專利名稱：一種腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)、食品安全領(lǐng)域，具體地說，是一種腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，尤其涉及螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰樂菌素、紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素等七種獸藥殘留量的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法。
背景技術(shù)：
大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(macrolide antibiotics，MALs)是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗菌作用相近的堿性抗生素群，屬于中譜抗生素，廣泛用于畜禽細(xì)菌性和支原體感染的化學(xué)治療， 同時也是重要的生長促進(jìn)劑，在動物藥品和飼料添加物中占有重要位置。然而當(dāng)過量或不當(dāng)使用此類抗生素時，會造成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及其代謝產(chǎn)物的殘留，并通過食物鏈進(jìn)入人體，在體內(nèi)器官積累到一定程度，可造成前廳和耳蝸神經(jīng)損傷，導(dǎo)致眩暈和聽力下降，嚴(yán)重者可造成肝腎損傷，高殘留對敏感人群會產(chǎn)生致敏性和毒性反應(yīng)。長期接觸會改變?nèi)梭w腸道菌群的微生態(tài)環(huán)境，造成腸道菌群失調(diào)，同時易產(chǎn)生細(xì)菌抗藥性。
MALs在動物性食品中的殘留檢測和監(jiān)控與其他獸藥一樣已受到許多國家的高度重視，目前歐盟、日本、澳大利亞及我國等國家均對MALs提出了限量要求。將對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害。
目前，大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的檢測方法主要有微生物法、免疫分析法(ELISA)、薄層色譜法(TLC)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC/MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC/MS)、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等。微生物法選擇性低，特異性不高，且僅檢測單一藥物的殘留。免疫分析法(ELISA)，特別是近來發(fā)展的放射受體分析法(Charm II法)，涉及的樣品前處理簡單、快速、特異性好，但難以實現(xiàn)多殘留分析。薄層色譜法檢測靈敏度較低，不適合食品中MALs殘留的微量分析。高效液相譜法測定低限不能滿足當(dāng)前國內(nèi)外對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留分析的要求，難以應(yīng)用。近年來，液質(zhì)聯(lián)用法檢測大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的研究比較活躍。夏曦等采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測豬肉中四種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留量；謝麗琪等采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定牛奶中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量；謝文等采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測蜂王漿產(chǎn)品中5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量；陳瑩等采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定了鰻魚中大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和磺胺類獸藥殘留量。但腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量檢測方法未見報道。本發(fā)明旨在利用LC-MS/MS檢測技術(shù)，建立一種可同時檢測腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有不足問題，提供一種液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量的檢測方法?？煞奖?、準(zhǔn)確、高效地同時檢測腸衣中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰樂菌素、紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素等七種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量。
本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是一種腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，包括以下步驟
1、樣品提取
稱取5 g均勻腸衣樣品置于50 mL具塞離心管中，加25 mL提取溶劑，渦旋，于4000 r/ min離心3 min，將提取液收集于50mL容量瓶中，再加20 mL提取溶劑，重復(fù)上述操作，合并提取液，加提取溶劑定容至50 mL。精密量取10 mL提取液于20mL離心管中，在45°C以下水浴減壓濃縮至近干，用10 mL緩沖溶液分次溶解殘渣。
2、固相萃取柱凈化
將提取液轉(zhuǎn)移過固相萃取柱，棄去流出液，用5 mL水和5 mL淋洗溶液依次洗滌離心管，洗滌液過Cw柱，棄去流出液，負(fù)壓抽干，用6 mL甲醇洗脫。收集全部洗脫液，在45°C 以下水浴減壓濃縮至近干，加2 mL樣液溶解稀釋液溶解，混勻，過0.22 Mm針筒濾膜，進(jìn)行 LC-MS/MS 分析。
3、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定
按照色譜條件測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)譜分離采用在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，再對其子離子進(jìn)行全掃描。通過被測樣品的質(zhì)譜和相關(guān)信息，得到其定性和定量結(jié)果。 定性時應(yīng)當(dāng)與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對豐度一致，相對豐度允許偏差不超過規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的被測物。定量測定時采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。
作為優(yōu)選，步驟1中所述提取溶劑為甲醇或乙腈。
作為優(yōu)選，步驟1中所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液，配置方法為溶解13. 8 g磷酸二氫鈉于950 mL水中，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值到8. 0，最后用水稀釋至1。
作為優(yōu)選，在步驟2中所述固相萃取柱為C18凈化柱(500 mg/6 mL，或相當(dāng)者)或HLB 凈化柱(Oasis，500 mg/6 mL，或相當(dāng)者)。C18凈化柱和HLB凈化柱使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水預(yù)淋洗。
作為優(yōu)選，在步驟2中所述淋洗溶液為甲醇一水混合溶液(2+8，V/V).
作為優(yōu)選，在步驟2中所述樣液溶解稀釋液為甲醇一水混合溶液(1+1，V/V).
作為優(yōu)選，在步驟3中所述色譜分析條件為
液相色譜條件
a)色譜柱ZORBAXEclipse C8 柱，150mmX4. 6 mm(i. d) , 5ym ；
b)流動相Α:乙腈，流動相B:0. 15%甲酸水溶液，梯度洗脫。
c)流速:400μ L/min ；
d)進(jìn)樣量:20yL.
串聯(lián)質(zhì)譜條件
a)離子源電噴霧離子源；
b)掃描方式正離子掃描；
c)檢測方式多反應(yīng)監(jiān)測；
d)電噴霧電壓(IS):4800 V ；
e)霧化氣壓力(GSl):42 psi ；
f)氣簾氣壓力(CUR):25 psi ；
g)輔助氣流速(GS2):45psi ；
h)離子源溫度(TEM):5400C ；i)碰撞氣(CAD) :6 psi ；
j)分別設(shè)定母離子、子離子、去簇電壓(DP)、碰撞室入口電壓(EP)、碰撞室出口電壓 (CXP)、碰撞氣能量(CE)。
作為優(yōu)選，在步驟3中所述標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置方法為配置單個標(biāo)準(zhǔn)儲備液時選用甲醇為溶劑，配置混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液時選用空白樣品溶液稀釋或定容。 作為優(yōu)選，所述梯度洗脫程序為 0 3. 5分鐘，流動相A30 70%，流動相B70 30% ； 3. 5 8分鐘，流動相A70%,流動相B30% ； 8 10分鐘，流動相A70 30%，流動相B30 70% ； 10 16分鐘，流動相A30%，流動相B70%。
進(jìn)一步地，所述大環(huán)內(nèi)酯類獸藥包括螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰樂菌素、紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素等七種獸藥至少一種。
由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果在于
1、建立了腸衣中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰樂菌素、紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素等七種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測方法。實現(xiàn)了對七種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的同時檢測。
2、提取液采用C18或HLB固相萃取凈化柱，通過對固相萃取柱凈化條件的優(yōu)化，具有較好的凈化效果，并保證七種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥都有較高的回收率。
3、利用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜多反應(yīng)模式(MRM)檢測，具有抗干擾能力強的特點。
4、與以往的方法比較，具有簡單、快速、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點，七種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥檢測低限均為20 μ g/kg。平均回收率為螺旋霉素71. 4 78. 8、替米考星75. 7 85. 6、竹桃霉素81. 1 85. 8、泰樂菌素78. 9 83. 0、紅霉素87. 1 89. 6、羅紅霉素83. 7 85. 4、交沙霉素75. 6 81. 8。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為螺旋霉素7. 7 11. 1、替米考星8. 0 15. 7、竹桃霉素10. 5 16. 4、泰樂菌素8. 1 12. 5、紅霉素10. 5 12. 4、羅紅霉素10. 6 14. 4、交沙霉素7. 8 18. 0。方法的檢測低限滿足國內(nèi)外相關(guān)法規(guī)的要求，精密度、回收率等技術(shù)指標(biāo)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。


圖1空白腸衣樣品添加七種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μ g/kg)提取離子流圖；圖中保留時間(min):螺旋霉素(spiramycin)9. 26，替米考星(tilmicosin)9. 63,竹桃霉素(Ieandomycin) 10. 01,泰樂菌素(tylosin) 10. 17,紅霉素(erythromycin) 10. 11,羅 HUM (roxithromycin) 10. 59,(josamycin) 11· 04。
圖2螺旋霉素子離子全掃描質(zhì)譜圖； 圖3替米考星子離子全掃描質(zhì)譜圖； 圖4竹桃霉素子離子全掃描質(zhì)譜圖； 圖5泰樂菌素子離子全掃描質(zhì)譜圖； 圖6紅霉素子離子全掃描質(zhì)譜圖； 圖7羅紅霉素子離子全掃描質(zhì)譜圖； 圖8交沙霉素子離子全掃描質(zhì)譜圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不局限于具體實施例。
實施例1腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法
1、樣品提取
(1)甲醇提取方法稱取5g均勻試樣置于50 mL具塞離心管中，加25 mL甲醇，渦旋， 于4000 r/min離心3 min，將上層甲醇提取液收集于50mL容量瓶中，再加20 mL甲醇，重復(fù)上述操作，合并甲醇提取液，加甲醇定容至50 mL。精密量取10 mL甲醇提取液于20mL離心管中，在45°C以下水浴減壓濃縮至近干，用10 mL磷酸鹽緩沖溶液分次溶解殘渣。
(2)乙腈提取方法稱取5g均勻試樣置于50 mL具塞離心管中，加25 mL乙腈，渦旋， 于4000 r/min離心3 min，將上層乙腈提取液收集于50mL容量瓶中，再加20 mL乙腈，重復(fù)上述操作，合并乙腈提取液，加乙腈定容至50 mL。精密量取10 mL乙腈提取液于20mL離心管中，在45°C以下水浴減壓濃縮至近干，用10 mL磷酸鹽緩沖溶液分次溶解殘渣。
2、固相萃取柱凈化法
(1)C18固相萃取柱凈化C18小柱(500mg/6 mL，或相當(dāng)者)依次用5 mL甲醇、5 mL水預(yù)淋洗。將提取液轉(zhuǎn)移過C18凈化柱，棄去流出液，用5 mL水和5 mL甲醇一水(2+8，K/T) 依次洗滌離心管，洗滌液過Cw柱，棄去流出液，負(fù)壓抽干，用6 mL甲醇洗脫。收集全部洗脫液，在45°C以下水浴減壓濃縮至近干，加2 mL甲醇一水(1+1，V/V)溶解，混勻，過0. 22 Mm 針筒濾膜，進(jìn)行LC-MS/MS分析。
(2)HLB固相萃取柱凈化法=Oasis(HLB)小柱(500mg/6 mL，或相當(dāng)者)依次用5 mL甲醇、5 mL水預(yù)淋洗。將提取液轉(zhuǎn)移過HLB凈化柱，棄去流出液，用5 mL水和5 mL甲醇一水 (2+8，K/K)依次洗滌離心管，洗滌液過HLB柱，棄去流出液，負(fù)壓抽干，用6 mL甲醇洗脫。收集全部洗脫液，在45°C以下水浴減壓濃縮至近干，加2 mL甲醇一水(1+1，V/V)溶解，混勻， 過0.22 Mm針筒濾膜，進(jìn)行LC-MS/MS分析。
4、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定
按照液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜條件測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，質(zhì)譜分離采用在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，再對其子離子進(jìn)行全掃描。通過被測樣品的質(zhì)譜和相關(guān)信息，得到其定性和定量結(jié)果。定性時應(yīng)當(dāng)與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對豐度一致，相對豐度允許偏差不超過規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的被測物。定量測定時采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。
液相色譜條件
e)色譜柱ZORBAXEclipse C8 柱，150mmX4. 6 mm(i. d) , 5ym ；
f)流動相乙腈-0.15 %甲酸水溶液，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1 ；
g)流速400μ L/min ；
h)進(jìn)樣量:20yL.
表1流動相梯度洗脫程序
權(quán)利要求
1.一種腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，其特征在于該方法包括以下的步驟(1)樣品提取稱取5 g腸衣樣品置于50 mL具塞離心管中，加25 mL提取溶劑，渦旋，于4000 r/min 離心3 min，將提取液收集于50mL容量瓶中，再加20 mL提取溶劑，重復(fù)上述操作，合并提取液，加提取溶劑定容至50 mL，精密量取10 mL提取液于20mL離心管中，在45°C以下水浴減壓濃縮至近干，用10 mL緩沖溶液分次溶解殘渣；(2)固相萃取柱凈化將提取液轉(zhuǎn)移過固相萃取柱，棄去流出液，用5 mL水和5 mL淋洗溶液依次洗滌離心管，洗滌液過C18柱，棄去流出液，負(fù)壓抽干，用6 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，在45°C以下水浴減壓濃縮至近干，加2 mL樣液溶解稀釋液溶解，混勻，過0.22 Mm針筒濾膜，進(jìn)行 LC-MS/MS 分析；(3)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定按照色譜條件測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)譜分離采用在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，再對其子離子進(jìn)行全掃描，通過被測樣品的質(zhì)譜和相關(guān)信息，得到其定性和定量結(jié)果； 定性時應(yīng)當(dāng)與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對豐度一致，相對豐度允許偏差不超過規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的被測物；定量測定時采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，其特征在于步驟(1)中所述提取溶劑為甲醇或乙腈。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，其特征在于步驟(1)中所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液，配置方法為溶解13. 8 g磷酸二氫鈉于950 mL 水中，用0. 1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值到8. 0，最后用水稀釋至1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述中所述固相萃取柱為C18凈化柱(500 mg/6 mL，或相當(dāng)者)或HLB凈化柱 (Oasis，500 mg/6 mL，或相當(dāng)者);C18凈化柱和HLB凈化柱使用前依次用5 mL甲醇、5 mL 水預(yù)淋洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述淋洗溶液為甲醇一水混合溶液(2+8，V/V)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述樣液溶解稀釋液為甲醇一水混合溶液(1+1，K/T)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，其特征在于步驟(3)中所述色譜分析條件為液相色譜條件色譜柱ZORBAX Eclipse C8 柱，150mmX4.6 mm(i. d) , 5ym ；流動相Α:乙腈，流動相B: 0. 15%甲酸水溶液，梯度洗脫；流速400 μ L/min ；進(jìn)樣量:20yL；串聯(lián)質(zhì)譜條件離子源電噴霧離子源；掃描方式正離子掃描； 檢測方式多反應(yīng)監(jiān)測； 電噴霧電壓(IS) :4800 V ； 霧化氣壓力(GSl) :42 psi ； 氣簾氣壓力(CUR) :25 psi ； 輔助氣流速(GS2) :45 psi ； 離子源溫度(TEM) :540 V ； 碰撞氣(CAD) :6 psi ；分別設(shè)定母離子、子離子、去簇電壓(DP)、碰撞室入口電壓(EP)、碰撞室出口電壓 (CXP)、碰撞氣能量(CE)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，其特征在于步驟(3)中所述標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置方法為配置單個標(biāo)準(zhǔn)儲備液時選用甲醇為溶劑，配置混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液時選用空白樣品溶液稀釋或定容。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，其特征在于所述梯度洗脫程序為0 3. 5分鐘，流動相A30 70%，流動相B70 30% ； 3. 5 8分鐘，流動相A70%,流動相B30% ； 8 10分鐘，流動相A70 30%，流動相B30 70% ； 10 16分鐘，流動相A30%，流動相B70%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一所述的腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，其特征在于所述所述大環(huán)內(nèi)酯類獸藥包括螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰樂菌素、紅霉素、 羅紅霉素、交沙霉素等七種獸藥至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及分析化學(xué)、食品安全領(lǐng)域。一種腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量的檢測方法，樣品經(jīng)甲醇或乙腈提取，提取液經(jīng)C18或OasisHLB固相萃取柱凈化，采用ZORBAXEclipseC8分析柱，以乙腈-0.15%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，電噴霧、正離子掃描模式分離與檢測七種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留量。七種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥檢測低限均為20μg/kg?；厥章事菪顾?1.4～78.8、替米考星75.7～85.6、竹桃霉素81.1～85.8、泰樂菌素78.9～83.0、紅霉素87.1～89.6、羅紅霉素83.7～85.4、交沙霉素75.6～81.8。室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為螺旋霉素7.7～11.1、替米考星8.0～15.7、竹桃霉素10.5～16.4、泰樂菌素8.1～12.5、紅霉素10.5～12.4、羅紅霉素10.6～14.4、交沙霉素7.8～18.0。檢測限、回收率和精密度等滿足國內(nèi)外的有關(guān)要求。
文檔編號G01N30/06GK102313787SQ201110096740
公開日2012年1月11日 申請日期2011年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月18日
發(fā)明者林維宣, 蔣維旗, 趙雪榮, 陳溪 申請人:林維宣