專利名稱：顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顯微鏡。
背景技術(shù)：
光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域早已建立并且目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了多種類型的顯微鏡。另外，隨著包括激光技術(shù)和電子成像技術(shù)的外圍技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了更加高級(jí)的顯微鏡技術(shù)。在這樣的背景下，人們提出了一種高功能性顯微鏡，其通過(guò)用多波長(zhǎng)光來(lái)照明樣本而誘發(fā)雙諧振吸收過(guò)程，而使得不僅能夠控制所獲得圖像的對(duì)比度，而且能夠?qū)λM(jìn)行科學(xué)分析(例如，參見(jiàn)日本專利特開(kāi)No. 8-184552)。這種顯微鏡能夠通過(guò)選擇具有雙諧振吸收的特定分子來(lái)觀察由特定光學(xué)躍遷造成的吸收和熒光性。下面將參照

圖19至圖22對(duì)其原理進(jìn)行描述。圖19示出了組成樣本的分子的價(jià)電子軌道的電子結(jié)構(gòu)。首先，用波長(zhǎng)為λ 1的光來(lái)激發(fā)圖19所示基態(tài)(SO態(tài): 穩(wěn)定狀態(tài))下分子的價(jià)電子軌道上的電子，從而使其躍遷至第一激發(fā)態(tài)(Si態(tài))。接下來(lái)， 按相似方式用波長(zhǎng)為λ 2的光來(lái)激發(fā)該電子，以便使其躍遷至圖21所示的第二激發(fā)態(tài)(S2 狀態(tài))。在這種激發(fā)態(tài)下，該分子發(fā)射熒光或磷光并且返回到圖22所示的基態(tài)。采用雙諧振吸收過(guò)程的顯微術(shù)被用于利用圖21的吸收過(guò)程和諸如熒光性或磷光現(xiàn)象的光發(fā)射來(lái)觀察吸收?qǐng)D像和發(fā)射圖像。根據(jù)這種顯微術(shù)，首先，通過(guò)諧振波長(zhǎng)為λ 1的激光等將組成該樣本的分子激發(fā)至Sl態(tài)，如圖20所示。這時(shí)，單位立方體積中Sl態(tài)的分子數(shù)與所發(fā)射光的強(qiáng)度成比例地增加。這里，通過(guò)將每分子吸收截面積乘以單位立方體積中的分子數(shù)來(lái)獲得線性吸收系數(shù)。因此，在圖21所示的激發(fā)過(guò)程中，隨后照射的諧振波長(zhǎng)為λ 2的光的線性吸收系數(shù)取決于最初照射的諧振波長(zhǎng)為λ 1的光的強(qiáng)度。S卩，波長(zhǎng)λ 2的線性吸收系數(shù)λ 2可以由諧振波長(zhǎng)為λ 1的光的強(qiáng)度來(lái)控制。這表明，通過(guò)用波長(zhǎng)為λ 1的光和波長(zhǎng)為λ 2的光來(lái)照明樣本并且用波長(zhǎng)λ 2來(lái)拍攝透射圖像，能夠完全通過(guò)波長(zhǎng)為λ 1的光來(lái)控制透射圖像的對(duì)比度。另外，如果可以利用熒光性或磷光現(xiàn)象來(lái)執(zhí)行從圖21的激發(fā)態(tài)向圖22的基態(tài)的去激發(fā)過(guò)程，則其發(fā)射強(qiáng)度與Sl態(tài)下的分子數(shù)成比例。因此，也可以利用顯微鏡作為熒光顯微鏡來(lái)控制圖像的對(duì)比度。而且，采用雙諧振吸收過(guò)程的顯微術(shù)不僅可以如上所述來(lái)控制圖像的對(duì)比度，而且可以進(jìn)行化學(xué)分析。即，因?yàn)閳D19所示最外側(cè)電子的軌道具有特定于每個(gè)分子的能級(jí)，所以波長(zhǎng)λ 1在這些分子當(dāng)中改變，同時(shí)，波長(zhǎng)λ2也特定于這些分子。這里，即使用常規(guī)的單一波長(zhǎng)的光來(lái)照射樣本，也可以在一定程度上觀察到特定分子的吸收?qǐng)D像或者熒光圖像。然而，一般來(lái)說(shuō)，因?yàn)槟承┓肿拥奈疹l帶的波長(zhǎng)范圍彼此交疊，所以當(dāng)用單一波長(zhǎng)的光來(lái)照射樣本時(shí)，不能精確地識(shí)別出該樣本的化學(xué)成分。與此相反，采用雙諧振吸收過(guò)程的顯微術(shù)利用兩個(gè)波長(zhǎng)λ 1和λ 2來(lái)限制分子吸收光或發(fā)射光，其使得能夠比常規(guī)方法更精確地識(shí)別樣本的化學(xué)成分。另外，在激發(fā)價(jià)電子方面，只有那些相對(duì)于分子軸具有特定電場(chǎng)矢量的光被強(qiáng)烈吸收，由此通過(guò)判定波長(zhǎng)λ 1 的光和波長(zhǎng)λ2的光的偏振方向來(lái)拍攝吸收?qǐng)D像或熒光圖像實(shí)現(xiàn)了對(duì)相同分子的取向方向的識(shí)別。另外，近來(lái)提出了一種能夠通過(guò)采用雙諧振吸收過(guò)程來(lái)提供超出衍射極限的空間分辨率的熒光顯微鏡(例如，參見(jiàn)日本專利特開(kāi)No. 2001-100102)。圖23示出了分子的雙諧振吸收過(guò)程的概念圖，其中，處于基態(tài)SO的分子被波長(zhǎng)為 λ 1的光激發(fā)至第一激發(fā)態(tài)并進(jìn)一步被波長(zhǎng)為λ 2的光激發(fā)至第二激發(fā)態(tài)S2。應(yīng)注意到， 圖23示出了來(lái)自處于S2狀態(tài)的特定類型分子的熒光極其弱。具有如圖23所示光學(xué)特性的分子呈現(xiàn)了非常有趣的現(xiàn)象。與圖23 —樣，圖M也是雙諧振吸收過(guò)程的概念圖，其示出了表示空間距離的擴(kuò)展的垂直軸X、被波長(zhǎng)為λ 2的光照射的空間區(qū)域Al，以及沒(méi)有被波長(zhǎng)為λ 2的光照射的空間區(qū)域AO。在圖M中，處于Sl態(tài)的多個(gè)分子是通過(guò)在空間區(qū)域AO中用波長(zhǎng)為λ 1的光激發(fā)而生成的，這時(shí)，可以觀察到來(lái)自空間區(qū)域AO的、由波長(zhǎng)為λ3的光發(fā)射的熒光。然而，因?yàn)閷⒉ㄩL(zhǎng)為λ 2的光照射至空間區(qū)域Al，所以處于第一激發(fā)態(tài)Sl的大多數(shù)分子都立即被激發(fā)至更高狀態(tài)-第二激發(fā)態(tài)S2，沒(méi)有分子保留在第一激發(fā)態(tài)Sl。針對(duì)某些分子來(lái)識(shí)別這種現(xiàn)象。因?yàn)檫@種現(xiàn)象，自從開(kāi)始起在空間區(qū)域Al中就完全消除了波長(zhǎng)為λ 3的熒光并且沒(méi)有來(lái)自第二激發(fā)態(tài)S2的熒光，熒光本身在空間區(qū)域Al中被完全抑制(熒光抑制效應(yīng))并且僅發(fā)射來(lái)自空間區(qū)域AO的熒光。另外，當(dāng)波長(zhǎng)為λ 2的光交疊了熒光發(fā)射頻帶時(shí)，分子因誘發(fā)發(fā)射過(guò)程而被迫從第一激發(fā)態(tài)Sl躍遷至基態(tài)SO的更高振動(dòng)級(jí)。因而，更加增強(qiáng)了熒光抑制效應(yīng)。換句話說(shuō)， 隨著波長(zhǎng)為λ 2的光的發(fā)射，從第一激發(fā)態(tài)Sl發(fā)射的熒光量減小了。因此，如果分子被迫躍遷至量子能級(jí)(quantum level)，則呈現(xiàn)了熒光抑制效應(yīng)。具有這種特性的材料是光致變色分子、包括稀土元素的熒光物質(zhì)、量子點(diǎn)等。從顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域來(lái)看，這種現(xiàn)象具有非常重要的意義。即，常規(guī)掃描顯微鏡等利用會(huì)聚透鏡將激光束會(huì)聚成微光束(microbeam)，以便在要觀察的樣本上進(jìn)行掃描。這時(shí)，微光束的尺寸降至衍射極限，后者取決于會(huì)聚透鏡的數(shù)值孔徑(numerical aperture) 和波長(zhǎng)。因此，原理上不能預(yù)計(jì)進(jìn)一步的空間分辨率。然而，在圖對(duì)所示的情況下，因?yàn)橥ㄟ^(guò)空間上部分交疊的波長(zhǎng)為λ 1和波長(zhǎng)為入2 的兩個(gè)不同光來(lái)控制熒光區(qū)域，所以當(dāng)注意力集中在波長(zhǎng)為λ 1的光的發(fā)射區(qū)域上時(shí)，例如可以根據(jù)會(huì)聚透鏡的數(shù)值孔徑和波長(zhǎng)使熒光區(qū)域比衍射極限窄，這導(dǎo)致空間分辨率的顯著提高。因此，采用這種原理的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)超過(guò)衍射限制分辨率的、采用雙諧振吸收過(guò)程的超高分辨率顯微鏡，即，例如超高分辨率熒光顯微鏡。在利用若丹明(rhodamine)6G方面，例如，如果發(fā)射了波長(zhǎng)為532nm的光(泵浦光；第一照明光)，則若丹明6G分子從基態(tài)SO被激發(fā)至第一激發(fā)態(tài)Si，并且發(fā)射了峰值在波長(zhǎng)560nm的熒光。這時(shí)，如果照射了波長(zhǎng)為599nm的光(消除光；第二照明光)，則造成雙諧振吸收過(guò)程，致使若丹明6G分子躍遷至熒光發(fā)射非常困難的第二激發(fā)態(tài)。更具體地說(shuō)， 向若丹明6G同時(shí)照射泵浦光和消除光抑制了熒光性。圖25是常規(guī)提出的超高分辨率顯微鏡的主截面構(gòu)造圖。這種超高分辨率顯微鏡基于激光掃描型通用熒光顯微鏡并且包括三個(gè)獨(dú)立單元，即，光源單元210、掃描單元230 以及顯微鏡單元250。光源單元210具有泵浦光源211和消除光源212。從泵浦光源211發(fā)射的泵浦光入射到二向色棱鏡213并被其反射。從消除光源212發(fā)射的消除光在其相位經(jīng)過(guò)調(diào)制光學(xué)部件215的空間調(diào)制之后入射至二向色棱鏡213，透射過(guò)二向色棱鏡213并接著按照與泵浦光同心組合的方式出射(exit)。這里，在觀察利用若丹明6G染色的樣本時(shí)，利用Nd:YAG激光器來(lái)設(shè)置泵浦光源 211，以發(fā)射波長(zhǎng)為532nm的光，它是該激光器的二次諧波。另外，利用Nd: YAG激光器和拉曼移相器(Raman shifter)來(lái)設(shè)置消除光源212，以通過(guò)拉曼移相器來(lái)發(fā)射作為Nd: YAG激光器的、被調(diào)制成波長(zhǎng)為599nm的光的二次諧波的光，作為消除光。例如，調(diào)制光學(xué)部件215調(diào)制消除光的相位并且具有被圍繞光軸徑向劃分成8個(gè)區(qū)域的光瞳面，如圖26所示。這些區(qū)域都是通過(guò)形成彼此相差消除光的波長(zhǎng)的λ/8相位的光學(xué)多層膜，使得消除光的相位差圍繞光軸以旋轉(zhuǎn)，或者通過(guò)蝕刻玻璃基板而形成的。當(dāng)透射過(guò)調(diào)制光學(xué)部件215的消除光被會(huì)聚時(shí)，它產(chǎn)生了抵消光軸上的電場(chǎng)的中空消除光。掃描單元230在通過(guò)半棱鏡231傳遞從激光源單元210同軸發(fā)射的泵浦光和消除光之后，利用兩個(gè)檢電鏡(galvano mirror) 232、233在二維方向上進(jìn)行擺動(dòng)掃描，以便向下面將描述的顯微鏡單元250發(fā)射光。另外，掃描單元230分支從顯微鏡單元250入射的熒光，利用半棱鏡231反向跟蹤(track back)其路徑，使得所分支的熒光經(jīng)由投影透鏡234、 針孔235以及陷波濾波器236、237被光電倍增器接收。為簡(jiǎn)化附圖起見(jiàn)，檢電鏡232、233在圖25中可按共平面方式搖擺。陷波濾波器 236、237消除了混合在熒光中的泵浦光和消除光。另外，針孔235是組成共焦光學(xué)系統(tǒng)的重要光學(xué)部件，并且僅允許在所觀察樣本的特定截面上發(fā)射的熒光通過(guò)。顯微鏡單元250是通用熒光顯微鏡，其在半棱鏡251上反射從掃描單元230入射的泵浦光和消除光，并且利用顯微鏡物鏡252將光會(huì)聚在要觀察的、包含有三種電子狀態(tài) (至少包括基態(tài))的分子的樣本上。另外，樣本253上發(fā)射的熒光再次通過(guò)物鏡252準(zhǔn)直并且在半棱鏡251上反射，從而返回至掃描單元230，而穿過(guò)半棱鏡251的一部分熒光被導(dǎo)向目鏡254，從而被可視地觀察為熒光圖像。根據(jù)這種超高分辨率顯微鏡，除了靠近光軸(在那里，消除光的強(qiáng)度在樣本253的聚焦點(diǎn)上變?yōu)榱?的熒光以外，其它熒光都被控制，結(jié)果，能夠僅測(cè)量在比泵浦光的寬度窄的區(qū)域中的熒光標(biāo)記(Iabeler)分子。因此，通過(guò)在計(jì)算機(jī)上按二維排列每個(gè)測(cè)量點(diǎn)處的熒光信號(hào)，可以形成分辨率超出衍射極限的空間分辨率的顯微鏡圖像。應(yīng)注意到，調(diào)制光學(xué)部件可以被設(shè)置成調(diào)制消除光的偏振，以便生成抵消光軸上的電場(chǎng)的中空消除光(例如，參見(jiàn)Y. Iketaki等人的Rev. Sci. Instrum 75(2004)5131)。另外，調(diào)制光學(xué)部件可以設(shè)置在泵浦光和消除光的公共光路上(例如，參見(jiàn)日本專利特開(kāi) No. 2010-150260)。在這種情況下，調(diào)制光學(xué)部件被形成為具有同心分離的中央?yún)^(qū)域和外周區(qū)域的環(huán)狀。該中央?yún)^(qū)域具有形成在透明光學(xué)基板(如玻璃基板等)上的光學(xué)多層，以反射泵浦光而使消除光相位反轉(zhuǎn)η而透過(guò)。該外周區(qū)域例如由光學(xué)基板形成，并且使泵浦光和消除光無(wú)相位調(diào)制地透過(guò)。另選的是，調(diào)制光學(xué)部件具有圍繞光軸徑向劃分的多個(gè)區(qū)域， 每個(gè)區(qū)域都由光學(xué)多層形成，以使泵浦光以相同相位透射，而調(diào)制消除光的相位，以便形成相位分布按2 31旋轉(zhuǎn)的拉蓋爾高斯(Laguerre-Gaussian)光束。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明第一方面的顯微鏡包括調(diào)制光學(xué)元件，該調(diào)制光學(xué)元件具有用于對(duì)照明光進(jìn)行空間調(diào)制的多個(gè)區(qū)域；以及調(diào)節(jié)元件，該調(diào)節(jié)元件用于調(diào)節(jié)由所述調(diào)制光學(xué)元件進(jìn)行了調(diào)制的照明光的光學(xué)特性。本發(fā)明的第二方面是根據(jù)本發(fā)明第一方面的顯微鏡，其中，所述調(diào)節(jié)元件對(duì)已經(jīng)通過(guò)了所述調(diào)制光學(xué)元件的照明光進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得光軸周圍的透射率和相位中的至少一方的非對(duì)稱分量在所述調(diào)制光學(xué)元件的所述多個(gè)區(qū)域之間抵消。本發(fā)明的第三方面是根據(jù)本發(fā)明第一方面的顯微鏡，其中，假設(shè)Si表示由所述調(diào)制光學(xué)元件空間調(diào)制的照明光的光瞳面上的與所述多個(gè)區(qū)域相對(duì)應(yīng)的各個(gè)區(qū)域i的尺寸，θ i表示通過(guò)了區(qū)域i的光的相位，Ti表示透射率，Ui表示能量密度，則所述調(diào)節(jié)元件按滿足以下關(guān)系式的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)
權(quán)利要求
1.一種顯微鏡，該顯微鏡包括調(diào)制光學(xué)元件，該調(diào)制光學(xué)元件具有用于對(duì)照明光進(jìn)行空間調(diào)制的多個(gè)區(qū)域；以及調(diào)節(jié)元件，該調(diào)節(jié)元件用于調(diào)節(jié)由所述調(diào)制光學(xué)元件進(jìn)行了調(diào)制的照明光的光學(xué)特性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯微鏡，其中，所述調(diào)節(jié)元件對(duì)已經(jīng)通過(guò)了所述調(diào)制光學(xué)元件的照明光進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得光軸周圍的透射率和相位中的至少一方的非對(duì)稱分量在所述調(diào)制光學(xué)元件的所述多個(gè)區(qū)域之間抵消。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯微鏡，其中，假設(shè)Si表示由所述調(diào)制光學(xué)元件空間調(diào)制的照明光的光瞳面上的與所述多個(gè)區(qū)域相對(duì)應(yīng)的各個(gè)區(qū)域i的尺寸，θ 1表示通過(guò)了區(qū)域i的光的相位，Ti表示透射率，Ui表示能量密度，則所述調(diào)節(jié)元件按滿足以下關(guān)系式的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯微鏡，其中，所述調(diào)節(jié)元件一體地形成在所述調(diào)節(jié)光學(xué)元件中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯微鏡，其中，作為所述多個(gè)區(qū)域，所述調(diào)制光學(xué)元件包括繞光軸徑向劃分的多個(gè)區(qū)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的顯微鏡，其中，假設(shè)對(duì)于所述調(diào)制光學(xué)元件的所述多個(gè)區(qū)域， 區(qū)域a具有透射率Ta、尺寸&和相位θ a，而隔著所述光軸與區(qū)域a相對(duì)的區(qū)域b具有透射率Tb、尺寸&和相位θ b，則滿足下面的等式，TaSaSin θ a+TbSbsin θ b = 0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的顯微鏡，其中，所述區(qū)域a和所述區(qū)域b具有相同尺寸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯微鏡，其中，作為所述多個(gè)區(qū)域，所述調(diào)制光學(xué)元件包括同心劃分的多個(gè)區(qū)域。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯微鏡，其中，所述照明光具有第一照明光和第二照明光，所述第一照明光通過(guò)將具有至少兩個(gè)激發(fā)量子態(tài)的材料從穩(wěn)定態(tài)激發(fā)至第一量子態(tài)而使該材料發(fā)光，所述第二照明光通過(guò)使所述材料進(jìn)一步躍遷至另一量子態(tài)而抑制發(fā)光；所述顯微鏡還包括照明光學(xué)系統(tǒng)，該照明光學(xué)系統(tǒng)包括物鏡，該物鏡通過(guò)局部地使得所述第一照明光和所述第二照明光交疊來(lái)將這些光會(huì)聚在包括所述材料的試樣上；并且所述調(diào)制光學(xué)元件和所述調(diào)節(jié)元件設(shè)置在所述照明光學(xué)系統(tǒng)中。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的顯微鏡，其中，所述調(diào)制光學(xué)元件調(diào)制所述第二照明光的相位。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的顯微鏡，其中，所述調(diào)制光學(xué)元件使所述第一照明光透射， 而不改變電場(chǎng)的符號(hào)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的顯微鏡，其中，所述調(diào)制光學(xué)元件具有光學(xué)多層。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的顯微鏡，其中，所述照明光學(xué)系統(tǒng)按空間匹配方式交疊所述第一照明光的光軸和所述第二照明光的光軸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的顯微鏡，其中，所述照明光學(xué)系統(tǒng)具有單模光纖；并且所述第一照明光和所述第二照明光經(jīng)由所述單模光纖入射在所述調(diào)制光學(xué)元件和所述調(diào)節(jié)元件上。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的顯微鏡，其中，所述調(diào)節(jié)元件包括用于調(diào)節(jié)所述照明光的光通量的直徑的光闌。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的顯微鏡，其中，所述光闌能夠在與進(jìn)入的照明光的光軸正交的方向上移動(dòng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的顯微鏡，該顯微鏡包括多個(gè)照明光源，這些照明光源能夠產(chǎn)生至少三種波長(zhǎng)的照明光，其中，從所述多個(gè)照明光源同時(shí)產(chǎn)生所述第一照明光和所述第二照明光。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的顯微鏡，該顯微鏡包括光檢測(cè)器，該光檢測(cè)器檢測(cè)所述試樣在被來(lái)自所述照明光學(xué)系統(tǒng)的所述第一照明光和所述第二照明光照射時(shí)發(fā)出的光；共焦針孔，該共焦針孔具有尺寸可變的孔徑，設(shè)置在所述光檢測(cè)器的入射側(cè)的與所述物鏡的焦點(diǎn)位置共軛的位置處；驅(qū)動(dòng)單元，該驅(qū)動(dòng)單元改變所述共焦針孔的所述孔徑的尺寸；以及控制單元，該控制單元通過(guò)控制所述多個(gè)照明光源來(lái)同時(shí)產(chǎn)生所述第一照明光和所述第二照明光，并且還根據(jù)所述第一照明光和所述第二照明光，經(jīng)由所述驅(qū)動(dòng)單元控制所述共焦針孔的所述孔徑，以滿足下式NA 物鏡的數(shù)值孔徑 M 光檢測(cè)器在物側(cè)會(huì)聚像的倍率 λ p:第一照明光的波長(zhǎng) λ…第二照明光的波長(zhǎng) ο dip 熒光抑制截面積 Ce0 第二照明光的峰值強(qiáng)度 ε 第二照明光的光子通量。
全文摘要
本發(fā)明提供一種顯微鏡，該顯微鏡能夠在焦平面上按希望形狀形成射束點(diǎn)。該顯微鏡設(shè)置有調(diào)制光學(xué)元件(38)和調(diào)節(jié)元件(37)，所述調(diào)制光學(xué)元件(38)具有用于對(duì)照明光進(jìn)行特殊調(diào)制的多個(gè)區(qū)域，所述調(diào)節(jié)元件(37)用于調(diào)節(jié)由所述調(diào)制光學(xué)元件進(jìn)行了調(diào)制的照明光的光學(xué)特性。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102288588SQ20111016240
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者池瀧慶記 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社