專利名稱：胰蛋白酶原-2化學發(fā)光免疫檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，具體涉及一種胰蛋白酶原-2檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
急性胰腺炎(AP)為腹部外科常見病，且近年來重型胰腺炎發(fā)病率逐漸增多。急性胰腺炎對生理擾亂大，而且對各重要臟器損害明顯故死亡率甚高，有時可引起驟然死亡，重型胰腺炎死亡率為20 %，有并發(fā)癥者可高達50 %。所以，臨床上需要及早和準確的診斷，以免延誤病情。對急性胰腺炎的診斷，傳統(tǒng)為采用生化方法測定淀粉酶。但人的淀粉酶有兩類同功酶，即胰腺淀粉酶和唾液淀粉酶，前者是由胰腺細胞特異分泌的，而后者可來源于唾液腺、肝細胞、乳腺、肺和女性生殖器官，并且后者的含量大于前者。傳統(tǒng)的生化方法不能區(qū)分這兩類淀粉酶，測定中造成干擾，導致誤診。急性胰腺炎一般來勢兇險，診斷延誤極易造成死亡。胰蛋白酶(Trypsin)是由胰腺外分泌細胞產(chǎn)生的蛋白水解酶，是胰液的主要成分，其前體為胰蛋白酶原。胰蛋白酶原(Trypsinogen)是一種分子量為25Kd的胰腺蛋白水解酶，由腸激酶激活。它分為兩種主要同功酶，即陽離子的胰蛋白酶原-1和陰離子的胰蛋白酶原-2，兩者在胰液中含量很高，正常時僅有極少量進入循環(huán)系統(tǒng)，但病理情況下可大量進入血液。健康人中胰蛋白酶原-1與胰蛋白酶原-2的比值為4 1，但在急性胰腺炎時， 血中胰蛋白酶原-2急劇增高，又由于它在腎小管吸收少，因此血和尿中胰蛋白酶原-2水平皆明顯升高。血清胰蛋白酶原-2測定對胰腺炎的診斷具有高度的特異性，能夠準確無誤的做出判斷，使急性胰腺炎得到及時和恰當?shù)闹委?，它同時又是病情嚴重程度的指標。英國利物浦皇家醫(yī)學院外科最近在Lancet報導他們比較了血中C-反應蛋白、尿中胰蛋白酶原激活肽等幾種臨床化學指標對急性胰腺炎的診斷、預后的意義，認為尿中胰蛋白酶原的檢測對急性胰腺炎較佳，可作為臨床常規(guī)應用。所以，對急性胰腺炎的診斷，測定胰蛋白酶原-2的特異性遠遠高于傳統(tǒng)的生化方法測定淀粉酶。2000年，Clin Cancer Res中報導日本科學家認為60%晚期胃癌患者血中胰蛋白酶原十分高，這些患者常伴有淋巴結(jié)、肝轉(zhuǎn)移，而且往往是分化差的腺癌。另外應用胰蛋白酶原對膽管癌、梗阻性黃疸的鑒別診斷近期也有相關(guān)報道。胰蛋白酶原-2的檢測，現(xiàn)有的膠體金的方法雖然操作比較簡單，但需要手工操作，僅適合少量樣本的檢查，不適合進行大規(guī)模使用，不適合上機進行全自動的操作，容易造成誤差，而且膠體金的方法對胰蛋白酶原-2的檢查是定性的，無法實現(xiàn)定量。化學發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)于 1977 年問世， 上世紀九十年代，化學發(fā)光免疫分析試劑盒的研制和自動化測量儀的生產(chǎn)取得了突破性進展，從而進入高速發(fā)展階段?；瘜W發(fā)光免疫分析是繼熒光、放射性同位素和酶免疫分析之后發(fā)展起來的一項新的免疫分析技術(shù)，根據(jù)大量的實驗結(jié)果及臨床應用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及發(fā)展前景來看，在非放射性標記分析技術(shù)中化學發(fā)光免疫分析處于領先地位， 代表了當今世界發(fā)展的方向和潮流，它不僅具有免疫反應的特異性，而且具有化學發(fā)光反應的高靈敏性(檢測限度可達10_15 10_18mOl/L)?；瘜W發(fā)光免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、 快速、準確、重復性好、效期長并安全無毒無污染等優(yōu)點，成為取代放射免疫分析和酶免疫分析技術(shù)的首選。化學發(fā)光免疫分析作為一種新興的分析技術(shù)，目前尚未應用于胰蛋白酶原-2的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種胰蛋白酶原-2化學發(fā)光免疫檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供所述試劑盒的臨床適用范圍。本發(fā)明的試劑盒可以用于急性胰腺炎的臨床診斷；本發(fā)明試劑盒還可以用于監(jiān)測胰腺癌、膽囊癌、胃癌、淋巴瘤、胚胎性惡性腫瘤的發(fā)展過程。本發(fā)明的再一目的是提供制備上述試劑盒的方法。本發(fā)明的胰蛋白酶原-2化學發(fā)光免疫檢測試劑盒包括1)胰蛋白酶原-2抗原校準品；2)胰蛋白酶原-2抗體或鏈霉親和素包被的微孔板；3)當2)中為胰蛋白酶原-2抗體包被的微孔板時，為酶標記的胰蛋白酶原-2抗體，當2、中為鏈霉親和素包被的微孔板時， 為酶標記的胰蛋白酶原-2抗體和生物素標記的胰蛋白酶原-2抗體；4)化學發(fā)光底物液； 以及幻濃縮洗滌液。本發(fā)明還提供了制備上述試劑盒的方法，其包括以下步驟1)配制胰蛋白酶原-2 抗原校準品；2)以胰蛋白酶原-2抗體或鏈霉親和素包被微孔板；3)當幻中采用胰蛋白酶原-2抗體包被微孔板時，采用酶標記胰蛋白酶原-2抗體，當2、中采用鏈霉親和素包被微孔板時，采用酶標記胰蛋白酶原-2抗體并采用生物素標記胰蛋白酶原-2抗體；4)配制化學發(fā)光底物液；以及幻濃縮洗滌液；6)分裝上述胰蛋白酶原-2抗原校準品、酶或生物素標記的胰蛋白酶原-2抗體、化學發(fā)光底物液和濃縮洗滌液；以及7)組裝為成品。
具體實施例方式急性胰腺炎時，尿或血液中胰蛋白酶原-2水平急劇升高，測定尿或血液中胰蛋白酶原-2的含量可以作為急性胰腺炎早期診斷的依據(jù)。同時本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在胃癌、淋巴瘤、胚胎性惡性腫瘤患者血液中胰蛋白酶原-2水平也明顯升高，可見胰蛋白酶原-2也是一種有價值的腫瘤標志物。胰蛋白酶原-2化學發(fā)光免疫檢測試劑盒將在急性胰腺炎診斷和癌癥發(fā)展監(jiān)測方面起到重大的作用。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明將化學發(fā)光技術(shù)與胰蛋白酶原-2的免疫分析學有效地結(jié)合，同時使用了發(fā)光信號強、持續(xù)時間長、更高信噪比的自制化學發(fā)光底物液，提供了一種能夠更加簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測胰蛋白酶原-2的試劑盒。同時，本發(fā)明的試劑盒采用的方法比目前其它分析法靈敏度高，反應高度特異性，因此使本試劑盒更適于在產(chǎn)業(yè)上有效地進行推廣和應用。
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根據(jù)本發(fā)明的胰蛋白酶原-2化學發(fā)光免疫檢測試劑盒包括1)胰蛋白酶原-2抗原校準品；2)胰蛋白酶原-2抗體或鏈霉親和素包被的微孔板；3)當2)中為胰蛋白酶原-2 抗體包被的微孔板時，為酶標記的胰蛋白酶原-2抗體，當2、中為鏈霉親和素包被的微孔板時，為酶標記的胰蛋白酶原-2抗體和生物素標記的胰蛋白酶原-2抗體；4)化學發(fā)光底物液；以及幻濃縮洗滌液。其中，所述胰蛋白酶原-2抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選為單克隆抗體，例如芬蘭Medix Biochemica公司的Anti-Trypsinogen—2單克隆抗體。其中，所述幻中的酶標記物優(yōu)選為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶或生物素；試劑盒優(yōu)選同時可以引入生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，采用鏈霉親和素包被微孔板，以生物素標記的一株單克隆抗體和酶標記的另一株單克隆抗體形成新的免疫分析模式。其中，所述4)中的化學發(fā)光底物優(yōu)選可以是1，2_ 二氧乙烷類衍生物，例如 3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷(AMPPD)；魯米諾或其衍生物，或異魯米諾或其衍生物；氨基苯二酰胼類，等。其中，所述4)采用的是化學發(fā)光底物液。該化學法光底物液可以按照本領域常規(guī)的方法自制，也可以購買得到，例如美國THERMO公司的PIERCE試劑。所述4)中，所述濃縮洗滌液優(yōu)選為PBST (即磷酸鹽吐溫緩沖液)或含Tween20的 Tris-HCl緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述胰蛋白酶原-2抗體的來源可以是大鼠、小鼠、 兔、山羊、綿羊、豚鼠、牛、驢、馬、雞或猴子。本發(fā)明的用于制備所述試劑盒的方法包括以下步驟1)配制胰蛋白酶原-2抗原校準品；2)以胰蛋白酶原-2抗體或鏈霉親和素包被微孔板；幻當幻中采用胰蛋白酶原-2 抗體包被微孔板時，采用酶標記胰蛋白酶原-2抗體，當2、中采用鏈霉親和素包被微孔板時，采用酶標記胰蛋白酶原-2抗體并采用生物素標記胰蛋白酶原-2抗體；4)配制化學發(fā)光底物液；以及幻配制濃縮洗滌液；6)分裝上述胰蛋白酶原-2抗原校準品、酶或生物素標記的胰蛋白酶原-2抗體、化學發(fā)光底物液和濃縮洗滌液；以及7)組裝為成品。所述步驟1)中，所述胰蛋白酶原-2抗原校準品為人工合成多肽，純度優(yōu)選不得低于 90%。所述步驟2、優(yōu)選包括以下步驟I)胰蛋白酶原-2抗體的準備所述胰蛋白酶原-2抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選為單克隆抗體，例如芬蘭Medix Biochemica公司的Anti-Trypsinogen-2單克隆抗體。所述胰蛋白酶原_2 抗體可以購買得到或者按照本領域常規(guī)的制備方法獲得。制備方法可以是①制備多克隆抗體人工合成胰蛋白酶原-2多肽，用合成的多肽交聯(lián)BSA后免疫兔子，制備兔抗人胰蛋白酶原-2抗體；或者②制備單克隆抗體用基因重組的胰蛋白酶原-2免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體細胞株。II)包被用0. 01 5mol/L(優(yōu)選為 0. 01 0. lmol/L,更優(yōu)選為 0. 05mol/L) pH 值為 7 11 (優(yōu)選為7 10，更優(yōu)選為9. 6)的碳酸鹽緩沖液與1 20 μ g/mL的胰蛋白酶原_2抗體配制成包被液，或者配制基于IOOOmL包含10 90g Na2HPO4 · 12H20、1 50g檸檬酸的溶液，所述溶液的PH值為3 10，然后將鏈霉親和素以1 20 μ g/mL的濃度溶解到所述溶液中，配制成包被液；將上述包被液負載于微孔板上，包被的微孔板為48或96孔的微孔板條。III)用生理鹽水洗滌上述微孔板。IV)封閉配制封閉液，基于IOOOmL所述封閉液包含0. 01 5g(優(yōu)選為0. 01 2. 0g，更優(yōu)選為 0. 2g) NaH2PO4 ·2Η20、0· 01 IOg (優(yōu)選為 0.01 ~ 5g，更優(yōu)選為 0. 5 5g 最優(yōu)選為 2. 9g) Na2HPO4 · 12H20、1 40g(優(yōu)選為1 20g，更優(yōu)選為IOg)牛血清白蛋白和0. 1 IOmL (優(yōu)選為ImL)生物防腐劑(例如慶大霉素、乳酸鏈球菌素和那他霉素、ProClin300等)，所述封閉液的PH值為7. 0 10 (優(yōu)選為7. 0 7. 6)，然后將所得封閉液加到微孔板上，每孔200 300微升，2 40°C放置4 M小時后將液體吸出，用0. 9%生理鹽水沖洗一遍后晾干備用。所述步驟幻中，胰蛋白酶原-2抗體酶標記物優(yōu)選為偶聯(lián)堿性磷酸酶或是辣根過氧化物酶。采用辣根過氧化物酶時，優(yōu)選采用過碘酸鈉法進行標記，采用堿性磷酸酶時，優(yōu)選采用戊二醛交聯(lián)法進行標記。試劑盒優(yōu)選同時可以引入生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，采用鏈霉親和素包被微孔板，以生物素標記的一株單克隆抗體和酶標記的另一株單克隆抗體形成新的免疫分析模式。所述步驟幻中，采用生物素標記胰蛋白酶原-2抗體的步驟優(yōu)選為①將胰蛋白酶原-2抗體在0. 01 2. OOmol/L的pH 5 10的硼酸緩沖液中透析4 M小時，透析完畢后取出抗體裝入玻璃瓶中；②稱生物素IOyg IOOOyg溶于有機溶劑中，所述有機溶劑優(yōu)選為非質(zhì)子極性溶劑，例如DMF、DMS0等；③將步驟①中所得到的溶液與步驟②中所得到的溶液混合，室溫反應1 M小時，加入100 μ 1的0. 5 5mol/L的氯化銨溶液。所述步驟4)中，所述化學發(fā)光底物液中的有效發(fā)光物質(zhì)優(yōu)選為魯米諾或AMPPD。 該化學法光底物液可以按照本領域常規(guī)的方法自制，也可以購買得到，例如美國THERMO公司PIERCE試劑。所述步驟5)中，濃縮洗滌液優(yōu)選為PBST或含Tween20的Tris-HCl緩沖液。步驟6)和7)可按照本領域常規(guī)的操作。例如步驟6)即將生產(chǎn)的所述組分等體積存放在小瓶中，步驟7)即將這些小瓶排放到試劑盒的里面。在本發(fā)明的研究過程中，首先對所用的原材料進行了篩選試驗和質(zhì)量鑒定，以保證試驗的精確性，然后對包被方法進行了研究，選擇出最適合的包被緩沖液和封閉液，找到最佳的濃度條件，并且配制出了能夠使酶標記物長期保持活性的稀釋液。本發(fā)明胰蛋白酶原-2化學發(fā)光免疫檢測試劑盒可以檢測尿或血液中胰蛋白酶原-2的水平，可以作為急性胰腺炎診斷指標之一，從而可以用于急性胰腺炎的臨床診斷。 同時使用該試劑盒測定尿或血液中胰蛋白酶原-2的水平還可用于監(jiān)測癌癥(例如胰腺癌、 膽囊癌、胃癌、淋巴瘤和胚胎性惡性腫瘤)的發(fā)展過程。本發(fā)明的試劑盒具有無創(chuàng)、簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。同時該胰蛋白酶原-2化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的各項指標均已達到技術(shù)要求。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，酶標記的胰蛋白酶原-2抗體與固相載體上包被的胰蛋白酶原-2抗體同被測樣品中的胰蛋白酶原-2抗原形成“包被抗體-抗原-抗體-酶”的夾心復合物結(jié)構(gòu)，因此本發(fā)明采用的“雙抗體夾心法”反應模式，既有效地利用抗原-抗體反應的高特異性，又結(jié)合了化學發(fā)光免疫分析技術(shù)的高靈敏度，可為臨床診斷提供更為特異、 快速、可靠的依據(jù)。實施例下面通過實施例對本發(fā)明進行進一步地說明，但不應理解為對本發(fā)明的限制。實施例1應用辣根過氧化物酶系統(tǒng)制備本發(fā)明的胰蛋白酶原-2化學發(fā)光免疫檢測試劑盒一、辣根過氧化物酶標記的胰蛋白酶原-2抗體的制備溶解5mg辣根過氧化物酶于0. 5mL蒸餾水中，加入0. 5mL過碘酸鈉(50mmol/L)室溫攪拌30min，經(jīng)IOmM pH值為4. 4醋酸鈉緩沖液，透析后加入5mg胰蛋白酶原-2抗體(芬蘭 Medix Biochemica 公司的 Anti-Trypsinogen-28603)，攪拌 2h，最后用 200mM NaBH4 進行還原，經(jīng)0. 02M PBS緩沖液透析后，加等體積甘油，-200C以下保存。二、酶標抗體稀釋液
權(quán)利要求
1.一種胰蛋白酶原-2化學發(fā)光免疫分析檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 1)胰蛋白酶原-2校準品；2)胰蛋白酶原-2抗體或鏈霉親和素包被的微孔板；3)當2)中為胰蛋白酶原-2抗體包被的微孔板時，為酶標記的胰蛋白酶原-2抗體，當2、中為鏈霉親和素包被的微孔板時，為酶標記的胰蛋白酶原-2抗體和生物素標記的胰蛋白酶原-2抗體； 4)化學發(fā)光底物液；以及幻濃縮洗滌液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，用于標記胰蛋白酶原-2抗體的標記物為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶或生物素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物為1，2_二氧乙烷類衍生物、魯米諾及其衍生物、異魯米諾及其衍生物或氨基苯二酰胼類衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物為AMPPD、魯米諾或異魯米諾或氨基苯二酰胼。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任意一項所述的試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為 PBST 或含 Tween20 的 Tris-HCl 緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任意一項所述的試劑盒，其特征在于所述胰蛋白酶原-2抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任意一項所述的試劑盒，所述胰蛋白酶原-2抗體來源于大鼠、小鼠、兔、山羊、綿羊、豚鼠、牛、驢、馬、雞或猴子。
8.一種制備權(quán)利要求1 7中任意一項所述試劑盒的方法，其包括以下步驟1)配制胰蛋白酶原-2抗原校準品；幻以胰蛋白酶原-2抗體或鏈霉親和素包被微孔板；幻當2)中采用胰蛋白酶原-2抗體包被微孔板時，采用酶標記胰蛋白酶原-2抗體，當2、中采用鏈霉親和素包被微孔板時，采用酶標記胰蛋白酶原-2抗體并采用生物素標記胰蛋白酶原-2抗體；4)配制化學發(fā)光底物液力)配制濃縮洗滌液；6)分裝所述胰蛋白酶原-2抗原校準品、 酶和/或生物素標記的胰蛋白酶原-2抗體、化學發(fā)光底物液、濃縮洗滌液；以及7)組裝為成品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟2、包括以下步驟I)胰蛋白酶原-2抗體的準備；II)包被用0. 01 5mol/L pH值為7. 0 11. 0的碳酸鹽緩沖液與1 20 μ g/mL的胰蛋白酶原-2抗體配制成包被液，或者配制基于IOOOmL包含10 90g Na2HPO4 · 12H20、1 50g檸檬酸的溶液，所述溶液的 PH值為3 10，然后將鏈霉親和素以1 20 μ g/mL的濃度溶解到所述溶液中，配制成包被液；將上述包被液負載于微孔板上，包被的微孔板為48或96孔的微孔板條；III)用生理鹽水洗滌上述微孔板；IV)封閉配制封閉液，基于IOOOmL所述封閉液包含0. 01 5. Og NaH2PO4 · 2H20、0. 01 IOg Na2HPO4 · 12H20、1 40g牛血清白蛋白和0. 1 IOmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為 7. 0 10，然后將所得封閉液負載于上述洗滌后的微孔板上。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，胰蛋白酶原-2抗體酶標記物為偶聯(lián)堿性磷酸酶或是辣根過氧化物酶，采用辣根過氧化物酶時，采用過碘酸鈉法進行標記，采用堿性磷酸酶時，采用戊二醛交聯(lián)法進行標記。
11.根據(jù)權(quán)利要求8 10中任意一項所述的方法，其特征在于所述步驟幻中，采用生物素標記胰蛋白酶原-2抗體的步驟為①將胰蛋白酶原-2抗體在0. 01 2. 00mol/L pH 5 10的硼酸緩沖液中透析4 M小時，透析完畢后取出抗體裝入玻璃瓶中；②稱生物素 10μ g ΙΟΟΟμ g溶于有機溶劑中；③將步驟①中得到的溶液與步驟②中得到的溶液混合， 室溫反應1 24小時，加入100 μ 10. 5 5mol/L的氯化銨溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述有機溶劑為DMF、DMS0或其組合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種胰蛋白酶原-2化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，其包括1)胰蛋白酶原-2校準品；2)胰蛋白酶原-2抗體或鏈霉親和素包被的微孔板；3)當2)中為胰蛋白酶原-2抗體包被的微孔板時，為酶標記的胰蛋白酶原-2抗體，當2)中為鏈霉親和素包被的微孔板時，為酶標記的胰蛋白酶原-2抗體和生物素標記的胰蛋白酶原-2抗體；4)化學發(fā)光底物液；以及5)濃縮洗滌液。本發(fā)明還提供制備上述試劑盒的方法。本發(fā)明的試劑盒具有操作簡便、靈敏度高、反應快速等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/573GK102226808SQ20111007551
公開日2011年10月26日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者張昊巖, 范振符, 范飛舟, 陳智周 申請人:北京永瀚星港生物技術(shù)有限公司