專利名稱：高通量檢測血清樣本中十二種病原抗體的液相芯片及其制備方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高通量檢測血清樣本中東方馬腦炎病毒抗體、西尼羅病毒抗體、 黃熱病毒抗體、土拉菌抗體、登革病毒抗體、禽流感病毒抗體、普氏立克次體病原體抗體、蜱傳腦炎病毒抗體、Q熱立克次體病原體抗體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病原體抗體、馬秋波病毒抗體、 西方馬腦炎病毒抗體共十二種病原抗體的液相芯片及其制備方法和使用方法。
背景技術(shù)：
東方馬腦炎病毒傳染性強，對人群危害性大，其臨床表現(xiàn)與乙型腦炎很相似，病死率約在35%以上。該病毒也是目前國際社會列為防生物恐怖的主要種類之一，國內(nèi)屬一類管理的病毒種類，備受關(guān)注。西尼羅熱是由西尼羅病毒感染引起的急性傳染病。人感染西尼羅病毒多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染，約140 300個感染者中有1個臨床病例。其癥狀為突然發(fā)熱、頭痛、背痛、肌肉痛等。發(fā)燒可表現(xiàn)為雙波熱，約半數(shù)病人可見皮疹。出疹時間在發(fā)熱期或發(fā)熱末期。皮疹可為玫瑰樣疹或斑丘疹，部位主要在頸背和上肢，持續(xù)時間約為1周。黃熱病毒引起的急性傳染病，病人常出現(xiàn)黃疸伴發(fā)熱，故名。主要癥狀有發(fā)熱、頭痛、黃疸和出血等；黃熱病的主要病變在肝、腎、心、胃、腸等內(nèi)臟。輕型病例呈急性發(fā)病，有明顯的發(fā)熱、頭痛、惡心、鼻衄、輕度黃疸和蛋白尿，幾日后痊愈；重型病例常突然發(fā)病，表現(xiàn)寒戰(zhàn)高熱頭痛、背痛、全身痛、惡心、嘔吐、面紅、眼結(jié)合膜充血、末梢血液中白細胞降低， 持續(xù)數(shù)日后，癥狀減輕，然后再出現(xiàn)發(fā)熱并開始有黃疸，伴出血傾向，表現(xiàn)為軟腭出血點、鼻衄、牙齦出血、嘔黑色血水，有時出現(xiàn)蛋白尿甚至無尿，50%病人出現(xiàn)相對緩脈，意識清醒， 肝功能受損，血膽紅質(zhì)增高，凝血酶原時間延長，轉(zhuǎn)氨酶升高，肝病重時可出現(xiàn)低血糖，10 60%病人在6 8日后出現(xiàn)休克、昏迷以致死亡。土拉菌病是由土拉弗朗西斯菌引起的多種野生動物、家畜及人共患病，亦稱野兔熱。臨床上以體溫升高、淋巴結(jié)腫大、脾和其他內(nèi)臟壞死為特征，土拉菌可以被用作生物戰(zhàn)中的致病病菌，感染者會出現(xiàn)高燒、渾身疼痛、腺體腫大和咽食困難等癥狀。登革熱是登革熱病毒引起、依蚊傳播的一種急性傳染病。臨床特征為起病急驟，高熱，全身肌肉、骨髓及關(guān)節(jié)痛，極度疲乏，部分患可有皮疹、出血傾向和淋巴結(jié)腫大。禽流感是由禽流感病毒引起的一種急性傳染病，也能感染人類，人感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴重的肺炎，嚴重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率約為百分之33。此病可通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結(jié)膜等多種途徑傳播，區(qū)域間的人員和車輛往來是傳播本病的重要途徑。感染委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒潛伏期2 5天，大多表現(xiàn)為流感樣癥狀，發(fā)冷、發(fā)熱、頭痛、肌痛(以下背部及腿部明顯)及惡心、嘔吐等?？捎行膭舆^速、結(jié)膜炎和非滲出性咽峽炎等體征，約4 6天上述癥狀消失，僅有少數(shù)患者有嗜睡、昏迷、抽搐、痙攣性癱瘓及中樞性呼吸型衰竭等腦炎的典型表現(xiàn)，末梢血白細胞輕度增高，有腦炎表現(xiàn)者腦脊液呈病毒性腦炎特點。免疫學(xué)方法酶聯(lián)免疫實驗(ELISA)中利用抗原與抗體特異性反應(yīng)來檢測抗原或抗體主要有由雙抗原夾心測抗體、雙抗體夾心測抗原、競爭法、間接法等。間接法測抗體的原理是特異性抗原結(jié)合到固相載體上，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物， 洗滌后再加酶標記二抗與免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合形成酶標記二抗-抗體-固相抗原復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗體含量。液相芯片技術(shù)，是20世紀70年代美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞儀作為檢測平臺，對核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進行大規(guī)模測定。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、抗體篩選及受體與配體的識別分析等領(lǐng)域。目前發(fā)展的液相芯片主要是基于實驗室檢測方法的建立和方法評價及優(yōu)化，以縮短檢測時間，降低檢測成本。但是液相芯片方法是否能夠高通量檢測人血清中的東方馬腦炎病毒抗體、西尼羅病毒抗體、黃熱病毒抗體、土拉菌抗體、登革病毒抗體、禽流感病毒抗體、普氏立克次體病原體抗體、蜱傳腦炎病毒抗體、Q熱立克次體病原體抗體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病原體抗體、馬秋波病毒抗體、西方馬腦炎病毒抗體共十二種抗體，其定量檢測能力如何，尚缺乏模型和評價。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高通量檢測血清樣本中東方馬腦炎病毒抗體、西尼羅病毒抗體、黃熱病毒抗體、土拉菌抗體、登革病毒抗體、禽流感病毒抗體、普氏立克次體病原體抗體、蜱傳腦炎病毒抗體、Q熱立克次體病原體抗體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病原體抗體、馬秋波病毒抗體、西方馬腦炎病毒抗體，共十二種病原抗體的液相芯片。一種高通量檢測十二種病原抗體的液相芯片包括包被有捕獲抗原的編碼微球、 生物素標記的二抗作為捕獲抗體、鏈親和素-藻紅蛋白及相關(guān)緩沖溶液，其中，作為捕獲抗原的有東部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原、西尼羅E蛋白抗原、黃熱E蛋白抗原、土拉fopA蛋白抗原、登革熱E2蛋白抗原、禽流感H5蛋白抗原、普氏立克次體120C蛋白抗原、蜱傳腦炎病毒E-D3蛋白抗原、Q熱立克次體coml蛋白抗原、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒E2蛋白抗原、馬秋波 GP2蛋白抗原、西部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原。進一步，所述編碼微球優(yōu)選011、025、027、028、031、032、033、034、043、044、061 和
071號編碼微球，其中，
011編碼微球用東部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、
025編碼微球用西尼羅E蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、
027號編碼微球用黃熱E蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、
028號編碼微球用土拉fopA蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、
031號編碼微球用登革熱E2蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、
032號編碼微球用禽流感H5蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、
033號編碼微球用普氏立克次體120C蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、
034號編碼微球用蜱傳腦炎病毒E-D3蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、
043號編碼微球用Q熱立克次體coml蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、044號編碼微球用委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒E2蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、
061號編碼微球用馬秋波GP2蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、
071號編碼微球用西部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原作為捕獲抗原來包被。一種檢測上述十二種病原抗體的液相芯片的制備方法，具體為在相關(guān)緩沖溶液中，挑選相應(yīng)的編碼微球，分別采用東部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原、西尼羅E蛋白抗原、黃熱 E蛋白抗原、土拉fopA蛋白抗原、登革熱E2蛋白抗原、禽流感H5蛋白抗原、普氏立克次體 120C蛋白抗原、蜱傳腦炎病毒E-D3蛋白抗原、Q熱立克次體coml蛋白抗原、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒E2蛋白抗原、馬秋波GP2蛋白抗原和西部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原作為捕獲抗原來包被相應(yīng)的編碼微球，用生物素標記的二抗作為Biotin-SPA，用鏈親和素-藻紅蛋白作為信號檢測物，來制備液相芯片。一種利用上述液相芯片高通量檢測血清樣品中抗體的間接免疫學(xué)定量檢測方法， 具體為
1)將東部馬腦炎病毒Eic蛋白抗原作為捕獲抗原來包被011編碼微球、西尼羅E蛋白抗原作為捕獲抗原來包被025編碼微球、黃熱E蛋白抗原作為捕獲抗原來包被027號編碼微球、用土拉fopA蛋白抗原作為捕獲抗原來包被0 號編碼微球、用登革熱E2蛋白抗原作為捕獲抗原來包被031號編碼微球、用禽流感H5蛋白抗原作為捕獲抗原來包被032號編碼微球、普氏立克次體120C蛋白抗原作為捕獲抗原來包被033號編碼微球、蜱傳腦炎病毒 E-D3蛋白抗原作為捕獲抗原來包被034號編碼微球、Q熱立克次體coml蛋白抗原作為捕獲抗原來包被043號編碼微球、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒E2蛋白抗原作為捕獲抗原來包被044號編碼微球、馬秋波GP2蛋白抗原作為捕獲抗原來包被061號編碼微球、西部馬腦炎病毒ElC 蛋白抗原作為捕獲抗原來包被071號編碼微球；
2)向檢測載體內(nèi)加入含十二種已包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液、或單一包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液、或幾種已包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；
3)加入待測血清樣品，孵育后清洗；
4)加入用生物素化的二抗，孵育后清洗；
5)加入鏈親和素-藻紅蛋白，孵育后清洗；
6)加入檢測緩沖液后混合均勻；
7)用液相芯片系統(tǒng)讀取平均熒光強度MFI數(shù)值，并分析數(shù)據(jù)判定檢測結(jié)果，以完成血清樣品中十二種抗體的同時檢測、或單一抗體的檢測、或同時完成幾種抗體的檢測。進一步，所述檢測過程中所有反應(yīng)可在96孔濾板上或在微量離心管中進行。進一步，本方法采用生物素標記的SPA作為捕獲抗體，并且其與各包被捕獲抗原的編碼微球組合組成間接法檢測體系。進一步，包被各種所述編碼微球的各捕獲抗原用量為0.01 300μβ /1.25Χ106個
編碼微球。進一步，標記檢測抗體SPA的所述生物素為羧基活性的生物素，2mg/mL生物素化的檢測二抗Bioin-SPA以1 :2500稀釋作為檢測物進行檢測。一種采用上述液相芯片定量檢測血清樣品中土拉菌抗體、登革病毒熱抗體的方法，具體為
1)加入的陽性檢測樣品或標準品經(jīng)4倍梯度倍比系列稀釋；
62)將系列稀釋樣品在液相芯片系統(tǒng)中檢測讀取對應(yīng)熒光值MFI；
3)制作樣品濃度對應(yīng)MFI值的劑量-反應(yīng)標準曲線；
4)用分析軟件擬合劑量-反應(yīng)曲線和方程；
5)根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線可判定方法的動態(tài)檢測范圍，未知濃度樣品可根據(jù)劑量-反應(yīng)方程判斷檢測樣品的濃度。液相芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為100種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5. 6Mffl，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應(yīng)。反應(yīng)后，利用機器自動將反應(yīng)液吸起并通過一微細管檢測通道，每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一道為綠色，激發(fā)報告分子的顏色，記錄信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測到。 再通過機器與計算機自動統(tǒng)計分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數(shù)十種病原。液相芯片技術(shù)由于利用微球在溶液中反應(yīng)，克服了片膜芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應(yīng)等對反應(yīng)動力學(xué)的影響，同時利用激光檢測技術(shù)，大大提高了樣品檢測的準確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡便、重復(fù)性好等特點。本發(fā)明的液相芯片及其檢測方法，能夠靈活的檢測，其可以實現(xiàn)單一檢測血清樣品中的單一抗體，也可以同時完成血清樣品中幾種抗體的檢測。本發(fā)明人經(jīng)過大量試驗和深入的研究，對高通量檢測東方馬腦炎病毒抗體、西尼羅病毒抗體、黃熱病毒抗體、土拉菌抗體、登革病毒抗體、禽流感病毒抗體、普氏立克次體病原體抗體、蜱傳腦炎病毒抗體、Q熱立克次體病原體抗體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病原體抗體、馬秋波病毒抗體、西方馬腦炎病毒抗體的液相芯片制備及其檢測條件作了實質(zhì)性的改進和創(chuàng)新，其具有下列優(yōu)點
1、抗原包被量的改進
抗原的包被量是成功檢測的關(guān)鍵，本發(fā)明對包被微球的抗原包被量進行實質(zhì)性優(yōu)化使對血清樣本的檢測效果非常良好，并且包被液相芯片所需的抗原包被量很低，本發(fā)明的抗原包被量為0. 0 μδ 300μδ/1. 25 X IO6個微球，即0. 04 ng 1200ng/5000個微球/測試， 而傳統(tǒng)免疫學(xué)ELISA方法的包被量為Iiag IOPg /測試。2、生物素標記的改進
通常，標記抗體需要使用過量的生物素。理論上講，在檢測過程中，過量的生物素因未標記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗體連接，清洗時被抽濾掉，不會與隨后加入的 SA-PE反應(yīng)，不影響檢測。但在實際檢測過程中，偶爾遇到過檢測信號可能過高的現(xiàn)象，出現(xiàn)假陽性，因此建議生物素標記抗體后，盡量去除多余的生物素。以標記ang/mL的IgG(分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27 μ L。3、檢測的靈敏度及動態(tài)范圍
本發(fā)明高通量檢測十二種病原體抗體的液相芯片系統(tǒng)檢測登革病毒2型抗體的檢測靈敏度為6. 3ng/mL，并且液相芯片系統(tǒng)的動態(tài)檢測范圍為11. 96ng /m廣3062. 5ng/ mL ；對土拉fopA抗體的檢測靈敏度為17. Ing/mL，并且液相芯片系統(tǒng)的動態(tài)檢測范圍為86. 33ng/ mL 88400ng/mLo4、方法的特異性
本發(fā)明通過選用東部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原、西尼羅E蛋白抗原、黃熱E蛋白抗原、 土拉fopA蛋白抗原、登革熱E2蛋白抗原、禽流感H5蛋白抗原、普氏立克次體120C蛋白抗原、蜱傳腦炎病毒E-D3蛋白抗原、Q熱立克次體coml蛋白抗原、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒E2蛋白抗原、馬秋波GP2蛋白抗原、西部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原為包被抗原，分別以東方馬腦炎病毒抗體、鼠抗西尼羅E蛋白血清、兔抗黃熱E蛋白血清、兔抗土拉fopA蛋白抗體、登革 2型抗體、禽流感病毒血清、普氏立克次體病原體抗體、蜱傳腦炎病毒抗體、Q熱立克次體病原體抗體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病原體抗體、馬秋波病毒抗體、西方馬腦炎病毒抗體、兔血清、大鼠血清、小鼠血清、BSA為待測樣品，以生物素化的SPA為捕獲抗體。5、樣品的檢測能力
本發(fā)明評價了液相芯片方法對人血清的檢測能力。通過對人血清的檢測，初步證實了該方法在檢測人血清中東方馬腦炎病毒抗體、西尼羅病毒抗體、黃熱病毒抗體、土拉菌抗體、登革病毒抗體、禽流感病毒抗體、普氏立克次體病原體抗體、蜱傳腦炎病毒抗體、Q熱立克次體病原體抗體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒體抗體、馬秋波病毒抗體、西方馬腦炎病毒抗體的實用性。


圖1為液相芯片方法檢測十二種病原抗體示意圖2為液相芯片方法檢測兔抗土拉抗體劑量-反應(yīng)標準曲線圖； 圖3為液相芯片檢測土拉抗體柱形圖4為液相芯片方法檢測兔抗登革病毒2型抗體劑量-反應(yīng)標準曲線圖； 圖5為液相芯片檢測登革病毒2型抗體柱形圖。
具體實施方式
如圖1至圖5所示，本發(fā)明涉及一種高通量檢測東方馬腦炎病毒抗體、西尼羅病毒抗體、黃熱病毒抗體、土拉菌抗體、登革病毒抗體、禽流感病毒抗體、普氏立克次體病原體抗體、蜱傳腦炎病毒抗體、Q熱立克次體病原體抗體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病原體抗體、馬秋波病毒抗體、西方馬腦炎病毒抗體共十二種病原抗體的液相芯片制備方法、檢測及定量方法通過下面的具體實施方式
作進一步說明，但本發(fā)明不以任何方式受該實施例的限定。
一、材料
1.液相芯片的相關(guān)緩沖液
(1) PBS 緩沖液(pH7. 4) :NaCl 137mmol/L ；KCl 2. 7mmol/L ；Na2HPO4 10mmol/L ；KH2PO4 2mmol/L0 用 800mL 蒸餾水溶解 8gNaCl,0. 2gKCl, 1. 44g Na2HPO4 和 0. 24g KH2PO40 用 HCl 調(diào)節(jié)溶液的PH值至7.4，加水至仏。分裝后在121°C高壓滅菌20分鐘，或過濾除菌，保存于室
ilm ο(2)微球清洗液:PBS (ρΗ7· 4),0. 05% Tween-20。(3)微球活化緩沖液 100 mM NaH2PO4 :3g NaH2PO4, 5M NaOH 1.5 mL，定容于 250mL，pH 6. 2。(4)微球包被緩沖液0. 05 M MES, pH 5. 0 2. 44 g MES, 5M NaOH 0. 15 mL，定容于 250mLo(5)微球保存液 PBS-TBN :PBS，0. 1%BSA，0. 02% Tween-20,0. 05% 疊氮化物，pH 7. 4。(6)微球封閉液 PBS-BN :PBS, 1%BSA, 0. 05% 疊氮化物，ρΗ7· 4。(7)檢測緩沖液PBS，1%BSA, ρΗ7· 4。(8)抗體稀釋液 PBS，ρΗ7· 4。。(9)微球稀釋液PBS，1%BSA, ρΗ7· 4。(10)樣品稀釋液 PVX :PBS, 0. 5% PVA, 0. 8% PVP ； (11) SA-PE 稀釋液=PBS (ρΗ7· 4)，1%BSA。2.抗原與抗體
本發(fā)明所使用的抗原為東部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原、西尼羅E蛋白抗原、黃熱E蛋白抗原、土拉fopA蛋白抗原、登革熱E2蛋白抗原、禽流感H5蛋白抗原、普氏立克次體120C蛋白抗原、蜱傳腦炎病毒E-D3蛋白抗原、Q熱立克次體coml蛋白抗原、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒 E2蛋白抗原、馬秋波GP2蛋白抗原、西部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原，其中禽流感H5蛋白可購自中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所，其余可購自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院。本發(fā)明所使用檢測抗體為兔抗土拉IgG，可購自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，兔抗登革病毒2型抗體可購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院微生物研究所，檢測二抗為生物素化SPA，所述的SPA可購自Sigma公司。二、待測樣品的制備 1、目標分析物樣品的制備
目標分析物為兔抗土拉IgG、兔抗登革病毒2型抗體。兔抗土拉IgG的儲備液濃度為 44. 2 μ g/mL，兔抗登革病毒2型抗體的儲備液濃度為1. 06mg/mL。將待分析的兔抗土拉IgG、、兔抗登革病毒2型抗體用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度樣品，以繪制樣品檢測劑量-反應(yīng)的標準曲線，其中幾個樣品濃度低于檢測的敏感度，高濃度樣品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)。2、人血清樣本的處理
將人血清樣本用樣品稀釋1 :10稀釋，例如人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L混勻后，作為待檢樣品進行液相芯片方法的檢測。(—)檢測十二種病原抗體的液相芯片的制備 1、捕獲抗原包被編碼微球
本發(fā)明采用的011號、025號、027號、028號、031號、032號、033號、034號、043號、044
號、061號、071號編碼微球購自美國Bio-Rad公司，011號編碼微球用于標記可以捕獲東部馬腦炎病毒抗體的東部馬腦炎抗體病毒ElC蛋白抗原、025編碼微球用于標記可以捕獲黃熱病毒抗體的黃熱E蛋白抗原，027號編碼微球用于標記可以捕獲西尼羅病毒抗體的西尼羅E蛋白抗原，0 號編碼微球用于標記可以捕獲土拉菌抗體的土拉fopA蛋白抗原，即利用土拉fopA蛋白包被微球；031號編碼微球用于標記可以捕獲登革病毒抗體的登革E2蛋白抗原，即利用登革E2蛋白包被微球；032號編碼微球用于標記可以捕獲禽流感病毒抗體的禽流感H5蛋白抗原，即利用禽流感H5蛋白包被微球；033號編碼微球用于標記可以捕獲普氏立克次體抗體的普氏立克次體120C蛋白抗原，即利用普氏立克次體120C蛋白包被微球； 034號編碼微球用于標記可以捕獲蜱傳腦炎病毒抗體的蜱傳腦炎病毒E-D3蛋白抗原，即利用蜱傳腦炎病毒E-D3包被微球；043號編碼微球用于標記可以捕獲Q熱立克次體抗體的Q 熱立克次體coml蛋白抗原，即利用Q熱立克次體coml包被微球；044號編碼微球用于標記可以捕獲委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒抗體的委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒E2蛋白抗原，即利用委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒E2蛋白包被微球；061號編碼微球用于標記可以捕獲馬秋波抗體的馬秋波GP2 蛋白抗原，即利用馬秋波GP2蛋白包被微球；071號編碼微球用于標記可以捕獲西部馬腦炎病毒抗體的西部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原，即利用西部馬腦炎病毒ElC蛋白包被微球。A、編碼微球的活化
分別取100 μ L(含1.25X IO6個)各個編號的編碼微球到1.5mL離心管中，14000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100μ L的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000Xg 離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的微球活化緩沖液，接著先加入10 μ L新鮮配置的EDC (50mg/mL),再加入10 μ L新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室溫震搖20分鐘。加入150μ L的PBS (pH7. 4)，震蕩后，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7. 4)懸浮編碼微球。B、用抗原包被編碼微球
取各捕獲抗原1 200 μ g分別加入到活化后的各對應(yīng)編碼微球中，用PBS緩沖液定容至500 μ L，室溫震搖2小時。14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。用500 μ L的PBS緩沖液洗一次，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L的封閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入500 μ L的微球保存液洗滌編碼微球，16000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150yL的微球保存液懸浮編碼微球，于4°C避光保存?zhèn)溆?。C、包被微球的計數(shù)
吸取適量微球，稀釋后，用血球計數(shù)板(0. IOmm ；l/400mm2)在普通顯微鏡下計數(shù)。根據(jù)公式(4個大格數(shù)平均數(shù)XlO4X稀釋倍數(shù)X體積(mL))計算微球數(shù)量。2、檢測物標記生物素 A、生物素的標記
分別配制好濃度為IOmM生物素溶液和ang/mL的待標記抗體溶液，將計算好體積的生物素加入到待標記物溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時)，過柱脫鹽后分裝，-200C 凍存?zhèn)溆谩、抗體的用量
以標記2 mg/mL的IgG (分子量150，000)1 mL溶液為例，需加入10 mM生物素溶液約 27 μ 1。
(二)液相芯片制備方法條件的優(yōu)化 1、微球包被抗原包被量的選擇
分另U 以 lPg、2. 5μβ、5μβ、7. 5μβ、10μβ、12. 5μβ、15μβ、20μβ、25μβ、30μβ、40μβ、50μβ 的量包被100μ 編碼微球。經(jīng)檢測效果比較，以1 /1. 25X IO6個微球，即0. 4 200ng/5000個微球/測試，包被效果最好，顯微鏡下計數(shù)后避光冷藏保存待用。如圖1所示，東部馬腦炎病毒ElC蛋白包被011編碼微球、西尼羅E蛋白包被025編碼微球、黃熱E 蛋白包被027號編碼微球、土拉fopA蛋白包被0 號編碼微球、登革病毒E2蛋白包被031 號編碼微球、禽流感H5蛋白包被032號編碼微球、普氏立克次體120C蛋白包被033號編碼微球、蜱傳腦炎病毒E-D3蛋白包被034號編碼微球、Q熱立克次體coml蛋白包被043號編碼微球、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒E2蛋白包被044號編碼微球、馬秋波GP2蛋白包被061號編碼微球、西部馬腦炎病毒ElC蛋白包被071號編碼微球均落在其正確檢測區(qū)域內(nèi)，并且獲得高信噪比結(jié)果(MFI值遠大于2000)，說明優(yōu)化的液相芯片檢測系統(tǒng)可成功用于東方馬腦炎病毒抗體、西尼羅病毒抗體、黃熱病毒抗體、土拉菌抗體、登革病毒抗體、禽流感病毒抗體、普氏立克次體病原體抗體、蜱傳腦炎病毒抗體、Q熱立克次體病原體抗體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒體抗體、馬秋波病毒抗體、西方馬腦炎病毒抗體的檢測。2、生物素化檢測物的優(yōu)化
本發(fā)明分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰胼(hydrazide)-生物素和羧基活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標記檢測抗體，經(jīng)質(zhì)控過程檢測效果比較，本實驗中Sulfo-NHS-生物素標記檢測物檢測效果較好，檢測效果的方法采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法或按照制造商的產(chǎn)品說明書所述的方法。本發(fā)明人經(jīng)過試驗驗證，2mg/mL生物素化的檢測物Biotin-SPA以1 :2500稀釋作為檢測人血清中抗體的檢測物，檢測結(jié)果顯示生物素化檢測物Biotin-SPA可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果。(三)液相芯片樣品制備、檢測及結(jié)果判定 1、待測樣品制備
用樣品稀釋液將待測樣本配置為不同濃度樣本進行液相芯片檢測。2、樣品的檢測及結(jié)果判定
檢測過程全部反應(yīng)均在96孔濾板上進行，檢測過程如下
1)每孔加入50μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；
2)加入50μ L檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；
3)加入50μ L適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化檢測物，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；
4)加入50μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；
5)加入125μ L的檢測緩沖液，經(jīng)渦旋振蕩使微球重懸；
6)用液相芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、檢測結(jié)果判定
根據(jù)試驗研究結(jié)果與相關(guān)研究報道，本發(fā)明定義液相芯片方法檢測抗體的最低檢出限 (L0D值)為檢測熒光強度臨界值(Cutoff)對應(yīng)的檢測物濃度。其中，Cutoff的定義是采用空白對照樣品(Blank)熒光檢測信號MFI均值加3倍標準差(SD)，即Cutoff值為=MFI (空白對照)+3倍標準差。若檢測結(jié)果高于LOD對應(yīng)熒光強度值則判定為待測抗體檢測結(jié)果陽性；若檢測結(jié)果低于LOD對應(yīng)熒光強度值則判定為待測抗體檢測結(jié)果陰性。(四)液相芯片定量檢測兔抗土拉IgG模型的建立 1、兔抗土拉IgG標準曲線樣品制備
用樣品稀釋液將兔抗土拉IgG標準品由濃度為353. 6 μ g /mL以4倍倍比梯度稀釋至濃度為21. 58ng/mL成系列濃度樣品。2、劑量-反應(yīng)標準曲線的繪制
按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，并根據(jù)液相芯片系統(tǒng)檢測結(jié)果繪制劑量-反應(yīng)標準曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表樣品濃度，Y軸代表液相芯片儀檢測的熒光值(MFI)。每個數(shù)據(jù)代表3次的檢測結(jié)果平均值，坐標軸以對數(shù)-對數(shù)關(guān)系設(shè)定，圖 2 中兔抗土拉抗體的濃度分別為S7 :88400ng/mL, S6 :22100ng/mL，S5 :5525ng/mL，S4 1381. 25ng/mL, S3 :345. 3ng/mL, S2 :86. 33ng/mL, Sl :21. 58ng/mL
液相芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測結(jié)果擬合兔抗土拉IgG劑量-反應(yīng)標準曲線方程FI = -7.90067 + (13503.2 + 7.90067) / [1 + (Cone / 2990. 24Γ1.45764]0 835078 3、液相芯片檢測兔抗土拉IgG的靈敏度和動態(tài)范圍
根據(jù)最低檢出限定義和劑量-反應(yīng)標準曲線方程，本發(fā)明即液相芯片方法檢測兔抗土拉IgG的靈敏度為17. Ing/mL (Cutoff = 16，MFI (空白對照)=13，標準差=1)。本發(fā)明定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)的檢測物濃度。根據(jù)標準曲線隨著兔抗土拉IgG濃度的升高，其對應(yīng)的MFI值也隨之遞增，當兔抗土拉IgG濃度超過88400ng/mL時，抗原抗體的免疫反應(yīng)達到飽和狀態(tài)，MFI值開始進入平臺期，說明樣品中的待檢物濃度過高，需要將樣品稀釋后再檢測。因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定本發(fā)明即液相芯片定量檢測兔抗土拉IgG的動態(tài)范圍為86. 33 ng/mL 88400ng/mL。4、液相芯片檢測兔抗土拉IgG各編碼微球的熒光值
以兔抗土拉抗體濃度為橫坐標，各編碼微球檢測所得的熒光值為縱坐標，不同編碼微球為Z軸，繪制液相芯片檢測兔抗土拉抗體柱形圖，見圖3。從圖中可以看出在兔抗土拉抗體濃度為88. 4 μ g/ml和353. 6 μ g/ml時與044號微球包被的委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒E2蛋白和034號微球包被蜱傳腦炎病毒E-D3蛋白的有輕微交叉反應(yīng)，其他均無交叉，其特異性較好。(五)液相芯片定量檢測兔抗登革病毒2型抗體模型的建立 1、兔抗登革病毒2型抗體標準曲線樣品制備
用樣品稀釋液將兔抗登革病毒2型抗體標準品由濃度為0. 053mg /mL以4倍倍比梯度稀釋至濃度為2. 99ng/mL成系列濃度樣品。2、劑量-反應(yīng)標準曲線的繪制
按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，并根據(jù)液相芯片系統(tǒng)檢測結(jié)果繪制劑量-反應(yīng)標準曲線(如圖4所示)。其中，X軸代表樣品濃度，Y軸代表液相芯片儀檢測的熒光值(MFI )。每個數(shù)據(jù)代表3次的檢測結(jié)果平均值，坐標軸以對數(shù)-對數(shù)關(guān)系設(shè)定，圖 4中兔抗登革病毒2型抗體的濃度分別為S8 :53000ng/mL,S7 12250ng/mL, S6 :3062. 5ng/ mL, S5 :765,625ng/mL, S4 :191. 4ng/mL, S3 :47. 85ng/mL, S2 :11. 96ng/mL, Sl :2. 99ng/mL。液相芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測結(jié)果擬合兔抗登革病毒2型抗體劑量-反應(yīng)標準曲線方程
FI = -1.11965 + (7271.51 + 1.11965) / [1 + (Cone / 64. 8821Γ1.28737] 1 99744
3、液相芯片檢測兔抗登革病毒2型抗體的靈敏度和動態(tài)范圍
根據(jù)最低檢出限定義和劑量-反應(yīng)標準曲線方程，本發(fā)明即液相芯片方法檢測兔抗登
12革病毒2型抗體的靈敏度為6. 3ng/mL (Cutoff = 18，MFI (空白對照)=15，標準差=1)。本發(fā)明定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)的檢測物濃度。根據(jù)標準曲線隨著兔抗登革病毒2型抗體濃度的升高，其對應(yīng)的MFI值也隨之遞增，當兔抗登革病毒2型抗體濃度超過3062. 5ng/mL時，抗原抗體的免疫反應(yīng)達到飽和狀態(tài)，MFI值開始進入平臺期，說明樣品中的待檢物濃度過高，需要將樣品稀釋后再檢測。因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定本發(fā)明即液相芯片定量檢測兔抗登革病毒2型抗體的動態(tài)范圍為11. 96ng/mL/mL 3062. 5ng/mL。4、液相芯片檢測兔抗登革病毒2型抗體各編碼微球的熒光值
以兔抗登革病毒2型抗體濃度為橫坐標，各編碼微球檢測所得的熒光值為縱坐標，不同編碼微球為Z軸，繪制液相芯片檢測兔抗登革病毒2型抗體柱形圖，見圖5。(六)人血清樣品的檢測 1、人血清樣品的準備
將人血清用樣品稀釋液1 10稀釋(人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L混勻)后用于液相芯片檢測。2、人血清樣品的檢測
1)每孔加入50μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；
2)加入50PL待檢測人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽
濾；
3)加入50μ L適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化SPA，混勻后室溫避光震搖 30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；
4)加入50μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；
5)加入125μ L的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；
6)用液相芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值。經(jīng)過多次重復(fù)試驗，生物素化SPA稀釋比例選用1 :2500稀釋，SA-PE稀釋比例選用1 :300稀釋，經(jīng)過對94份人血清的檢測，所得的MFI值的均值與其標準差的3倍之和為作為判斷陰陽性的界值，即Cutoff值，待檢測血清中各編碼微球檢測對應(yīng)抗體的MFI值如果大于其Cutoff值，即血清中的對應(yīng)抗體濃度過高，可視為對應(yīng)抗體陽性可能被相應(yīng)病原微生物感染，如果MFI值小于對應(yīng)Cutoff值，即血清中的相應(yīng)抗體濃度低于正常值可判斷為相應(yīng)抗體陰性，未感染相應(yīng)病原微生物或是隱性攜帶者。
權(quán)利要求
1.一種高通量檢測血清樣本中十二種病原抗體的液相芯片，其特征在于，該液相芯片包括包被有捕獲抗原的十二種編碼微球、生物素標記的二抗作為捕獲抗體、鏈親和素-藻紅蛋白及相關(guān)緩沖溶液，其中，作為捕獲抗原的有東部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原、西尼羅E 蛋白抗原、黃熱E蛋白抗原、土拉fopA蛋白抗原、登革熱E2蛋白抗原、禽流感H5蛋白抗原、 普氏立克次體120C蛋白抗原、蜱傳腦炎病毒E-D3蛋白抗原、Q熱立克次體coml蛋白抗原、 委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒E2蛋白抗原、馬秋波GP2蛋白抗原、西部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的高通量檢測血清樣本中十二種病原抗體的液相芯片，其特征在于，所述編碼微球優(yōu)選 011、025、027、028、031、032、033、034、043、044、061 和 071 號編碼微球，其中，011編碼微球用東部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、025編碼微球用西尼羅E蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、027號編碼微球用黃熱E蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、028號編碼微球用土拉fopA蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、031號編碼微球用登革熱E2蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、032號編碼微球用禽流感H5蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、033號編碼微球用普氏立克次體120C蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、034號編碼微球用蜱傳腦炎病毒E-D3蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、043號編碼微球用Q熱立克次體coml蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、044號編碼微球用委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒E2蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、061號編碼微球用馬秋波GP2蛋白抗原作為捕獲抗原來包被、071號編碼微球用西部馬腦炎病毒ElC蛋白抗原作為捕獲抗原來包被。
3.—種檢測上述十二種病原抗體的液相芯片的制備方法，其特征在于，該方法具體為在相關(guān)緩沖溶液中，用不同的十二種抗原分別包被十二種編碼微球，用生物素標記的二抗為羊抗人IgG或/和Biotin-SPA，用鏈親和素-藻紅蛋白SA-PE作為信號檢測物。
4.一種利用上述液相芯片高通量檢測血清樣品中抗體的間接免疫學(xué)定量檢測方法， 其特征在于，該方法具體為1)在相關(guān)緩沖溶液中，將十二種蛋白抗原作為捕獲抗原來包被編碼微球；2)向檢測載體內(nèi)加入含十二種已包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液、或單一包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液、或幾種已包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；3)加入待測血清樣品，孵育后清洗；4)加入用生物素化的二抗，孵育后清洗；5)加入鏈親和素-藻紅蛋白，孵育后清洗；6)加入檢測緩沖液后混合均勻；7)用液相芯片系統(tǒng)讀取平均熒光強度MFI數(shù)值，并分析數(shù)據(jù)判定檢測結(jié)果，以完成血清樣品中十二種抗體的同時檢測、或單一抗體的檢測、或同時完成幾種抗體的檢測。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測過程中所有反應(yīng)可在96孔濾板上或在微量離心管中進行。
6.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟1)中采用生物素標記的SPA 作為捕獲抗體，并且其與各包被編碼微球的捕獲抗原組合組成間接法檢測體系。
7.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述相關(guān)緩沖溶液包括用于所述待測抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素標記的二抗所用的抗體稀釋液、每個反應(yīng)之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋液、檢測緩沖液。
8.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述生物素標記的二抗優(yōu)選為 Biotin-羊抗人和 / 或 Biotin-SPA。
9.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，包被各種所述編碼微球的各捕獲抗原用量為0. 01 300μβ /1. 25 X IO6個編碼微球，標記檢測抗體SPA的所述生物素為羧基活性的生物素，2mg/mL生物素化的檢測二抗Bioin-SPA以1 :2500稀釋作為檢測物進行檢測。
10.一種采用上述液相芯片定量檢測血清樣品中土拉抗體、登革熱抗體的方法，其特征在于，該方法具體為1)加入的陽性檢測樣品或標準品經(jīng)4倍梯度倍比系列稀釋；2)將系列稀釋樣品在液相芯片系統(tǒng)中檢測讀取對應(yīng)熒光值MFI；3)制作樣品濃度對應(yīng)MFI值的劑量-反應(yīng)標準曲線；4)用分析軟件擬合劑量-反應(yīng)曲線和方程；5)根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線可判定方法的動態(tài)檢測范圍，未知濃度樣品可根據(jù)劑量-反應(yīng)方程判斷檢測樣品的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高通量檢測血清樣本中十二種病原抗體的液相芯片及其制備方法和使用方法。本發(fā)明的方法檢測能力好、靈敏度高、特異性強、動態(tài)范圍寬，一次檢測樣本可同時檢測十二種病原抗體，還可靈活組織檢測項目，只檢測所要求的病原抗體，并建立了以土拉抗體、登革熱抗體為代表的定量檢測微生物抗體液相芯片檢測的開放性檢測模式化平臺。
文檔編號G01N21/64GK102183666SQ20111006624
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者楊宇, 楊永莉, 王靜 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院