專利名稱：一種利用拉曼光譜掃描法檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法。
背景技術(shù)：
淀粉樣前體蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)是I型跨膜糖蛋白，在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中高度保守，其基因定位于人染色體21q，APP在大部分的組織細(xì)胞中都有表達(dá)。因APP基因突變或者缺失，會(huì)引起組織細(xì)胞中APP含量的變化，引起進(jìn)而一些疾病，如皮膚基底細(xì)胞癌、阿爾茨海默病等。外周血的血小板APP含量能準(zhǔn)確反映體內(nèi)APP的水平，因此建立一種快速、微創(chuàng)、靈敏的血小板APP檢測(cè)方法具有重要意義。傳統(tǒng)檢測(cè)血小板中APP的方法是生物化學(xué)的方法，其主要流程為提取血小板，用蛋白提取液將血細(xì)胞勻漿，然后應(yīng)用免疫學(xué)的方法將APP吸附、分離、在膠片或計(jì)算機(jī)上成 像，利用灰度值反映APP含量。該方法需要的血小板量大、操作復(fù)雜、靈敏度低。因此，研究一種需血小板量少、操作步驟少、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法成為該領(lǐng)域的重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種利用拉曼光譜(Raman spectroscopy)掃描法檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法，使其具有需血小板量少、操作步驟少、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等特點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的這種利用拉曼光譜掃描法檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)的方法，包括以下步驟步驟一從待檢血液樣品中分離出血小板；步驟二 取分離出的血小板滴加到光滑的金片上；步驟三將滴加有血小板的金片置于激光拉曼顯微鏡下進(jìn)行光譜掃描；步驟四對(duì)光譜掃描結(jié)果進(jìn)行分析。上述步驟一所述的從待檢血液樣品中分離出血小板的具體方法包括以下步驟步驟a.抽取5ml新鮮血液置于含有EDTA抗凝劑的離心管中；步驟b.離心15分鐘，離心條件為轉(zhuǎn)速60g，溫度4°C，去上清，分離出血漿；步驟c.離心15分鐘，離心條件為轉(zhuǎn)速60g，溫度4°C，分離沉淀，取上清；步驟d.將上清液離心15分鐘，離心條件為轉(zhuǎn)速1500g，溫度4°C，去上清，沉淀出血小板。其中步驟b和步驟c中的離心條件為轉(zhuǎn)速60g，溫度4°C ;步驟c中的離心條件為轉(zhuǎn)速1500g，溫度4°C。前述步驟二中滴加到金片上的血小板的量為l_5iil，具體可以是2iil。
前述步驟三中將滴加有血小板的金片置于激光拉曼顯微鏡下進(jìn)行光譜掃描的掃描條件是所用光源為激發(fā)波長(zhǎng)為633nm的半導(dǎo)體激光器，功率17mw，通過光柵和濾光片后，實(shí)際到達(dá)樣品的功率不足lmw，確保樣品成分完整。檢測(cè)鏡頭為50倍長(zhǎng)焦鏡頭(numerical apertufe (NA) 0. 50, Olympus, Japan),匯聚激光為直徑約 I. 5 y m 的光斑；信號(hào)采集時(shí)間為30秒，累積掃描4次，采譜范圍為600-1700(^^600線的光柵使光譜分辨率達(dá)到 5cm 1O前述步驟四中所述的對(duì)光譜掃描結(jié)果進(jìn)行分析的具體方法是讀取740cm—1與1654cm—1處峰強(qiáng)值，以757cm—1處的峰做參比，740cm—1與1654cm—1處峰強(qiáng)增加，為檢測(cè)出有APP存在，且740cm—1峰強(qiáng)與APP含量呈正相關(guān)。本發(fā)明提供了一種利用拉曼光譜掃描法檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法，主要流程為提取血小板，將血小板置于拉曼顯微鏡下進(jìn)行拉曼光譜掃描，從光譜值反映APP含量。與傳統(tǒng)生化方法相比具有所需血小板量少(2 yl)、操作步驟少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)資料(一 )實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦美庾V掃描法檢測(cè)轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板APP，并與不含外源性APP基因的小鼠、血管性癡呆(VD)模型小鼠、帕金森病(PD)模型小鼠進(jìn)行對(duì)照。( 二)實(shí)驗(yàn)材料及儀器血小板分別來(lái)源于轉(zhuǎn)APP基因小鼠及其背景小鼠(C57小鼠)、血管性癡呆模型小鼠、帕金森病模型小鼠，制備方法見以下實(shí)驗(yàn)操作部分。離心機(jī)Sigma離心機(jī)。激光拉曼顯微鏡及載物金片HR800，Horbia Jobin Yvon，法國(guó)產(chǎn)。(三)實(shí)驗(yàn)操作I.制備血小板I. I抽取的5ml新鮮血液置于含有EDTA抗凝劑的離心管中；I. 2離心15分鐘，離心條件為轉(zhuǎn)速60g，溫度4°C，去上清，分離出血漿；I. 3離心15分鐘，離心條件為轉(zhuǎn)速60g，溫度4°C，分離沉淀，取上清；I. 4將上清液離心15分鐘，離心條件為轉(zhuǎn)速1500g，溫度4°C，去上清，沉淀出血小板；2.拉曼光譜掃描將2 ill的血小板滴到光滑的金片上，置于激光拉曼顯微鏡(HR800，Horbia JobinYvon，法國(guó)產(chǎn))下，進(jìn)行光譜掃描。3.光譜分析利用MATLAB軟件完成。在740(^1與1654(^1處峰強(qiáng)能反映血小板APP的變化。(四)結(jié)果I.圖I為轉(zhuǎn)APP基因小鼠小鼠血小板的原始拉曼光譜。720nm激發(fā)光下血紅素的拉曼譜峰主要出現(xiàn)在759，1231，1568，1626and 1640cm—1，而從圖I中除了 759CHT1之外，未明顯出現(xiàn)和血紅素有關(guān)的譜峰，說(shuō)明血小板采集成功。2.圖2顯示的是不同小鼠模型的平均拉曼光譜對(duì)比。圖2中的A圖為4月齡，12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠的平均拉曼光譜對(duì)比，箭頭所示的地方存在明顯的光譜差異。第一個(gè)差異為740CHT1處的峰強(qiáng)變化，如果以旁邊757CHT1處的峰做參比，4月齡的轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板拉曼光譜在此處峰強(qiáng)明顯的強(qiáng)于對(duì)照組的，并且此峰在12月齡的轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板拉曼光譜中進(jìn)一步增強(qiáng)，說(shuō)明740cm—1峰強(qiáng)隨APP增加而增大。第二個(gè)光譜差異就是1654cm-1處的峰強(qiáng)，4月齡及12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板光譜中該處峰強(qiáng)要明顯弱于對(duì)照組。圖2中的B圖顯示的是轉(zhuǎn)APP基因小鼠，VD及TO模型血小板的平均拉曼光譜。3.圖3顯示的是對(duì)4月齡，12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠及對(duì)照組的血小板光譜數(shù)據(jù)的分類結(jié)果。進(jìn)一步對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分類分析表中的數(shù)字結(jié)果顯示不僅能對(duì)轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板和正常血小板進(jìn)行區(qū)分，更能將不同月齡的轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板和正常血小板都區(qū)分開來(lái)。4月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠區(qū)分靈敏度為79%，12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠區(qū)分靈敏度也上升到93. 5%。4.圖4中的A圖顯示了 12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠及VD模型小鼠的血小板拉曼光譜數(shù)據(jù)分類結(jié)果圖顯示了 12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠及ro模型小鼠的血小板拉曼光譜數(shù)據(jù)分類結(jié)果，W2和W3是對(duì)應(yīng)的分類特征組合。很明顯所有區(qū)分靈敏度都超過了 90%，說(shuō)明該 方法可以有效的將APP基因小鼠血小板與VD、PD模型血小板區(qū)分。以上實(shí)驗(yàn)證明血小板拉曼光譜(如740CHT1峰強(qiáng))能靈敏反映轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板APP水平。


圖I為轉(zhuǎn)APP基因小鼠小鼠血小板的原始拉曼光譜。圖2顯示的是不同小鼠模型的平均拉曼光譜對(duì)比。圖3顯示的是對(duì)4月齡，12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠及對(duì)照組的血小板光譜數(shù)據(jù)的分
類結(jié)果。圖4中A圖顯示了 12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠及VD模型小鼠的血小板拉曼光譜數(shù)據(jù)分類結(jié)果；B圖顯示了 12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠及ro模型小鼠的血小板拉曼光譜數(shù)據(jù)分類結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I利用拉曼光譜掃描法檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白I制備血小板I. I抽取的5ml新鮮血液置于含有EDTA抗凝劑的離心管中；I. 2離心15分鐘，離心條件轉(zhuǎn)速60g，溫度4°C，去上清，分離出血漿；I. 3離心15分鐘，離心條件轉(zhuǎn)速60g，溫度4°C，分離沉淀，取上清；I. 4將上清液離心15分鐘，離心條件轉(zhuǎn)速1500g，溫度4°C，去上清，沉淀出血小板。2拉曼光譜掃描將2 ill的血小板滴到光滑的金片上，置于激光拉曼顯微鏡(HR800，Horbia JobinYvon，法國(guó)產(chǎn))下，進(jìn)行光譜掃描。掃描條件所用光源為激發(fā)波長(zhǎng)為633nm的半導(dǎo)體激光器，功率17mw，通過光柵和濾光片后，實(shí)際到達(dá)樣品的功率不足lmw，確保樣品成分完整。檢測(cè)鏡頭為50倍長(zhǎng)焦鏡頭(numerical aperture (NA) 0. 50, Olympus, Japan),匯聚激光為直徑約I. m的光斑；信號(hào)采集時(shí)間為30秒，累積掃描4次，采譜范圍為600-1700(^^600線的光柵使光譜分辨率達(dá)到5CHT1。3光譜分析讀取740CHT1與1654CHT1處峰強(qiáng)值，以757CHT1處的峰做參比，740CHT1與1654CHT1處峰強(qiáng)增加說(shuō)明存在APP，即為檢測(cè)出有APP存在，而且740CHT1峰強(qiáng)與APP含量正相關(guān)。4 結(jié)果4. I圖I為轉(zhuǎn)APP基因小鼠小鼠血小板的原始拉曼光譜。720nm激發(fā)光下血紅素的拉曼譜峰主要出現(xiàn)在759，1231，1568，1626and 1640CHT1，而從圖I中除了 759cm_1之外，未明顯出現(xiàn)和血紅素有關(guān)的譜峰，說(shuō)明血小板采集成功。4. 2圖2顯示的是不同小鼠模型的平均拉曼光譜對(duì)比。圖2中的A圖為4月齡，12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠的平均拉曼光譜對(duì)比，箭頭所示的地方存在明顯的光譜差異。第一個(gè)差異為740CHT1處的峰強(qiáng)變化，如果以旁邊757CHT1處的峰做參比，4月齡的轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板拉曼光譜在此處峰強(qiáng)明顯的強(qiáng)于對(duì)照組的，并且此峰在12月齡的轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板拉曼光譜中進(jìn)一步增強(qiáng)，說(shuō)明740CHT1峰強(qiáng)隨APP增加而增大。第二個(gè)光譜差異就是1654cm-1處的峰強(qiáng)，4月齡及12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板光譜中該處峰強(qiáng)要明顯弱于對(duì)照組。圖2中的B圖顯示的是轉(zhuǎn)APP基因小鼠，VD及模型血小板的平均拉曼光譜。4. 3圖3顯示的是對(duì)4月齡，12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠及對(duì)照組的血小板光譜數(shù)據(jù)的分類結(jié)果。進(jìn)一步對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分類分析表中的數(shù)字結(jié)果顯示不僅能對(duì)轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板和正常血小板進(jìn)行區(qū)分，更能將不同月齡的轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板和正常血小板都區(qū)分開來(lái)。4月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠區(qū)分靈敏度為79%，12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠區(qū)分靈敏度也上升到93. 5%。4，4圖4中的A圖顯示了 12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠及VD模型小鼠的血小板拉曼光譜數(shù)據(jù)分類結(jié)果；B圖顯示了 12月齡轉(zhuǎn)APP基因小鼠及ro模型小鼠的血小板拉曼光譜數(shù)據(jù)分類結(jié)果，W2和W3是對(duì)應(yīng)的分類特征組合。很明顯所有區(qū)分靈敏度都超過了 90%，說(shuō)明該方法可以有效的將APP基因小鼠血小板與VD、PD模型血小板區(qū)分。上述實(shí)施例證明血小板拉曼光譜(如740CHT1峰強(qiáng))能靈敏反映轉(zhuǎn)APP基因小鼠血小板APP水平。權(quán)利要求
1.ー種利用拉曼光譜掃描法檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法，包括以下步驟 步驟ー從待檢血液樣品中分離出血小板； 步驟ニ 取分離出的血小板滴加到光滑的金片上； 步驟三將滴加有血小板的金片置于激光拉曼顯微鏡下進(jìn)行光譜掃描； 步驟四對(duì)光譜掃描結(jié)果進(jìn)行分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法，其特征在于，步驟一所述的從待檢血液樣品中分離出血小板的具體方法包括以下步驟 步驟a .抽取5ml新鮮血液置于含有EDTA抗凝劑的離心管中； 步驟b.尚心15分鐘，去上清,分尚出血衆(zhòng)； 步驟c .離心15分鐘，分離沉淀,取上清； 步驟d .將上清液離心15分鐘，去上清，沉淀出血小板。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法，其特征在于，步驟b和步驟c中的離心條件為轉(zhuǎn)速60g，溫度4°C ;步驟c中的離心條件為轉(zhuǎn)速1500g，溫度4°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法，其特征在于，步驟ニ中滴加到金片上的血小板的量為1-5 μ I。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法，其特征在于，步驟ニ中滴加到金片上的血小板的量為2 μ I。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法，其特征在于，步驟三中將滴加有血小板的金片置于激光拉曼顯微鏡下進(jìn)行光譜掃描的掃描條件是所用光源為激發(fā)波長(zhǎng)為633nm的半導(dǎo)體激光器，功率17mw，通過光柵和濾光片后，實(shí)際到達(dá)樣品的功率不足Imw,確保樣品成分完整,檢測(cè)鏡頭為50倍長(zhǎng)焦鏡頭(numerical aperture (NA)O.50, Olympus, Japan),匯聚激光為直徑約I. 5Mm的光斑；信號(hào)采集時(shí)間為30秒,累積掃描4次，采譜范圍為600-1700 CnT1JOO線的光柵使光譜分辨率達(dá)到δοπΓ1。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白的方法，其特征在于，步驟四中所述的對(duì)光譜掃描結(jié)果進(jìn)行分析的具體方法是讀取740 cm—1與1654cm—1處峰強(qiáng)值，以757CHT1處的峰做參比，740 cnT1與1654CHT1處峰強(qiáng)增加，為檢測(cè)出有APP存在，且740 cnT1峰強(qiáng)與APP含量呈正相關(guān)。
8.拉曼光譜Ramanspectroscopy掃描法檢測(cè)血小板膜上淀粉樣前體蛋白AmyloidPrecursor Protein, APP 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用拉曼光譜(Ramanspectroscopy)掃描法檢測(cè)血小板膜淀粉樣前體蛋白(AmyloidPrecursorProtein，APP)的方法，主要流程為提取血小板，將血小板置于拉曼顯微鏡下進(jìn)行拉曼光譜掃描，從光譜值反映APP含量。與傳統(tǒng)生化方法相比具有所需血小板量少(2μl)、操作步驟少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/65GK102692403SQ20111007231
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者沈愛國(guó), 王建枝, 田青, 胡繼明 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)