專利名稱：一種基于創(chuàng)傷弧菌菌體抗體的創(chuàng)傷弧菌快速檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病菌的快速檢測試紙，特別涉及一種基于創(chuàng)傷弧菌菌體抗體的創(chuàng)傷弧菌快速檢測試紙。
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷弧菌是海洋和鹽湖中廣泛分布的一種嗜鹽性病原菌，可通過創(chuàng)口及消化道感染，易致蜂窩織炎和膿毒血癥，病死率高達(dá)50%以上。經(jīng)典的創(chuàng)傷弧菌檢測方法是培養(yǎng)法及生化實驗方法，耗時長且需要的條件較多， 無法實現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌的快速檢測。CN101403004公開了創(chuàng)傷弧菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法，試劑盒由兩對引物、DNA聚合酶、穩(wěn)定液、反應(yīng)液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對照液組成，以上七種液體分別置于容器中。該基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否。這種方法雖然準(zhǔn)確，但是操作較為復(fù)雜，檢測成本高。CN101818200A公開了創(chuàng)傷弧菌核酸定量檢測試紙條，通過設(shè)計。引物及探針結(jié)合位點的靶基因為創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素結(jié)構(gòu)基因vvhA350位 800位來確定是否存在創(chuàng)傷弧菌。這種方法雖然靈敏度高，安全可靠，但是同樣存在組成復(fù)雜，成本較高的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于創(chuàng)傷弧菌菌體抗體的創(chuàng)傷弧菌快速檢測試紙。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
一種創(chuàng)傷弧菌快速檢測試紙，包括有底板、吸水墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)抗體結(jié)合物膜和樣品墊，硝酸纖維素膜上固定有抗創(chuàng)傷弧菌抗體和可與該抗體反應(yīng)的IgG ；金標(biāo)抗體結(jié)合物膜上固定有膠體金-抗創(chuàng)傷弧菌抗體復(fù)合物。其制備方法包括以下步驟
1)使用創(chuàng)傷弧菌免疫動物，制得抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體，純化得到抗創(chuàng)傷弧菌抗
體；
2)將純化得到抗創(chuàng)傷弧菌抗體和可與該抗體反應(yīng)的IgG分別滴于硝酸纖維素膜上， 分別作為檢測線和質(zhì)控線，封閉、烘干，得到固定有抗創(chuàng)傷弧菌抗體和可與該抗體反應(yīng)的 IgG的硝酸纖維素膜。本發(fā)明的試紙，制備工藝簡單，成本低廉，使用方便，可靠性高，可快速準(zhǔn)確地檢測出創(chuàng)傷弧菌。


圖1是本發(fā)明試紙的檢測結(jié)果圖2是本發(fā)明試紙的不同菌濃度檢測結(jié)果圖3是不同濃度創(chuàng)傷弧菌膠體金免疫層析試紙條檢測線及質(zhì)控線PU值；圖4是創(chuàng)傷弧菌免疫層析試紙條特異性檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。多克隆抗體的制備
使用創(chuàng)傷弧菌免疫新西蘭大白兔獲得兔抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體，采用辛酸-硫酸銨法純化兔血清蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，間接ELISA方法測定效價為1 12800)，-20°C保存； 金標(biāo)抗體結(jié)合物膜的制備
采用檸檬酸三鈉鹽還原法，制備粒徑為13 nm膠體金顆粒，將膠體金與純化得到的多克隆抗體復(fù)合得到膠體金-抗體復(fù)合物；
使用得到的膠體金-抗體復(fù)合物浸泡金標(biāo)墊，干燥得到金標(biāo)抗體結(jié)合物膜； 含抗體的硝酸纖維素膜的制備
用兔抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體和羊抗兔IgG分別點樣于硝酸纖維素膜上，作為檢測線和質(zhì)控線，封閉并烘干，得到含抗體的硝酸纖維素膜；
在塑料底板上分別將吸水墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)抗體結(jié)合物膜和樣品墊依次組裝，切割成為4mm寬的條帶，得到試紙。試紙條檢測結(jié)果判定
將試紙條插入樣品懸液中，待樣品層析完畢后觀察檢測結(jié)果。在測試條反應(yīng)區(qū)中，檢測線及質(zhì)控線處各出現(xiàn)一條紅帶，則表示待檢樣品中有創(chuàng)傷弧菌，判為陽性；若僅在質(zhì)控線處出現(xiàn)一條紅帶，則判為陰性；若質(zhì)控線不出現(xiàn)紅帶，則表示測試條失效。將試紙條插入樣品溶液，2(T30 min內(nèi)可見質(zhì)控線呈紅色條帶；檢測線上陽性對照呈紅色條帶，陰性對照不顯色，陽性樣品呈紅色條帶，如圖1所示，圖中，1:陰性對照；2: 陽性對照；3:樣品1 ( + );4:樣品2 (-);C:質(zhì)控線；Τ:檢測線。試紙條敏感性檢測
取創(chuàng)傷弧菌培養(yǎng)物，甲醛滅活后，稀釋成不同濃度的菌懸液，分別為2Χ109、2Χ108、 2Χ 107、2X 106、2X 105、2X 104、2X 103、2X IO2JXIOi 及 2X10°CFU/ml。各取 250 μ 1 于離心管中，插入試紙條。用Leica Q500MC圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果定量測試，分別測試每個條帶 200個區(qū)域的平均灰度值G α，同時測試硝酸纖維素膜背景灰度平均值G β，按申洪，免疫組織化學(xué)染色定量方法研究(III) [J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，1995，4(1): 89.記載的公式計算每一條帶的陽性單位(Positive Unit, PU)。將試紙條插入不同稀釋濃度的創(chuàng)傷弧菌懸液中，待樣品層析完畢后觀察檢測結(jié)果，其檢測結(jié)果如圖2所示?？梢妱?chuàng)傷弧菌菌液濃度的目測檢測下限為2X IO6 CFU/ml。圖像分析檢測結(jié)果顯示檢測帶PU值隨著創(chuàng)傷弧菌濃度增加而增強(qiáng)。借助圖像分析，可將檢測閾值下限降低到2 X 105CFU/ml。質(zhì)控帶PU值在各濃度標(biāo)本中較穩(wěn)定，變異系數(shù)為4. 75%， 如圖3所示。試紙條特異性檢測
以創(chuàng)傷弧菌菌液為陽性對照，以溶血性葡萄球菌(1)、金黃色葡萄球菌(2)、銅綠假單胞菌(3)、鮑曼不動菌(4)、肺炎克雷氏菌(5)、嗜麥菌窄食單胞菌(6)、產(chǎn)氣桿菌(7)、陰溝腸桿菌(8)、奇異變形菌(9)、大腸埃希菌(10)、痢疾桿菌(11)及副溶血弧菌(12)共12株非創(chuàng)傷弧菌菌株為陰性對照，進(jìn)行試紙條特異性檢測。調(diào)整各菌懸液濃度至2X IO8 CFU/ml后， 各取250 μ 1置于離心管中，插入試紙條檢測。檢測結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明創(chuàng)傷弧菌菌株在質(zhì)控線與檢測線上均出現(xiàn)紅色條帶，為陽性；而空白組及其他受試菌僅在質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，檢測線上無條帶出現(xiàn)，為陰性。試紙條穩(wěn)定性檢測
將試紙條置于4 °C干燥密封保存，每15 d對陽性和陰性標(biāo)本測試1次，共測試至實驗第180天。結(jié)果如表1所示。
權(quán)利要求
1.一種創(chuàng)傷弧菌快速檢測試紙，包括有底板、吸水墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)抗體結(jié)合物膜和樣品墊，其特征在于硝酸纖維素膜上固定有抗創(chuàng)傷弧菌抗體和可與該抗體反應(yīng)的IgG ； 金標(biāo)抗體結(jié)合物膜上固定有膠體金-抗創(chuàng)傷弧菌抗體復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種創(chuàng)傷弧菌快速檢測試紙，其特征在于其制備方法包括以下步驟1)使用創(chuàng)傷弧菌免疫動物，制得抗創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體，純化得到抗創(chuàng)傷弧菌抗體；2)將純化得到抗創(chuàng)傷弧菌抗體和可與該抗體反應(yīng)的IgG分別滴于硝酸纖維素膜上， 分別作為檢測線和質(zhì)控線，封閉、烘干，得到固定有抗創(chuàng)傷弧菌抗體和可與該抗體反應(yīng)的 IgG的硝酸纖維素膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于創(chuàng)傷弧菌菌體抗體的創(chuàng)傷弧菌快速檢測試紙。該檢測試紙包括有底板、吸水墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)抗體結(jié)合物膜和樣品墊，硝酸纖維素膜上固定有抗創(chuàng)傷弧菌抗體和可與該抗體反應(yīng)的IgG；金標(biāo)抗體結(jié)合物膜上固定有膠體金-抗創(chuàng)傷弧菌抗體復(fù)合物。本發(fā)明的試紙，制備工藝簡單，成本低廉，使用方便，可靠性高，可快速準(zhǔn)確地檢測出創(chuàng)傷弧菌。
文檔編號G01N33/569GK102331498SQ20111015227
公開日2012年1月25日 申請日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者嚴(yán)智敏, 申洪, 鄭晶, 陳清 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)