專利名稱：蛋白組合物及其在制備肺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物 學(xué)、臨床檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及包含P53、P63、Ki67、MCM7、及EGFR五個(gè)蛋白的蛋白組合物，以及所述蛋白組合物在制備肺癌，特別是肺鱗癌和肺腺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺癌是當(dāng)今世界各國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，對(duì)人類健康和生命構(gòu)成極大威脅。美國(guó)2010年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌的死亡率在男性和女性均位于身體各部 位腫瘤的首位，分別為29%和26%。新發(fā)病例在男性和女性中均占第二位，分別為各部位腫瘤總和的15%和14%。1999-2005年間美國(guó)肺癌的5年生存率為16%，其中局灶性者5年生存率為53%，有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為24%,有血行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者僅為4%。歐洲肺癌的總體5年生存率為10. 9%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于乳腺癌和前列腺癌的79%和78%。在我國(guó)，衛(wèi)生部全國(guó)腫瘤防治辦公室提供的資料顯示，自2000-2005年間，中國(guó)肺癌的發(fā)病人數(shù)估計(jì)增加12萬(wàn)人，其中男性肺癌患者從2000年的26萬(wàn)人增加到2005年的33萬(wàn)人，同期女性肺癌患者從12萬(wàn)人增加到17萬(wàn)人。目前我國(guó)肺癌發(fā)病率每年增長(zhǎng)26. 9%,如不及時(shí)采取有效控制措施，預(yù)計(jì)到2025年，我國(guó)肺癌患者將達(dá)100萬(wàn)，成為世界第一肺癌大國(guó)。盡管近年在診斷方法、手術(shù)技術(shù)以及化療藥物方面均有新的發(fā)展，但肺癌患者總的5年生存率仍非常低。在我國(guó)，肺癌每年約致400，000例患者死亡。肺癌總體5年生存率之所以這么低，主要因?yàn)槎鄶?shù)肺癌患者就診時(shí)已處于晚期，或較早就出現(xiàn)播散轉(zhuǎn)移，所以降低肺癌患者死亡率的關(guān)鍵在于早期預(yù)警、早期發(fā)現(xiàn)，以便早期干預(yù)。研究顯示I期肺癌術(shù)后10年生存率可達(dá)到92 %。目前常用的肺癌篩查方法包括胸部X線、低劑量螺旋CTdow-dosespiral CT,LDCT)、痰液細(xì)胞學(xué)檢查、支氣管鏡下刷片或取活檢、支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢查等，但各種檢查手段在敏感性、特異性、適用度等方面均存在局限。除了以上的物理性檢查方式之外，目前臨床上也有應(yīng)用血清腫瘤學(xué)標(biāo)志物診斷肺癌。常見(jiàn)的標(biāo)志物包括癌胚抗原(CEA)、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCC-Ag)、細(xì)胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原153 (CA153)、糖類抗原199(CA199)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、組織多肽抗原(TPA)等。但這些腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)檢測(cè)其敏感性和特異性均有限，聯(lián)合檢測(cè)雖有所提高，但依然面臨許多良性病變?nèi)缌夹阅[瘤、炎癥、退行性疾病等也會(huì)引起這些腫瘤標(biāo)志物血清學(xué)水平增高的問(wèn)題。進(jìn)一步探索高效特異的肺癌標(biāo)志物、特別是早期預(yù)警的標(biāo)志物極其重要。肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，各占肺癌的85%和15%。其中非小細(xì)胞肺癌又包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌。因鱗癌和腺癌在被診斷出的患者中占大多數(shù)，目前對(duì)這兩種類型肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究較多。綜合目前的研究，與肺癌發(fā)病機(jī)制相關(guān)的基因改變涉及到細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖與分化、DNA修復(fù)以及細(xì)胞凋亡等(如p53、CCNDl、ki-67、TelomeraseJTFl等)，而染色體結(jié)構(gòu)的異常與基因表達(dá)水平的改變也可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。近年的研究證明，有些分子改變是順序發(fā)生，它們出現(xiàn)的頻率與癌前病變的發(fā)展程度(鱗狀上皮化生-不典型增生-原位癌；非典型腺瘤增生-腺癌)同步升高。因此，以分子水平異常作為肺癌的腫瘤標(biāo)志物能更恰當(dāng)?shù)胤从衬[瘤生物學(xué)行為的異質(zhì)性，進(jìn)而為肺癌的預(yù)警提供更有價(jià)值的指導(dǎo)。盡管取得了一些研究進(jìn)展，但迄今為止，尚無(wú)任何確定的分子標(biāo)志可真正用于肺癌的預(yù)警。因此，本領(lǐng)域迫切需要研究出可用于肺癌早期診斷的標(biāo)志物或標(biāo)志物組合，以及可有效檢測(cè)肺癌，尤其是早期檢測(cè)肺癌的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可有效檢測(cè)肺癌，特別是早期肺癌的蛋白組合物，所述早期肺癌優(yōu)選為早期肺鱗癌和早期肺腺癌。該組合具有以下特征
(a)在肺癌患者組織中高表達(dá)，在手術(shù)切端組織中低表達(dá)或不表達(dá)；(b)在結(jié)核、炎癥、肺隱球菌病等其它非癌性肺部病變組織中低表達(dá)或不表達(dá)；(c)在腫瘤患者支氣管刷檢標(biāo)本中強(qiáng)表達(dá)，在肺部炎癥、結(jié)核及其它良性病變中低表達(dá)/不表達(dá)；(d)健康體檢人群中此蛋白組合表達(dá)陽(yáng)性者發(fā)生肺癌風(fēng)險(xiǎn)增高。在本發(fā)明中，發(fā)明人通過(guò)不懈的努力，從大量的癌癥標(biāo)志物蛋白中篩選得到用于肺癌診斷的蛋白標(biāo)志物組合,所述蛋白標(biāo)志物的組合物包括以下五種蛋白，P53、P63、Ki67、MCM7 及 EGFR。具體地，本發(fā)明涉及以下幾個(gè)方面本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種蛋白組合物，其包含選自P53、P63、Ki67、MCM7及EGFR蛋白中的至少四種。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述蛋白組合物中為四種或五種。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其為以下組合(1)EGFR、MCM7、P63 和 P53 蛋白；(2)EGFR、Ki67、MCM7 和 P53 蛋白；(3)EGFR、Ki67、P53 和 P63 蛋白；(4)Ki67、P53、P63 和 MCM7 蛋白；(5)Ki67、P63、MCM7、EGFR 蛋白；或者(6)P53、P63、Ki67、MCM7 和 EGFR 蛋白。在本發(fā)明中，所述蛋白組合物即為蛋白標(biāo)志物的組合物，其可作為標(biāo)志性蛋白用于肺癌的檢測(cè)。因此本發(fā)明還公開(kāi)了與標(biāo)志物蛋白特異性結(jié)合的分子。本發(fā)明的另一方面涉及一種配體組合物，其為與本發(fā)明的蛋白組合物中所述的蛋白特異性結(jié)合的配體的組合物。在本發(fā)明中，所述配體是與本發(fā)明的蛋白組合物中的蛋白特異性結(jié)合的分子。配體可以是核酸、多肽或化合物。本發(fā)明的配體可以是肽配體，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述配體為抗體。抗體可以是人抗體、嵌合抗體、重組抗體、人源化抗體、單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或者多克隆抗體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述抗體為單克隆抗體。本發(fā)明的另一方面涉及一種芯片，其上點(diǎn)有本發(fā)明的配體組合物中所述的配體。所述芯片即蛋白質(zhì)陣列，可以將與本發(fā)明的蛋白標(biāo)志物特異性結(jié)合的抗體或其它配體固定在蛋白質(zhì)陣列上，以檢測(cè)樣品中是否存在本發(fā)明的蛋白標(biāo)志物。本發(fā)明的另一方面涉及一種試劑盒，其包含本發(fā)明的配體組合物。在本發(fā)明中，所述試劑盒還包含緩沖液及顯色劑。本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的蛋白組合物或配體組合物或芯片在制備肺癌診斷試劑盒中的用途。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述肺癌為肺鱗癌或肺腺癌。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述肺鱗癌或肺腺癌為晚期肺鱗癌或晚期肺腺癌。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述肺鱗癌或肺腺癌為早期肺鱗癌或早期肺腺癌。在本發(fā)明中，所述試劑盒用于組織樣品或細(xì)胞樣品的診斷。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織樣品為肺癌或手術(shù)切端組織切片樣品。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞樣品為支氣管刷檢的細(xì)胞樣本。
在本發(fā)明中，所述試劑盒的判斷方法為，當(dāng)本發(fā)明的配體組合物中的至少兩種配體與待測(cè)樣品反應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)，即判斷為肺癌樣品。在本發(fā)明中，所述配體是與本發(fā)明的蛋白組合物中的蛋白特異性結(jié)合的分子。配體可以是核酸、多肽或化合物。本發(fā)明的配體可以是肽配體，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述配體為抗體。抗體可以是人抗體、嵌合抗體、重組抗體、人源化抗體、單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或者多克隆抗體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述抗體為單克隆抗體。當(dāng)配體為寡核苷酸片段時(shí)，所述寡核苷酸片段能夠與本發(fā)明的蛋白組合物中所述蛋白的基因序列特異性結(jié)合；所述寡核苷酸片段例如為引物或探針。檢測(cè)蛋白標(biāo)志物的方法涉及通過(guò)與蛋白質(zhì)特異性抗體的相互作用進(jìn)行檢測(cè)。例如可以如本文所述使用針對(duì)蛋白標(biāo)志物的抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生抗體，或者可以使用購(gòu)買(mǎi)的抗體。這些抗體可以是多克隆抗體，或優(yōu)選是單克隆抗體。例如，可以使用完整抗體或與抗原結(jié)合的抗體片段?？梢允褂妹庖邷y(cè)定的方法定量或定性檢測(cè)蛋白標(biāo)志物的存在。所述免疫測(cè)定通常包括將生物樣品與抗體一起孵育，并通過(guò)多種熟知技術(shù)檢測(cè)結(jié)合抗體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，制備樣本方法、免疫組織化學(xué)方法和陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)如下(a)制備樣本組織芯片肺癌及手術(shù)切端組織用福爾馬林固定，用石蠟包埋，制成石蠟標(biāo)本。切片染色，以明辨腫瘤病理類型且標(biāo)記所需癌巢及手術(shù)切緣組織位置。在石蠟標(biāo)本的相應(yīng)位置取出組織芯，放入預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列模塊中，排列成組織芯片模塊。將組織芯片模塊切片，裱于玻片上，置于干燥箱中過(guò)夜，待做免疫組織化學(xué)用。細(xì)胞懸液微陣列將存有支氣管刷檢樣本的保存液離心、依細(xì)胞量留取適宜體積的液體。吸取適量按預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列點(diǎn)于防脫玻片上，固定，待做免疫細(xì)胞化學(xué)用。(b)免疫組織化學(xué)組織芯片烤片，脫蠟，微波熱修復(fù)，加抗體孵育，洗滌。力口PV9000試劑I于37°C溫箱中孵育，加PV9000試劑2于37°C溫箱中孵育，DAB溶液鏡下顯色，蒸餾水漂洗，蘇木素復(fù)染，氨水返藍(lán)，乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。免疫細(xì)胞化學(xué)無(wú)烤片、脫蠟兩步，余步驟同免疫組織化學(xué)。(C)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)依蛋白表達(dá)部位對(duì)顯色結(jié)果采取不同評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
如EGFR為膜表達(dá)，0分為陰性，完全無(wú)顯色或< 10%腫瘤細(xì)胞膜顯色。I分為陰性，> 10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)很弱的膜顯色且顯色不完整。2分為弱至中等陽(yáng)性，> 10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度的膜顯色。3分為強(qiáng)陽(yáng)性，> 10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)的膜顯色。2分以上即判斷為陽(yáng)性。MCM7、P53、Ki67及P63均為核表達(dá)，評(píng)分需綜合考慮陽(yáng)性細(xì)胞百分比和顯色強(qiáng)度。百分比< 10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核顯色為0分，10% -33%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核顯色為I分，33% -67%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核顯色為2分，> 67%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核顯色為3分。顯色強(qiáng)度無(wú)核顯色為0分，較弱核顯色為I分，中等核顯色為2分，較強(qiáng)核顯色為3分。以百分比評(píng)分X顯色強(qiáng)度評(píng)分為最終評(píng)分結(jié)果。百分比評(píng)分X顯色強(qiáng)度評(píng)分為I分以上即判斷為陽(yáng)性。發(fā)明的有益效果
本發(fā)明利用抗體聯(lián)合檢測(cè)樣品中的EGFR、MCM7、P53、Ki67及P63蛋白，可以有效
檢測(cè)肺癌，尤其是早期肺鱗癌和肺腺癌，其靈敏度和特異性顯著高于使用單一蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的方法能夠大大提高早期肺癌特別是早期肺鱗癌和肺腺癌的檢出率，有利于肺癌患者早發(fā)現(xiàn)、早治療，以大大提高肺癌患者的生存率。


圖I肺鱗癌及手術(shù)切端組織微陣列免疫組織化學(xué)檢測(cè)從圖I可以看出，EGFR、MCM7、P53、Ki67及P63五個(gè)蛋白在晚期肺鱗癌組織中強(qiáng)表達(dá)，而在癌旁組織不表達(dá)。 圖2肺腺癌及手術(shù)切端組織微陣列免疫組織化學(xué)檢測(cè)從圖2可以看出，EGFR、MCM7、P53、Ki67及P63五個(gè)蛋白在晚期肺腺癌組織中強(qiáng)表達(dá)，而在癌旁組織不表達(dá)。圖3支氣管刷檢標(biāo)本細(xì)胞懸液微陣列免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)從圖3可以看出，EGFR、MCM7、P53、Ki67及P63五個(gè)蛋白在腫瘤病例的FOB標(biāo)本中強(qiáng)表達(dá)，而在炎性病例不表達(dá)。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。在本發(fā)明中，所述蛋白組合物包括以下五種蛋白，P53、P63、Ki67、MCM7及EGFR。其中p53分為野生和突變兩種亞型，該基因的突變或缺失是導(dǎo)致許多腫瘤發(fā)生的原因，同時(shí)也是細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子。廣泛表達(dá)于大部分的腫瘤，如肺癌、乳腺癌、胃腸道腫瘤及肝細(xì)胞癌等。P63表達(dá)于表皮的基底細(xì)胞、皮膚附屬器的基底/肌上皮細(xì)胞、乳腺肌上皮細(xì)胞、前列腺基底細(xì)胞等，是鱗癌、基底細(xì)胞癌、尿路移行細(xì)胞癌的標(biāo)記物，可用于皮膚原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腺癌、乳腺良惡性病變、前列腺癌的診斷和鑒別診斷。Ki-67蛋白可與DNA結(jié)合，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖方面起重要作用。只有G1，G2，M和S期的細(xì)胞表達(dá)Ki-67蛋白，GO期及Gl早期細(xì)胞不表達(dá)。利用Ki-67單克隆抗體可檢測(cè)增值細(xì)胞。MCM7為微小染色體維持蛋白復(fù)合體的重要成分，在啟動(dòng)DNA復(fù)制、合成中起關(guān)鍵作用。通過(guò)檢測(cè)MCM7蛋白的表達(dá)和定位可作為判斷細(xì)胞增殖的指標(biāo)。EGFR是一種分子量為170kDa的膜蛋白。其過(guò)表達(dá)預(yù)示乳腺癌及胃癌預(yù)后差。并可指導(dǎo)治療結(jié)直腸癌的靶向藥物西妥昔單抗的應(yīng)用。在本發(fā)明中，P53抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，貨號(hào)為sc-6243 ；P63抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，貨號(hào)為sc_8431 ;Ki67抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為zm-0166 ；MCM7 抗體購(gòu)自 Santa Cruz 公司，貨號(hào)為 sc-9966 ;EGFR 抗體購(gòu)自 Invitrogen 公 司，貨號(hào)為28-0005。在本發(fā)明中，制備樣本方法、免疫組織化學(xué)方法和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下(a)制備樣本組織芯片肺癌及手術(shù)切端組織用10%中性福爾馬林固定48h后分別用石蠟包埋，切HE染色，明辨腫瘤病理類型且標(biāo)記所需癌巢及手術(shù)切緣組織位置。在石蠟標(biāo)本的相應(yīng)位置標(biāo)記作為取材部位，后用直徑為1_的打孔針從標(biāo)定部位逐個(gè)取出組織芯，放入預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列模塊中，排列成組織芯片模塊。4°C冰箱中凍存30min后用切片機(jī)切成4um厚的切片裱于防脫玻片上，置于65°C干燥箱中過(guò)夜，待做免疫組織化學(xué)用。細(xì)胞懸液微陣列將存有支氣管刷檢樣本的保存液離心、依細(xì)胞量留取適宜體積的液體。吹打均勻，吸取IuL按預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列點(diǎn)于防脫玻片上，95%乙醇固定，待做免疫細(xì)胞化學(xué)用。(b)免疫組織化學(xué)組織芯片65°C烤片30min，二甲苯脫蠟IOminX 3次，100 %、85%、75%乙醇各3min，PBS 5minX 2次，H20215min，枸櫞酸鈉溶液(PH = 6. 0)微波熱修復(fù)(微波加熱至95°C _99°C后將薄片置入，再用微波爐中-低火加熱20分鐘，冷卻至室溫)，PBS 3minX3次，加抗體置入濕盒中4°C過(guò)夜。第二天取出濕盒恢復(fù)至室溫，PBS 3minX3次，加PV9000試劑I于37°C溫箱中孵育20min, PBS 3minX3次，加PV9000試劑2于37。。溫箱中孵育30min，PBS 3minX 3次，DAB溶液鏡下顯色，蒸餾水漂洗，蘇木素復(fù)染，氨水返藍(lán)10min，75%、85%、100%乙醇脫水各3min，二甲苯透明5minX2次，樹(shù)膠封片。注免疫細(xì)胞化學(xué)無(wú)烤片、脫蠟兩步，余步驟同免疫組織化學(xué)。(C)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)依蛋白表達(dá)部位對(duì)顯色結(jié)果采取不同評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如EGFR為膜表達(dá)，0分為陰性，完全無(wú)顯色或< 10%腫瘤細(xì)胞膜顯色。I分為陰性，> 10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)很弱的膜顯色且顯色不完整。2分為弱至中等陽(yáng)性，> 10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)弱至中等強(qiáng)度的膜顯色。3分為強(qiáng)陽(yáng)性，> 10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)的膜顯色。2分以上即判斷為陽(yáng)性。MCM7、P53、Ki67及P63均為核表達(dá)，評(píng)分需綜合考慮陽(yáng)性細(xì)胞百分比和顯色強(qiáng)度。百分比< 10%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核顯色為0分，10% -33%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核顯色為I分，33% -67%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核顯色為2分，> 67%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核顯色為3分。顯色強(qiáng)度無(wú)核顯色為0分，較弱核顯色為I分，中等核顯色為2分，較強(qiáng)核顯色為3分。以百分比評(píng)分X顯色強(qiáng)度評(píng)分為最終評(píng)分結(jié)果。百分比評(píng)分X顯色強(qiáng)度評(píng)分為I分以上即判斷為陽(yáng)性。實(shí)施例I五個(gè)蛋白抗體組合在晚期肺鱗癌和肺腺癌組織檢測(cè)中的靈敏度和特異性將84例晚期(III期、IV期)肺鱗癌、88例晚期肺腺癌及其相應(yīng)手術(shù)切端組織制備成組織芯片，其中腫瘤部分取3個(gè)點(diǎn)，手術(shù)切端組織取2個(gè)點(diǎn)。用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)卩53、？63、燈67、1 117、及￡6 1 五個(gè)蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行評(píng)分、分析。結(jié)果如下表I :肺鱗癌中不同蛋白抗體組合的靈敏度
權(quán)利要求
1.蛋白組合物，其包含選自P53、P63、Ki67、MCM7及EGFR蛋白中的至少四種，例如為四種或五種。
2.權(quán)利要求I的蛋白組合物，其為以下組合(1)EGFR、MCM7、P63和 P53 蛋白；(2)EGFR、Ki67、MCM7和 P53 蛋白；(3)EGFR、Ki67、P53和 P63 蛋白；(4)Ki67、P53、P63和 MCM7 蛋白； (5)Ki67、P63、MCM7、EGFR蛋白；或者(6)P53、P63、Ki67、MCM7 和 EGFR 蛋白。
3.配體組合物，其為與權(quán)利要求I或2的蛋白組合物中所述的蛋白特異性結(jié)合的配體的組合物；其中所述配體優(yōu)選為抗體；所述抗體優(yōu)選為單克隆抗體。
4.芯片，其上點(diǎn)有權(quán)利要求3的配體組合物中所述的配體。
5.試劑盒,其包含權(quán)利要求3的配體組合物。
6.權(quán)利要求5的試劑盒，其還包含緩沖液及顯色劑。
7.權(quán)利要求I或2的蛋白組合物或權(quán)利要求3的配體組合物或權(quán)利要求4的芯片在制備肺癌診斷試劑盒中的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述肺癌為肺鱗癌或肺腺癌。
9.權(quán)利要求7-8任一項(xiàng)的用途，其中所述試劑盒用于組織樣品或細(xì)胞樣品的診斷。
10.權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)的用途，其中所述試劑盒的判斷方法為，當(dāng)權(quán)利要求3的配體組合物或權(quán)利要求4的芯片中的至少兩種配體與待測(cè)樣品反應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)，即判斷為肺癌樣品。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、臨床檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及包含選自P53、P63、Ki67、MCM7及EGFR蛋白的蛋白組合物，與蛋白組合物中的蛋白特異性結(jié)合的配體組合物，以及所述蛋白組合物或配體組合物在制備肺癌、特別是早期肺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明可用于肺癌的診斷，尤其是早期肺癌的診斷，其靈敏度、特異性高，優(yōu)于單一蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102735844SQ20111008886
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者劉一臻, 徐昕, 王明榮, 蔣炎熠 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所