專(zhuān)利名稱(chēng)：熒光強(qiáng)度校正方法、熒光強(qiáng)度計(jì)算方法及計(jì)算裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光強(qiáng)度校正方法、熒光強(qiáng)度計(jì)算方法、以及熒光強(qiáng)度計(jì)算裝置。更具體地，本發(fā)明涉及一種熒光強(qiáng)度校正方法、一種熒光強(qiáng)度計(jì)算方法、以及一種熒光強(qiáng)度計(jì)算裝置(calculating apparatus)，其各自分別能夠精確地計(jì)算由多個(gè)(多種，plural)熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度，其中微粒(微小粒子，microparticle)用該多個(gè)熒光染料進(jìn)行多重標(biāo)記。
背景技術(shù)：
迄今為止，已使用儀器(如流式細(xì)胞儀)來(lái)標(biāo)記微粒，如用熒光染料(熒光色素， fluorescent dye)來(lái)標(biāo)記細(xì)胞，并測(cè)量由通過(guò)對(duì)微利照射激光束而激發(fā)的熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度或模式，由此測(cè)量該微粒的特性。近年來(lái)，已進(jìn)行了多色測(cè)量(multicolor measurement)以更加精細(xì)地分析細(xì)胞等的特性。在這種情況下，多色測(cè)量是這樣的測(cè)量，其中微粒用多個(gè)熒光染料標(biāo)記，并且通過(guò)使用分別對(duì)應(yīng)于不同的接收光波長(zhǎng)帶的多個(gè)光檢測(cè)器(如PMT)來(lái)測(cè)量由各個(gè)熒光染料產(chǎn)生的光。在多色測(cè)量中，選擇和使用熒光波長(zhǎng)與各個(gè)光檢測(cè)器的接收光波長(zhǎng)帶一致的熒光染料。在另一方面，熒光染料(如FITC、藻紅蛋白(PE)以及別藻藍(lán)蛋白(APC))的熒光中心波長(zhǎng)彼此靠近。因而，存在其中熒光光譜彼此重疊的波長(zhǎng)帶。因此，在基于這些熒光染料的組合進(jìn)行多色測(cè)量的情況下，即使當(dāng)通過(guò)利用濾光器將由各個(gè)熒光染料產(chǎn)生的熒光彼此通過(guò)波長(zhǎng)帶分開(kāi)時(shí)，由不同于目標(biāo)熒光染料的熒光染料產(chǎn)生的熒光在某些情況下仍然會(huì)泄漏到光檢測(cè)器。當(dāng)發(fā)生熒光的泄漏時(shí)，通過(guò)各個(gè)光檢測(cè)器測(cè)得的熒光強(qiáng)度變得大于由目標(biāo)熒光染料產(chǎn)生的熒光的真實(shí)強(qiáng)度，因而發(fā)生數(shù)據(jù)上的錯(cuò)配。為了校正數(shù)據(jù)上的錯(cuò)配，進(jìn)行了熒光校正(補(bǔ)償)從通過(guò)光檢測(cè)器測(cè)得的熒光強(qiáng)度減去泄漏的熒光強(qiáng)度。熒光校正是使得將電或數(shù)學(xué)校正加入專(zhuān)用回路上的脈沖，以使通過(guò)光檢測(cè)器測(cè)得的熒光強(qiáng)度變成由目標(biāo)熒光染料產(chǎn)生的熒光的真實(shí)強(qiáng)度。一種以向量形式表示通過(guò)各個(gè)光檢測(cè)器測(cè)得的熒光強(qiáng)度，并使之前設(shè)置的泄漏矩陣(leakage matrix)的逆矩陣(inversion matrix)作用于該向量，從而計(jì)算由目標(biāo)熒光染料產(chǎn)生的熒光的真實(shí)強(qiáng)度的方法稱(chēng)作算術(shù)地進(jìn)行熒光校正的方法。在日本專(zhuān)利臨時(shí)公開(kāi)No. 2003-83894中描述了這種方法(參照

圖10和11)。通過(guò)分析用熒光染料單個(gè)標(biāo)記 (single-labeled)的微粒的熒光波長(zhǎng)分布而產(chǎn)生泄漏矩陣，并且以列向量的形式排列熒光染料的熒光波長(zhǎng)分布。另外，泄漏矩陣的逆矩陣也稱(chēng)作“校正矩陣(correction matrix)”。

發(fā)明內(nèi)容
由于在利用校正矩陣的熒光強(qiáng)度校正方法下，使得泄漏矩陣的逆矩陣作用于具有通過(guò)各個(gè)光檢測(cè)器測(cè)得的熒光強(qiáng)度作為其要素的向量，所以必要的是，泄漏矩陣是方矩陣。泄漏矩陣的矩陣大小取決于使用的熒光染料的數(shù)量和使用的光檢測(cè)器的數(shù)量。因此，為了使校正矩陣可以是方矩陣，必要的是，使用的熒光染料的數(shù)量和使用的光檢測(cè)器的數(shù)量彼此相等。圖IOA至IOC以及圖11例舉了通過(guò)利用5種熒光染料(FITC、PE、E⑶、PC5、 以及PC7)和5個(gè)光檢測(cè)器進(jìn)行五色測(cè)量的情形。最近，為了滿(mǎn)足用戶(hù)的需要期望增加可用的熒光染料的數(shù)量以精細(xì)地分析細(xì)胞等的特性，也已開(kāi)發(fā)了其中增加光檢測(cè)器的數(shù)量的裝置。在這樣的設(shè)置有大量光檢測(cè)器的裝置中，測(cè)量中使用的光檢測(cè)器的數(shù)量在某些情況下可能大于標(biāo)記微粒所使用的熒光染料的數(shù)量。在這樣的情況下，為了有效地應(yīng)用利用校正矩陣的熒光校正，必要的是，使用的熒光染料的數(shù)量和使用的光檢測(cè)器的數(shù)量彼此相等。因此，通過(guò)適當(dāng)選擇光檢測(cè)器(其數(shù)量與熒光染料的數(shù)量一致)來(lái)利用測(cè)量數(shù)據(jù)，而沒(méi)有利用從所有光檢測(cè)器獲得的測(cè)量數(shù)據(jù) (measured data)。為此，引起以下問(wèn)題沒(méi)有有效地利用所獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)。為了解決上述問(wèn)題，形成了本發(fā)明，并因此期望提供一種熒光強(qiáng)度校正方法、一種熒光強(qiáng)度計(jì)算方法、以及一種熒光強(qiáng)度計(jì)算裝置，在通過(guò)多個(gè)光檢測(cè)器對(duì)標(biāo)記有多個(gè)熒光染料的微粒進(jìn)行多色測(cè)量的情況下，它們各自能夠有效地利用從所有光檢測(cè)器獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)而不取決(依賴(lài))于熒光染料的數(shù)量，從而精確地計(jì)算由各個(gè)熒光染料產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。為了實(shí)現(xiàn)上述期望，根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，提供了一種熒光強(qiáng)度校正方法， 包括以下步驟通過(guò)光檢測(cè)器來(lái)接收熒光，該熒光由通過(guò)對(duì)用多個(gè)熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的所述多個(gè)熒光染料產(chǎn)生，其中該多個(gè)熒光染料具有彼此重疊的熒光波長(zhǎng)帶，并且光檢測(cè)器分別對(duì)應(yīng)于不同的接收光波長(zhǎng)帶，并且光檢測(cè)器的數(shù)量大于熒光染料的數(shù)量；以及基于從用熒光染料單個(gè)標(biāo)記(單獨(dú)標(biāo)記，individually labeled)的微粒而獲得的單染色光譜的線(xiàn)性總和，對(duì)通過(guò)從多個(gè)光檢測(cè)器收集的檢測(cè)值獲得的測(cè)定光譜(測(cè)得的光譜，measured spectra)進(jìn)行近似(approximate)。在以上描述的熒光強(qiáng)度校正方法中，基于單染色光譜的線(xiàn)性總和的測(cè)定光譜的近似可以通過(guò)利用最小二乘法來(lái)進(jìn)行。另外，這時(shí)，當(dāng)檢測(cè)值中包含無(wú)效值時(shí)，可以排除無(wú)效的檢測(cè)值，因而可以基于單染色光譜的線(xiàn)性總和來(lái)近似測(cè)定光譜。通過(guò)排除無(wú)效的檢測(cè)值， 增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度的校正精度。具體地，在以上描述的熒光強(qiáng)度校正方法中，通過(guò)使用法方程(正規(guī)方程，normal equation)或奇異值分角軍(singular value decomposition),獲得參數(shù) ak(k = 1 至 m),在該參數(shù)4下，由以下表達(dá)式表示的評(píng)價(jià)函數(shù)得到最小值，從而使得有可能分別計(jì)算產(chǎn)生自熒光染料的熒光強(qiáng)度
權(quán)利要求
1.一種熒光強(qiáng)度校正方法，包括以下步驟通過(guò)光檢測(cè)器來(lái)接收熒光，所述熒光由通過(guò)對(duì)用多個(gè)熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的所述多個(gè)熒光染料產(chǎn)生，其中所述多個(gè)熒光染料具有彼此重疊的熒光波長(zhǎng)帶，并且其中所述光檢測(cè)器分別對(duì)應(yīng)于不同的接收光波長(zhǎng)帶，并且所述光檢測(cè)器的數(shù)量大于所述熒光染料的數(shù)量；以及基于從用所述熒光染料單個(gè)標(biāo)記的微粒獲得的單染色光譜的線(xiàn)性總和，對(duì)通過(guò)從所述多個(gè)光檢測(cè)器收集檢測(cè)值而獲得的測(cè)定光譜進(jìn)行近似。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，基于所述單染色光譜的線(xiàn)性總和的所述測(cè)定光譜的近似通過(guò)利用最小二乘法進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，獲得參數(shù)％&=1至m)，從而分別計(jì)算由所述熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度，在所述參數(shù)4下，由以下表達(dá)式表示的評(píng)價(jià)函數(shù)得到最小值其中，A(Xi)表示在第k個(gè)熒光染料的單染色光譜中的來(lái)自第i個(gè)光檢測(cè)器的檢測(cè)值， Yi表示在所述測(cè)定光譜中的來(lái)自第i個(gè)光檢測(cè)器的檢測(cè)值，而σ i表示來(lái)自第i個(gè)光檢測(cè)器的測(cè)量值的權(quán)重的倒數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，通過(guò)利用法方程或奇異值分解而獲得所述參數(shù)4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，當(dāng)所述檢測(cè)值中包含無(wú)效值時(shí)，排除所述無(wú)效值，并通過(guò)利用最小二乘法進(jìn)行基于所述單染色光譜的線(xiàn)性總和的所述測(cè)定光譜的近似。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，獲得參數(shù)\&=1至m)，從而計(jì)算由各個(gè)熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度，在所述參數(shù)4下，由以下表達(dá)式表示的評(píng)價(jià)函數(shù)得到最小值其中，A(Xi)表示在第k個(gè)熒光染料的單染色光譜中的來(lái)自第i個(gè)光檢測(cè)器的檢測(cè)值， Yi表示在所述測(cè)定光譜中的來(lái)自第i個(gè)光檢測(cè)器的檢測(cè)值，σ i表示來(lái)自第i個(gè)光檢測(cè)器的測(cè)量值的權(quán)重的倒數(shù)，無(wú)效檢測(cè)值被取為Yi (i =“Ni+r’至N)，而有效檢測(cè)值被取為yi(i = 1 至 N1)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，獲得參數(shù)％&= 1至m)，從而計(jì)算由各個(gè)熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度，在所述參數(shù)4下，由以下表達(dá)式表示的評(píng)價(jià)函數(shù)得頁(yè)到最小值X' k(Xi) = Xk(Xi) (Ii=I-Ma = I-N1) X' k(x,) = 0(k = 1 Μ、i = Νι+1 N)其中，A(Xi)表示在第k個(gè)熒光染料的單染色光譜中的來(lái)自第i個(gè)光檢測(cè)器的檢測(cè)值， Yi表示在所述測(cè)定光譜中的來(lái)自第i個(gè)光檢測(cè)器的檢測(cè)值，σ i表示來(lái)自第i個(gè)光檢測(cè)器的測(cè)量值的權(quán)重的倒數(shù)，無(wú)效檢測(cè)值取為Yi (i =“&+1”至沁，而有效檢測(cè)值取為71(1 = 1至 N)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光強(qiáng)度校正方法，其中，所述微粒是細(xì)胞。
9.一種熒光強(qiáng)度計(jì)算方法，包括以下步驟通過(guò)光檢測(cè)器來(lái)接收熒光，所述熒光由通過(guò)對(duì)用多個(gè)熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的所述多個(gè)熒光染料產(chǎn)生，并通過(guò)從所述光檢測(cè)器收集檢測(cè)值而獲得測(cè)定光譜，其中所述多個(gè)熒光染料具有彼此重疊的熒光波長(zhǎng)帶，并且其中所述光檢測(cè)器分別對(duì)應(yīng)于不同的接收光波長(zhǎng)帶，并且所述光檢測(cè)器的數(shù)量大于所述熒光染料的數(shù)量；以及基于從用所述熒光染料單個(gè)標(biāo)記的微粒獲得的單染色光譜的線(xiàn)性總和，對(duì)所述測(cè)定光譜進(jìn)行近似，從而分別計(jì)算從所述熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度。
10.一種熒光強(qiáng)度計(jì)算裝置，包括測(cè)量裝置，用于通過(guò)光檢測(cè)器來(lái)接收熒光，所述熒光由通過(guò)對(duì)用多個(gè)熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的所述多個(gè)熒光染料產(chǎn)生，并通過(guò)從所述光檢測(cè)器收集檢測(cè)值而獲得測(cè)定光譜，其中所述多個(gè)熒光染料具有彼此重疊的熒光波長(zhǎng)帶，并且其中所述光檢測(cè)器分別對(duì)應(yīng)于不同的接收光波長(zhǎng)帶，并且所述光檢測(cè)器的數(shù)量大于所述熒光染料的數(shù)目；以及計(jì)算裝置，用于基于從用所述熒光染料單個(gè)標(biāo)記的微粒獲得的單染色光譜的線(xiàn)性總和，對(duì)所述測(cè)定光譜進(jìn)行近似，從而分別計(jì)算從所述熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度。
11.一種熒光強(qiáng)度計(jì)算裝置，包括測(cè)量部，所述測(cè)量部被構(gòu)造成通過(guò)光檢測(cè)器來(lái)接收熒光，所述熒光由通過(guò)對(duì)用多個(gè)熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的所述多個(gè)熒光染料產(chǎn)生，并通過(guò)從所述光檢測(cè)器收集檢測(cè)值而獲得測(cè)定光譜，其中所述多個(gè)熒光染料具有彼此重疊的熒光波長(zhǎng)帶，并且其中所述光檢測(cè)器分別對(duì)應(yīng)于不同的接收光波長(zhǎng)帶，并且所述光檢測(cè)器的數(shù)量大于所述熒光染料的數(shù)量；以及計(jì)算部，所述計(jì)算部被構(gòu)造成基于從用所述熒光染料單個(gè)標(biāo)記的微粒獲得的單染色光譜的線(xiàn)性總和，對(duì)所述測(cè)定光譜進(jìn)行近似，從而分別計(jì)算從所述熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度。
全文摘要
本文提供了熒光強(qiáng)度校正方法、熒光強(qiáng)度計(jì)算方法及計(jì)算裝置。更具體地，提供了一種熒光強(qiáng)度計(jì)算裝置，包括測(cè)量部，該測(cè)量部被構(gòu)造成通過(guò)光檢測(cè)器接收由通過(guò)對(duì)用多個(gè)熒光染料多重標(biāo)記的微粒照射光而激發(fā)的多個(gè)熒光染料產(chǎn)生的熒光，然后通過(guò)從光檢測(cè)器收集檢測(cè)值來(lái)獲得測(cè)定光譜；以及計(jì)算部，該計(jì)算部被構(gòu)造成基于從用熒光染料單個(gè)標(biāo)記的微粒獲得的單染色光譜的線(xiàn)性總和來(lái)近似測(cè)定光譜，從而分別計(jì)算由熒光染料產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度，其中該多個(gè)熒光染料具有彼此重疊的熒光波長(zhǎng)帶，并且其中該光檢測(cè)器分別對(duì)應(yīng)于不同的接收光波長(zhǎng)帶，并且該光檢測(cè)器的數(shù)量大于熒光染料的數(shù)量。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102235976SQ20111010115
公開(kāi)日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者加藤泰信, 酒井啟嗣 申請(qǐng)人:索尼公司