專利名稱：稀有鮈鯽α型Na⁺/K⁺-ATPase及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及環(huán)境生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種稀有鉤鯽a型Na+/K+-ATPase及其編碼基因和應(yīng)用，以及基于所述編碼基因的引物對(duì)及其在輔助檢測(cè)水環(huán)境中是否含有腎上腺激素或腎上腺激素干擾物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
NaVK+-ATPase又稱鈉泵，它能催化ATP水解供能，驅(qū)動(dòng)Na+和K+于細(xì)胞膜兩側(cè)的對(duì)向運(yùn)輸，維持著細(xì)胞膜兩側(cè)的膜電位、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收提供動(dòng)力，并在神經(jīng)和肌肉細(xì)胞的沖動(dòng)傳導(dǎo)等方面起著重要作用。魚類終生生活在水環(huán)境中，其體液與外界往往是不等滲的，因此必須進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)，以維持生命所需的水鹽平衡。Na+A+-ATPase是評(píng)價(jià)魚類滲透壓調(diào)節(jié)功能的一個(gè)重要指標(biāo)。魚類Na+/K+-ATPase的基本結(jié)構(gòu)包括一個(gè)a亞基和一個(gè)3亞基，通過(guò)這兩個(gè)亞單位異構(gòu)型的變化調(diào)控Na+A+-ATPase的生物活性。目 前已經(jīng)證實(shí)a和0亞基由不同基因編碼，其中a亞基分子量較大(約IlOkD),含有功能酶的酶促反應(yīng)結(jié)構(gòu)域，而P亞基分子量較小(約55kD)，其作用目前不十分明確，現(xiàn)有的研究表明，它可能是維持鈉鉀泵穩(wěn)定性及正確膜定位的必要組成部分。硬骨魚類下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPI)不僅在調(diào)控對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)中占主導(dǎo)地位，而且在滲透壓調(diào)節(jié)方面也有至關(guān)重要的作用。近年來(lái)隨著對(duì)環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物研究的不斷擴(kuò)展和深入，越來(lái)越多的研究表明，除已受到廣泛關(guān)注的生殖系統(tǒng)和甲狀腺系統(tǒng)外，魚類腎上腺系統(tǒng)也是內(nèi)分泌干擾物的重要作用靶之一。皮質(zhì)醇是魚類應(yīng)激反應(yīng)的重要指標(biāo)之一，同時(shí)也是硬骨魚類體內(nèi)最重要的腎上腺皮質(zhì)激素，具有調(diào)節(jié)魚體內(nèi)碳水化合物的新陳代謝和離子平衡的功能。有研究表明當(dāng)血液皮質(zhì)醇水平的變化時(shí)，魚體內(nèi)Na+/K+_ATPase活性及離子濃度均會(huì)發(fā)生變化[Waring, C. P.和Moore, A. , The effectof atrazine on Atlantic salmon(Salmo salar)smolts in fresh waterand after seawater transfer. Aquat Toxicol, 66 :93-104 (2004)]。因此,有必要對(duì)魚類腎上腺調(diào)節(jié)的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，并尋找合適的腎上腺激素干擾物的檢測(cè)方法。稀有鉤鯽(Gobiocypris rarus)屬擔(dān)尼亞科,鉤鯽屬，是中國(guó)特有的稀有魚類,分布于四川省漢源縣、石棉縣、雙流縣、都江堰市和彭縣等地。我國(guó)學(xué)者對(duì)其生物學(xué)背景進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)其不僅具有性成熟周期短，繁殖季節(jié)長(zhǎng)，連續(xù)產(chǎn)卵，溫度適應(yīng)范圍廣，二氧化碳和溶解氧耐受力高等作為實(shí)驗(yàn)魚類的優(yōu)良特征，而且在水生化學(xué)品毒性測(cè)試上有極高的敏感性[Zhong, X.，Xu, Y.，Liang, Y.，Liao, T.，Wang, J. ；Zha, J.，Wang, Z.，Wang, N.，Ingersoll, C. Histological alternation andvitellogenin induction in adult rareminnow (Gobiocypris rarus)after exposureto ethynyIestradiol and nonylphenol.Chemosphere 66:488-95(2007)]。但在分子生物學(xué)和毒理學(xué)方面，尤其關(guān)于腎上腺系統(tǒng)應(yīng)激機(jī)制方面，仍需要大量的工作。因此，鑒定和檢測(cè)稀有鉤鯽a型Na+A+-ATPase基因及其所編碼的蛋白，并將其應(yīng)用于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物作用機(jī)制研究中具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種稀有鉤鯽a型Na+A+-ATPase及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì),來(lái)自稀有鉤鯽(Gobiocypris rarus),是如下(a)或(b)
(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有Na+A+-ATPase活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標(biāo)簽。表I標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有Na+A+-ATPase活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下(I)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子 (1)序列表中序列2自5’末端第I至93位核苷酸所示的DNA分子； (2)序列表中序列2所示的DNA分子； (3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼具有Na+A+-ATPase活性的蛋白的DNA分子； (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有Na+A+-ATPase活性的蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因或其片段的引物對(duì)。
6.如權(quán)利要求5所述的引物對(duì)，其特征在于所述引物對(duì)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。
7.一種輔助檢測(cè)水環(huán)境中是否含有腎上腺激素或腎上腺激素干擾物的方法，包括如下步驟 (1)分別在水環(huán)境甲和水環(huán)境乙中養(yǎng)殖稀有鉤鯽；所述水環(huán)境甲為不含有腎上腺激素和腎上腺激素干擾物的水環(huán)境；所述水環(huán)境乙為待檢測(cè)水環(huán)境； (2)分別提取步驟(I)的兩種水環(huán)境中的稀有鉤鯽的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA； (3)分別檢測(cè)步驟⑵的兩種cDNA中權(quán)利要求2或3所述基因或其片段的含量，如果兩者具有顯著差異待測(cè)水環(huán)境中疑似含有腎上腺激素或腎上腺激素干擾物，如果兩者沒(méi)有顯著差異待測(cè)水環(huán)境中疑似不含有腎上腺激素或腎上腺激素干擾物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于檢測(cè)步驟⑵的兩種cDNA中權(quán)利要求2或3所述基因或其片段的含量的方法為熒光定量PCR;所述熒光定量PCR所用的引物為權(quán)利要求5或6所述的引物對(duì)；所述腎上腺激素為皮質(zhì)醇；所述腎上腺激素干擾物為五氯酚。
9.權(quán)利要求2或3所述基因、擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因或其片段的引物對(duì)在輔助檢測(cè)水環(huán)境中是否含有腎上腺激素或腎上腺激素干擾物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述腎上腺激素為皮質(zhì)醇；所述腎上腺激素干擾物為五氯酚。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種稀有鮈鯽α型Na+/K+-ATPase及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的稀有鮈鯽α型Na+/K+-ATPase，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有Na+/K+-ATPase活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了所述蛋白質(zhì)的編碼基因，并設(shè)計(jì)了基于所述基因的特異引物對(duì)。在含有腎上腺激素干擾物的水環(huán)境中養(yǎng)殖，稀有鮈鯽的稀有鮈鯽α型Na+/K+-ATPase基因的表達(dá)量發(fā)生了變化，且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，從而所述特異引物對(duì)可應(yīng)用于輔助檢測(cè)水環(huán)境中是否含有腎上腺激素干擾物。本發(fā)明的方法具有簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102757946SQ201110108639
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者楊麗華, 査金苗, 王子健 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心