專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種病毒的檢測(cè)試劑盒及其方法，特別是一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus-2, PCV-2)可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎炎綜合征(PDNS)、繁殖障礙(Iteproductive failure)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、增生性壞死性肺炎(PNP)及先天性震顫(CT)等多種疾病，但以PMWS 最為常見(jiàn)，目前該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，死亡率10% 30%不等。郎洪武等(郎洪武， 2000)采用ELISA方法對(duì)北京、河北、山東、天津、吉林、河南等七省(市)22個(gè)豬群的559 份血清進(jìn)行了檢測(cè)。樣品總陽(yáng)性率為42. 9% 040/559)，其中20日齡未斷奶仔豬抗體陽(yáng)性率為0(0/58)、1 2月齡斷奶仔豬陽(yáng)性率為16.5% (23/139)、后備母豬陽(yáng)性率為43. 3% (61/141)、經(jīng)產(chǎn)母豬陽(yáng)性率為85. 6% (107/125)、育肥豬陽(yáng)性率為51.0% (49/96)。從這些數(shù)字中可以看出，豬的血清樣品大多數(shù)存在PCV-2抗體，不同豬群相同年齡段的陽(yáng)性率不同，不同年齡段的陽(yáng)性比率也有不同。王忠田、楊漢春等(王忠田，2001)用PCR方法對(duì)我國(guó)北京、天津、河北、山東、山西、廣東等地的12個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)病豬群進(jìn)行PCV-2感染的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)的PCV-2感染情況相當(dāng)嚴(yán)重。加上繼發(fā)感染和混合感染的因素，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失。Gagnon CA等人于2006年夏天在加拿大一家發(fā)生PMWS的豬場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)一株P(guān)CV-2 的變異株，其直接的臨床表現(xiàn)就是，豬場(chǎng)豬群的死亡率比一股發(fā)生PMWS豬場(chǎng)的死亡率要高許多。同時(shí)在美國(guó)的豬場(chǎng)中無(wú)論是否發(fā)生PMWS也都發(fā)現(xiàn)這種PCV-2變異株，這種變異株被命名為PCV-2b，而先前發(fā)現(xiàn)的未變異株則被命名為PCV-2a。這種變異株的感染在世界范圍呈蔓延趨勢(shì)，在許多國(guó)家的豬場(chǎng)中都有分離的報(bào)道，我國(guó)也有很多學(xué)者對(duì)PCV-2基因亞型進(jìn)行了研究和報(bào)道，張建武等人(張建武，2009)在2007年針對(duì)中國(guó)部分地區(qū)豬內(nèi)臟樣本進(jìn)行PCV-2的分子流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)中國(guó)地區(qū)PCV-2感染已經(jīng)比較普遍，發(fā)病豬場(chǎng)的感染率高于正常豬場(chǎng)，且近兩年的PCV-2陽(yáng)性率明顯高于高于前年的陽(yáng)性率，表明PCV-2的感染呈上升趨勢(shì)，值得我們關(guān)注。但是傳統(tǒng)分型鑒定采用的是測(cè)序方法，其有一定的局限性，對(duì)同一豬體PCV-2不同亞型的混合感染無(wú)法判定，且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，所以應(yīng)當(dāng)建立一種快速、方便、 直觀的熒光PCR檢測(cè)方法，既可以達(dá)到檢測(cè)目的，又可以達(dá)到基因分型的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒及方法，所述的這種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒及方法能夠快速的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型， 而且特異性強(qiáng)、敏感性高、成本低。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒，含有(1)、熒光PCR反應(yīng)液，所述的熒光PCR反應(yīng)液中含有特異性引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；(2)、針對(duì)PCV-加型的TaqMan特異性探針a，探針a的序列如SEQ ID NO 5所示， 在探針a的5’設(shè)計(jì)有熒光物質(zhì)，在探針a的3’設(shè)計(jì)有帶有淬滅物質(zhì)；(3)、針對(duì)PCV-沘型的TaqMan特異性探針b，探針b的序列如SEQ ID NO 6所示， 在探針b的5’設(shè)計(jì)有熒光物質(zhì)，在探針b的3’設(shè)計(jì)有帶有淬滅物質(zhì)；(4)、熱啟動(dòng)Taq酶和酶保護(hù)劑；(5)、PCV-2a型和PCV_2b型質(zhì)粒DNA陽(yáng)性對(duì)照。進(jìn)一步的，所述的特異性引物的濃度為0.32μΜ。進(jìn)一步的，所述的探針a和b的濃度均為10 μ Μ。進(jìn)一步的，所述的熒光PCR反應(yīng)液含有濃度均為0. 24mM的dATP、dTTP、dGTP和 dCTP，還含有濃度為2. 4mM的Mg2+。進(jìn)一步的，所述的熱啟動(dòng)Taq酶的濃度為lU/uL，所述的酶保護(hù)劑的濃度為0. 2U/
uLo進(jìn)一步的，在探針a的5’設(shè)計(jì)有FAM熒光物質(zhì)，在探針a的3’設(shè)計(jì)有帶有BHQ淬滅物質(zhì)。進(jìn)一步的，在探針b的5’設(shè)計(jì)有HEX熒光物質(zhì)，在探針b的3’設(shè)計(jì)有帶有BHQ淬滅物質(zhì)。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的特異性引物，其上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒加型的TaqMan特異性探針，其堿基序列如SEQ ID NO 5所示。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2b型的TaqMan特異性探針，其堿基序列如SEQ ID NO 6所示。本發(fā)明還提供了采用上述的試劑盒檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的方法，包括以下步驟(1)待檢樣本的DNA提??；(2)熒光PCR檢測(cè)按照擴(kuò)增對(duì)象數(shù)量，取熒光PCR反應(yīng)液、探針、熱啟動(dòng)Taq酶混于一離心管中，震蕩，分裝，蓋上管蓋備用；將陰性對(duì)照液加入一個(gè)分裝管中，取各樣本的 DNA加入對(duì)應(yīng)反應(yīng)管中，最后取陽(yáng)性對(duì)照加入一反應(yīng)管中，各反應(yīng)管標(biāo)記后離心，取出置熒光PCR儀中；(3)結(jié)果判定反應(yīng)液測(cè)定Ct值均大于35或無(wú)數(shù)值的標(biāo)本為陰性；FAM通道測(cè)定 Ct ^ 30的標(biāo)本為A型標(biāo)本；HEX/VIC通道測(cè)定Ct ^ 30的標(biāo)本為B型標(biāo)本；測(cè)定30 < Ct < 35的標(biāo)本建議復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)結(jié)果Ct < 35為陽(yáng)性，復(fù)測(cè)結(jié)果Ct >= 35的為陰性。進(jìn)一步的，熒光PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性:3min ；按以下參數(shù)循環(huán)40次95°C變性 15sec、58°C采集熒光 40sec。PCV-2可分為PCV-加和PCV-沘兩個(gè)亞型，其中PCV-加為176^p，登錄號(hào)為 AB072302-JAPAN-2009，其全基因序列如 SEQ ID NO 1 所示，PCV_2b 為 1767bp，登錄號(hào)為 DQ141322-CHINA-2005，其全基因序列如 SEQ ID NO :2 所示。根據(jù)PCV-加和PCV_2b基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物如下
上游引物Cl :5，-CCA，GAA，TTC，AAC，YTT，AAC，CTT，YCT，TAT-3，；下游弓丨物C2 :5，-GRC，RGT，GGA，CAT, GMT，GAG，A-3，；其作用是能夠特異性同時(shí)擴(kuò)增兩種亞型的DNA片段，并且其DNA片段包含兩種亞型的變異區(qū)。根據(jù)PCV-加和PCV_2b基因序列的變異區(qū)設(shè)計(jì)兩個(gè)探針，其序列如下a FAM-AGG, GTA, TAG, AGA, TTT，TGT，TGG，TCC, CCC, CTC-BHQb HEX-CAA，ACC，CCC，kCw, CTG，TGC，CCT，TTG，A-BHQ ；其作用是a與PCV-加的變異區(qū)特異性結(jié)合，在PCR擴(kuò)增中釋放FAM熒光信號(hào)；b 與PCV-2b的變異區(qū)特異性結(jié)合，在PCR擴(kuò)增中釋放HEX熒光信號(hào)，當(dāng)熒光PCR儀通過(guò)相應(yīng)的通道采集熒光時(shí)，就可以特異性觀察到兩種擴(kuò)增曲線，既達(dá)到檢測(cè)PCV-2的目的，同時(shí)也達(dá)到分型的目的。本試劑盒熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化過(guò)程為(1)、引物濃度的優(yōu)化設(shè)置引物終濃度范圍為50 ΙΟΟΟρΜ，用不同濃度梯度的引物進(jìn)行熒光PCR試驗(yàn)， 結(jié)果表明此濃度范圍的引物都可以擴(kuò)增S型曲線，并且當(dāng)每條引物終濃度為270pM時(shí)效果最佳。O) Mg2+濃度的優(yōu)化設(shè)置Mg2+終濃度范圍為1. 5 5. OmM,結(jié)果表明此濃度范圍內(nèi)的Mg2+均能擴(kuò)增出 S型曲線，并且當(dāng)Mg2+終濃度為2. 88mM時(shí)，擴(kuò)增效果最好。(3) dNTPs濃度的優(yōu)化四種dNIPs等當(dāng)量混合，設(shè)置每種dNIPs終濃度范圍為0. 1 ImM，結(jié)果表明此濃度范圍內(nèi)的dNIPs均能擴(kuò)增出曲線，并且每種dNIPs終濃度以0. 288mM,即總dNIPs終濃度為1. 152mM時(shí)為最佳。(4)探針濃度的優(yōu)化設(shè)置探針終濃度范圍為0. 05 1 μ Μ，用不同濃度梯度的探針進(jìn)行熒光PCR試驗(yàn)， 結(jié)果表明此濃度范圍的引物都可以擴(kuò)增S型曲線，并且當(dāng)每條探針終濃度以0. 2 μ M時(shí)效果最佳。(4)退火溫度的篩選根據(jù)所采用的PCR引物和探針，運(yùn)用公式T = 2(A+T)+4(G+C)計(jì)算退火溫度，再按照實(shí)際情況，確定PCR反應(yīng)的中限溫度是59°C，溫度范圍是56 66°C，結(jié)果表明該范圍溫度下均能擴(kuò)增出S型曲線，當(dāng)退火溫度為58°C，PCR擴(kuò)增出的曲線效果最佳。因此，選擇 58°C作為熒光PCR敏感性和特異性試驗(yàn)的退火溫度。(5)熱啟動(dòng)Taq酶和酶保護(hù)劑濃度的優(yōu)化設(shè)置熱啟動(dòng)Taq酶和酶保護(hù)劑終濃度范圍為0. 001 0. IU/μ L，用不同濃度梯度的熱啟動(dòng)Taq酶和酶保護(hù)劑進(jìn)行熒光PCR試驗(yàn)，結(jié)果表明此濃度范圍的熱啟動(dòng)Taq酶和酶保護(hù)劑都可以擴(kuò)增S型曲線，并且當(dāng)熱啟動(dòng)Taq酶和酶保護(hù)劑濃度為以0. 067U/ μ L時(shí)效果最佳。本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明的試劑制備簡(jiǎn)單、方法簡(jiǎn)便快捷、特異性強(qiáng)、敏感性高、結(jié)果判斷容易，對(duì)兩種亞型的混合感染具有鑒別診斷作用。


圖1是TaqMAN熒光探針?lè)z測(cè)PCV_2的原理圖之一，顯示了 TaqMAN探針一端連接發(fā)光基團(tuán)，一端連接淬滅基團(tuán)，并且連接的DNA鏈能夠與特異性DNA目的片段結(jié)合。圖2是TaqMAN熒光探針?lè)z測(cè)PCV_2的原理圖之二，顯示了一對(duì)特異性引物在 TaqDNA聚合酶作用下一方面進(jìn)行DNA片段的合成，當(dāng)?shù)竭_(dá)探針結(jié)合位置時(shí)，它同時(shí)發(fā)揮限制性酶切作用，將探針中連接發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的DNA鏈切斷，釋放發(fā)光基團(tuán)。圖3是TaqMAN熒光探針?lè)z測(cè)PCV-2的原理圖之三，顯示了發(fā)光基團(tuán)游離在反應(yīng)體系中時(shí)，受到激發(fā)就可以發(fā)出熒光，并被儀器收集到，形成擴(kuò)增曲線，達(dá)到檢測(cè)目的。圖4是熒光PCR圖，其中呈S型的曲線分別為PCV_2a和PCV_2b的DNA樣本，其余樣本均為陰性，表明該試劑盒特異性好。圖5是熒光PCR圖，其中，3條呈S型曲線的樣本為PCV_2a陽(yáng)性質(zhì)粒，其質(zhì)粒大腸桿菌濃度分別為 6. 25X 105f/mL、6. 25 X IO4 個(gè)/mL、6. 25 X IO3 個(gè)/mL，當(dāng)樣本中 PCV_2a 陽(yáng)性質(zhì)粒大腸桿菌濃度為6. 25 X IO3個(gè)/mL時(shí)，熒光PCR在FAM通道可觀察明顯的S型曲線。圖6是熒光PCR圖，其中，3條呈S型曲線的樣本為PCV_2b陽(yáng)性質(zhì)粒，其質(zhì)粒大腸桿菌濃度分別為3. 14X105個(gè)/mL、3. 14X IO4個(gè)/mL、3. 14X IO3個(gè)/mL，當(dāng)樣本中PCV_2b陽(yáng)性質(zhì)粒大腸桿菌濃度為3. 14X103個(gè)/mL時(shí)，熒光PCR在VIC通道可觀察明顯的S型曲線。圖7是熒光PCR圖，其中，在_20°C儲(chǔ)存時(shí)間分別為30d, 60d, 90d, 120d, 150d, 180d 的試劑盒對(duì)PCV_2a陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明本試劑盒穩(wěn)定性良好。圖8是熒光PCR圖，其中，在_20°C儲(chǔ)存時(shí)間分別為30d, 60d, 90d, 120d, 150d, 180d 的試劑盒對(duì)PCV-2b陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明本試劑盒穩(wěn)定性良好。圖9、圖10和圖11是3份PCV-加和7份PCV_2b陽(yáng)性樣本用本試劑盒重復(fù)試驗(yàn)三次的熒光PCR圖，結(jié)果均能擴(kuò)增出S型曲線，顯示試劑盒的穩(wěn)定性。圖12是采用-20°C保存1 12個(gè)月的試劑盒檢測(cè)PCV-加的熒光PCR圖。圖13是采用-20°C保存1 12個(gè)月的試劑盒檢測(cè)PCV_2b的熒光PCR圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述發(fā)明，而不是以任何方式限制發(fā)明，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利范圍之內(nèi)。實(shí)施例1試劑盒組成熒光PCR反應(yīng)液2管(25 4 17反應(yīng)\100)，其中的(^1 、(1111\( ^13和(1013終濃度為0. 24mM、Mg2+終濃度為2. 4mM，引物C1、C2終濃度為0. 32 μ Μ,探針a、b混合物1管O μ L/ 反應(yīng)X 100)，濃度都為5 μ Μ,熱啟動(dòng)Taq酶和酶保護(hù)劑混合物1管O μ L/反應(yīng)X 100)， 其中熱啟動(dòng)Taq酶濃度為IU/ μ L，酶保護(hù)劑濃度為0. 2U/ μ L，陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照a和b各1管 (250 μ L/管)，陰性質(zhì)粒對(duì)照1管(250 μ L/管)。本試劑盒采用30 μ L反應(yīng)體系，反應(yīng)液組成為熒光PCR反應(yīng)液為25 μ L、酶2 μ L、 探針混合物IyL及模板2 μ L。實(shí)施例2豬圓環(huán)病毒2型二重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒的使用方法
1、樣本處理請(qǐng)自行提取DNA，陽(yáng)性對(duì)照無(wú)需提取，直接加樣。2、熒光PCR的檢測(cè)(1)按照檢測(cè)樣品數(shù)n(n =待檢樣品數(shù)+2)取PCR反應(yīng)液、熱啟動(dòng)Taq酶和探針混于一離心管中，于渦旋振蕩器上振蕩，按每管分裝，蓋上管蓋備用。(2)現(xiàn)將陰性對(duì)照液加入一個(gè)分裝管中，取各樣本的DNA加入對(duì)應(yīng)反應(yīng)管中；最后取出陽(yáng)性對(duì)照加入另一反應(yīng)管中，各反應(yīng)管標(biāo)記后離心，取出置熒光PCR儀中。(3)熒光PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性:3min，按以下參數(shù)循環(huán)40次94°C變性15sec、 58°C采集熒光40sec。58°C時(shí)熒光檢測(cè)，檢測(cè)通道FAM，VIC/HEX。3、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)(1)陰性對(duì)照的Ct值應(yīng)等于none。(2)陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)<30，否則，此實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。(Ct值應(yīng)以S型曲線拐點(diǎn)的循環(huán)數(shù)為準(zhǔn))(3)應(yīng)該同時(shí)滿(mǎn)足上述2項(xiàng)條件，否則試驗(yàn)無(wú)效。4、結(jié)果判定(I)Ct值> 35或無(wú)數(shù)值的標(biāo)本為陰性。(2) FAM通道Ct值≤30的標(biāo)本為a型標(biāo)本。(3)HEX/VIC通道Ct值≤30的標(biāo)本為b型標(biāo)本。(4)30 < Ct值< 35的樣本建議重做。重做結(jié)果Ct值為none為陰性，否則為陽(yáng)性。實(shí)施例3試劑盒特異性試驗(yàn)取豬圓環(huán)病毒1型毒株、豬偽狂犬毒株、豬細(xì)小病毒、PK-15細(xì)胞等4個(gè)對(duì)照樣本的DNA各2 μ L為模板進(jìn)行試劑盒的特異PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。PCR擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性3min，按以下參數(shù)循環(huán)40次95°C變性15sec、58°C采集熒光40sec。熒光PCR結(jié)果表明僅PCV-加和PCV_2b的DNA擴(kuò)增出曲線，而作為對(duì)照樣本的豬圓環(huán)病毒1型毒株、豬偽狂犬毒株、豬細(xì)小病毒、PK-15細(xì)胞的DNA均無(wú)此擴(kuò)增曲線出現(xiàn)(見(jiàn)圖4)。實(shí)施例4試劑盒敏感性試驗(yàn)將計(jì)數(shù)后的PCV_2a和PCV_2b陽(yáng)性質(zhì)粒大腸桿菌進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?PCV-2a(625X 106)和 PCV-2b(3. 14X107)都按 1 IO1,1 IO2,1 IO3,1 IO4,1 IO5 進(jìn)行稀釋?zhuān)樘酓NA。從每個(gè)梯度DNA中各取2μ L模板用熒光PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增條件同上，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。通過(guò)6個(gè)濃度梯度的PCV-加和PCV-2b質(zhì)粒DNA的熒光PCR 反應(yīng)，結(jié)果表明當(dāng)樣本中PCV-加陽(yáng)性質(zhì)粒大腸桿菌濃度為6. 25X IO3個(gè)/mL時(shí)，熒光PCR 在FAM通道可觀察明顯的S型曲線(見(jiàn)圖5)；當(dāng)樣本中PCV-2b陽(yáng)性質(zhì)粒大腸桿菌濃度為 3. 14X IO3AiL時(shí)，熒光PCR在VIC通道可觀察到明顯的S型曲線(見(jiàn)圖6)。實(shí)施例5試劑盒的穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)試劑盒內(nèi)所用試劑均在_20°C儲(chǔ)存，儲(chǔ)存時(shí)間為30d，60d，90d，120d, 150d, 180d時(shí)取出，用已知PCR陽(yáng)性樣本檢測(cè)試劑盒的穩(wěn)定性。此外，PCV-2a和PCV-2bPCR陽(yáng)性樣本各15份用本試劑盒進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)3次；15份PCR陰性樣本用本試劑盒進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)3次。 擴(kuò)增條件同上，并記錄結(jié)果。結(jié)果表明在30，60，90，120，150，180d各時(shí)段分別取出試劑盒， 用PCV-2a和PCV-2bPCR陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，均能擴(kuò)增出曲線，且無(wú)非特異性曲線， 陰性對(duì)照均為陰性(見(jiàn)圖7和圖8)。3份PCV-加和7份PCV-2b陽(yáng)性樣本用本試劑盒重復(fù)試驗(yàn)三次，結(jié)果均能擴(kuò)增出S型曲線(見(jiàn)圖9、10、11)。實(shí)施例6試劑盒的保存期試驗(yàn)將在-20°C分別保存1 12個(gè)月的試劑盒對(duì)已知樣品進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增條件同上。 結(jié)果表明本試劑盒均在-20°C下可以長(zhǎng)期保存，在試驗(yàn)的12個(gè)月內(nèi)均能擴(kuò)增出S型曲線，陰性對(duì)照均為陰性(見(jiàn)圖12和圖13)。實(shí)施例7普通PCR方法的對(duì)比采集了上海及周邊地區(qū)豬臨床內(nèi)臟樣本共101份，編號(hào)后放入4°C冰箱待檢。(一)、樣本的前處理1、將采集的豬內(nèi)臟樣本剪取心、肝、脾、肺及淋巴結(jié)共5克左右放入研缽中，加入 PBS液進(jìn)行研磨，取上清，4°C保存?zhèn)溆茫?、樣本DNA的提取(參考AXYGEN公司Axyft^p體液病毒DNA/RNA小量試劑盒說(shuō)明書(shū))(1)取研磨的豬內(nèi)臟樣本上清200μ L，加入DNA裂解液Buffer V_L，渦旋震蕩混合均勻，靜置5min。(2)加 75 μ L Buffer V-N,渦旋振蕩混合均勻，12000 Xg 離心 5min。(3)將上清轉(zhuǎn)移到新的2ml離心管中，加300 μ L異丙醇(1%冰乙酸)，上下倒置 6 8次，混合均勻。(4)將制備管置于2ml離心管中，取步驟3中混合液移入制備管中，6000 X g離心 lmin。(5)棄濾液，將制備管置回到于2ml離心管中，加SOOyLBufferWlA，室溫靜置 lmin。12000Xg 離心 lmin。(6)棄濾液，將制備管置回到2ml離心管中，加800 μ L Buffer W2，12000 Xg離心 lmin。(7)將制備管置回至IJ 2ml離心管中，12000 Xg離心lmin。(8)將制備管置于潔凈的1. 5ml離心管中，在制備管膜中央加40 60 μ LBuffer TE，室溫靜置lmin，室溫靜置lmin。12000 Xg離心Imin洗脫DNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?二)普通PCR方法檢測(cè)參考張建武等的方法(張建武，莊金山，劉長(zhǎng)龍.2007年中國(guó)部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型分子流行病學(xué)分析[J]中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,42(8) =2949-2957)合成上下游引物 PCF1096/PCR1588。(1)組織樣品中PCR的擴(kuò)增PCV-2檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系如下PCV_2檢測(cè)用的上下游引物PCF1096/ PCR1588 (IOymol · L-1)各 1 μ L, IOXBuffer 2μ L,2. 5mmol · L-IdNTP 2 μ L，rTaqDNA 聚合酶5U，加入2 μ L提取的病毒核酸，加入滅菌雙蒸水至25 μ L，PCR循環(huán)條件為94°C 5min ； 94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s，40循環(huán)，72°C IOmin0當(dāng)PCR結(jié)束后在的瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳，EB染色后，在紫外燈下成像。(2)組織樣品中PCV-20RF2的克隆及鑒定在紫外燈下將上述PCR的目的條帶取出，按照DNA膠回收試劑盒的步驟進(jìn)行回收， 取回收產(chǎn)物與PBS-T載體連接，連接反應(yīng)體系為回收的PCR產(chǎn)物7 μ L，IOX連接Buffer IuL, pBS-T載體lyL，T4DNA連接酶1 μ L，4°C連接過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)菌，在 IPTG、X-gal誘導(dǎo)下37°C培養(yǎng)12 16h，挑取白斑菌落接種LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后提取質(zhì)粒，選取大小陽(yáng)性的質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶)(bal I和HindIII進(jìn)行陽(yáng)性重組子的雙酶切鑒定。(3)血清或組織樣品中PCV-20RF2的核苷酸序列的測(cè)定與分型取上述經(jīng)雙酶切鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送hvitrogen公司進(jìn)行序列測(cè)定，并連同已發(fā)表的PCV-2 0RF2的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，確定其基因亞型。(三)熒光PCR方法檢測(cè)(1)按照檢測(cè)樣品數(shù)n(n =待檢樣品數(shù)+2)取PCR反應(yīng)液、熱啟動(dòng)Taq酶和探針混于一離心管中，于渦旋振蕩器上振蕩，按每管分裝，蓋上管蓋備用。(2)現(xiàn)將陰性對(duì)照液加入一個(gè)分裝管中，取各樣本的DNA加入對(duì)應(yīng)反應(yīng)管中；最后取出陽(yáng)性對(duì)照加入另一反應(yīng)管中，各反應(yīng)管標(biāo)記后離心，取出置熒光PCR儀中。(3)熒光PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性:3min，按以下參數(shù)循環(huán)40次94°C變性15sec、 60°C采集熒光40sec。60°C時(shí)熒光檢測(cè)，檢測(cè)通道FAM，VIC/HEX。(四)檢測(cè)結(jié)果同時(shí)用普通PCR方法和熒光PCR方法對(duì)上海及周邊地區(qū)101份豬臨床內(nèi)臟樣本進(jìn)行PCV-2基因型檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。表1.普通PCR方法和熒光PCR方法對(duì)豬臨床內(nèi)臟樣本進(jìn)行PCV-2基因型檢測(cè)結(jié)果的比較
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于它含有(1)、熒光PCR反應(yīng)液，所述的熒光PCR反應(yīng)液中含有特異性引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；(2)、針對(duì)PCV-加型的TaqMan特異性探針a，探針a的序列如SEQID NO 5所示，在探針a的5’設(shè)計(jì)有熒光物質(zhì)，在探針a的3’設(shè)計(jì)有帶有淬滅物質(zhì)；(3)、針對(duì)PCV_2b型的TaqMan特異性探針b，探針b的序列如SEQID NO 6所示，在探針b的5’設(shè)計(jì)有熒光物質(zhì)，在探針b的3’設(shè)計(jì)有帶有淬滅物質(zhì)；(4)、熱啟動(dòng)Taq酶和酶保護(hù)劑；(5)、PCV-2a型和PCV-2b型質(zhì)粒DNA陽(yáng)性對(duì)照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物的濃度為0. 32μΜ。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于所述的探針a和b的濃度均為ΙΟμΜ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于所述的熒光PCR反應(yīng)液含有濃度均為0. 24mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，還含有濃度為2. 4mM 的 Mg2+。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于所述的熱啟動(dòng)Taq酶的終濃度為lU/uL，所述的酶保護(hù)劑的終濃度為0. 2U/uL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于在探針a的5’設(shè)計(jì)有FAM熒光物質(zhì)，在探針a的3’設(shè)計(jì)有帶有BHQ淬滅物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒，其特征在于在探針b的5’設(shè)計(jì)有HEX熒光物質(zhì)，在探針b的3’設(shè)計(jì)有帶有BHQ淬滅物質(zhì)。
8.一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的特異性引物，其特征在于其上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示。
9.一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒加型的TaqMan特異性探針，其特征在于其堿基序列如 SEQ ID NO 5 所示。
10.一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2b型的TaqMan特異性探針，其特征在于其堿基序列如 SEQ ID NO 6 所示。
11.采用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的方法，其特征在于包括以下步驟(1)待檢樣本的DNA提??；(2)熒光PCR檢測(cè)按照擴(kuò)增對(duì)象數(shù)量，取熒光PCR反應(yīng)液、探針、熱啟動(dòng)Taq酶混于一離心管中，震蕩，分裝，蓋上管蓋備用；將陰性對(duì)照液加入一個(gè)分裝管中，取各樣本的DNA加入對(duì)應(yīng)反應(yīng)管中，最后取陽(yáng)性對(duì)照加入一反應(yīng)管中，各反應(yīng)管標(biāo)記后離心，取出置熒光PCR 儀中；(3)結(jié)果判定反應(yīng)液測(cè)定Ct值均大于35或無(wú)數(shù)值的標(biāo)本為陰性；FAM通道測(cè)定 Ct ^ 30的標(biāo)本為A型標(biāo)本；HEX/VIC通道測(cè)定Ct ^ 30的標(biāo)本為B型標(biāo)本；測(cè)定30 < Ct < 35的標(biāo)本建議復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)結(jié)果Ct < 35為陽(yáng)性，復(fù)測(cè)結(jié)果Ct >= 35的為陰性。
12.如權(quán)利要求11所述的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的方法，其特征在于熒光PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性:3min ；按以下參數(shù)循環(huán)40次95°C變性15seC、58°C采集熒光40sec。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的試劑盒，屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，解決了檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型方法程序復(fù)雜，周期長(zhǎng)的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明的試劑盒中含有熒光PCR反應(yīng)液，反應(yīng)液中含有特異性引物，其中上游引物的序列如SEQIDNO3所示，下游引物的序列如SEQIDNO4所示，還含有針對(duì)PCV-2a型的TaqMan特異性探針a和針對(duì)PCV-2b型的TaqMan特異性探針b。本發(fā)明還提供了采用上述的試劑盒檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和分型的方法。本發(fā)明的二重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)PCV-2，同時(shí)能夠進(jìn)行其亞型的鑒定，適用于PCV-2快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及基因型分析。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102206715SQ20111010318
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者劉佩紅, 劉健, 周錦萍, 張維誼, 王建, 葛菲菲, 鞠厚斌 申請(qǐng)人:上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心