專利名稱：一種超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定中藥中100種農(nóng)藥殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種同時(shí)分析中藥中100種農(nóng)藥殘留物含量的超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥殘留是指農(nóng)藥使用后殘存于生物體、農(nóng)副產(chǎn)品和環(huán)境中的農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱。農(nóng)藥的發(fā)明和使用在提高農(nóng)作物產(chǎn)量的同時(shí)也帶來了很多負(fù)
面作用。中藥作為一種特殊的物質(zhì)，由于在治療疾病和強(qiáng)身健體方面具有獨(dú)特效果使得需求量不斷增大，目前野生藥材遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)需求，大部分中草藥都依賴于人工栽培。為了保證藥材質(zhì)量和產(chǎn)量，在栽培過程中藥農(nóng)不得不大量使用各種類型的農(nóng)藥，因此中藥中農(nóng)藥的污染不容忽視。農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要分為前處理和檢測(cè)兩部分。目前，中藥中農(nóng)藥殘留的前處理方法大多采用傳統(tǒng)的提取和凈化方法，容劑消耗量大，操作過程繁瑣，分析周期長(zhǎng)，且易造成環(huán)境污染。中藥相對(duì)于其他作物而言，其成分的特殊性和復(fù)雜性對(duì)前處理的要求更為嚴(yán)格，一些其他領(lǐng)域較為先進(jìn)的前處理技術(shù)不能直接引用進(jìn)來。Hajou等(Hajou M K7AfifiU, Battah H. Comparative determinationof multi-pesticide residues in Piminellaanisum using two different AOACmethods. Food Chemistry, 2004,88 :469-478)以兩種美國(guó)農(nóng)業(yè)化學(xué)協(xié)會(huì)(AOAC)指定的方法為指導(dǎo)分析中藥茴香中有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲菊酯等農(nóng)藥，認(rèn)為一般的多種類農(nóng)藥殘留前處理方法不能無條件應(yīng)用于特定中藥，需兩種以上方法方能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。然而，這無疑增又加了實(shí)驗(yàn)的工作量和成本，與農(nóng)藥殘留分析的發(fā)展趨勢(shì)背道而馳。迄今為止，在中藥農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，氣象色譜一直居于主導(dǎo)地位，氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用很少，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)幾乎沒有應(yīng)用。研究范圍主要包括單個(gè)農(nóng)藥殘留分析或單種類農(nóng)藥殘留分析(吳永江，朱煒等，液-質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定鐵皮石斛和西洋參及制劑中多菌靈殘留，分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2006，34 (2)，235-238)，多類農(nóng)藥殘留同時(shí)分析的方法研究較少。因此，存在分析時(shí)間長(zhǎng)，不能同時(shí)分析檢測(cè)多種類農(nóng)藥殘留，分析過程繁瑣，成本高等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定中藥中100種農(nóng)藥殘留的方法。目前為止，此方法尚未在中藥農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用。解決主要問題如下I建立了一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效的中藥中多類農(nóng)藥殘留的前處理方法。本方法的核心是使用加入類分析保護(hù)劑(乙酸)的單一溶劑(乙腈)提取農(nóng)藥，并通過具有更強(qiáng)吸水功能的試劑無水硫酸鎂代替常用的無水硫酸鈉干燥提取溶劑，最后采用N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化碳黑(GCB)等凈化，去除脂肪酸、有機(jī)酸和色素等雜質(zhì)。與過去的中藥農(nóng)藥殘留前處理方法相比，具有簡(jiǎn)便、易操作、低成本(不許昂貴的儀器設(shè)備，所有操作步驟手動(dòng)即可)、溶劑使用少、低污染、對(duì)環(huán)境友好(每個(gè)樣品只需IOmL有機(jī)溶劑)等特點(diǎn)。2建立了一種可同時(shí)檢測(cè)100種農(nóng)藥殘留的分析方法。本方法將超高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，不但達(dá)到了高分辨率、高靈敏度、高選擇性的要求，而且極大地縮短了分析時(shí)間(整個(gè)分析過程可在15分鐘內(nèi)完成)，顯著提高了工作效率，目前超高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合尚未在中藥農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用。實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案如下[I]農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備分別稱取100種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各IOmg置于IOmL容 量瓶中，選擇乙腈、甲醇或丙酮分別溶解農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品并定容至刻度，使100種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的濃度均為IOOOii g/mL，農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液-18°c保存。[2]農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備將上述100種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別取出，然后混合到一起，用乙腈定容，按照表3中的每種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品在農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的濃度數(shù)值制備農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。[3]中藥材前處理液的制備①將待檢測(cè)的中藥材飲片粉碎，過9號(hào)篩，得到待檢測(cè)的中藥材樣品粉末，置干燥器中儲(chǔ)存；②取2. OOg待檢測(cè)的中藥材樣品粉末，加入IOmL超純水，混勻后放置I小時(shí)，加入IOmL乙酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的乙酸乙腈混合液用渦旋振蕩器渦旋提取Imin 向上述提取物中加入4g無水硫酸鎂與Ig氯化鈉的混合物，繼續(xù)渦旋提取Imin ;④在4°C下，3500rpm離心IOmin ;⑤放置至室溫時(shí)取出7mL提取液,加入混合吸附劑凈化，振蕩l_2min, 3500rpm離心IOmin ;⑥移取5mL上清液,用氮?dú)獯蹈?用含甲酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水質(zhì)量比為3 2，過0. 2 m濾膜，得到中藥材前處理液，待檢測(cè)；所述的混合吸附劑的加入量及組成為1. 05g無水硫酸鎂，21Omg N-丙級(jí)乙二胺(PSA), 70mg石墨化碳(GCB)。[4]基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取檢測(cè)的不含農(nóng)藥殘留的中藥材樣品粉末5份，每份為2. 00g，均用上述的步驟的①至⑤進(jìn)行處理；在所述的⑥，移取5mL上清液，分別加入步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使得到的溶液中的農(nóng)藥的最終濃度分別為5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、IOOmg/kg、500mg/kg，均用氮?dú)獯蹈?，分別用甲酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水體積比為3 2，過0.2 濾膜，得到5份待檢測(cè)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。[5]中藥材前處理液的檢測(cè)將步驟[3]得到的中藥材前處理液用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣體積L，利用超高效液相色譜對(duì)待測(cè)的100種農(nóng)藥進(jìn)行分離后，在電噴霧(ESI)電離源正、負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)中藥材前處理液進(jìn)行測(cè)定。[6]超高效液相色譜的檢測(cè)條件如下超高效液相色譜儀ACQUITYUPLC (Waters，美國(guó))；色譜柱Acquity UPLCBEH C18色譜柱(I. 7u m,2. I X 100mm) (Waters,美國(guó))；流動(dòng)相A為乙腈，B為甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0. I %的水溶液；流速0. 3毫升每分鐘；柱溫35°C ;梯度0分鐘-I分鐘A為5% -10%，1-4 分鐘 A 為 10 % -30 %，4-8 分鐘 A 為 30 % -60 %，8-13 分鐘 A 為 60 % -90 %，13-14 分鐘A 為 90% -70%, 14-15 分鐘 A 為 70% _5%。[7]質(zhì)譜檢測(cè)條件如下質(zhì)譜儀Waters Xevo TQ ;電噴霧離子源，正、負(fù)離子同時(shí)掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，毛細(xì)管電壓3. 20kV，離子源溫度150°C，脫溶劑氣為氮?dú)猓瑴囟葹?00°C，干燥氣流速800L/Hr,碰撞氣為気氣,気氣流速為0. 16mL/min。[8]標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)校準(zhǔn)曲線吸取上述步驟[2]的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制成濃度分別為0. lng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL 的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣5 u L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥 的線性回歸方程，所述的100種農(nóng)藥的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3，每個(gè)線性回歸方程都可以做出一條曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線；可由此標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷100種農(nóng)藥的線性范圍，圖2給出了莠去津、速滅磷、乙草胺、敵百蟲、苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯六種代表性農(nóng)藥的線性回歸方程所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其它農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線均可由儀器軟件自動(dòng)給出。所述的線性范圍指的是標(biāo)準(zhǔn)曲線為直線的農(nóng)藥的濃度范圍。為消除中藥材前處理液中化學(xué)成分對(duì)測(cè)定的影響，用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線代替標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。取上述步驟[4]的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程；此線性回歸方程對(duì)應(yīng)的曲線為基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，此曲線可用于定量分析；所述的100種農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表4、5、6、7、8。[9]靈敏度實(shí)驗(yàn)靈敏度實(shí)驗(yàn)包括儀器的靈敏度和方法的靈敏度，儀器的靈敏度用儀器的檢出限表示，方法的靈敏度用方法的定量限表示。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇的水溶液逐級(jí)稀釋，并分別進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 3的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為儀器檢測(cè)限。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用中藥材前處理液逐級(jí)稀釋，并進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 10的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為方法定量限。[10]準(zhǔn)確性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取不含農(nóng)藥殘留的中藥材粉末9份，每份為2. OOg,每3份分別加入濃度為I U g/mL的步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 u LUOO u L、20 u L ;按照上述步驟[3]制備中藥材前處理液，并進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；所述的準(zhǔn)確性用回收率來表/In 重復(fù)性用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來表不。有益效果中藥材樣品經(jīng)提取凈化后，利用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，88%的農(nóng)藥在5-500ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0. 99以上，98%的農(nóng)藥相關(guān)系數(shù)在0. 97以上；大部分農(nóng)藥在低濃度為IOii g/kg、中濃度為50ii g/kg、高濃度為IOOii g/kg的三個(gè)濃度上的回收率平均值在70% -130%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于0. 15 ;檢出限< 0. 01mg/kg，完全能滿足常規(guī)檢測(cè)要求。該方法通用性強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便。


圖I為本發(fā)明中10 ii g/mL的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)總離子流圖。圖2為莠去津、速滅磷、乙草胺、敵百蟲、苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯六種代表性農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表I為本發(fā)明中多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的時(shí)間窗口劃分序列。表2為100種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間。
表3為農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、儀器檢出限(LOD)、線性范圍、農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品在農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的濃度及掃描方式。表4為人參前處理液中農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限(LOQ)、加樣回收率及精密度(RSD)。表5為金銀花前處理液中農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限(LOQ)、加樣回收率及精密度(RSD)。表6為山茱萸前處理液中農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限(LOQ)、加樣回收率及精密度(RSD)。表7為桃仁前處理液中農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限(LOQ)、加樣回收率及精密度(RSD)。表8為淡竹葉前處理液中農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限(LOQ)、加樣回收率及精密度(RSD)。
具體實(shí)施例方式以下本文將通過具體的實(shí)施例來描述發(fā)明。另外，實(shí)施例中所使用的材料除有特別說明外，均可通過商業(yè)途徑從市場(chǎng)上購(gòu)買。實(shí)施例I以人參作為根及根莖類中藥材的代表。[I]農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備分別稱取100種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各IOmg置于IOmL容量瓶中，選擇乙腈、甲醇或丙酮分別溶解農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品并定容至刻度，使100種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的濃度均為IOOOii g/mL，農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液-18°c保存。[2]農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備將上述100種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別取出，然后混合到一起，用乙腈定容，按照表3中的每種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品在農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的濃度數(shù)值制備農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。[3]人參前處理液的制備①將待檢測(cè)的人參飲片粉碎，過9號(hào)篩，得到待檢測(cè)的人參樣品粉末，置干燥器中儲(chǔ)存；②取2. OOg待檢測(cè)的人參樣品粉末，加入IOmL超純水，混勻后放置I小時(shí)，加入IOmL乙酸體積分?jǐn)?shù)為0. 1%的乙酸乙腈混合液用渦旋振蕩器渦旋提取Imin 向上述提取物中加入4g無水硫酸鎂與Ig氯化鈉的混合物,繼續(xù)潤(rùn)旋提取Imin ；④在4°C下，3500rpm離心IOmin ;⑤放置至室溫時(shí)取出7mL提取液,加入混合吸附劑凈化，振蕩l_2min, 3500rpm離心IOmin ;⑥移取5mL上清液,用氮?dú)獯蹈?用含甲酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的甲醇和水混合溶液定容至ImL,甲醇和水質(zhì)量比為3 2,過0. 2 i! m濾膜,得到人參前處理液，待檢測(cè)；所述的混合吸附劑的加入量及組成為1.05g無水硫酸鎂，210mg N-丙級(jí)乙二胺(PSA)，70mg石墨化碳(GCB)。[4]基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取檢測(cè)的不含農(nóng)藥殘留的人參樣品粉末5份，每份為2. 00g，均用上述的步驟[3]的①至⑤進(jìn)行處理；在所述的⑥，移取5mL上清液，分別加入步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使人參處理液中的農(nóng)藥的最終濃度分別為5mg/kg、IOmg/kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg，均用氮?dú)獯蹈?，分別用甲酸體積 分?jǐn)?shù)為0. I %的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水體積比為3 2，過0.2 濾膜，得到5份待檢測(cè)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。[5]人參前處理液的檢測(cè)將步驟[3]得到的人參前處理液用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣體積L，利用超高效液相色譜對(duì)待測(cè)的100種農(nóng)藥進(jìn)行分離后，在電噴霧(ESI)電離源正、負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)人參前處理液進(jìn)行測(cè)定。[6]超高效液相色譜的檢測(cè)條件如下超高效液相色譜儀ACQUITYUPLC (Waters，美國(guó))；色譜柱Acquity UPLCBEH C18色譜柱(I. 7u m,2. I X 100mm) (Waters,美國(guó))；流動(dòng)相A為乙腈，B為甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0. I %的水溶液；流速0. 3毫升每分鐘；柱溫35°C ;梯度0分鐘-I分鐘A為5% -10%，1-4 分鐘 A 為 10 % -30 %，4-8 分鐘 A 為 30 % -60 %，8-13 分鐘 A 為 60 % -90 %，13-14 分鐘A 為 90% -70%，14-15 分鐘 A 為 70% _5%。[7]質(zhì)譜檢測(cè)條件如下質(zhì)譜儀Waters Xevo TQ ;電噴霧離子源，正、負(fù)離子同時(shí)掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，毛細(xì)管電壓3. 20kV，離子源溫度150°C，脫溶劑氣為氮?dú)?，溫度?00°C，干燥氣流速800L/Hr,碰撞氣為気氣,気氣流速為0. 16mL/min。[8]標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)校準(zhǔn)曲線吸取上述步驟[2]的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制成濃度分別為0. lng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL 的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣5 u L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程，所述的100種農(nóng)藥的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3，每個(gè)線性回歸方程都可以做出一條曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線；可由此標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷100種農(nóng)藥的線性范圍，農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線均可由儀器軟件自動(dòng)給出。所述的線性范圍指的是標(biāo)準(zhǔn)曲線為直線的農(nóng)藥的濃度范圍。為消除人參前處理液中化學(xué)成分對(duì)測(cè)定的影響，用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線代替標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。取上述步驟[4]的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程；此線性回歸方程對(duì)應(yīng)的曲線為基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，此曲線可用于定量分析；[9]靈敏度實(shí)驗(yàn)
靈敏度實(shí)驗(yàn)包括儀器的靈敏度和方法的靈敏度，儀器的靈敏度用儀器的檢出限表示，方法的靈敏度用方法的定量限表示。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇的水溶液逐級(jí)稀釋，并分別進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 3的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為儀器檢測(cè)限。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用人參前處理液逐級(jí)稀釋，并進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 10的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為方法定量限。[10]準(zhǔn)確性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取不含農(nóng)藥殘留的人參粉末9份，每份為2. OOg,每3份分別加入濃度為 g/mL的步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 u LUOO u L、20 u L ;按照上述步驟[3]制備人參前處理液，并進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；所述的準(zhǔn)確性用回收率來表示，重復(fù)性用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。表4為人參前處理液中農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限(LOQ)、加樣回收率及精密度(RSD)。實(shí)施例2以金銀花作為花類中藥材的代表。[I]農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備；[2]農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備同實(shí)施例I ;[3]金銀花前處理液的制備①將待檢測(cè)的金銀花飲片粉碎，過9號(hào)篩，得到待檢測(cè)的人參樣品粉末，置干燥器中儲(chǔ)存；②取2. OOg待檢測(cè)的金銀花樣品粉末，加入IOmL超純水，混勻后放置I小時(shí)，加入IOmL乙酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的乙酸乙腈混合液用渦旋振蕩器渦旋提取Imin 向上述提取物中加入4g無水硫酸鎂與Ig氯化鈉的混合物，繼續(xù)渦旋提取Imin ;④在4°C下，3500rpm離心IOmin ;⑤放置至室溫時(shí)取出7mL提取液,加入混合吸附劑凈化，振蕩l_2min, 3500rpm離心IOmin ;⑥移取5mL上清液,用氮?dú)獯蹈?用含甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水質(zhì)量比為3 2，過0.2i!m濾膜，得到金銀花前處理液，待檢測(cè)；所述的混合吸附劑的加入量及組成為1.05g無水硫酸鎂，210mgN-丙級(jí)乙二胺(PSA，70mg石墨化碳(GCB)。[4]基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取檢測(cè)的不含農(nóng)藥殘留的金銀花樣品粉末5份，每份為2. 00g，均用上述的步驟的①至⑤進(jìn)行處理；在所述的⑥，移取5mL上清液，分別加入步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使金銀花處理液中的農(nóng)藥的最終濃度分別為5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg，均用氮?dú)獯蹈?分別用甲酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水體積比為3 2，過0.2 濾膜，得到5份待檢測(cè)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。[5]金銀花前處理液的檢測(cè)將步驟[3]得到的金銀花前處理液用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣體積L，利用超高效液相色譜對(duì)待測(cè)的100種農(nóng)藥進(jìn)行分離后，在電噴霧(ESI)電離源正、負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)金銀花前處理液進(jìn)行測(cè)定。[6]超高效液相色譜的檢測(cè)條件如下超高效液相色譜儀ACQUITYUPLC (Waters，美國(guó))；色譜柱Acquity UPLCBEH C18色譜柱(I. 7u m,2. I X 100mm) (Waters,美國(guó))；流動(dòng)相A為乙腈，B為甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0. I %的水溶液；流速0. 3毫升每分鐘；柱溫35°C ;梯度0分鐘-I分鐘A為5% -10%，、1-4 分鐘 A 為 10 % -30 %，4-8 分鐘 A 為 30 % -60 %，8-13 分鐘 A 為 60 % -90 %，13-14 分鐘A 為 90% -70%，14-15 分鐘 A 為 70% _5%。[7]質(zhì)譜檢測(cè)條件如下質(zhì)譜儀:Waters Xevo TQ ;電噴霧離子源，正、負(fù)離子同時(shí)掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，毛細(xì)管電壓3. 20kV，離子源溫度150°C，脫溶劑氣為氮?dú)?，溫度?00°C，干燥氣流速800L/Hr,碰撞氣為気氣,気氣流速為0. 16mL/min。[8]標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)校準(zhǔn)曲線吸取上述步驟[2]的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制成濃度分別為0. lng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL 的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣5 u L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程，所述的100種農(nóng)藥的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3，每個(gè)線性回歸方程 都可以做出一條曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線；可由此標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷100種農(nóng)藥的線性范圍，農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線均可由儀器軟件自動(dòng)給出。所述的線性范圍指的是標(biāo)準(zhǔn)曲線為直線的農(nóng)藥的濃度范圍。為消除金銀花前處理液中化學(xué)成分對(duì)測(cè)定的影響，用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線代替標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。取上述步驟[4]的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程；此線性回歸方程對(duì)應(yīng)的曲線為基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，此曲線可用于定量分析； [9]靈敏度實(shí)驗(yàn)靈敏度實(shí)驗(yàn)包括儀器的靈敏度和方法的靈敏度，儀器的靈敏度用儀器的檢出限表示，方法的靈敏度用方法的定量限表示。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇的水溶液逐級(jí)稀釋，并分別進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 3的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為儀器檢測(cè)限。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用金銀花前處理液逐級(jí)稀釋，并進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 10的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為方法定量限。[10]準(zhǔn)確性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取不含農(nóng)藥殘留的金銀花粉末9份，每份為2. OOg,每3份分別加入濃度為I U g/mL的步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 u LUOO u L、20 u L ;按照上述步驟[3]制備金銀花前處理液，并進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；所述的準(zhǔn)確性用回收率來表/In 重復(fù)性用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來表不。表5為金銀花前處理液中農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限(LOQ)、加樣回收率及精密度(RSD)。實(shí)施例3以山茱萸作為果實(shí)類中藥材的代表。[I]農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備；[2]農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備同實(shí)施例I。[3]山茱萸前處理液的制備①將待檢測(cè)的山茱萸飲片粉碎，過9號(hào)篩，得到待檢測(cè)的人參樣品粉末，置干燥器中儲(chǔ)存；②取2. OOg待檢測(cè)的山茱萸樣品粉末，加入IOmL超純水，混勻后放置I小時(shí)，加入IOmL乙酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的乙酸乙腈混合液用渦旋振蕩器渦旋提取Imin 向上述提取物中加入4g無水硫酸鎂與Ig氯化鈉的混合物，繼續(xù)渦旋提取Imin ;④在4°C下，3500rpm離心IOmin ;⑤放置至室溫時(shí)取出7mL提取液,加入混合吸附劑凈化，振蕩l_2min, 3500rpm離心IOmin ;⑥移取5mL上清液,用氮?dú)獯蹈?用含甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水質(zhì)量比為3 2，過0.2i!m濾膜，得到山茱萸前處理液，待檢測(cè)；所述的混合吸附劑的加入量及組成為1.05g無水硫酸鎂，210mgN-丙級(jí)乙二胺(PSA，70mg石墨化碳(GCB)。[4]基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取檢測(cè)的不含農(nóng)藥殘留的山茱萸樣品粉末5份，每份為2. OOg,均用上述的步驟的①至⑤進(jìn)行處理；在所述的⑥，移取5mL上清液，分別加入步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使山茱萸處理液中的農(nóng)藥的最終濃度分別為5mg/kg、I Omg/kg、50mg/kg、 100mg/kg、500mg/kg，均用氮?dú)獯蹈?分別用甲酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水體積比為3 2，過0.2pm濾膜，得到5份待檢測(cè)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。[5]山茱萸前處理液的檢測(cè)將步驟[3]得到的山茱萸前處理液用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣體積L，利用超高效液相色譜對(duì)待測(cè)的100種農(nóng)藥進(jìn)行分離后，在電噴霧(ESI)電離源正、負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)山茱萸前處理液進(jìn)行測(cè)定。[6]超高效液相色譜的檢測(cè)條件如下超高效液相色譜儀ACQUITYUPLC (Waters，美國(guó))；色譜柱Acquity UPLCBEH C18色譜柱(I. 7u m,2. I X 100mm) (Waters,美國(guó))；流動(dòng)相A為乙腈，B為甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0. I %的水溶液；流速0. 3毫升每分鐘；柱溫35°C ;梯度0分鐘-I分鐘A為5% -10%，1-4 分鐘 A 為 10% -30%，4-8 分鐘 A 為 30% -60%，8-13 分鐘 A 為 60% -90%，13-14 分鐘A 為 90% -70%, 14-15 分鐘 A 為 70% _5%。[7]質(zhì)譜檢測(cè)條件如下質(zhì)譜儀Waters Xevo TQ ;電噴霧離子源，正、負(fù)離子同時(shí)掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，毛細(xì)管電壓3. 20kV，離子源溫度150°C，脫溶劑氣為氮?dú)?，溫度?00°C，干燥氣流速800L/Hr,碰撞氣為気氣,気氣流速為0. 16mL/min。[8]標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)校準(zhǔn)曲線吸取上述步驟[2]的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制成濃度分別為0. lng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL 的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣5 u L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程，所述的100種農(nóng)藥的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3，每個(gè)線性回歸方程都可以做出一條曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線；可由此標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷100種農(nóng)藥的線性范圍，農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線均可由儀器軟件自動(dòng)給出。所述的線性范圍指的是標(biāo)準(zhǔn)曲線為直線的農(nóng)藥的濃度范圍。為消除山茱萸前處理液中化學(xué)成分對(duì)測(cè)定的影響，用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線代替標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。
取上述步驟[4]的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程；此線性回歸方程對(duì)應(yīng)的曲線為基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，此曲線可用于定量分析；[9]靈敏度實(shí)驗(yàn)靈敏度實(shí)驗(yàn)包括儀器的靈敏度和方法的靈敏度，儀器的靈敏度用儀器的檢出限表示，方法的靈敏度用方法的定量限表示。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇的水溶液逐級(jí)稀釋，并分別進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 3的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為儀器檢測(cè)限。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用山茱萸前處理液逐級(jí)稀釋，并進(jìn)樣分 析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 10的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為方法定量限。[10]準(zhǔn)確性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取不含農(nóng)藥殘留的山茱萸粉末9份，每份為2. 00g，每3份分別加入濃度為I U g/mL的步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 u LUOO u L、20 u L ;按照上述步驟[3]制備金銀花前處理液，并進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；所述的準(zhǔn)確性用回收率來表/In 重復(fù)性用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來表不。表6為山茱萸前處理液中農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限(LOQ)、加樣回收率及精密度(RSD)。實(shí)施例4以桃仁作為種子類中藥材的代表。[I]農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備；[2]農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備同實(shí)施例I。[3]桃仁前處理液的制備①將待檢測(cè)的桃仁飲片粉碎，過9號(hào)篩，得到待檢測(cè)的人參樣品粉末，置干燥器中儲(chǔ)存；②取2. OOg待檢測(cè)的桃仁樣品粉末，加入IOmL超純水，混勻后放置I小時(shí)，加入IOmL乙酸體積分?jǐn)?shù)為0. 1%的乙酸乙腈混合液用渦旋振蕩器渦旋提取Imin !③向上述提取物中加入4g無水硫酸鎂與Ig氯化鈉的混合物,繼續(xù)潤(rùn)旋提取Imin ；④在4°C下，3500rpm離心IOmin ;⑤放置至室溫時(shí)取出7mL提取液,加入混合吸附劑凈化，振蕩l_2min, 3500rpm離心IOmin ;⑥移取5mL上清液,用氮?dú)獯蹈?用含甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水質(zhì)量比為3 2，過0.2 濾膜，得到桃仁前處理液，待檢測(cè)；所述的混合吸附劑的加入量及組成為1.058無水硫酸鎂，210!^ N-丙級(jí)乙二胺(PSA，70mg石墨化碳(GCB)。[4]基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取檢測(cè)的不含農(nóng)藥殘留的桃仁樣品粉末5份，每份為2. 00g，均用上述的步驟[3]的①至⑤進(jìn)行處理；在所述的⑥，移取5mL上清液，分別加入步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使桃仁處理液中的農(nóng)藥的最終濃度分別為5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg，均用氮?dú)獯蹈?，分別用甲酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水體積比為3 2，過0.2 濾膜，得到5份待檢測(cè)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。[5]桃仁前處理液的檢測(cè)將步驟[3]得到的桃仁前處理液用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣體積L，利用超高效液相色譜對(duì)待測(cè)的100種農(nóng)藥進(jìn)行分離后，在電噴霧(ESI)電離源正、負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)桃仁前處理液進(jìn)行測(cè)定。[6]超高效液相色譜的檢測(cè)條件如下超高效液相色譜儀ACQUITYUPLC (Waters，美國(guó))；色譜柱Acquity UPLCBEH C18色譜柱(I. 7u m,2. I X 100mm) (Waters,美國(guó))；流動(dòng)相A為乙腈，B為甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0. I %的水溶液；流速0. 3毫升每分鐘；柱溫35°C ;梯度0分鐘-I分鐘A為5% -10%，1-4 分鐘 A 為 10 % -30 %，4-8 分鐘 A 為 30 % -60 %，8-13 分鐘 A 為 60 % -90 %，13-14 分鐘A 為 90% -70%，14-15 分鐘 A 為 70% _5%。[7]質(zhì)譜檢測(cè)條件如下質(zhì)譜儀Waters Xevo TQ ;電噴霧離子源，正、負(fù)離子同時(shí)掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，
毛細(xì)管電壓3. 20kV，離子源溫度150°C，脫溶劑氣為氮?dú)?，溫度?00°C，干燥氣流速800L/Hr,碰撞氣為気氣,気氣流速為0. 16mL/min。[8]標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)校準(zhǔn)曲線吸取上述步驟[2]的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制成濃度分別為0. lng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL 的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣5 u L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程，所述的100種農(nóng)藥的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3，每個(gè)線性回歸方程都可以做出一條曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線；可由此標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷100種農(nóng)藥的線性范圍，農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線均可由儀器軟件自動(dòng)給出。所述的線性范圍指的是標(biāo)準(zhǔn)曲線為直線的農(nóng)藥的濃度范圍。為消除桃仁前處理液中化學(xué)成分對(duì)測(cè)定的影響，用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線代替標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。取上述步驟[4]的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程；此線性回歸方程對(duì)應(yīng)的曲線為基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，此曲線可用于定量分析；[9]靈敏度實(shí)驗(yàn)靈敏度實(shí)驗(yàn)包括儀器的靈敏度和方法的靈敏度，儀器的靈敏度用儀器的檢出限表示，方法的靈敏度用方法的定量限表示。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇的水溶液逐級(jí)稀釋，并分別進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 3的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為儀器檢測(cè)限。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用桃仁前處理液逐級(jí)稀釋，并進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 10的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為方法定量限。[10]準(zhǔn)確性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取不含農(nóng)藥殘留的桃仁粉末9份，每份為2. OOg,每3份分別加入濃度為I U g/mL的步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 u LUOO u L、20 u L ;按照上述步驟[3]制備桃仁前處理液，并進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；所述的準(zhǔn)確性用回收率來表示，重復(fù)性用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來表不。
表7為桃仁前處理液中農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限(LOQ)、加樣回收率及精密度(RSD)。實(shí)施例5以淡竹葉作為葉和全草類中藥材的代表。[I]農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備；[2]農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備同實(shí)施例I。[3]淡竹葉前處理液的制備①將待檢測(cè)的淡竹葉飲片粉碎，過9號(hào)篩，得到待檢測(cè)的人參樣品粉末，置干燥器中儲(chǔ)存；②取2. OOg待檢測(cè)的淡竹葉樣品粉末，加入IOmL超純水，混勻后放置I小時(shí)，加入IOmL乙酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的乙酸乙腈混合液用渦旋振蕩器渦旋提取Imin 向上述提取物中加入4g無水硫酸鎂與Ig氯化鈉的混合物，繼續(xù)渦旋提取Imin ;④在4°C下，3500rpm離心IOmin ;⑤放置至室溫時(shí)取出7mL提取液,加入混合吸附劑凈化，振蕩l_2min, 3500rpm離心IOmin ;⑥移取5mL上清液,用氮?dú)獯蹈?用含甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水質(zhì)量比為3 2，過0.2i!m濾膜，得到 淡竹葉前處理液，待檢測(cè)；所述的混合吸附劑的加入量及組成為1.05g無水硫酸鎂，210mgN-丙級(jí)乙二胺(PSA，70mg石墨化碳(GCB)。[4]基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取檢測(cè)的不含農(nóng)藥殘留的淡竹葉樣品粉末5份，每份為2. 00g，均用上述的步驟[3]的①至⑤進(jìn)行處理；在所述的⑥，移取5mL上清液，分別加入步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使淡竹葉處理液中的農(nóng)藥的最終濃度分別為5mg/kg、IOmg/kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg，均用氮?dú)獯蹈?分別用甲酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水體積比為3 2，過0.2 濾膜，得到5份待檢測(cè)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。[5]淡竹葉前處理液的檢測(cè)將步驟[3]得到的淡竹葉前處理液用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣體積L，利用超高效液相色譜對(duì)待測(cè)的100種農(nóng)藥進(jìn)行分離后，在電噴霧(ESI)電離源正、負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)淡竹葉前處理液進(jìn)行測(cè)定。[6]超高效液相色譜的檢測(cè)條件如下超高效液相色譜儀ACQUITYUPLC (Waters，美國(guó))；色譜柱Acquity UPLCBEH C18色譜柱(I. 7u m,2. I X 100mm) (Waters,美國(guó))；流動(dòng)相A為乙腈，B為甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0. I %的水溶液；流速0. 3毫升每分鐘；柱溫35°C ;梯度0分鐘-I分鐘A為5% -10%，1-4 分鐘 A 為 10 % -30 %，4-8 分鐘 A 為 30 % -60 %，8-13 分鐘 A 為 60 % -90 %，13-14 分鐘A 為 90% -70%，14-15 分鐘 A 為 70% _5%。[7]質(zhì)譜檢測(cè)條件如下質(zhì)譜儀:Waters Xevo TQ ;電噴霧離子源，正、負(fù)離子同時(shí)掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，毛細(xì)管電壓3. 20kV，離子源溫度150°C，脫溶劑氣為氮?dú)?，溫度?00°C，干燥氣流速800L/Hr,碰撞氣為気氣,気氣流速為0. 16mL/min。[8]標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)校準(zhǔn)曲線吸取上述步驟[2]的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制成濃度分別為0. lng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL 的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣5 u L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程，所述的100種農(nóng)藥的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3，每個(gè)線性回歸方程都可以做出一條曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線；可由此標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷100種農(nóng)藥的線性范圍，農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線均可由儀器軟件自動(dòng)給出。所述的線性范圍指的是標(biāo)準(zhǔn)曲線為直線的農(nóng)藥的濃度范圍。為消除淡竹葉前處理液中化學(xué)成分對(duì)測(cè)定的影響，用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線代替標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。取上述步驟[4]的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程；此線性回歸方程對(duì)應(yīng)的曲線為基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，此曲線可用于定量分析；[9]靈敏度實(shí)驗(yàn)
靈敏度實(shí)驗(yàn)包括儀器的靈敏度和方法的靈敏度，儀器的靈敏度用儀器的檢出限表示，方法的靈敏度用方法的定量限表示。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇的水溶液逐級(jí)稀釋，并分別進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 3的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為儀器檢測(cè)限。將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用淡竹葉前處理液逐級(jí)稀釋，并進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 10的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為方法定量限。[10]準(zhǔn)確性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取不含農(nóng)藥殘留的淡竹葉粉末9份，每份為2. OOg,每3份分別加入濃度為I U g/mL的步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 u LUOO u L、20 u L ;按照上述步驟[3]制備淡竹葉前處理液，并進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；所述的準(zhǔn)確性用回收率來表/In 重復(fù)性用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來表不。表8為淡竹葉前處理液中農(nóng)藥的基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限(LOQ)、加樣回收率及精密度(RSD)。表I
權(quán)利要求
1. 一種超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定中藥中100種農(nóng)藥殘留的方法，其特征在于步驟如下[I]農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備分別稱取100種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各IOmg置于IOmL容量瓶中，選擇乙腈、甲醇或丙酮分別溶解農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品并定容至刻度，使100種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的濃度均為IOOOii g/mL，農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液-18°C保存；[2]農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備將上述100種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別取出，然后混合到一起，用乙腈定容，按照表3中的每種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品在農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的濃度數(shù)值制備農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液；[3]中藥材前處理液的制備①將待檢測(cè)的中藥材飲片粉碎，過9號(hào)篩，得到待檢測(cè)的中藥材樣品粉末，置干燥器中儲(chǔ)存；②取2. OOg待檢測(cè)的中藥材樣品粉末，加入IOmL超純水，混勻后放置I小時(shí)，加入IOmL乙酸體積分?jǐn)?shù)為0. 1%的乙酸乙腈混合液用渦旋振蕩器渦旋提取Imin 向上述提取物中加入4g無水硫酸鎂與Ig氯化鈉的混合物，繼續(xù)渦旋提取Imin通在4°C下，3500rpm離心IOmin ;⑤放置至室溫時(shí)取出7mL提取液,加入混合吸附劑凈化，振蕩l_2min, 3500rpm離心IOmin ;⑥移取5mL上清液,用氮?dú)獯蹈?用含甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水質(zhì)量比為3 2，過0.2iim濾 膜，得到中藥材前處理液，待檢測(cè)；所述的混合吸附劑的加入量及組成為1.05g無水硫酸鎂，210mg N-丙級(jí)乙二胺(PSA)，70mg石墨化碳(GCB) ； [4]基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取檢測(cè)的不含農(nóng)藥殘留的中藥材樣品粉末5份，每份為2.00g，均用上述的步驟[3]的①至⑤進(jìn)行處理；在所述的⑥，移取5mL上清液，分別加入步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使得到的溶液中的農(nóng)藥的最終濃度分別為5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg,均用氮?dú)獯蹈桑謩e用甲酸體積分?jǐn)?shù)為0. I %的甲醇和水混合溶液定容至lmL，甲醇和水體積比為3 2，過0. 2 ii m濾膜，得到5份待檢測(cè)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；[5]中藥材前處理液的檢測(cè)將步驟[3]得到的中藥材前處理液用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣體積5yL，利用超高效液相色譜對(duì)待測(cè)的100種農(nóng)藥進(jìn)行分離后，在電噴霧(ESI)電離源正、負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)中藥材前處理液進(jìn)行測(cè)定；[6]超高效液相色譜的檢測(cè)條件如下超高效液相色譜儀ACQUITY UPLC (Waters，美國(guó))；色譜柱Acquity UPLC BEH C18 色譜柱(1.7iim，·2.I X 100mm) (Waters，美國(guó));流動(dòng)相A為乙腈，B為甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0. I %的水溶液；流速0. 3毫升每分鐘；柱溫35°C ;梯度0分鐘-I分鐘A為5 % -10 %，1-4分鐘A為·10 % -30 %，4-8 分鐘 A 為 30 % -60 %，8-13 分鐘 A 為 60 % -90 %，13-14 分鐘 A 為 90 % -70 %，·14-15分鐘A為70% -5% ；[7]質(zhì)譜檢測(cè)條件如下質(zhì)譜儀:Waters Xevo TQ ;電噴霧離子源，正、負(fù)離子同時(shí)掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，毛細(xì)管電壓3. 20kV,離子源溫度150°C，脫溶劑氣為氮?dú)?，溫度?00°C，干燥氣流速800L/Hr，碰撞氣為氬氣，氬氣流速為0. 16mL/min ；[8]標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)校準(zhǔn)曲線吸取上述步驟[2]的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制成濃度分別為·0.lng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL 的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣5 u L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，可得到100種農(nóng)藥的線性回歸方程，每個(gè)線性回歸方程都可以做出一條曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線；由此標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷100種農(nóng)藥的線性范圍，農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線均由儀器軟件自動(dòng)給出；所述的線性范圍指的是標(biāo)準(zhǔn)曲線為直線的農(nóng)藥的濃度范圍；為消除中藥材前處理液中化學(xué)成分對(duì)測(cè)定的影響，用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線代替標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析；取上述步驟[4]的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣5 u L，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，記錄各待測(cè)組分MRM色譜峰面積，以各成份的濃度為橫坐標(biāo)X，各成份的峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸分析，得到·100種農(nóng)藥的線性回歸方程；此線性回歸方程對(duì)應(yīng)的曲線為基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，此曲線可用于定量分析[9]靈敏度實(shí)驗(yàn)靈敏度實(shí)驗(yàn)包括儀器的靈敏度和方法的靈敏度，儀器的靈敏度用儀器的檢出限表示，方法的靈敏度用方法的定量限表示；將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用體積分?jǐn)?shù)為60%甲醇的水溶液逐級(jí)稀釋，并分別進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比^ 3的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為儀器檢測(cè)限；將步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用中藥材前處理液逐級(jí)稀釋，并進(jìn)樣分析，測(cè)定信噪比，取信噪比> 10的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最小濃度作為方法定量限；[10]準(zhǔn)確性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取不含農(nóng)藥殘留的中藥材粉末9份，每份為2. OOg,每3份分別加入濃度為I U g/mL的步驟[2]制備的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 u LUOO u L、20 u L ;按照上述步驟[3]制備中藥材前處理液，并進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；所述的準(zhǔn)確性用回收率來表示，重復(fù)性用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來表/Jn o
全文摘要
本發(fā)明提供了一種超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定中藥中100種農(nóng)藥殘留的方法。中藥材粉末用超純水浸泡，用含0.1％乙酸的乙腈勻漿法提取，N-丙級(jí)乙二胺和石墨化碳固相分散凈化，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在分時(shí)段多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下檢測(cè)，外標(biāo)曲線法定量。88％的農(nóng)藥在5-500ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系好，相關(guān)系數(shù)在0.99以上，98％的農(nóng)藥相關(guān)系數(shù)在0.97以上；農(nóng)藥在低濃度為10μg/kg、中濃度為50μg/kg、高濃度為100μg/kg的回收率平均值在70％-130％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.15；檢出限≤0.01mg/kg，完全滿足常規(guī)檢測(cè)要求。該方法通用性強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102735784SQ201110089408
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者劉志強(qiáng), 劉淑瑩, 宋鳳瑞, 邢俊鵬, 鄭重, 陳麗娜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所