專利名稱：基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用兩種納米材料水滑石MgNiFe-LDH及其衍生物Mg (Ni)Fe2O4固定葡萄糖氧化酶并以復(fù)合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT和Mg (Ni ) Fe204/G0D/CHT修飾玻碳電極制作葡萄糖生物傳感器的方法，屬納米技術(shù)和電化學(xué)分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，隨著人們生活水平的提高和老年人口的增多，糖尿病成為世界性的多發(fā)病和常見病，并嚴(yán)重危脅著人類健康，成為僅次于心血管病和癌癥的第三大危險疾病。因此葡萄糖的含量的測定對糖尿病的預(yù)防和治療有著重要的意義。電化學(xué)生物傳感器由于其簡單、快速、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點在葡萄糖檢測中占有重要的地位。葡萄糖氧化酶因其催化效率高、穩(wěn)定性好以及對D-葡萄糖的催化高度專一性等特點成為人們制備葡萄糖傳感器的理想模型。自Updike和Hicks在1967年制備第一支葡萄糖傳感器以來，葡萄糖生物傳感器經(jīng)歷了第一代，第二代及第三代生物傳感器。 而人為加入具有電催化氧化還原作用的電子媒介體是第二代生物傳感器的一大特點。本發(fā)明即利用二茂鐵甲酸作為電子媒介體的。但由于酶的一些弱點(易流失，活性不能保持長久等)限制了此類葡萄糖傳感器的應(yīng)用。因此有效固定葡萄糖氧化酶以保持酶活性成為此類葡萄糖傳感器的研究重點。為此研究者利用多種材料如聚合物膜，介孔材料，碳納米管和粘土等來固定酶保持酶的活性。陰離子粘土又稱水滑石(LDHs)(分子式為[M(II)1-,M(III),(0Η)2Γ+[(Χ,//_)· Η20] 〃)因其特殊多孔性、含水率高，并且無毒，成本低以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好等物理和化學(xué)性能，為固定酶提供了較好的生物環(huán)境，特別由Co2+，Ni2+，Mn3+等在堿溶液中具有電子傳遞和氧化還原作用的過渡金屬組成的水滑石，近來引起了越來越多的研究者的興趣。如NiAl-LDH， ZnAl-LDH等水滑石已被用來制備生物傳感器。但是三元素組成的水滑石MgNiFe-LDH 及其衍生物還沒有被用于此類研究中。本發(fā)明就是利用利用共沉淀法合成的納米材料 MgNiFe-LDH及其衍生物固定葡萄糖氧化酶用于葡萄糖生物傳感器的研究。本發(fā)明是將納米技術(shù)和生物傳感技術(shù)結(jié)合在一起。通過納米材料水滑石或其衍生物為生物酶提供良好的生物環(huán)境，使葡萄糖氧化酶在此環(huán)境中充分發(fā)揮對葡萄糖的催化作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在提供兩種新的納米材料水滑石MgNiFe-LDH及其衍生物Mg (Ni) Fe2O4,并利用納米材料的優(yōu)良特性有效固定葡萄糖氧化酶(GOD)，與成膜性良好的殼聚糖 (CHT)的協(xié)同作用制備出了修飾劑MgNiFe-LDH/GOD/CHT和Mg (Ni ) i^e204/G0D/CHT復(fù)合膜滴涂玻碳電極制作了一種葡萄糖生物傳感器的方法。一種基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征在于具有以下的制備過程和步驟
A.首先制備三元水滑石晶體MgNiFe-LDH及其衍生物Mg(Ni )Fe204，用共沉淀法制備， 其制備過程如下先制備三元水滑石晶體MgNiFe-LDH，在惰性氣氛下在三頸瓶中加入摩爾比為 2 1 1 的 Mg (NO3) 2 · 6H20, Ni (NO3) 2 · 6H20 和 Fe (NO3) 3 · 9H20 水溶液，在劇烈攪拌下加熱到40 °C，滴加一定比例的NaOH和Na2CO3堿液混合液(2 :1)，直到溶液pH=10為止，然后所得懸浮液繼續(xù)攪拌下在100 °C下晶化6小時后，抽濾、洗滌至中性，所得濾餅在70 V 的烘箱中干燥M h,即得三元水滑石納米粒子，記為MgNiFe-LDH ；
將MgNiFe-LDH在900°C下焙燒2小時，即制備得到水滑石衍生物，即納米材料Mg (Ni) Fe2O4 ；
B.將三元水滑石MgNiFe-LDH及其衍生物Mg(Ni)Fe204納米材料分別和殼聚糖(CHT)、 葡萄糖氧化酶(GOD)組合修飾在玻碳電極上制備成兩種用于測定葡萄糖濃度的生物傳感器；其制備過程如下
B-1.用傳統(tǒng)的方法處理玻碳電極首先用金相砂紙拋光，然后依次用1.0μπι，0.3μπι 和0. 05 μ m Al2O3懸濁液在麂皮上拋光至鏡面，最后分別用HNO3溶液(1 1)、無水乙醇和二次水超聲清洗；
B-2.修飾劑的配制將1. 6 mg的三元水滑石MgNiFe-LDH或衍生物Mg (Ni)Fe2O4納米材料分散于1 mL CHT醋酸溶液(0. 5%，r/V，即g/mL)，超聲分散均勻，加入1.6 mg GOD繼續(xù)超聲至分散均勻；
B-3.將上述兩種分散均勻的修飾劑10 μ L滴涂在干凈的玻碳電極表面上，4°C冰箱里過夜干燥，使電極表面形成均勻的MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg (Ni)Fe204/G0D/CHT復(fù)合膜； 即得基于納米材料三元水滑石MgNiFe-LDH或其衍生物Mg(Ni)Fe2O4的葡萄糖生物傳感器。一種葡萄糖濃度的測定，采用上述的基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物傳感器來測定，其特征具有以下測定步驟為
a.使用前，將此化學(xué)修飾玻碳電極先在pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡，然后在-0. 4 +0. 8V的電位窗口中循環(huán)伏安法掃描至圖形穩(wěn)定；再用二次蒸餾水沖洗干凈；
b.將納米材料復(fù)合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg(Ni) i^CVGOD/CHT修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬片電極為對電極，組成傳統(tǒng)的三電極體系； 電化學(xué)測定時，修飾電極放置在以恒定速率攪拌的0.1 M pH 7.0的磷酸緩沖液中，緩沖液中加入了 0.5 mM 二茂鐵甲酸；分別在0.60 V和0.50 V最佳電位下，記錄電流-時間曲線， 當(dāng)背景電流達(dá)到穩(wěn)態(tài)，用微量進(jìn)樣器加葡萄糖樣品，記錄電流響應(yīng)信號；得到葡萄糖濃的響應(yīng)時間-電流曲線；然后按照常規(guī)計算方法測得葡萄糖濃度。。本發(fā)明分別利用三元水滑石MgNiFe-LDH或其衍生物尖晶石鐵氧體Mg(Ni)Fe2O4納米粒子的獨特性質(zhì)來有效固定葡萄糖氧化酶，并用復(fù)合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg (Ni) i^204/G0D/CHT滴涂玻碳電極，制備出葡萄糖氧化酶生物傳感器。其優(yōu)點是(1)納米粒子的比表面積大，具有介孔結(jié)構(gòu)，在納米粒子表面或孔間固定酶的效率高，有效保持了酶的活性；(2)水滑石的層狀結(jié)構(gòu)促進(jìn)了酶和電解質(zhì)媒介體間的電子傳遞作用；水滑石衍生物即尖晶石型鐵氧體具有立方體結(jié)構(gòu)，它是軟磁鐵氧體材料，具有一定的分散能力可以使酶和基體之間的反應(yīng)加快，檢出限更低。本發(fā)明中的修飾電極是一類新型納米材料固定酶的電化學(xué)傳感器，用于葡萄糖的快速電化學(xué)測定，利用水滑石及其衍生物納米粒子所制得的葡萄糖生物傳感器具有活性高、穩(wěn)定性好、成本低和壽命長等優(yōu)點，有望得到實際應(yīng)用。


圖la，b分別為本發(fā)明中具有層狀結(jié)構(gòu)的水滑石MgNiFe-LDH (a)及其衍生物-尖晶石型鐵氧體Mg (Ni)Fe2O4 (b)納米材料的X-射線衍射圖(橫坐標(biāo)為X-射線掃描角度2T， 縱坐標(biāo)為X-射線衍射峰強(qiáng)度I)。圖2a，b分別為本發(fā)明中兩種納米材料分別固定葡萄糖氧化酶與殼聚糖一起組成的復(fù)合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT (a)和Mg (Ni) Fe204/G0D/CHT (b)修飾玻碳電極構(gòu)建的葡萄糖生物傳感器，在最優(yōu)化條件下對葡萄糖濃度響應(yīng)的時間-電流曲線(橫坐標(biāo)為時間t， 縱坐標(biāo)為電流值/p)。
具體實施例方式現(xiàn)將本發(fā)明的具體實施例敘述于后。
本實施中生物傳感器的制備過程和步驟如下
A.首先制備三元水滑石晶體MgNiFe-LDH及其衍生物Mg (Ni )Fe204，用共沉淀法制備， 其制備過程如下先制備三元水滑石晶體MgNiFe-LDH，在惰性氣氛下在三頸瓶中加入摩爾比為 2 1 1 的 Mg (NO3) 2 · 6H20, Ni (NO3) 2 · 6H20 和 Fe (NO3) 3 · 9H20 水溶液，在劇烈攪拌下加熱到40 V，滴加一定比例的NaOH和Na2CO3堿液混合液，體積比為2 1，直到溶液pH=10 為止，然后所得懸浮液繼續(xù)攪拌下在100 °C下晶化6小時后，抽濾、洗滌至中性，所得濾餅在70 0C的烘箱中干燥M h，即得三元水滑石納米粒子，記為MgNiFe-LDH。將MgNiFe-LDH 在900°C下焙燒2小時，即制備得到水滑石衍生物，即納米材料Mg (Ni)狗204。B.生物傳感器制備
(1)首先用金相砂紙拋光玻碳電極，然后依次用Ι.ομπι,ο.3μπι和0.05μπι Al2O3懸濁液在鹿皮上拋光至鏡面，最后分別用HNO3 (1 1)、無水乙醇和二次水超聲清洗；
(2)修飾劑及傳感器的制備將1.6 mg三元水滑石MgNiFe-LDH或衍生物Mg (Ni)Fe2O4 納米材料分散于1 mL CHT的醋酸(0. 5%，w/v即g/mL)溶液，超聲分散均勻，加入1. 6 mg GOD繼續(xù)超聲至分散均勻；將10 μ L分散均勻的修飾劑MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg (Ni) Fe204/G0D/CHT滴涂在干凈的玻碳電極表面上，4 °C冰箱里過夜干燥，使電極表面形成均勻的MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg (Ni ) Fe204/G0D/CHT復(fù)合膜，即得基于納米材料三元水滑石 MgNiFe-LDH或其衍生物Mg (Ni)Fe2O4的葡萄糖生物傳感器。利用上述生物傳感器測定葡萄糖濃度的方法，其步驟如下
(1)使用時，先把化學(xué)修飾電極在PH=7. 0的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡，然后在-0. 4 0. 8V的電位窗口中循環(huán)伏安法掃描至穩(wěn)定；再用二次蒸餾水沖洗干凈。(2)將上述化學(xué)修飾的玻碳電極用于葡萄糖濃度的測定；具體測定方法如下將納米材料復(fù)合膜修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬片電極為對電極，組成傳統(tǒng)的三電極體系；電化學(xué)測定時，修飾電極放置在以恒定速率攪拌的0. 1 M PH 7.0的磷酸緩沖液中，緩沖液中加入了 0.5 mM 二茂鐵甲酸。分別在電位為0.60 V和0.5 V下，記錄電流-時間曲線，當(dāng)背景電流達(dá)到穩(wěn)態(tài)，用微量進(jìn)樣器加葡萄糖樣品，記錄電流響應(yīng)信號；得到葡萄糖濃度響應(yīng)時間-電流曲線，然后按照常規(guī)計算方法測得葡萄糖濃度。納米材料結(jié)構(gòu)及化學(xué)修飾電極的電化學(xué)性能表征
通過X-射線衍射儀圖，可知合成了具有良好晶體結(jié)構(gòu)的水滑石材料MgNiFe-LDH和立方晶體結(jié)構(gòu)的尖晶石型鐵氧體材料Mg (Ni)I^e2O4，如圖la，b所示。化學(xué)修飾電極對葡萄糖進(jìn)行電化學(xué)測定
在最佳測試條件下，MgNiFe-LDH/GOD/CHT (a)或 Mg (Ni)Fe204/G0D/CHT (b)復(fù)合膜修飾電極對葡萄糖的電流-時間響應(yīng)如圖2所示。由圖可見，達(dá)到95%穩(wěn)態(tài)電流的時間都很短(均小于10 s)，這主要是因為制得的納米材料對生物酶具有生物相容性、多孔性以及電子傳遞促進(jìn)性等優(yōu)良特性。所制備的生物傳感器對葡萄糖的電流響應(yīng)均隨著葡萄糖濃度的增加而逐漸增大。MgNiFe-LDH/GOD/CHT復(fù)合膜修飾的電極在1. 0—8. 0 mM范圍內(nèi)，電流與葡萄糖濃度成線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r =0.989，檢測限為0.12 mM (信噪比為3)；用Mg (Ni)Fe204/G0D/CHT復(fù)合膜修飾的電極在在1. 0—7. OmM范圍內(nèi)，電流與葡萄糖濃度成線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r =0.991，檢測限為0.05 mM (信噪比為3)?；诩{米材料三元水滑石MgNiFe-LDH或其衍生物Mg (Ni )Fe2O4的葡萄糖生物傳感器表現(xiàn)了良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。對等濃度的葡萄糖溶液進(jìn)行15次測定，其標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1. 165%和2. 18%。電極不用時在4°C的冰箱中存放一個月后，電流響應(yīng)均保持在90% 以上。且不受一些常見的金屬離子或果糖、木糖等其它糖類的干擾，專一性好。
權(quán)利要求
1.一種基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征在于具有以下的制備過程和步驟A.首先制備三元水滑石晶體MgNiFe-LDH及其衍生物Mg(Ni )Fe204，用共沉淀法制備， 其制備過程如下先制備三元水滑石晶體MgNiFe-LDH，在惰性氣氛下在三頸瓶中加入摩爾比為 2 1 1 的 Mg (NO3) 2 · 6H20, Ni (NO3) 2 · 6H20 和 Fe (NO3) 3 · 9H20 水溶液，在劇烈攪拌下加熱到40 °C，滴加一定比例的NaOH和Na2CO3堿液混合液(2 :1)，直到溶液pH=10為止，然后所得懸浮液繼續(xù)攪拌下在100 °C下晶化6小時后，抽濾、洗滌至中性，所得濾餅在70 V 的烘箱中干燥M h,即得三元水滑石納米粒子，記為MgNiFe-LDH ；將MgNiFe-LDH在900°C下焙燒2小時，即制備得到水滑石衍生物，即納米材料Mg (Ni) Fe2O4 ；B.將三元水滑石MgNiFe-LDH及其衍生物Mg(Ni)Fe204納米材料分別和殼聚糖(CHT)、 葡萄糖氧化酶(GOD)組合修飾在玻碳電極上制備成兩種用于測定葡萄糖濃度的生物傳感器；其制備過程如下B-1.用傳統(tǒng)的方法處理玻碳電極首先用金相砂紙拋光，然后依次用1.0μπι，0.3μπι 和0. 05 μ m Al2O3懸濁液在麂皮上拋光至鏡面，最后分別用HNO3溶液(1 1)、無水乙醇和二次水超聲清洗；B-2.修飾劑的配制將1. 6 mg的三元水滑石MgNiFe-LDH或衍生物Mg (Ni)Fe2O4納米材料分散于1 mL CHT醋酸溶液(0. 5%，r/V，即g/mL)，超聲分散均勻，加入1.6 mg GOD繼續(xù)超聲至分散均勻；B-3.將上述兩種分散均勻的修飾劑10 μ L滴涂在干凈的玻碳電極表面上，4°C冰箱里過夜干燥，使電極表面形成均勻的MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg (Ni)Fe204/G0D/CHT復(fù)合膜； 即得基于納米材料三元水滑石MgNiFe-LDH或其衍生物Mg(Ni)Fe2O4的葡萄糖生物傳感器。
2.一種葡萄糖濃度的測定，采用根據(jù)權(quán)利要求所述的基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物傳感器來測定，其特征具有以下測定步驟為a.使用前，將此化學(xué)修飾玻碳電極先在pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡，然后在-0. 4 +0. 8V的電位窗口中循環(huán)伏安法掃描至圖形穩(wěn)定；再用二次蒸餾水沖洗干凈；b.將納米材料復(fù)合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg(Ni) i^CVGOD/CHT修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬片電極為對電極，組成傳統(tǒng)的三電極體系； 電化學(xué)測定時，修飾電極放置在以恒定速率攪拌的0.1 M pH 7.0的磷酸緩沖液中，緩沖液中加入了 0.5 mM 二茂鐵甲酸；分別在0.60 V和0.50 V最佳電位下，記錄電流-時間曲線， 當(dāng)背景電流達(dá)到穩(wěn)態(tài)，用微量進(jìn)樣器加葡萄糖樣品，記錄電流響應(yīng)信號；得到葡萄糖濃的響應(yīng)時間-電流曲線；然后按照常規(guī)計算方法測得葡萄糖濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物傳感器的制備方法。本發(fā)明方法利用LDH及其衍生物納米材料的優(yōu)異特性有效固定葡萄糖氧化酶,并促進(jìn)電子傳遞作用。具體方法如下先將1.6mgMgNiFe-LDH和Mg(Ni)Fe2O4納米材料分散于1mL0.5%(w/v)CHT溶液，超聲分散均勻，加入1.6mgGOD繼續(xù)超聲分散均勻，即得所需修飾劑。將修飾劑滴涂于玻碳電極表面即成葡萄糖生物傳感器。本發(fā)明方法分別用納米材料MgNiFe-LDH和Mg(Ni)Fe2O4固定葡萄糖氧化酶，并用復(fù)合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg(Ni)Fe2O4/GOD/CHT分別修飾玻碳電極，制備出兩種葡萄糖生物傳感器，用于葡萄糖的電化學(xué)測定，所固定的酶活性高、穩(wěn)定性好和專一性強(qiáng)，對葡萄糖的測定具有快速、靈敏和準(zhǔn)確等特點。
文檔編號G01N27/327GK102243208SQ20111015667
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月13日
發(fā)明者丁亞平, 劉小娟, 葉代新, 徐彥紅, 王玉龍, 羅立強(qiáng) 申請人:上海大學(xué)