專利名稱：快速檢測四環(huán)素、金霉素、土霉素與多西環(huán)素殘留的四聯(lián)膠體金免疫層析試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸藥殘留免疫學(xué)快速檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及四環(huán)素類藥物殘留的多聯(lián)檢免疫層析快速檢測膠體金試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
四環(huán)素類抗生素(TCs)，包括四環(huán)素(Tetracycline，TC)、金霉素 (Chlortetracycline, CTC) > ΜΜ (Oxytetracycline, OTC)、多西環(huán)素(Doxycycline， D0X)等是放線菌屬所產(chǎn)生的一類堿性廣譜抗生素及半合成的抗生素，它們均是氫化并四苯的衍生物，具有共同的基本母核，化學(xué)結(jié)構(gòu)僅取代基有所不同。在實(shí)際工作中，由于隨意加大使用劑量和不遵守休藥期，造成四環(huán)素類藥物在動(dòng)物源性組織中殘留。四環(huán)素類藥物長期殘留在動(dòng)物組織中，導(dǎo)致耐藥菌在人類之間傳播，嚴(yán)重?fù)p害人體健康。很多國家和國際組織通過建立動(dòng)物性食品中獸藥殘留的有效檢測方法，來控制藥物殘留問題。如，我國和歐盟對(duì)四環(huán)素類藥物在動(dòng)物組織中殘留最高殘留限量(MRL)作了明確規(guī)定肌肉、肝臟和腎臟的MRL分別為100 Pg/kg、300 Pg/kg和600 Pg/kg。為了控制獸藥殘留，保障人類健康，有必要建立一種快速、有效的殘留檢測方法對(duì)其殘留進(jìn)行監(jiān)測。目前在動(dòng)物性食品中四環(huán)素類藥物的分析檢測方法有很多，包括高效液相色譜法、薄層色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、微生物法、酶聯(lián)免疫法。但微生物方法存在檢測時(shí)間長、缺乏特異性，容易導(dǎo)致假陽性和假陰性產(chǎn)生。儀器檢測主要存在儀器購置費(fèi)用昂貴、 樣品前處理復(fù)雜、程序繁瑣費(fèi)時(shí)、檢測費(fèi)用高、不能現(xiàn)場操作等缺陷，所以在生產(chǎn)中應(yīng)用受到限制。ELISA方法靈敏度高、成本低，在藥物殘留檢測中應(yīng)用也很廣泛，但該方法需要酶標(biāo)儀等實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，分析時(shí)間長，在應(yīng)用中有局限性。近年來，膠體金免疫層析技術(shù)(GICA) 與目前普遍采用的標(biāo)記免疫分析技術(shù)相比，具有簡便快速，特異性強(qiáng)、敏感性高，肉眼判斷， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果易保存，無需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，因此GICA技術(shù)在藥物殘留檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。目前還沒有針對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、金霉素和土霉素等藥物殘留多聯(lián)檢檢測的免疫膠體金試紙條及其制備方法報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、且操作簡單， 對(duì)樣品簡單處理即可同時(shí)檢測CTC、0TC、TC和D0X4種四環(huán)素類藥物殘留的4聯(lián)檢免疫膠體金試紙條。本發(fā)明目的之一是這樣實(shí)現(xiàn)的
一種快速檢測四環(huán)素、金霉素、土霉素與多西環(huán)素殘留的四聯(lián)膠體金免疫層析試紙條， 包括背板、吸水墊、硝酸纖維膜、結(jié)合墊、樣品墊，其特征在于所述背板上依次連續(xù)粘附有吸水墊、硝酸纖維膜、結(jié)合墊和樣品墊，所述樣品墊靠結(jié)合墊一端搭接在結(jié)合墊上，所述吸水墊上表面吸附有手控區(qū)封膜，所述樣品墊上表面吸附有樣品端封膜，所述硝酸纖維膜上包被有兔抗鼠的IgG質(zhì)控線(C)和CTC-BSA、OTC-BSA、TC-BSA、DOX-BSA四條檢測線，CTC-BSA 即(Tl)、OTC-BSA即(T2)、TC-BSA即(T3)、DOX-BSA即(T4)；樣品墊(8)上包被有所述的抗CTC、OTC、TC、DOX藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。本發(fā)明目的之二是這樣實(shí)現(xiàn)的
一種快速檢測四環(huán)素、金霉素、土霉素與多西環(huán)素殘留的四聯(lián)膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其關(guān)鍵在于按如下步驟進(jìn)行
1)將半抗原CTC、OTC、TC和DOX采用赫夫曼消除反應(yīng)后，再與牛血清白蛋白偶聯(lián)合成偶聯(lián)物 CTC-BSA、OTC-BSA、TC-BSA 和 DOX-BSA ；
2)將合成的偶聯(lián)物CTC-BSA、OTC-BSA,TC-BSA和DOX-BSA免疫原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合篩選得到分泌抗CTC、0TC、TC和DOX藥物的單克隆抗體的細(xì)胞株，將細(xì)胞株注射小鼠腹腔，得到抗CTC、OTC、TC和DOX四株單克隆抗體；
3)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；
4)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗體；
5)將步驟2)制成的抗CTC、OTC、TC和DOX單克隆抗體加入步驟3)制備的膠體金中， 得到抗CTC、OTC、TC和DOX單克隆抗體與-膠體金標(biāo)記物；
6)將抗CTC、OTC、TC和DOX單克隆抗體與-膠體金標(biāo)記物包被在背板上；
7)將步驟1)合成01(、011(、11(和0( 與BSA 偶聯(lián)合成偶聯(lián)物 CTC-BSA、0TC-BSA、TC-BSA 和DOX-BSA包被在硝酸纖維膜得到檢測線四條，分別為Tl、T2、T3和T4 ；
7)將步驟4)制成的兔抗鼠IgG包被在硝酸纖維膜得到質(zhì)控線(C) ；8)將手控區(qū)封膜、 吸水墊、硝酸纖維素膜結(jié)合墊、樣品墊和樣品端封膜依次粘貼在背板上。本發(fā)明選用樣品區(qū)的結(jié)合墊包被膠體金標(biāo)記好的分別抗CTC、OTC、TC和DOX藥物的4株單克隆抗體，測試區(qū)的4條檢測線分別為CTC-BSA、OTC-BSA, TC-BSA和D0X-BSA，質(zhì)控線為兔抗鼠IgG。其反應(yīng)原理為競爭法將樣品液滴加到試紙條樣品墊上，樣品在毛細(xì)管作用下沿試紙條泳動(dòng)，當(dāng)泳動(dòng)至金標(biāo)墊時(shí)，固態(tài)化的金標(biāo)抗單抗迅速溶解釋放，隨樣品一起沿試紙條泳動(dòng)至檢測線，若樣品中含有CTC、0TC、TC和DOX，CTC,OTC,TC和DOX首先與金標(biāo)抗CTC、0TC、TC和DOX單抗發(fā)生免疫反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，抑制金標(biāo)抗CTC、0TC、TC和DOX 單抗與檢測線(Tl、T2、T3和T4)包被的CTC-BSA、OTC-BSA, TC-BSA和D0X-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，使檢測線截獲的金標(biāo)抗體的量減少，T線顏色變淺，當(dāng)樣品中CTC、0TC、TC和DOX的量足夠大時(shí)，檢測線將無顏色出現(xiàn)，金標(biāo)單抗穿過檢測線與被包被于C線的兔抗鼠IgG截獲C線出現(xiàn)紅色條帶；反之，若樣品中不含CTC、OTC、TC和DOX，金標(biāo)抗CTC、OTC、TC和DOX單抗與包被于NC膜上的CTC-BSA、OTC-BSA、TC-BSA和DOX-BSA偶聯(lián)物發(fā)生特異性免疫反應(yīng)而被截獲，在檢測線位置(Tl、T2、T3和T4)形成紅色條帶，即陰性結(jié)果，部分金標(biāo)單抗穿過檢測線與被包被于C線的兔抗鼠IgG截獲，形成紅色條帶。有益效果本發(fā)明應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)篩選出抗CTC、OTC、TC和DOX藥物的單克隆抗體，通過膠體金的制備及膠體金標(biāo)記條件的探索研究，在應(yīng)用抗CTC、0TC、TC和DOX藥物單克隆抗體和GICA技術(shù)研究建立抗四環(huán)素類藥物單克隆抗體快速檢測試紙條，并對(duì)其性能進(jìn)行測定。試紙條檢測范圍較寬，假陽性低，檢測靈敏、準(zhǔn)確、可靠，適用于動(dòng)物可食性組織如肌肉、肝臟和腎臟等組織中CTC、OTC、TC和DOX等四環(huán)素類藥物殘留的多聯(lián)檢檢測。


圖1為本發(fā)明膠體金免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明膠體金免疫層析試紙條檢測結(jié)果對(duì)比圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、CTC、OTC、TC/D0X-載體蛋白偶聯(lián)物的制備
本發(fā)明包被原(CTC、0TC、TC、D0X-BSA)合成方法。分別準(zhǔn)確稱取CTC、OTC、TC、DOX各 0. 2mmol溶解在3mL超純水中，然后將4 mL溴水堿液加入CTC/0TC/TC/D0X溶液中，加熱反應(yīng)2h，4°C預(yù)冷。在4°C避光條件下向上述反應(yīng)體系中緩慢滴加lmol/L的鹽酸0. 6mL (調(diào)pH 至2)，在冰水浴中，邊攪拌邊逐滴加入現(xiàn)配的lmol/L NaNO2 0. 3mL，加完后置于4°C冰箱陰暗處孵育6h。按照20 1摩爾比，將340mg BSA(5X l(T6mol)溶于5mLPBS,將偶氮化CTC慢慢滴入BSA溶液中，加完后在4°C冰箱陰暗處孵育過夜。離心除去沉淀，取上清液用磷酸緩沖液(PBS)透析3d，每6h更換透析液，將所得產(chǎn)物低壓凍干，于-20°C保存?zhèn)溆谩?、抗CTC、OTC、TC、DOX單克隆抗體制備
2. 1動(dòng)物免疫
用實(shí)施例1制備的免疫原(CTC-BSA、OTC-BSA, TC-BSA, D0X-BSA)分別免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫劑量為100 μδ/0. 2 mL。首次免疫，用無菌0.01 mol/L pH7. 4PBS溶解免疫原，再與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化，頸背部皮下分2 3點(diǎn)注射； 加強(qiáng)免疫，用0.01 mol/L PH7.4PBS溶解免疫原與等量弗氏不完全佐劑混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次間隔1Γ21 d，第3次免疫后疒10 d開始對(duì)免疫小鼠尾靜脈采血，收集血清，用ELISA檢測小鼠血清效價(jià)。末次免疫后間隔4周以上，在細(xì)胞融合前3、d，分別對(duì)腹腔注射CTC、OTC、TC、DOX-BSA抗原100 μδ/0. 2 mL/只，注射后每天注意觀察，保證融合前小鼠狀態(tài)良好。2.2 CTC、0TC、TC、D0X 單克隆抗體制備
分離免疫小鼠的脾細(xì)胞，并進(jìn)行勻漿制備免疫睥細(xì)胞。取1只免疫的Balb/c小鼠，從眼眶放血分離血清作為陰性血清，處死。小鼠用75%酒精中浸泡5 min，進(jìn)行整體消毒。將小鼠四肢固定，然后用鑷子夾住小鼠下腹部皮膚，剪開一小口，再用鑷子撕開皮膚，露出腹膜， 在腹膜上用剪刀(操作時(shí)要換一套鑷子和剪刀)剪一小口(在腹部中央)。剪開腹膜(換 1套鑷子和剪刀)，露出脾臟，用鑷子夾住脾臟(再換1套器械)，用剪刀將脾臟外膜剪破， 然后放入事先滅菌的勻漿器中。加適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RPMI-1640)于勻漿器中，進(jìn)行研磨，擠壓出脾細(xì)胞，取出勻漿器的勻漿棒，再補(bǔ)加適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RPMI-1640)，靜置2 min，將上層細(xì)胞懸液吸取后，放入腹腔巨噬細(xì)胞離心管中，重復(fù)上述操作1次。1200 r/min離心10 min，除去上清。將IO8個(gè)免疫脾細(xì)胞與廣2X107個(gè)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按照1: 10或1: 5 的比例加入50 mL離心管中，進(jìn)行混勻，然后于1500 r/min水平離心10 min，棄去上清。將離心管倒扣在滅菌的吸水紙上，把管中液體吸干。用手指或桌面輕輕敲擊管底，讓沉淀的細(xì)胞松動(dòng)，再把離心管置于37°C水浴鍋中。在1 min內(nèi)緩慢將50%PEG 0.8 mL滴入離心管中， 邊加邊輕輕用吸管尖攪拌沉淀細(xì)胞。再繼續(xù)攪拌30 sec后，靜置1 min，然后慢慢加入40 mL 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(事先進(jìn)行37°C預(yù)溫)。加基礎(chǔ)培養(yǎng)基方法為第1 min內(nèi)逐滴滴入 1 mL，第2 min內(nèi)加2 mL，第3 min內(nèi)加3 mL，第4 min內(nèi)加其余的4 mL，在每次加培養(yǎng)基時(shí)需緩慢加入，并輕輕地?cái)嚢枧囵B(yǎng)基，最后將剩余的1640培養(yǎng)基慢慢加入。1000 r/min離心5 min，除去上清。然后用HAT培養(yǎng)基懸浮混合的細(xì)胞，再加入飼養(yǎng)脾細(xì)胞。根據(jù)需要補(bǔ)加適量的HAT培養(yǎng)基，混合均勻，再將含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞融合液滴加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，滴加量約為150 μ L/孔。將培養(yǎng)板置于37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中，進(jìn)行培養(yǎng)。用建立的間接ELISA篩選陽性細(xì)胞克隆。選擇強(qiáng)陽性集落生長的孔，用有限稀釋法進(jìn)行克隆。 并對(duì)其他陽性孔，進(jìn)行24孔擴(kuò)大培養(yǎng)，用間接ELISA和間接競爭ELISA對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)孔的上清液進(jìn)行檢測，對(duì)間接ELISA和間接競爭ELISA均為陽性孔的細(xì)胞進(jìn)行液氮冷凍保存。通過融合檢測，并進(jìn)行3次亞克隆后獲得雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)過多次傳代、凍存、 復(fù)蘇，雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定。進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞染色體的計(jì)數(shù)，將每株雜交瘤細(xì)胞隨機(jī)選擇20個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞染色體條數(shù)的計(jì)數(shù)，再計(jì)算細(xì)胞染色體條數(shù)的平均值。小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)為40條，SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)目平均數(shù)為62飛8條，而本試驗(yàn)獲得的20株雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目都在92 103條之間，平均為97. 8條。本雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目高于兩親本細(xì)胞的染色體數(shù)目，說明是兩種細(xì)胞的雜交產(chǎn)物。取細(xì)胞株細(xì)胞分泌的培養(yǎng)上清液，進(jìn)行1:10稀釋后，用夾心ELISA方法測定抗體亞型，該細(xì)胞株分泌的抗體亞型為IgGl。采用辛酸一硫酸銨法對(duì)小鼠腹水進(jìn)行純化。該單克隆抗體可用于制備膠體金。2. 3兔抗鼠IgG抗體的制備
用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西蘭大白兔，制備高效價(jià)的兔抗鼠IgG高免血清，采用飽和硫酸銨沉淀法對(duì)血清進(jìn)行粗提，經(jīng)G-200過柱后得到高純度的兔抗鼠IgG。利用兔抗鼠 IgG作為質(zhì)控線。3、抗CTC、OTC、TC、DOX單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備膠體金的制備
量取去離子水100 mL，移入500 mL的平底燒瓶中，將燒瓶置于磁力攪拌器的加熱套內(nèi)， 打開攪拌旋鈕和加熱旋鈕，加熱至沸騰。加入1% HAuC14溶液1.0 mL，繼續(xù)加熱2 min，然后按表5-1所示體積一次性迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱。待溶液變?yōu)榱良t色或橙紅色后，再繼續(xù)加熱攪拌15 min。關(guān)掉加熱旋扭，冷卻至室溫，過濾備用。3. 2抗CTC、OTC、TC、DOX單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備與純化
于50 mL的小燒杯中加入30 mL的膠體金，用0. 1 mol/L K2CO3適量調(diào)pH達(dá)到最佳標(biāo)記PH值，在攪拌的狀態(tài)下，緩慢加入一定量稀釋好的抗CTC、OTC、TC、DOX單克隆抗體，繼續(xù)攪拌30 min;加10% BSA使其終濃度為1%，攪拌30 min ;4°C放置2 h后，將以上膠體金標(biāo)記物分裝，以2 000 r/min離心15 min，取上清，棄去沉淀；以10 000 r/min離心30 min, 棄上清，加入標(biāo)記洗滌液到原體積；再次以10 000 r/min離心30 min，棄上清，加入標(biāo)記洗滌液到原體積；以10 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀用1. 0 mL標(biāo)記洗滌液進(jìn)行重懸， 然后置4°C冰箱。金標(biāo)墊的制備
分別剪取規(guī)格為20X4 mm的玻璃纖維棉，然后將上述4種金標(biāo)抗體復(fù)合物溶液用 ZX1000噴點(diǎn)平臺(tái)系統(tǒng)均勻噴灑于玻璃纖維棉上，置于37 °C干燥1 h，加入干燥劑密封保存，后置于4 °C冰箱。硝酸纖維膜(NC膜)的制備
將NC膜置于ZX1000噴點(diǎn)平臺(tái)系統(tǒng)上，將濃度為0. 1 mg/mL的完全抗原CTC/0TC/TC/DOX-BSA放于貯存池A，濃度為0. 5 mg/mL的GaMIgG放于貯存池B。將NC膜展平，放上壓條，質(zhì)控線與檢測線位于膜的中間相距0.5 cm，其距膜的邊距為0.75 cm。開機(jī)后，噴點(diǎn)平臺(tái)系統(tǒng)將完全抗原CTC/0TC/TC/D0X-BSA和兔抗鼠IgG分別點(diǎn)射于NC膜上，形成4條檢測線和1條質(zhì)控線，置室溫自然干燥后，加入干燥劑密封，置于4 °C保存，備用。檢測試紙條的組裝
將背板、樣品端封膜(9)、結(jié)合墊、硝酸纖維膜(4)、吸水墊和手控區(qū)封膜(1)組裝到一起。將組裝的半成品試紙條放入試紙條切割機(jī)槽內(nèi)進(jìn)行切割，然后將制備成品的試紙條注明生產(chǎn)時(shí)間和批次，置4 °C保存(密封)。4、檢測CTC/0TC/TC/D0X的免疫膠體金試紙條的使用方法 4. 1組織樣品預(yù)處理
將豬肌肉、肝臟、腎臟等待檢組織樣品勻漿，取2 g加入4 mL乙酸乙酯振蕩2 min，室溫3000 r/min離心5 min，取300 μ L上層液體于1. 5 mL離心管中80°C水浴蒸干(大約 30 min)或在氮?dú)饬飨麓蹈?，?50 μ L稀釋液溶解殘留物。4. 2檢測結(jié)果判定
如圖1、圖2所示，一種快速檢測四環(huán)素、金霉素、土霉素與多西環(huán)素殘留的四聯(lián)膠體金免疫層析試紙條，包括背板2、吸水墊3、硝酸纖維膜4、結(jié)合墊7、樣品墊8，所述背板2上依次連續(xù)粘附有吸水墊3、硝酸纖維膜4、結(jié)合墊7和樣品墊8，所述樣品墊8靠結(jié)合墊7—端搭接在結(jié)合墊7上，所述吸水墊3上表面吸附有手控區(qū)封膜1，所述樣品墊8上表面吸附有樣品端封膜9，所述硝酸纖維膜4上包被有兔抗鼠的IgG質(zhì)控線(C)5和CTC-BSA、0TC-BSA、 TC-BSA、DOX-BSA四條檢測線6。其中質(zhì)控線(C)5靠近吸水墊3，CTC-BSA、OTC-BSA、TC-BSA、 DOX-BSA四條檢測線6分別為Tl、T2、T3、T4。NC膜上包被有CTC-BSA偶聯(lián)物、0TC-BSA偶聯(lián)物、TC-BSA偶聯(lián)物、D0X-BSA偶聯(lián)物和兔抗鼠IgG，分別作為檢測線(T1、T2、T3、T4)和質(zhì)控線(C)。金標(biāo)墊上分別涂布有固態(tài)化的金標(biāo)抗CTC、金標(biāo)抗OTC單抗、金標(biāo)抗TC單抗和金標(biāo)抗DOX單抗的混合金標(biāo)抗體作為示蹤物。將樣品液滴加到試紙條樣品墊上，樣品在毛細(xì)管作用下沿試紙條泳動(dòng)，當(dāng)泳動(dòng)至金標(biāo)墊時(shí)，固態(tài)化的金標(biāo)抗單抗迅速溶解釋放，隨樣品一起沿試紙條泳動(dòng)至檢測線，若樣品中含有 CTC、TC、0TC、D0X首先與金標(biāo)抗CTC、0TC、TC、D0X單抗發(fā)生免疫反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，抑制金標(biāo)抗 CTC、OTC、TC、DOX 單抗與檢測線(Tl、T2、T3 和 T4)包被的 CTC、OTC、TC、DOX-BSA 偶聯(lián)物的結(jié)合，使檢測線截獲的金標(biāo)抗體的量減少，T線顏色變淺，當(dāng)樣品中CTC、0TC、TC、D0X 量足夠大時(shí)，檢測線將無顏色出現(xiàn)，金標(biāo)單抗穿過檢測線與被包被于C線的兔抗鼠IgG截獲 C線出現(xiàn)紅色條帶；反之，若樣品中不含CTC、OTC、TC、D0X,金標(biāo)抗CTC、OTC、TC、DOX單抗與包被于NC膜上的CTC、0TC、TC、DOX-BSA偶聯(lián)物發(fā)生特異性免疫反應(yīng)而被截獲，在檢測線位置(Tl、T2和T3)形成紅色條帶，即陰性結(jié)果，部分金標(biāo)單抗穿過檢測線與被包被于C線的兔抗鼠IgG截獲，形成紅色條帶。5、本發(fā)明CTC/0TC/TC/D0X藥物檢測試紙條的應(yīng)用、OTC、TC、DOX殘留4聯(lián)檢檢測試紙條的靈敏度測定
將CTC、0TC、TC、D0X配成濃度分別為0、5、10、20、40、80 μ§/1的標(biāo)準(zhǔn)品，分別加到試紙條的樣品墊上，測試重復(fù)8次，靜置試紙條反應(yīng)10 min，然后用BioDot-TSR3000讀條儀掃描檢測線的相對(duì)光密度值(G/Peak-ROD值)，機(jī)讀結(jié)果見表1。以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品與空白標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)光密度值的百分率(Β/Β0%)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度的常用對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，繪制檢測試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程，進(jìn)行相關(guān)回歸分析，結(jié)果見表1。G/Peak-ROD 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)G/Peak-ROD值與0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品檢測線G/Peak-ROD值(B/BJ為 80%時(shí)，為機(jī)讀靈敏度，確定試紙條的檢測限。目測檢測方法建立在有紅色質(zhì)控線出現(xiàn)的情況下，當(dāng)試紙條與陰性對(duì)照試紙條檢測線顏色相似紅色條帶時(shí)判為陰性；當(dāng)試紙條檢測線顏色明顯淺于陰性對(duì)照試紙條檢測線顏色時(shí)判為弱陽性；當(dāng)試紙條檢測線位置無紅色條帶出現(xiàn)時(shí)判為陽性。在試紙條沒有出現(xiàn)紅色質(zhì)控線的情況下，說明試紙條已失效，此時(shí)不管檢測線顏色的深淺和有無，檢測結(jié)果都判為無效，應(yīng)更換另一批次的試紙條重新檢測。
表1試紙條靈敏度試驗(yàn)
聯(lián)檢殘留檢測試紙條的特異性試驗(yàn)
以與四條檢測線相對(duì)應(yīng)的藥物CTC、OTC、TC與DOX的交叉反應(yīng)率為100%，分別計(jì)算四環(huán)素類藥物殘留四聯(lián)檢膠體金免疫層析快速檢測試紙條各檢測線與其它四環(huán)素類藥物的交叉反應(yīng)率見表2。從表中可以看出，四環(huán)素類藥物殘留四聯(lián)檢膠體金免疫層析快速檢測試紙條與常用四環(huán)素類藥物的交叉反應(yīng)率，說明該試紙條可用于CTC、0TC、TC和DOX等四種四環(huán)素類藥物殘留檢測。 表2四環(huán)素類藥物殘留四聯(lián)檢試紙條與四環(huán)素類藥物的交叉反應(yīng)率
權(quán)利要求
1.一種快速檢測四環(huán)素、金霉素、土霉素與多西環(huán)素殘留的四聯(lián)膠體金免疫層析試紙條，包括背板(2)、吸水墊(3)、硝酸纖維膜(4)、結(jié)合墊(7)、樣品墊(8)，其特征在于所述背板(2)上依次連續(xù)粘附有吸水墊(3)、硝酸纖維膜(4)、結(jié)合墊(7)和樣品墊(8)，所述樣品墊(8 )靠結(jié)合墊(7 ) 一端搭接在結(jié)合墊(7 )上，所述吸水墊(3 )上表面吸附有手控區(qū)封膜 (1)，所述樣品墊(8)上表面吸附有樣品端封膜(9)，所述硝酸纖維膜(4)上包被有兔抗鼠的 IgG質(zhì)控線(5)和CTC-BSA、OTC-BSA、TC-BSA、DOX-BSA四條檢測線(6)；樣品墊(8)上包被有所述的抗CTC、OTC、TC、DOX藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
2.—種權(quán)利要求1所述快速檢測四環(huán)素、金霉素、土霉素與多西環(huán)素殘留的四聯(lián)膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行1)將半抗原CTC、OTC、TC和DOX采用赫夫曼消除反應(yīng)后，再與牛血清白蛋白偶聯(lián)合成偶聯(lián)物 CTC-BSA、OTC-BSA、TC-BSA 和 DOX-BSA ；2)將合成的偶聯(lián)物CTC-BSA、OTC-BSA,TC-BSA和DOX-BSA免疫原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合篩選得到分泌抗CTC、0TC、TC和DOX藥物的單克隆抗體的細(xì)胞株，將細(xì)胞株注射小鼠腹腔，得到抗CTC、OTC、TC和DOX四株單克隆抗體；3)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；4)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗體；5)將步驟2)制成的抗CTC、OTC、TC和DOX單克隆抗體加入步驟3)制備的膠體金中， 得到抗CTC、OTC、TC和DOX單克隆抗體與-膠體金標(biāo)記物；6)將抗CTC、OTC、TC和DOX單克隆抗體與-膠體金標(biāo)記物包被在背板上；7)將步驟1)合成01(、011(、11(和0( 與BSA 偶聯(lián)合成偶聯(lián)物 CTC-BSA、0TC-BSA、TC-BSA 和DOX-BSA包被在硝酸纖維膜(4)得到檢測線(6)四條，分別為Tl、T2、T3和T4 ；7)將步驟4)制成的兔抗鼠IgG包被在硝酸纖維膜(4)得到質(zhì)控線(5);8)將手控區(qū)封膜(1)、吸水墊(3 )、硝酸纖維膜(4 )結(jié)合墊(7 )、樣品墊(8 )和樣品端封膜(9 )依次粘貼在背板(2)上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測四環(huán)素、金霉素、土霉素與多西環(huán)素殘留的四聯(lián)膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，硝酸纖維膜(4)上包被有兔抗鼠的IgG質(zhì)控線和CTC-BSA、OTC-BSA、TC-BSA、DOX-BSA四條檢測線；樣品墊上包被有的抗CTC、OTC、TC、DOX藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。本發(fā)明應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)篩選出抗CTC、OTC、TC和DOX藥物的單克隆抗體，通過膠體金的制備及膠體金標(biāo)記條件的探索研究，在應(yīng)用抗CTC、OTC、TC和DOX藥物單克隆抗體和GICA技術(shù)研究建立抗四環(huán)素類藥物單克隆抗體快速檢測試紙條，并對(duì)其性能進(jìn)行測定。試紙條檢測范圍較寬，假陽性低，檢測靈敏、準(zhǔn)確、可靠，適用于動(dòng)物可食性組織如肌肉、肝臟和腎臟等組織中CTC、OTC、TC和DOX四環(huán)素類藥物殘留的多聯(lián)檢檢測。
文檔編號(hào)G01N33/532GK102288753SQ201110119780
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月10日
發(fā)明者樂濤, 何亮, 何紅秋, 魏啟明 申請(qǐng)人:重慶市科學(xué)技術(shù)研究院