專利名稱：8-氧代脫氧鳥苷的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種8-氧代脫氧鳥苷的 檢測方法。
背景技術(shù)：
機(jī)體在細(xì)胞中的線粒體、微粒體、質(zhì)膜和胞質(zhì)中的酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)在代謝過程中，可以產(chǎn)生活性氧自由基。同時機(jī)體在受到外源化學(xué)物質(zhì)和電離輻射等條件下也可能產(chǎn)生活性氧自由基。所述活性氧自由基可以與DNA的堿基形成加合物如脫氧鳥苷，所述脫氧鳥苷加合物在羥化酶的作用下，形成羥基脫氧核苷，其中8-氧代脫氧鳥苷(8-oxo-dG)是羥基脫氧核苷羥中的主要一種，全名為8-羥基-2、-脫氧鳥苷(8-oxo-dG)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。8-oxo-dG可直接引起基因突變和癌基因表達(dá)。如Kuchino等報道8_羥基脫氧鳥嘌呤具有同任何堿基配對的能力。脫氧鳥嘌呤的C8被羥基化后，脫氧鳥嘌呤同胞嘧啶特異性配對的能力喪失，導(dǎo)致DNA復(fù)制時堿基的錯配，從而出現(xiàn)多種基因突變的形式。Wood等曾證實在大腸桿菌中，8-氧代脫氧鳥苷具有誘導(dǎo)G — T置換的能力。Cheng等也報道8_氧代脫氧鳥苷可以引起G —T和A —C置換。8-氧代脫氧鳥苷可以引起突變，ras基因激活的主要原因為點突變。Kamiya等M證實用人工合成的第12位密碼子堿基G置換的原癌基因 c-Ha-ras轉(zhuǎn)染NTS3T3細(xì)胞，可使部分細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。在已知的大約20種DNA的加合物中，8-oxo-dG易于檢出，且8-oxo-dG與基因突變明顯相關(guān)，8-oxo-dG已成為研究最多的 DNA堿基氧化損傷修復(fù)產(chǎn)物，成為研究DNA損傷修復(fù)最常用的生物學(xué)標(biāo)志物(Biomarker)。8-oxo-dG作為內(nèi)源性或外源性因素對DNA氧化損傷作用的生物標(biāo)志物，是一種極有前景的生物標(biāo)志，通過8-oxo-dG的檢測可以評估體內(nèi)氧化損傷和修復(fù)的程度。氧化應(yīng)激與DNA損傷的相互關(guān)系，對研究退行性疾病、衰老機(jī)制、癌發(fā)生機(jī)制、環(huán)境毒物與氧化應(yīng)激的關(guān)系等具有重要意義，也可以用來評價抗氧化劑治療DNA氧化損傷的效果。目前8-oxo-dG的檢測方法主要有32P后標(biāo)記法、免疫熒光組織化學(xué)檢測法、酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA)法、高效液相色譜-電化學(xué)法、氣質(zhì)聯(lián)用分析法和高效毛細(xì)管電泳等。32P后標(biāo)記法，32P后標(biāo)記技術(shù)是20世紀(jì)90年代后發(fā)展起來的，具有靈敏度高、樣品用量少、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。其操作過程包括DNA的消化、標(biāo)記、層析分離、放射自顯影。 但該方法的特異性有待提高，且容易造成放射性污染。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法，應(yīng)用單克隆抗體的ELISA法具有很高的靈敏度和很好的重復(fù)性?？?-oxo-dG多克隆抗體的發(fā)展和單克隆抗體的使用為免疫親和柱的發(fā)展提供了條件，可以用于分析生物樣品，尤其是尿中DNA和RNA的氧化損傷產(chǎn)物。該方法法不用對 DNA進(jìn)行分解處理，不需使用昂貴的儀器，測定時間短，樣本預(yù)處理程序簡單，是一種很有應(yīng)用價值的方法。高效液相色譜-電化學(xué)檢測器分析(HPLC-EOT)法，是將DNA的酶水解樣品通過 HPLC分離后，使用E⑶進(jìn)行測定。該方法是Floyd等提出的一種定量測定8-0X0-dG的有效方法。HPLC-ECD在檢測8-oxo-dG中得到廣泛應(yīng)用，具有較高的靈敏度，其最低檢測限大約為1/50核苷，所需樣品量少，對機(jī)體不會產(chǎn)生損傷性、且選擇性好，對組織細(xì)胞DNA及尿中 8-oxo-dG均可檢測，是目前應(yīng)用廣泛、較為成熟的方法。氣質(zhì)聯(lián)用分析法(GC-MQ，是一種將氣相色譜儀與質(zhì)譜儀聯(lián)合使用檢測方法，可為 DNA損傷中的氧化產(chǎn)物的鑒定提供可靠而明確的數(shù)據(jù)，其檢測下限為1/50核苷。然而由于質(zhì)譜儀價格昂貴，無法廣泛應(yīng)用于實驗室的檢測。同時DNA堿基必須首先進(jìn)行衍生化反應(yīng)， 這一過程容易導(dǎo)致副產(chǎn)物的形成，從而容易產(chǎn)生假陽性的顯示結(jié)果。高效毛細(xì)管電泳(HPCE)是利用8-oxo-dG與其他脫氧鳥苷在電場中泳動方向和速率的不同而進(jìn)行分離，應(yīng)用保留時間而進(jìn)行定性，通過外標(biāo)法來進(jìn)行定量。其優(yōu)點是進(jìn)樣量小、分離效率高、保留時間短，比HPLC分離更為迅速，使用紫外檢測器靈敏度較低，應(yīng)用電化學(xué)檢測器則大大提高靈敏度。上述的多種檢測方法中，都存在某些缺陷，如利用效液相色譜-電化學(xué)法檢測的過程中，存在酶解不完全、生存副產(chǎn)物、放射性污染、檢測周期長，且檢測成本高，只能局限于很小范圍的臨床應(yīng)用。ELISA免疫學(xué)方法相比HPLC法存在交叉反應(yīng)使測定結(jié)果偏高。從現(xiàn)有的上述檢測方法可知，將8-0X0-dG與其他干擾物質(zhì)分離，檢測儀器對 8-oxo-dG的特異性響應(yīng)的靈敏度還有待提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種8-氧代脫氧鳥苷的檢測方法，避免免疫檢測的非特異性交叉，簡化檢測步驟。本發(fā)明提出一種8-氧代脫氧鳥苷的檢測方法，包括步驟將含8-oxo-dG的待測物加入到固相載體中；向固相載體中加入抗8-oxo-dG抗體，使8-oxo-dG與抗8-oxo-dG抗體反應(yīng)形成特異性結(jié)合物；向固相載體中加入抗鼠IgG-HRP多聚物，使抗鼠IgG-HRP多聚物與所述特異性結(jié)合物反應(yīng)形成8-oxo-dG、抗8-oxo-dG抗體和抗鼠IgG-HRP多聚物的三元復(fù)合物；向固相載體中加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，所述ECL化學(xué)發(fā)光底物在所述三元復(fù)合物的作用下發(fā)光；檢測ECL化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度計算待測物中8-oxo-dG的含量。優(yōu)選地，所述8-氧代脫氧鳥苷的檢測方法，所述固相載體為DE81膜。本發(fā)明提供的8-氧代脫氧鳥苷的檢測方法，相對現(xiàn)有檢測方法，其回收率高、檢測限低、交叉反應(yīng)低、操作簡單，檢測時間短(不超過3. 5小時)、無需對樣本進(jìn)行復(fù)雜的前期處理，以及無需采用貴重儀器，檢測成本低。


圖1是8-羥基-2、-脫氧鳥苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；圖2是本發(fā)明的8-oxo-dG含量檢測原理示意圖；圖3是本發(fā)明根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣本濃度及其對應(yīng)的灰度值，擬合而成的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明。參見圖2，本發(fā)明檢測8-oxo-dG的原理如下將8-oxo-dG與抗8-0X0_dG抗體反應(yīng)形成特異性結(jié)合物；向特異性結(jié)合物加入抗鼠-HR多聚物，使抗鼠-HR多聚物與所述特異性結(jié)合物反應(yīng)形成8-oxo-dG、抗8-oxo-dG抗體和抗鼠-HR多聚物的三元復(fù)合物；然后向三元復(fù)合物中加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，所述ECL化學(xué)發(fā)光底物在所述三元復(fù)合物的作用下發(fā)光；然后檢測ECL化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度計算待測物中8-oxo-dG的含量。實施例1 :8-oxo-dG含量的檢測

本發(fā)明采用上述檢測方法檢測待測物中8-oxo-dG的含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測量結(jié)果做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測物中8-oxo-dG的含量。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線需用到8-oxo-dG標(biāo)準(zhǔn)樣本濃度包括20ng/ml、10ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0. 5ng/ml 共 6 個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。該6各不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本是通過PBS緩沖液(磷酸二氫鈉0. 01M/L,NaCl 0. 15M/L， PH 7. 4)對8-oxo-dG標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成的。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測待測物中8-oxo-dG含量，以及分析特異性的具體過程如下Si、將內(nèi)含DE81膜的模板平放在干凈濾紙上，將濃度為0ng/ml、0. 5ng/mlUng/ ml、2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)液依次點樣 DE81 膜中編號為 Al、A2、A3、A4、 八54647孔內(nèi)，每孔點樣3111。將濃度為15ng/ml的待檢樣本點樣到DE81膜中編號為A8、 A9孔內(nèi)，每個孔點樣3μ1 ；濃度為1.5ng/ml的待檢樣本點樣到AlO和All孔內(nèi)，每個孔點樣 3 μ 1。將濃度為lOng/ml的dG干擾樣本點樣到編號為A12和A13孔內(nèi)，每個孔點樣3 μ 1。 將PBS緩沖液點樣到編號為Α14至Α23孔內(nèi)，每個孔內(nèi)點樣3μ 1。將4ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)樣本點樣的編號為A24孔內(nèi)，點樣3μ1。S2、將所述模板置于室溫下30 60分鐘使DE81膜干透至自然翹起。S3、打開模板將DE81膜放入反應(yīng)盒內(nèi)，用去離子水振搖洗膜2次，每次1分鐘，倒掉洗滌后的去離子水，然后加入封閉液(1%BSA，用PBS稀釋，BSA要求使用片段5，純度 95%以上)，將反應(yīng)盒置于37°C的恒溫箱內(nèi)振搖封閉20分鐘。S4、倒掉封閉液，加入通過PBS稀釋的抗8-oxo-dG抗體，并將反應(yīng)盒置于37°C的恒溫箱內(nèi)振搖孵育60分鐘。S5、倒掉多余的抗8-oxo-dG抗體液，并用洗滌液(PBS，0. 1 % Tween-20)振搖洗滌 3次，每次洗滌5分鐘。S6、加入通過PBS稀釋的抗鼠IgG-HRP聚合物，并將反應(yīng)盒置于37°C的恒溫箱內(nèi)振搖孵育10分鐘。S7、用洗滌液(PBS，0. 1 % Tween-20)振搖洗滌3次，每次洗滌5分鐘。加入ECL底物液液，反應(yīng)盒中的DE81膜過膜浸濕，開始計時，精確反應(yīng)1分鐘后，用吸水紙將DE81膜吸干，然后將DE81膜放入壓膜透明膠片內(nèi)，擠干剩余的溶液。S8、6分鐘后將DE81膜放入化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像分析儀內(nèi)拍攝并分析，得到相應(yīng)的
灰度值。編號為Al至A24孔內(nèi)對應(yīng)樣品的灰度值。ECL試劑從反應(yīng)開始6分鐘后達(dá)到峰值，此時拍攝獲取的灰度值比較準(zhǔn)確。
其中，7個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本對應(yīng)的灰度值如下表1。表 權(quán)利要求
1.一種8-氧代脫氧鳥苷的檢測方法，包括步驟 將含8-oxo-dG的待測物加入到固相載體中；向固相載體中加入抗8-oxo-dG抗體，使8-oxo-dG與抗8-oxo-dG抗體反應(yīng)形成特異性結(jié)合物；向固相載體中加入抗鼠IgG-HRP多聚物，使抗鼠IgG-HRP多聚物與所述特異性結(jié)合物反應(yīng)形成8-oxo-dG、抗8-oxo-dG抗體和抗鼠IgG-HRP多聚物的三元復(fù)合物；向固相載體中加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，所述ECL化學(xué)發(fā)光底物在所述三元復(fù)合物的作用下發(fā)光；檢測ECL化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度計算待測物中8-oxo-dG的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的8-氧代脫氧鳥苷的檢測方法，其特征在于，所述固相載體為 DE81 膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了8-氧代脫氧鳥苷的檢測方法，包括將含8-oxo-dG待測物加入到固相載體；加入抗8-oxo-dG抗體，使8-oxo-dG與抗8-oxo-dG抗體反應(yīng)形成特異性結(jié)合物；加入抗鼠IgG-HRP多聚物，使抗鼠IgG-HRP多聚物與特異性結(jié)合物反應(yīng)形成8-oxo-dG、抗8-oxo-dG抗體和抗鼠IgG-HRP多聚物的三元復(fù)合物；加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，ECL化學(xué)發(fā)光底物在三元復(fù)合物作用下發(fā)光；檢測ECL化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度計算待測物中8-oxo-dG的含量。本發(fā)明的方法，回收率高、檢測限低、交叉反應(yīng)低、操作簡單，檢測時間短、無需復(fù)雜的前期處理和采用貴重儀器，檢測成本低。
文檔編號G01N33/53GK102169118SQ201110095478
公開日2011年8月31日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者周際, 施艾馬克.華科奧斯特, 李 遠(yuǎn) 申請人:華瑞同康生物技術(shù)(深圳)有限公司