛(wèi)生組織和歐洲共同體都已經在作為其優(yōu)先發(fā)展的該領域中進行了研究。已經定義了三個基本的目標a)通過研制一種提供比現(xiàn)有疫苗BCG (Calmette和Guerin桿菌)更好預防的疫苗來進行預防；b)改善肺結核快速診斷的方式；以及c)發(fā)現(xiàn)便于實施的快速治療方法，并因此避免多抗性的菌株的發(fā)展。已經將對于肺結核的新病例的缺乏檢測確定為在世界范圍內肺結核病例數目增加的一個主要的原因O)。顯微鏡檢驗和對痰的培養(yǎng)被認為是兩種診斷肺結核的好方法。 但是，分枝桿菌培養(yǎng)的結果只能是在6到8周之后進行解釋，并且發(fā)展中國家不總是具備該方法所需要的基本設施，其大大地限制了第一個目標診斷試驗的培養(yǎng)的應用(3)。因此在痰中的多抗性的細菌鑒定仍然是肺結核的快速診斷的最有效的試驗，但不幸的是鑒定僅在50%到60%的肺結核病例中有效，其部分由于這樣的事實需要在每μ 1痰中5000到 10000個細菌該試驗才是有效的(3)。對于兒童，診斷肺結核更加困難，當他們年輕時，很少吐痰，通常收集他們胃中的吸出物。但是，在不到20%的被證明有肺結核的孩子中該樣品的全面檢查是有效的，其比在成年人中所獲得的結果要低得多G)。最后，在兒童中比在成年人中更頻繁的額外肺結核診斷仍然難以進行。它常常主要基于活組織的解剖學-病理檢查。肺結核的傳統(tǒng)的有機狀態(tài)是存在于干酪樣壞死的肉芽腫中。該肉芽腫瘤由組織細胞、上皮樣細胞和/或巨大胰島類細胞所組成。但是，對于淋巴神經節(jié)和肺部樣品，某些不同的診斷都可以解釋為感染性(非結核性的分枝桿菌、霉菌病等)或非感染性疾病(伯克氏肉樣瘤、Wegener氏病等)(5)。為了證實肺結核的診斷，必須通過進行專門的染色來完成組織學檢查，例如利用分枝桿菌肺結核的酒精-抗酸性的Ziehl-Nielsen染色。但是，每毫米組織106個生物體的數量是獲得正的Ziehl-Nielsen染色所必需的。最后，診斷仍然常?；谝唤M臨床的或放射性的材料，并且其依賴于對結核菌素 (純化蛋白衍生物或PPD)的遲發(fā)過敏性的皮膚試驗的結果。但是，該最后試驗不能容易地區(qū)分通過接種BCG感染結核分枝桿菌(M. tuberculosis)的個體和與周圍的分枝桿菌交叉反應來表現(xiàn)其缺乏特異性。該基于細胞免疫反應的證明的試驗也在免疫缺乏個體中具有較低的靈敏度。最后，雖然其能夠確定在未進行預防接種的個體的人群中感染結核分枝桿菌 (M. tuberculosis)的人，但是不幸的是其不能從正發(fā)病的個體中區(qū)分出表現(xiàn)潛在性結核 (無癥狀)的個體。事實上，僅5%到10%的感染結核分枝桿菌(M. tuberculosis)的個體發(fā)病，而其他個體能預防該疾病即使他們受到感染(7)。該測試的實際用途是極為有限的。近來，分子生物學技術已經發(fā)展到能夠利用PCR(聚合酶鏈反應)技術來表現(xiàn)結核分枝桿菌(M. tuberculosis)的存在。該方法是靈敏的(95 ，但其對于痰的樣品尤其正確，對其的全面檢查是正的。相反，其特異性極好(98% )，其使結核分枝桿菌 (M. tuberculosis)與其他的肺結核不同。但是，該方法花費較多，限制了其應用。因此，它可能是研制快速診斷肺結核的新方法所急需解決的的問題?？赡艿耐緩街话ɡ每赡艽嬖谟谖锤腥緦ο蠛透腥镜娜Q于其是否患病的個體之間的在免疫應答上的差異。因此，基于用肺結核抗原來誘導在淋巴循環(huán)中IFN-Y的分泌的研究的不同的測試已在文獻中進行了報道(8)。但是，由結核菌素誘導的IFN-Y的分泌的分析，肺結核抗原的復雜混合物，具有與其用于皮膚試驗的相同的限制。事實上，所有活化個體，不論其是否患病，和對于存在于某些非典型分支桿菌或僅在BCG中的抗原敏感的人都將產生應答。該測試相對于皮膚試驗的優(yōu)勢在于與正對照(植物凝血素)并列的淋巴應答的分析可以檢測到由于嚴重免疫缺陷而對PPD不作出應答的病人。然后將對于結核分枝桿菌 (M. tuberculosis)特異的抗原分離出來，并用于體外IFN-γ分泌測試，所述測試的特異性明顯更加突出。實質上，可能用到抗原ESAT-6和CFP10，但是必須指出由在患病的或健康的、被感染的對象之間的那些抗原所得到的辨別仍然遠遠不夠完美(9)。在人體中涉及“肝素結合血細胞凝集素”的免疫應答的研究顯示了在患病的或健康的、被感染的人之間的極好的辨別力。HBHA是一種粘合素，其在細菌的表面上表達，形成分枝桿菌復合體的一部分，而不在非病原菌例如Msmegmatis的表面上表達(10)。該蛋白質由結核分枝桿菌(M. tuberculosis)所分泌，并引起該感染的傳播(11)。HBHA具有甲基化的C末端區(qū)域，并在表面上表達，而非甲基化的N末端部分錨定在分枝桿菌細胞壁的粘合素上(1 。甲基化是重要的，不但能誘導人體內的免疫應答，而且能誘導老鼠體內的保護性免疫反應(13)。已經顯示了由體外HBHA刺激的IFN-Y誘導分泌的差別取決于感染結核分枝桿菌(M. tuberculosis)的人是否患病(14)。在大多數的健康病人體內由周邊的淋巴細胞分泌IFN- γ來對HBHA應答，而僅有少數的結核病患者通過分泌IFN- γ來對其抗原應答。但是，在基于這些初步結果的這兩組個體之間的辨別力不滿足于實施診斷試驗。本發(fā)明的目的在于提供哺乳動物由結核分枝桿菌引起的感染的體外檢測方法。
本發(fā)明的目的也在于提供在體外區(qū)分明確由結核分枝桿菌引起感染的哺乳動物和被感染但未發(fā)肺結核病的哺乳動物的方法，并提供體外在健康群體中鑒定潛在TB 病人的方法，并提供體外區(qū)分表現(xiàn)主動形式的肺結核的哺乳動物和未被結核分枝桿菌 (M. tuberculosis)感染或表現(xiàn)潛在形式的肺結核的哺乳動物的方法。最后，本發(fā)明的目的也在于提供包含檢測結核分枝桿菌感染所必需的所有成分的試劑盒，其可將表現(xiàn)該疾病(活動性結核)的病人從感染而無癥狀的病人(潛伏性結核)中辨別出來，并提供區(qū)分表現(xiàn)主動形式的肺結核的哺乳動物和未被結核分枝桿菌 (M. tuberculosis)感染或表現(xiàn)潛在形式的肺結核的哺乳動物的試劑盒。本發(fā)明還涉及通過利用HBHA自身或其在試驗中的重組體形式來檢測由結核分枝桿菌引起的感染，以及區(qū)分表現(xiàn)潛在形式的肺結核的病人和表現(xiàn)肺結核的所有癥狀且正在發(fā)病的病人。這些及其它的目的被概括在本發(fā)明中，正如在本發(fā)明的概述、描述和優(yōu)選實施例以及權利要求中所指明的。發(fā)明的概述本發(fā)明描述了體外用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的方法，所述的方法包括a)從所述的哺乳動物中獲得生物樣品；b)測定針對HBHA蛋白的兩個截然不同的形式、并包含在所述生物樣品中的抗體(IgG)的數量；以及 c)比較獲得自兩種形式的HBHA蛋白的抗體的滴度，其中獲得自表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的抗體的滴度的比較不同于獲得自表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的抗體的滴度。本發(fā)明的范圍也包括用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的試劑盒，所述的試劑盒包含兩種截然不同的形式的HBHA蛋白，其選自由以下成分組成的組a)天然的HBHA和重組HBHA，或b) HBHA的rHBHA Δ C片段和甲基化C 末端片段、組成用于在包含于來源于所述哺乳動物的生物樣品的抗體和截然不同的形式的 HBHA蛋白之間進行免疫反應的介質所需要的試劑，和檢測在所述免疫反應中形成免疫學復合物所需要的試劑。本發(fā)明還涉及體外用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物或用于鑒定在健康的群體內表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的方法，所述的方法包括a)從所述的哺乳動物中獲得生物樣品；b)用獨立的方法，將所述的生物樣品與天然形式的HBHA和ESAT-6相接觸；c)測定HBHA特異性IFN- γ的分泌和ESAT-6特異性IFN- γ 的分泌；以及d)計算HBHA特異性IFN- γ的分泌和ESAT-6特異性IFN- γ的分泌之間的比，其中在表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物中獲得的所述比值要高于在表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物或未被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染的哺乳動物中獲得的比值。本發(fā)明還涉及用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物或用于鑒定在健康的群體內表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的試劑盒，所述的試劑盒包含天然形式的HBHA和ESAT-6、組成用獨立的方法，將所述的生物樣品與天然形式的HBHA 和ESAT-6相接觸的介質所需要的試劑、以及用于檢測接觸之后IFN-Y的分泌的試劑。本發(fā)明還涉及體外用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物和未被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染或表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的方法，所述的方法包括: a)從所述的哺乳動物的局部感染部位獲得生物樣品；b)將所述的生物樣品與天然或重組體形式的HBHA相接觸；以及c)測定所述接觸對于HBHA特異性IFN-Y的影響，其中在表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物中HBHA特異性IFN-Y的影響要大于在未被結核分枝桿菌 (M. tuberculosis)感染的哺乳動物或表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物中HBHA特異性IFN-γ的影響。本發(fā)明也闡述了用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物和未被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染或表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的試劑盒，所述的試劑盒包含天然或重組體形式的HBHA、組成適合于將來自所述的哺乳動物的生物樣品中的細胞與HBHA 相接觸的介質所需要的試劑、以及用于檢測接觸之后IFN-Y的分泌的試劑。


圖1涉及在結核病患者(TB)和在表現(xiàn)潛伏性結核(PI)的對象中的HBHA特異性 IgG的滴度。矩形顯示了 25和75的百分比。鉛垂線顯示了極限值。在這兩個群體之間未觀察到顯著差異(P > 0. 05)。圖2比較了在結核病患者(TB)和在表現(xiàn)潛伏性結核(PI)的對象中的nHBHA特異性IgG與rHBHA特異性IgG的滴度。圖2A顯示了在表現(xiàn)潛伏性結核的對象中，IgG對于天然的HBHA的甲基化形式的識別比重組體形式(rHBHA)更好(ρ > 0. 05)，而在結核病患者中(圖2B)，該差異并不明顯 (P > 0. 05)。圖3比較了在結核病患者(TB)和在表現(xiàn)潛伏性結核(PI)的對象中的rHBHA Δ C 特異性IgG與HBHA的C片段(C-肽)特異性IgG的滴度。圖3Α顯示了結核病患者具有優(yōu)先識別縮短的重組體形式(rHBHAAC)的IgG，而表現(xiàn)潛伏性結核的對象的IgG僅識別該形式(p = 0. 0052)。相反地，在圖:3B中，與表現(xiàn)潛伏性結核的對象相反，來自于結核病患者的IgG不能識別C-肽片段(p = 0. 0478)。圖4顯示了在對照的對象中(對照；η = 12)、在表現(xiàn)最近的潛伏性結核的對象中 (< 5年)(PI ;n = 38)和在結核病患者中(TB ；η = 46)應答于nHBHA的IFN- γ的分泌。 中值分別在 10pg/ml、2040pg/ml 和 16pg/ml 處。**p < 0. 001。圖5顯示了在具有潛伏性結核的對象中(PI)和在結核病患者中(TB)應答于 ESAT-6的IFN-Y的分泌。在具有潛伏性結核的對象中，特定的ESAT-6誘導的IFN-γ的分泌明顯比在結核病患者中要少。對于PI患者中值在對應ESAT-6的IFN- γ的42. 50pg/ml處，對于TB患者中值在 IFN- γ 的 4072pg/ml 處(ρ = 0. 02)。圖6顯示了在結核病患者和表現(xiàn)潛伏性肺結核的對象中nHBHA/ESAT-6的比值。 中值分別是0. lpg/ml和146. 2pg/ml。該比值實質上有利于表現(xiàn)潛伏性結核的對象(p = 0. 001)，并提供了患病的被感染對象和被感染的非患病對象(無癥狀)之間的良好辨別力。圖7顯示了在結核病患者中由周圍血液單核細胞(PBMC)應答于nHBHA的IFN- γ 分泌的抗-轉化生長因子β1、2、3(抗-TGFi3)區(qū)抗體。在上清液中鑒定IFN-Y。二點檢驗(ffi lcoxon-p = 0. 0161 ；η = 15 對)。圖8顯示了在由取自表現(xiàn)胸膜腔積液的肺結核患者或其他患者的胸膜液單核細胞應答于nHBHA的IFN- γ分泌和應答于PPD的IFN- γ分泌之間的比較。在上清液中鑒定 IFN-Y。橫線表示中值。
圖9說明了來自PBMC的CD3+CD4+T淋巴細胞(PBMC nHBHA)與肋膜的CD3+CD4+T淋巴細胞(Lympho. Pleural nHBHA)之間的比例，并包含應答于nHBHA的胞漿內的IFN-γ，表示為在結核病患者之中，在經HBHA刺激16小時之后表達IFN- γ的細胞的百分數少于未經HBHA刺激產生IFN-Y的細胞的百分數(n = 7)。中值分別在0. 04%和1. 23%處。(ρ =0. 0156 ；ffilcoxon)。圖10表示包含應答于nHBHA的胞漿內的IFN- γ的⑶3+CD4+T淋巴細胞的比例，對于肋膜的肺結核來說(n = 7 ；中值=1. 23% )，對于胸膜腔積液的非結核性的來源來說(η =2 ；中值=0. 18% )。圖11顯示了包含應答于nHBHA刺激的IFN- γ的T淋巴細胞的⑶3+CD4+(圖11A) 和CD3+CD8+(圖11B)的比例。該圖顯示了來自于氣管氣泡洗出液或周圍血液單核細胞(血液)的泡狀淋巴細胞細胞(蜂窩狀小窩)。該氣管氣泡洗出液獲得自表現(xiàn)肺結核的病人(TB)或表現(xiàn)非肺結核來源的肺病的對照對象。圖12顯示了能辨別來自nHBHA特異性IFN-γ分泌的潛在TB患者和對照個體 (A)，和來自nHBHA特異性IFN- γ分泌的潛在TB和發(fā)病TB病人(B)，以及來自PPD特異性 IFN- γ分泌的潛在TB和發(fā)病TB病人(C)的ROC曲線?？紤]如上所述的圖，NS指差異并不明顯，*指差異明顯，為0.01 <ρ <0.05，以及 "指差異很明顯，為P <0.01。優(yōu)選實施例的描述在本發(fā)明的范圍內，術語“哺乳動物”指覆蓋有毛或毛皮、給其幼仔哺乳并生育活的幼仔的任何熱血動物。術語"哺乳動物"包括但不局限于人、象、豬、狗、貓、牛、鹿、猴等。結核分枝桿菌主要影響人類宿主，而其它哺乳動物也可能受到這種細菌性疾病的影響。在這種情況下，在除了人類的哺乳動物中感染肺結核被稱為“反相的動物傳染病”，因為結核分枝桿菌可由人類傳播給動物。縮寫“ΗΒΗΑ”的意思是“肝素結合血細胞凝集素”，其為涉及支持上皮細胞的表面蛋白(Genbank登錄號AF074390和AAC26052. 1)。以其天然形式存在的HBHA蛋白的鑒定已經由 Menzozzi 等描述了(J Exp Med 184 ;993_1001 (1996))。HBHA 是 199 個氨基酸的蛋白， 其C末端富含賴氨酸重復，并包含肝素結合位點。該蛋白對于結核分枝桿菌的膈外傳播是必需的(Pethe 等，Nature412 190-194 (2001)) 在法國專利申請FR-A-01/14953中描述了重組HBHA(rHBHA)，其中報道說與天然的蛋白(nHBHA)相反，重組HBHA蛋白在其C末端的賴氨酸殘基上并未甲基化。在Pethe 等(2000， Journal of Biological Chemistry 275(19) :14273-14280) 描述了 rHBHAAC片段。該片段起源于重組HBHA，其氨基酸殘基第161-199位已被刪除。該甲基化的C末端片段包含氨基酸殘基第161-199位，其具有以下序列KKAAPAK KAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK(SEQ ID NO :1)。上述引用的所有參考文獻都并入本文作為參考。在本發(fā)明的范圍內，術語“PBMC”的意思是“周圍血液單核細胞”。此處描述的PBMC 可由文獻中已知的任何方法來獲得。在本發(fā)明的一個實施例中，通過密度梯度離心從使用大約9. 1% (w/v)的diatriazoate鈉和大約5. 7%的多聚糖的溶液的靜脈血樣品中獲得。 該溶液具有大約1. 077士0. 001g/ml的密度和280士 15moSm的滲透壓度。該溶液的商品名為 Lymphoprep 。在本申請中術語“潛在性結核”或“潛在結核分枝桿菌”或“潛在形式的肺結核”可互換使用，其意思是哺乳動物被結核分枝桿菌復合體的細菌所感染但無癥狀，即產生無癥狀的肺結核。進一步地，被感染的哺乳動物不能將肺結核傳給其它哺乳動物，因為在痰中不存在肺結核細菌。換句話說，哺乳動物被感染但不傳播該疾病。多種形式的肺結核按如下分類TBO 不暴露于肺結核細菌；沒有感染；TBl 暴露于結核分枝桿菌，未知程度的感染；TB2:由肺結核細菌引起的感染，無癥狀產生(結核菌素皮膚試驗陽性反應正 PPD)；TB3 主動形式的肺結核，完整診斷；TB4 肺結核的臨床上不發(fā)病形式，適當地或免除處理；以及TB5 可能的肺結核，準備妥當的診斷(“排除”TB)。在本發(fā)明的范圍內，術語“健康群體”指無論其感染狀態(tài)，均不顯示肺結核癥狀的個體，即未感染(TBO)或被感染但健康(潛伏性結核；TB2)。在本發(fā)明的范圍內所描述的方法和試劑盒可區(qū)分上述分類中的TB3形式與TB2形式、TB2形式與TBO形式、TB3形式與TBO形式?？s寫PPD的意思是“結核菌素蛋白醇化衍生物”。通常通過包括暴露于PPD的皮內試驗來診斷肺結核。如果在PPD暴露點的該皮膚反應超過某一大小，例如10毫米或其以上，則認為該測試為正。此處所定義的術語“生物樣品”包括呼吸性和非呼吸性樣品?！昂粑詷悠贰卑ㄖ夤芪鑫?、氣管氣泡洗出液(BAL)、胃洗出液和痰?？赡鼙挥糜诒景l(fā)明的方法中的非呼吸性樣品的例子包括滲出液例如肋膜的、腹的和關節(jié)的液體、腦脊髓液、頭脊柱液、關節(jié)液、 腹水、心包液、及其它體液、淋巴結活組織、經支氣管的活組織、肋膜和肝臟的活組織、髓質穿刺和腰椎穿刺、尿或血樣(PBMC或周圍血液單核細胞)和膿液吸出等的樣品。術語“來自感染部位”包括除掉肺結核感染部位的任何生物樣品，也包括如上所述的任何生物樣品等。本發(fā)明的方法可以一方面在被感染的哺乳動物中檢測體內的結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis) HBHA蛋白的免疫反應，另一方面作為現(xiàn)有診斷方法的選擇性補充，在體外區(qū)分肺結核的潛伏形式與主動形式，換句話說區(qū)分各自的非感染形式與感染形式。本發(fā)明涉及一種體外用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的方法，所述的方法包括a)從所述的哺乳動物中獲得生物樣品；b)在形成抗體-HBHA相互作用的合適條件下，測定針對HBHA蛋白的兩個截然不同的形式、并包含在所述生物樣品中的抗體(IgG)的數量；以及c)比較獲得自兩種形式的HBHA蛋白的抗體的滴度，其中獲得自表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的抗體的滴度的比較不同于獲得自表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的抗體的滴度。起始于來自哺乳動物的生物樣品，并利用針對結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的HBHA蛋白的免疫反應的特征，其對于各種結核病(發(fā)病的對潛在的)， 該方法能夠區(qū)分被感染的患病的哺乳動物和未患病的哺乳動物。因此，表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物具有免疫反應，尤其是由體液引起的反應，其依據 HBHA蛋白而不同。獲得自表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的抗體，例如免疫球蛋白(IgG)，識別HBHA蛋白的不同部分。因此可能調節(jié)HBHA蛋白的結構來獲得不同形式的HBHA和辨別各種結核病。術語“不同形式的HBHA”的意思是HBHA蛋白的結構的任何改變，關于其氨基酸殘基的數目(減少或增加)和/或性質(具有不同的或相同大小電荷、 空間阻礙的氨基酸的取代)，和/或任一翻譯后修飾，例如乙酰化、酰胺化、生物素化、羧化、 羥基化、甲基化、磷酸化或硫酸鹽化或通過增加脂類(異戊二烯化、棕櫚?；投罐Ⅴ；?、 糖類(糖基化作用)或多肽(泛素化)。在本發(fā)明的范圍內，當兩種形式以不同的方式識別來自表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的抗體時，兩者被成為是不同的。以獨立的方式進行滴定，即確定識別每種形式的HBHA的抗體(血清學測試)的數量，使用對于本領域技術人員所知的任何技術，例如直接的或間接的ELISA，(酶聯(lián)免疫測試)或用放射免疫檢定(RIA)，允許與包含在具有不同形式的HBHA的生物樣品中的抗體相接觸?！耙元毩⒌姆绞健敝笇悠返囊徊糠峙cHBHA蛋白的一種形式接觸，并將樣品的另一部分與HBHA蛋白的第二種形式接觸。將存在于樣品中的抗體與允許其相互作用的HBHA的形式相接觸，所述相互作用的測定在本領域技術人員所知的適當的條件下進行。因此，舉例來說，下列可被改進用于將抗原(HBHA)耦聯(lián)到支持物上的技術、生物樣品稀釋、不同形式的HBHA的濃度、溫度和接觸時間以及如果需要的話，第二種抗體的性質和濃度、以及允許測定相互作用的參數，例如本底噪聲的降低、標記物(放射物、熒光染料)的選擇或測定信號的采集時間。例如ELISA方案，用適當的緩沖液(涂料)將不同形式的HBHA稀釋至1到10 μ g/ ml的濃度范圍，并在室溫下(RT)I到6小時或在4°C下過夜在酶標板中孵育(50到200μ 1)。 通常使用的緩沖溶液是 50mM碳酸鈉、ρΗ6. 9 ；20mMTris-HCl，pH8. 5 或 IOmM PBS, pH7. 2-7. 4。 然后將該板用包含0. IM PBS或TBS，pH7. 4的洗液來洗滌，再用例如Triton或Tween 20(終濃度0. 01%到0. 05% )的洗液來洗滌。然后將一種飽和溶液O00到300 μ 1)，例如包含脫脂奶粉、酪素或膠的PBS，在37°C或室溫下應用于阻礙非特異性相互作用30到60分鐘，然后在幾次洗滌之后去除剩余物。在幾次洗滌之后，將稀釋的(l/10th到l/1000th)生物樣品(100到200 μ 1)在 37°C或室溫下孵育30分鐘到2小時或在4°C下過夜。然后加入在飽和溶液中烯釋的第二種抗體(大約100 μ 1)在室溫或37°C下反應30分鐘到2小時。在幾次洗滌之后去除剩余物。如果必要的話，在加入終止液之后，加入基質(100 μ 1)在黑暗中在室溫下反應1到5 分鐘。滴定的結果能夠使由兩種不同形式得到的兩個值對于同一哺乳動物進行比較。這種在表現(xiàn)潛伏性結核的一個或多個哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的一個或多個哺乳動物中同時進行的比較產生了懸殊的結果，因為存在于被感染哺乳動物中的免疫反應的特異性質。法國專利(FR-A-01/14953)在以前已經說明了 天然的HBHA蛋白(nHBHA)在其 C末端部分的賴氨酸殘基上甲基化。相反地，重組HBHA蛋白(rHBHA)具有不同的甲基化程度，因為其不具有這種翻譯后修飾。因此，天然或重組體形式的使用已經顯示了來自具有活動性結核的哺乳動物的生物樣品包含比較大量的針對活動性的抗體；重組體形式顯示了在那些哺乳動物中，該蛋白的相同部分(N末端)被識別了。相反地，來自具有活動性結核的哺乳動物的生物樣品顯示了針對天然形式的抗體的滴度，其高于針對重組體形式的抗體的滴度，表明在那些哺乳動物中存在對天然形式甲基化的優(yōu)先識別。因此，這些結果能夠通過比較針對天然形式和重組體形式的HBHA的抗體的滴度來區(qū)分潛伏性和活動性形式的結核病。用于本發(fā)明的范圍內的兩種其它不同形式的HBHA是代表該蛋白的N末端部分 (氨基酸第1到160位)的rHBHA Δ C片段和甲基化C末端部分。來源于該生物樣品的抗體的滴度的比較顯示在表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物中，觀測到識別甲基化C末端片段的抗體占優(yōu)勢，而在表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物中，觀測到識別rHBHA Δ C片段的抗體占優(yōu)勢。這種包含抗體滴定的方法可在任何包含IgG的生物樣品上進行。在本發(fā)明的進一步方面，所述方法在血樣上進行。本發(fā)明也提供了一種用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的試劑盒，所述的試劑盒包含·兩種不同形式的HBHA蛋白，如上所定義，一種是天然的HBHA和重組ΗΒΗΑ，另一種是HBHA的rHBHA Δ C片段和甲基化C末端片段； 組成適合于在包含于來源于所述哺乳動物的生物樣品的抗體和不同形式的HBHA 蛋白之間進行免疫反應的介質所需要的試劑；所述試劑包含在抗體和HBHA的不同形式之間相互作用所必需的所有化合物，以及可增加或促進所述相互作用或使其更具特異性的任何化合物；·檢測在所述免疫反應中形成免疫學復合物所需要的試劑。所述試劑包含可顯示或探測在抗體和上述HBHA的不同形式之間的反應的任何化合物。該試劑包括第二種抗體、 選擇性的放射性標記物或耦聯(lián)熒光染料，以及可增強或調節(jié)探測信號的任何分子。該試劑盒選擇性地包含一種或多種對照組織或生物樣品，其可用作負對照(取自未感染哺乳動物的樣品；TBO期)或正對照(ΤΒ2期和/或ΤΒ3期)。如圖12的ROC曲線所示，目前基于HBHA特異性IFN-γ分泌的習慣方法似乎足以在健康的對照人群中識別TB潛在的病人，并區(qū)分TB潛在的和TB活動的病人。但是，通過考慮ESAT-6特異性的IFN-γ分泌，可大大改進這些方法。因此，本發(fā)明描述了這些習慣方法的替代方法，即其基于HBHA特異性和ESAT-6特異性的IFN- γ分泌。本發(fā)明涉及第二種體外用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物或用于鑒定在健康的群體內表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的方法，所述的方法包括a)從所述的哺乳動物中獲得生物樣品；b)用獨立的方法，在允許IFN-Y分泌的條件下，將所述的生物樣品與天然形式的HBHA和ESAT-6相接觸；c)測定HBHA特異性IFN- γ的分泌和ESAT-6特異性IFN- γ的分泌；以及d)計算HBHA特異性IFN- γ的分泌和ESAT-6特異性IFN- γ的分泌之間的比，其中在表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物中獲得的所述比值要高于在表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物或未被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染的哺乳動物中獲得的比值。在步驟a)中，生物樣品獲得自健康的群體，即來自不表現(xiàn)結核病癥狀的個體，或獲得自被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染的群體。在健康的群體內，該方法的目的是在不具有結核病癥狀的個體中識別被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染但不表現(xiàn)癥狀的個體(潛在的TB)，相反地，在被感染的病人的群體內，該方法的目的是區(qū)分具有活動性結核的病人和具有潛伏性結核的病人。該方法包含將生物樣品與天然形式的HBHA相接觸，并獨立地與ESAT-6 (提前分泌的抗原靶6)相接觸。短語“用獨立的方法”的意思是將生物樣品與HBHA相接觸，在空間上分開地與ESAT-6相接觸。向生物樣品中加入這兩種分子能刺激存在于所述樣品中的細胞， 并引起細胞活素，例如IFN-Y的分泌。將樣品與HBHA和ESAT-6接觸是在允許IFN- γ分泌的條件下進行的。因此，本領域技術人員可以根據樣品的性質來改進介質、用于接觸的介質的PH和溫度、接觸時間、生物樣品的稀釋、HBHA蛋白的濃度的選擇。使用本領域技術人員所知的任何技術來測定IFN- γ的分泌，例如ELISA、 ELISP0T、流細胞計數法(FACS)、定量RT-PCR，在將樣品與HBHA接觸之后，相應地被稱為 HBHA特異性IFN- γ，并在將樣品與ESAT-6接觸之后，相應地被稱為HBHA特異性ESAT-6。 本領域技術人員可對涉及能測定IFN-Y分泌的參數，例如抗體、其標記物和相互作用條件進行改進。ELISA條件與如上所述的條件相同，緩沖溶液包含抗IFN-Y的抗體，而不是與 HBHA不同的蛋白。也使用針對于IFN-γ的第二種抗體。計算HBHA特異性IFN- γ的分泌和ESAT-6特異性IFN- γ的分泌之間的比值能夠使?jié)撛谛越Y核區(qū)別于活動性結核。因此，在具有潛伏性結核的哺乳動物中，得到了非常高的比值，其大于1，大于50，大于100，大于1，大于200或大于300。因此，在100到400范圍內確定為潛在形式的結核病，相反地，在具有活動性結核的哺乳動物或未被結核分枝桿菌 (M. tuberculosis)感染的哺乳動物中，該比值極低，并且小于1，小于0. 75或小于0. 5。因此，0或小于0. 5的比值確定為在一群被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染的病人中的具有活動的TB形式的病人(例如具有正的結核菌素試驗)或者在健康的群體中未被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染的病人(無結核病癥狀)。第二種方法是在通常用于結核病診斷的任何生物樣品上進行的，例如支氣管吸出物、氣管氣泡洗出液(BAL)、胃洗出液、痰、滲出液例如肋膜的、腹的和關節(jié)的液體、腦脊髓液、頭脊柱液、關節(jié)液、腹水、心包液、及其它體液、淋巴結活組織、經支氣管的活組織、肋膜和肝臟的活組織、髓質穿刺和腰椎穿刺、尿或血樣和膿液吸出的樣品。在本發(fā)明的一個實施例中，可對通過本領域技術人員所知的任何方法從血樣中分離的淋巴細胞應用本方法。在進一步的實施例中，從周圍血液中分離了 PBMC。在進一步的實施例中，在獲得生物樣品之后和在將所述樣品進行接觸之前，如上所述的方法包含培養(yǎng)生物樣品的附加步驟。培養(yǎng)適應于該生物樣品的性質。
本發(fā)明還涉及一種用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物或用于鑒定在健康的群體內表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的試劑盒，所述的試劑盒包含·天然形式的HBHA和ESAT-6 ；·組成用獨立的方法，將存在于來自所述的哺乳動物的生物樣品中的細胞與天然形式的HBHA和ESAT-6相接觸的介質所需要的試劑；該試劑包括用于前面的試劑盒的如上所述的試劑； 用于檢測接觸之后IFN-Y的分泌的試劑。使用任何已知技術來測定分泌的 IFN-γ，在該試劑盒中可包含特異于IFN-Y的主抗體、選擇性標記、或第二抗體、能識別主抗體的選擇性標記，以及可增強或調節(jié)探測信號的任何分子。該試劑盒選擇性地包含一種或多種對照組織或生物樣品，其可用作負對照(取自未感染哺乳動物的樣品；TBO期)或正對照(TB2期和/或TB3期)。在進一步的實施例中，該試劑盒包含在與天然的HBHA或ESAT-6接觸之前，參與其樣品培養(yǎng)的培養(yǎng)基和任何化合物。本發(fā)明還涉及第三種體外用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物和未被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染或表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的方法，所述的方法包括a)從所述的哺乳動物的局部感染部位獲得生物樣品；b)在能獲得對IFN-Y的影響的適當條件下，將所述的生物樣品與天然或重組體形式的HBHA相接觸；以及c)測定所述接觸對于HBHA特異性IFN- γ的影響；其中在表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物中HBHA特異性IFN-γ的影響要大于在未被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染的哺乳動物或表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物中的影響。在本發(fā)明的范圍內，短語“局部感染部位”包括形成致病菌結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)和已經發(fā)生感染的任何部位。因此，該定義包括肺、淋巴結、肋隔(肋膜的空間)、關節(jié)、骨、生殖泌尿道、腦膜、腹膜、胃腸道、中樞神經系統(tǒng)、腎上腺或心包膜。在該方法中，所有包括PBMC的血液來源的樣品都被除去了。該方法包含將生物樣品與天然的或重組體形式的HBHA相接觸，造成對所述樣品的細胞的刺激。用于第三種方法的短語“重組體形式的HBHA”指全部未甲基化形式的HBHA， 例如從 E. coli 菌株(BL21(DE3) (pET-HBHA))中純化的。然后測定所述刺激對于IFN- γ的效果。術語“對于IFN- γ的效果”指對于IFN- γ 表達的任何改變，在轉錄(mRNA)或翻譯(蛋白質)水平上，關于IFN-Y的降解、成熟(例如糖基化)或分泌。將來源于局部感染部位的樣品在適合于獲得對IFN-Y影響的條件下與HBHA接觸，該條件可由本領域技術人員來改進，例如對于介質、用于接觸的介質的PH和溫度、接觸時間、生物樣品的稀釋、HBHA蛋白的濃度的選擇。在本發(fā)明的一個實施例中，使用任何已知的用于測定化合物數量的技術來測定分泌IFN-γ的數量，例如ELISA、ELISP0T、流細胞計數法(FACS)、定量RT-PCR。從來自表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的生物樣品中分泌的HBHA特異性IFN- γ的數量大于 1000、大于 2000pg/ml、大于 5000pg/ml 或大于 10000pg/ml。因此，5000 到 45000pg/ ml的范圍或10000到45000pg/ml的范圍內的量確定為活動性結核病，相反地，從生物樣品中分泌的HBHA特異性IFN- γ的數量等于或小于100、400或1000pg/ml確定為未感染結核分枝桿菌(M. tuberculosis)或潛伏性結核病。在進一步的實施例中，對于IFN-Y標記物為正的細胞的比例是這樣測定的計算在與HBHA刺激16小時后表達IFN-Y的細胞的百分比，與未刺激而產生IFN-γ (自生分泌)的細胞的百分比的差值。在對于定量實驗方案的靶生物樣品的細胞上進行該計算，例如淋巴細胞、CD4+細胞、或任何其它的淋巴細胞亞群。用任何已知的方式來標記，用于化合物的胞內標記，其可使用透化劑，例如皂莢苷 (0. 01%到0. 1% ), triton(0. 1 %)、毛地黃皂苷和/或細胞固色劑，例如2%仲甲醛、或抗體、選擇性的放射性標記物或耦聯(lián)熒光染料。將樣品與HBHA接觸之后，將布雷菲德菌素A (Brefeldin A) (10yg/ml)加入到樣品中，在37°C或室溫下反映3到5小時來阻礙樣品中所含有的細胞的任何分泌。然后，將細胞用固色劑，例如如上所述的試劑，在4°C下固定15到30分鐘，然后用透化劑，例如如上所述的試劑，在黑暗中在室溫下固定15到30分鐘。在透化劑溶液(10mg/ml)中稀釋主要抗體和第二抗體，并加入在40°C下來孵育15到30分鐘。在用固色劑固定之前標記表面抗原，例如CD4或CD8，其是靈敏的；或在透化之后標記那些抗固定的表面抗原。然后用流細胞計數法來分析標記的細胞。因此，從來自表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的生物樣品中獲得的細胞的比例大于 0. 3%、大于0. 5%、大于0. 75%或大于1%?？色@得5%、10%和高達15%。相反地，在未被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染的哺乳動物或表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物中獲得的細胞的比例是0或小于0. 2%到0. 3%。該方法可證實在哺乳動物中的活動性結核。相反地，以上引用的值中IFN-Y 的低分泌或少量的胞漿內IFN-Y顯示非活動性結核，并可解釋為未被結核分枝桿菌 (M. tuberculosis)感染或潛伏性結核。在該方法中的獲得生物樣品和將其與樣品接觸之間，可選擇性地加入一個步驟， 該步驟包括培養(yǎng)所述的生物樣品。在一個實施例中，生物樣品選自由以下成分組成的組支氣管吸出物、氣管氣泡洗出液(BAL)、胃洗出液、痰、滲出液例如肋膜的、腹的和關節(jié)的液體、腦脊髓液、頭脊柱液、關節(jié)液、腹水、心包液、及其它體液、淋巴結活組織、經支氣管的活組織、肋膜和肝臟的活組織、 髓質穿刺和腰椎穿刺、尿樣和膿液吸出的樣品。在本發(fā)明進一步的實施例中，用于所述方法的細胞是T淋巴細胞，例如CD3+CD4+T 淋巴細胞。本發(fā)明還涉及一種用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物和未被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染或表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的試劑盒，所述的試劑盒包含·天然或重組體形式的HBHA ；·組成適合于將來自所述的哺乳動物的生物樣品中的細胞與天然或重組體形式的 HBHA相接觸的介質所需要的試劑；該試劑包括用于前面的試劑盒的如上所述的試劑； 用于檢測接觸之后的IFN- Y的試劑。使用任何已知技術來測定分泌的或在胞漿內的IFN-γ，在該試劑盒中可包含特異于IFN-Y的主抗體，其可被標記，第二抗體，其可被標記，能識別主抗體，以及可增強或調節(jié)探測信號的任何分子。該試劑盒選擇性地包含一種或多種對照組織或生物樣品，其可用作對照取自未感染哺乳動物的樣品(ΤΒ0期)，取自TB2期的樣品和/或取自TB3期的樣品。在進一步的實施例中，該試劑盒包含在與HBHA接觸之前，參與其樣品培養(yǎng)的培養(yǎng)基和任何化合物。給出下列實施例來說明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明的范圍。 實施例實施例1 血樣的來源在獲得患者同意后，從結核病患者和具有潛在的結核病的患者處獲得血樣?；谡闹苯訖z查和/或對結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的正培養(yǎng)來選擇結核病患者。在治療的第一個三周末之前登記所有的對象?；趯τ诮Y核菌素(在診斷時硬結的直徑超過18mm)的正的遲發(fā)過敏性試驗來選擇具有潛在形式的結核病的對象?；谕ǔ５男赝刚掌懦顒有问降慕Y核病。所有的病人都是HIV血清反應陰性的，并沒有接受過免疫抑制劑治療。在招募時，所有的對象都生活在歐洲。實施例2:其它樣品在注射了大約200ml的生理鹽水后，通過食道硬化治療，將氣管氣泡洗出液(BAL) 去除。然后將去除的液體(大約IOml)進行離心。將肋膜的、腹的和關節(jié)的、頭脊柱的及其它液體集中于無菌炮彈管中，并當它們一到達實驗室就進行離心。對于神經節(jié)或其它可疑的集結，進行手術上的切除術。當它到達實驗室，就將收集的組織片段切碎，并在培養(yǎng)基中孵育來使細胞從組織中逐步解離下來。實施例3:抗原利用如其它地方(14)所述的肝素-瓊脂糖凝膠色譜法，接著進行高壓液相色譜法 (HPLC)，將天然形式的HBHA(nHBHA)從M. bovis BCG上純化出來。在用考馬斯亮藍染色之后的HPLC色譜圖和SDS-PAGE分析證明以上準備沒有蛋白質污染。使用氣相色譜法發(fā)現(xiàn)來源不明的糖脂。鱟試驗顯示脂多糖濃度小于10pg/ml。從Ε. C01 i菌株(BL21 (DE3) (pET-HBHA))中純化出未甲基化的重組體形式 (rHBHA)。在法國專利FR-A-01/14953中比較了重組體蛋白的甲基化程度與天然蛋白的甲基化程度相比的情況。WE. coli菌株(BL21(DE3) (ρΕΤτΗΒΗΑ Δ C))中純化出縮短的重組體形式的C末端部分(rHBHAAC)。在 Pethe 等 Q000 Journal of Biological Chemistry 275(19) 14273-14280,并入本說明書作為參考)中描述了縮短的形式rHBHA Δ C，其來自于氨基酸第 161到199位被刪除的重組HBHA蛋白。用前甲基化氨基酸合成的分離的C末端肽，相應于HBHA蛋白的氨基酸第161到 199 位，并具有下列序列KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK (SEQ ID NO 1) (12，13)。Pethe 等(Proc Natl Acad Sci 2002 ；99 :10759-10764)和 iTemmerman 等(Nat. Med. 2004Sep, 10(9) :935-941)并入此處作為參考。
實施例4 =HBHA的特異性IgG的測定使用ELISA來測定抗-nHBHA、-rHBHA、-rHBHA Δ C和-C肽(分離的C末端肽)的 IgG。詳細地，在4°C下用96-孔聚苯乙烯板(Maxisorp Nunc)孵育過夜，其中50 μ 1/孔的 PBS 稀釋的 1. 5μ g/Ι 的抗原溶液(nHBHA、rHBHA, rHBHAAC 或 C-肽)。用 PBS-Tween 20(0. 05% )將板洗滌三次，在37°C下用溶于PBS中的酪素溶液浸透1小時。在洗滌之后，在室溫下在孔中將來自病人的血清稀釋于PBS-Tween 20溶液(0.05%)中(1 50 到1 1觀00的稀釋)處理30分鐘，并進行攪拌。在PBS-Tween 20 (0. 05% )中稀釋250 倍的與生物素耦合的山羊的抗-人體IgG抗體是使用的第二種抗體(biotinylated goat anti-human IgG-Southern Biotechnologies Associates, Birmingham, USA 2040-08), 通過50 μ 1/孔的用1 : 1000稀釋(0. 5% casein)的過氧物酶溶液(extravidin過氧物酶-共軛E2886-Sigma)顯示了它們的存在。在黑暗中洗滌10到30分鐘的時間之后，加入 50μ 1的基質溶液(在0. IM檸檬酸鈉中0. lmg/ml的3，3' ,5,5'-四甲基對二氨基聯(lián)苯和1 μ 1/ml的30%過氧化氫，pH5)。該反應用25 μ 1/孔的氫氯酸QmMol/L)來終止。抗體滴度可以表示為最后的血清稀釋度，其相對于孔中負的血清被認為是正的。實施例5 通過應答于nHBHA/ESAT-6的PBMC的γ干擾素的分泌(ELISA)用周圍血液樣品(lymphopr印-Nycomed Pharma)的密度梯度離心來獲得 PBMC。所述的PBMC再懸浮于2倍濃度的106細胞/ml的培養(yǎng)基中(完全RPMI:RPMI 1640 (Bioffhittaker)補充有40 μ g/ml的慶大霉素、50μΜ的2-巰基乙醇、1倍的非必需氨基酸(Life Technologies)和10%的胎兒小牛血清(FCS))。在37°C下在含有5% C02的大氣中用2 μ g/ml的nHBHA和5 μ g/ml的提前的分泌物抗原靶6 (ESAT-6) (Statens Serum Institut,Denmark)刺激細胞96小時的時間。在一些試驗中，以5 μ g/ml的濃度加入阻遏抗體抗-TGF-β 1,2,3( IgGl，R&D 系統(tǒng))。在培養(yǎng) 4 天之后，使用 ELISA(IFN-γ Cytoset， Biosource)收集上清液來測定分泌的IFN-γ。實施例6 局部的、干擾素應答實施例6a 生物學液體和生理部分分析的生物學液體是肋膜的、關節(jié)的和腹的液體。分析的生理部分是從神經節(jié)或其它可疑的集結中切除的活組織。通過第一次過濾(細胞篩，NylonlOOymFalcon &reg ； 352360)，接著以2300rpm離心15分鐘，從生物學液體中分離成核成分。如果需要的話，將存在于細胞殘留物中的紅色小球溶解。然后將細胞再懸浮于完全的RPMI溶液中。通過切碎各部分來分離來自組織樣品的成核成分，并在37°C、5% C02的大氣中在完全的RPMI溶液中孵育過夜?；厥丈锨逡?，沖洗各部分來回收仍然易得到的任何細胞。然后將得到的液體以2300rpm離心15分鐘。如果需要的話，將紅色小球溶解。將細胞殘留物再懸浮于完全的 RPMI溶液中。實施例6b:抗原刺激當分離的細胞的數目足夠時(胸膜液)，PBMC在體外以同樣的方式刺激這些細胞， 在體外用HBHA刺激96小時之后測定培養(yǎng)的上清液中分泌的IFN- γ的濃度。至于PBMC， 如下所述在體外用HBHA短暫刺激氣管氣泡洗出液、關節(jié)液或腹膜液、神經節(jié)等之后，也可以用流細胞計數法來進行利用這些細胞的IFN-Y合成的分析。在體外用10 μ g/ml濃度的 HBHA刺激分離的細胞Oxl06/ml) 16到18小時的時間。然后在存在布雷菲德菌素A (10 μ g/ml-Brefeldin A-Sigma)的條件下，通過孵育4小時來阻礙從細胞中細胞活素的分泌，并在標記細胞之后，用流細胞計數法來分析細胞中IFN-Y的存在。在固定細胞之后，將其透性化(固定并加熱；細胞透性化試劑盒-Caltag Laboratories)、洗滌，然后在黑暗中在存在與熒光染料相耦聯(lián)的抗體(抗-⑶3PerCP、抗-⑶4APC、抗-IFN- γ ΡΕ,所有的都獲得自 Becton, Dickinson)的條件下孵育30分鐘。然后用FACSCalibur細胞計分析正的細胞的百分比，最初基于大小和顆粒度來把淋巴細胞作為目標，然后淋巴細胞子群的不同與其表面標志的表達有關。實施例7:統(tǒng)計分析對于未配對的數據，在使用Durm試驗來進行后試驗比較之后，進行Marm-Whitney 無參數試驗或無參數Kruskall-Wallis試驗。使用Wilcoxon或Friedman試驗來分析配對數據。接受器操作曲線(ROC)分析在曲線(圖12)上的每個點對應于具有靈敏性和特異性的特定一對。根據表1、2或3給出的值來計算。完整的曲線(及特別是在其下面的面積)給出了整個試驗的概括。令人滿意的曲線接近左上角，而在最壞情況下獲得了對角線 (虛線)。在ROC曲線之下的總面積是診斷試驗性能的尺度，因為起反映了在所有的截止水平上該試驗的性能。該面積在
之間，并且面積越大，該試驗的性能就越好。按照曲線下的面積，將該試驗的精確性進行分類，如下所示優(yōu)秀的；好的；普通的；不良的和失敗的。用到如下定義-靈敏性在具有陽性診斷的病人中有正試驗的概率真陽性(TP)；-特異性在具有陰性診斷的病人中有負試驗的概率真陰性(TN)；-(1-特異性)在具有陰性診斷的病人中有正試驗的概率假陽性(FP)；-(1-靈敏性)在具有陽性診斷的病人中有負試驗的概率假陰性(FN)；ROC試驗能夠發(fā)現(xiàn)最佳的截止值，其靈敏性和特異性都較高。結果1.由體液引起的應答從大約40%的感染了結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)對象的血清中發(fā)現(xiàn)了 nHBHA-特異性IgG，不論其身體健康(首次被傳染對象或潛在的形式)還是其患病和表現(xiàn)結核病(活動形式)。在這兩個組中得到的抗體滴度是不同的(圖1)。但是，針對天然甲基化形式的HBHA(nHBHA)的抗體的滴度與針對非甲基化的重組體形式(rHBHA)的抗體的滴度相比，支持了這種假說抗體的差異取決于感染結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的病人是患病的(活動形式)還是未患病的(潛在形式)。如在圖2中可以看到的，在首次被傳染對象中，抗-nHBHA IgG的滴度明顯比抗-rHBHA IgG的滴度要高(p = 0.0015)(圖2A)，而在結核病患者中該差異并不明顯(圖2B)。然后，我們一方面分析針對由該分子的N末端區(qū)域(rHBHAAC)單獨組成的縮短的重組體形式的HBHA的IgG，另一方面分析針對甲基化的C末端肽的IgG。如圖3所示，這些結果說明存在于來自結核病患者的血清中的抗-HBHA IgG識別rHBHA Δ C (圖3A)，而來自首次被傳染對象的抗體識別甲基化C末端肽(圖:3Β)。因此，根據存在于來自感染結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的對象的血清中的抗體的種類，其可被分為兩組，首次被傳染的或患病的，這取決于IgG是針對HBHA的未甲基化N末端部分，還是針對甲基化的N 末端部分。2.通過淋巴循環(huán)的IFN-Y分泌a.之前我們已經顯示了在首次被傳染對象中，通過PBMC應答于天然形式的HBHA 的IFN-γ的分泌明顯要大于在結核病患者中的分泌。但是，獲得的差別不足以用于診斷目的。試驗對象數目上的增加使得其在推測感染日期小于五年的首次被傳染對象中進行選擇。圖4所示的結果顯示了在兩組之間的差別稍微更好，但仍然不夠。b.為了更好地評估由天然HBHA誘導的IFN-γ來診斷結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)的潛伏性感染的潛在價值，繪制ROC(接受器操作曲線)來建立IFN-γ的濃度(最佳的截止值)，其給出了對于提出的問題來說，最好的靈敏性/特異性配對。1)在健康群體中潛在的TB患者的診斷(在潛在的TB患者與非感染者之間的差別)因為表現(xiàn)潛在的TB的人(IP)不是患病的，但其表現(xiàn)為Koch氏菌散布的潛在病源，所以該試驗必須能在健康群體中識別這樣的人。因此，根據HBHA所誘導的、來自對照對象(未被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染_n = 14)或表現(xiàn)潛在TB的人(n = 46)的 PBMC所分泌的IFN- γ的濃度來繪制ROC曲線，其中表現(xiàn)潛在TB的人是基于對結核菌素陽性PPD皮內反應的結果來定義的，其為參考的特征性判據(表1)。
狀況數目nHBHA 特異性 IFNyCpg/ml)潛在的TB463390, 35, 2500，18210, 519, 72, 7576, 997, 223,12750，32700，4025，373, 20505, 1727, 28400，15820,16580, 395，13528, 3790, 6496, 2500, 21440，3035，2040，1545, 16000, 1, 3305, 35550, 121000，32600，5092, 988, 269, 608, 78, 1256, 1455，14, 131，4933，532.9， 3565.7, 249.45對照144, 0，62, 87，3, 2，21, 16，0, 90, 0, 83, 36，31.6表1 在潛在的TB患者和對照(健康的)個體中nHBHA特異性IFN γ的值在這樣的試驗中，“陽性的”和“陰性的”人按照如下定義-TP 在對于結核菌素具有陽性皮內反應的病人中有正試驗(超過最佳的截止值) 的概率；-FP 在對于結核菌素具有陰性皮內反應的病人中有負試驗(低于最佳的截止值) 的概率；-FN 在對于結核菌素具有陰性皮內反應的病人中有正試驗(超過最佳的截止值)的概率；-TN 在對于結核菌素具有陽性皮內反應的病人中有負試驗(低于最佳的截止值) 的概率；下面的圖12A所示的ROC曲線是優(yōu)秀的，因為在該曲線下的面積是0. 95(95%可靠區(qū)間0. 90-1. 00 ；P < 0. 0001)。對于超過110pg/ml (最佳的截止值)的IFN- γ的濃度，該試驗對于診斷潛在的TB的靈敏性是89. 13% (CI95 :76. 43-96. 38)，而具有100%的特異性 (CI95 76.84-100)。值得注意的是在ROC試驗中的對照是未進行結核病接種疫苗(卡介苗(BCG))的人。之前已經校正了卡介苗接種的可能的干擾，并在2002年報道過了(Masimgi等J. hf. Dis. 2002 ；185 :513-20)。初步試驗顯示，來自15個接種卡介苗的人(在采血前接種卡介苗超過10年)的淋巴循環(huán)不分泌應答于HBHA的IFN γ，而其應答于PPD。但是，因為關于在健康的成年群體中TB的差別的研究，以及在大多數國家在兒童期就進行了預防接種，似乎適合于對預防接種超過10年的人進行試驗。在這些人中，5人給出了對于結核菌素的陽性皮內反應，3人給出了可疑的結果。另外，來自這些健康接種卡介苗的人中的10個人的淋巴循環(huán)分泌應答于PPD的IFN γ?？傊?，接種卡介苗似乎并不干擾對于在健康群體中區(qū)分潛在的TB患者的可能的診斷結果，該診斷是基于體外由HBHA誘導IFN-Y的。2)在潛在的TB和活動的TB患者之間診斷的差別當病人表現(xiàn)出和結核病相適合的病歷，并且他的或她的對結核菌素皮內反應是陽性時，將結核病與另一種可能發(fā)生在也有潛在的TB的病人身上的疾病相區(qū)別是很重要的。 因此，該試驗必須在被結核分枝桿菌(M. tuberculosis)感染的病人的群體中識別潛在的 TB病人。因此，根據HBHA所誘導的、一方面來自表現(xiàn)潛在TB的對象、另一方面來自表現(xiàn)未處理的活動TB的對象(n = 50)的PBMC所分泌的IFN- γ的濃度來繪制ROC曲線(表2)， 其中表現(xiàn)潛在TB的人是基于對結核菌素皮內反應的結果來定義的，其為臨界的診斷參考 (n = 46)。
權利要求
1.天然形式的HBHA和天然形式的ESAT-6在制備用于在體外檢測和區(qū)分表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物或用于鑒定在健康的群體內表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的標記物中的應用，所述檢測和區(qū)分或者所述鑒定通過如下步驟獲得a)從所述的哺乳動物中獲得生物樣品；b)在允許IFN-γ的分泌的條件下，以獨立的方式，將所述的生物樣品與天然形式的 HBHA和ESAT-6相接觸；c)測定HBHA特異性IFN-γ分泌和ESAT-6特異性IFN- γ分泌；以及d)計算HBHA特異性IFN-γ分泌和ESAT-6特異性IFN- γ分泌之間的比，其中在來自表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物或未被結核分枝桿菌感染的哺乳動物的樣品中獲得的分泌比值大于1，而在來自表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的樣品中獲得的分泌比值小于1。
2.根據權利要求1的應用，其中在來自表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物或未被結核分枝桿菌感染的哺乳動物的樣品中獲得的分泌比值在100到400的范圍內。
3.根據權利要求1所述的應用，其中在來自表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的樣品中獲得的分泌比值小于0.5。
4.根據權利要求1 3中任何一項所述的應用，其中生物樣品選自由以下成分組成的組支氣管吸出物；支氣管氣肺泡灌洗液(BAL)；胃洗出液；痰；滲出液例如肋膜的、腹的和關節(jié)的液體；腦脊髓液；頭脊柱液；關節(jié)液；腹水；心包液及其它體液；淋巴結活組織；經支氣管的活組織；肋膜和肝臟的活組織；髓質穿刺和腰椎穿刺；尿或血樣；和膿液吸出的樣品。
5.根據權利要求1 4中任何一項所述的應用，其中步驟b)包含以獨立的方式將天然形式的HBHA和ESAT-6與PBMC相接觸。
6.根據權利要求1 5中任何一項所述的應用，其包含先于步驟b)的培養(yǎng)生物樣品的附加步驟。
7.一種用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物或用于鑒定在健康的群體內表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的試劑盒，所述的試劑盒包含 天然形式的HBHA和ESAT-6 ； 組成用于以獨立的方式將存在于來自所述的哺乳動物的生物樣品中的細胞與天然形式的HBHA和ESAT-6相接觸的介質所需要的試劑；以及 用于檢測接觸之后IFN-Y分泌的試劑。
8.天然形式的HBHA或重組體形式的HBHA在制備用于在體外檢測和區(qū)分表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物和表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物或用于鑒定在健康的群體內表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的標記物中的應用，所述檢測和區(qū)分或者所述鑒定通過如下步驟獲得a)從所述的哺乳動物的局部感染部位獲得生物樣品；b)在允許獲得對IFN-γ的影響的條件下，將所述的生物樣品與天然形式的HBHA或重組體形式的HBHA相接觸；以及c)通過如下步驟測定所述哺乳動物的狀態(tài)cl)在將細胞與天然的或重組體形式的HBHA接觸之后檢測IFN-γ的分泌量，其中在表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物中HBHA特異性IFN- γ的分泌量要大于1000pg/ml，而在未被結核分枝桿菌感染的哺乳動物或表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物中HBHA特異性IFN- γ的分泌量要小于 1000pg/ml ；或者c2)在淋巴細胞群或其子群內將所述細胞與HBHA相接觸之后，計算包含胞漿內IFN-Y 的細胞的比例，其中在表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物中包含胞漿內IFN-Y的細胞的比例大于0. 3%，而在未被結核分枝桿菌感染的哺乳動物或表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物中包含胞漿內IFN-Y的細胞的比例小于0.3%。
9.根據權利要求8所述的應用，其中由來自表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的生物樣品所分泌的HBHA特異性IFN- γ的量要大于5000pg/ml。
10.根據權利要求8所述的應用，其中由來自未被結核分枝桿菌感染的哺乳動物或表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的生物樣品所分泌的HBHA特異性IFN-Y的量要小于100pg/ml。
11.根據權利要求8所述的應用，其中由來自表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物的生物樣品所獲得的細胞的所述比例大于0.5%。
12.根據權利要求8 11中任何一項所述的應用，其包含先于步驟b)的培養(yǎng)生物樣品的附加步驟。
13.根據權利要求8 12中任何一項所述的應用，其中生物樣品選自由以下成分組成的組支氣管吸出物；支氣管氣肺泡灌洗液(BAL)；胃洗出液；痰；滲出液例如肋膜的、腹的和關節(jié)的液體；腦脊髓液；頭脊柱液；關節(jié)液；腹水；心包液及其它體液；淋巴結活組織；經支氣管的活組織；肋膜和肝臟的活組織；髓質穿刺和腰椎穿刺；尿樣；和膿液吸出的樣品。
14.根據權利要求8 13中任何一項所述所述的應用，其中細胞是⑶；TCD4+T淋巴細胞。
15.一種用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)活動性結核的哺乳動物和未被結核分枝桿菌感染或表現(xiàn)潛伏性結核的哺乳動物的試劑盒，所述的試劑盒包含 天然或重組體形式的HBHA ； 組成適合于將來自所述的哺乳動物的生物樣品中的細胞與HBHA相接觸的介質所需要的試劑； 用于定量接觸之后的IFN-Y分泌和胞漿內的IFN-Y的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用HBHA來檢測肺結核和由結核分枝桿菌(MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS)引起的感染的方法，以及體外區(qū)分明確由結核分枝桿菌引起感染的哺乳動物(主動形式)和被感染但無癥狀的哺乳動物(潛在形式)的方法，以及體外區(qū)分表現(xiàn)主動形式的肺結核的哺乳動物和未被結核分枝桿菌(M.tuberculosis)感染或表現(xiàn)潛在形式的肺結核的哺乳動物的方法。本發(fā)明還涉及用于檢測和區(qū)分表現(xiàn)肺結核癥狀的被感染哺乳動物和未發(fā)病的被感染哺乳動物的試劑盒，以及區(qū)分表現(xiàn)主動形式的肺結核的哺乳動物和未被結核分枝桿菌(M.tuberculosis)感染或表現(xiàn)潛在形式的肺結核的哺乳動物的試劑盒。
文檔編號G01N33/569GK102253204SQ201110064938
公開日2011年11月23日 申請日期2005年6月30日 優(yōu)先權日2004年6月30日
發(fā)明者克里斯蒂安·塞爾埃拉爾特, 卡米爾·洛赫特, 弗朗索瓦斯·馬斯卡爾, 斯特凡那·特默爾曼, 薩米·普拉斯, 讓-米歇爾·烏加爾迪 申請人:法國國家健康與醫(yī)學研究院, 法國巴斯德研究所, 法語布魯塞爾自由大學, 里爾第二大學