專利名稱:尋找發(fā)酵用原料玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo)的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于工業(yè)發(fā)酵原料分析領(lǐng)域,涉及一種尋找發(fā)酵用原料玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo)的方法。
背景技術(shù):
玉米漿是生產(chǎn)玉米淀粉過程中在浸漬玉米時(shí)得到的副產(chǎn)品。它含有氨基酸、有機(jī)酸、可溶性糖、維生素和金屬鹽類等多種營養(yǎng)物質(zhì),是生產(chǎn)抗生素等培養(yǎng)基中的重要原料, 為微生物生長提供天然的有機(jī)氮源。由于其價(jià)格低廉、營養(yǎng)豐富,在工業(yè)微生物發(fā)酵中得到廣泛地應(yīng)用。玉米漿現(xiàn)有的技術(shù)質(zhì)量檢測方法由各生產(chǎn)廠商自行規(guī)定,并無國家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)?,F(xiàn)行的質(zhì)量檢查規(guī)定外觀濃稠、不透明;色澤棕色到棕褐色;無腐臭等異味;及規(guī)定干重、蛋白質(zhì)、酸度、亞硫酸和灰分的含量標(biāo)準(zhǔn)。這些檢查不能科學(xué)準(zhǔn)確地判定原料的質(zhì)量,不同批次的原料對發(fā)酵產(chǎn)品的效價(jià)有很大的影響,為了全面準(zhǔn)確地控制原料的質(zhì)量,保證高效價(jià)發(fā)酵產(chǎn)品,提高產(chǎn)率,避免浪費(fèi),故有必要對其質(zhì)量控制指標(biāo)進(jìn)行研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種尋找發(fā)酵用原料玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下尋找發(fā)酵用原料玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo)的方法,其特征是包括下述步驟(1)對玉米漿的化學(xué)成分的測定①樣品的制備將0.5_2g均勻的發(fā)酵用原料玉米漿置于離心管中,離心收集上清;將獲得的上清液用超純水稀釋10-40體積倍,取10-40 μ L置于另一離心管中,加入30-50 μ L的0. 040mg/ mL氘標(biāo)記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標(biāo);冷凍干燥后,加入50-100 μ L濃度為20mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30°C _40°C水浴中肟化反應(yīng)60-120min ;再加入60-100 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35°C _40°C水浴進(jìn)行硅烷化反應(yīng)20-50min ;②氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀測定方法將1 μ 1步驟①獲得的樣品進(jìn)到氣相色譜中,色譜柱為DB-5MS,所述色譜柱的規(guī)格為30mΧ0. 25mm i. d.,進(jìn)樣口溫度250°C _280°C,載氣為高純氦氣,流速0. 6-0. 8ml/min,分流比30 1-10 1,柱溫箱升溫程序?yàn)槌跏?0°C-80°C保持2-5min,以4°C/min-8°C/ min的速度升到250°C -300°C,保持8-lOmin,使用EI電離源,源溫230°C _280°C,檢測器電壓2300V-2700V,電離電壓60eV_80eV,電流30 μ A-50 μ A ;質(zhì)譜檢測范圍50_800m/z ;成分的鑒定使用NIST數(shù)據(jù)庫,質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理和成分相對含量的測定使用Masslynx 4. 1軟件;并通過對色譜峰面積積分處理,并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積對照,得到發(fā)酵用原料玉米漿中化學(xué)成分的相對含量;(2)偏最小二乘判別分析法
①將方法⑴獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和預(yù)處理;②用SIMCA-P 11. 5軟件對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘法判別分析,得到用于表達(dá)樣本相似性和差異性的得分圖、載荷圖和VIP圖;在得分圖中,樣品點(diǎn)相互之間距離越近,說明樣本的相似度越大,距離越遠(yuǎn),說明樣本差異越大,可用來尋找不同批次玉米漿中各物質(zhì)的相似和差異;在載荷圖中,每個(gè)點(diǎn)表示每個(gè)物質(zhì),距離中心點(diǎn)距離越遠(yuǎn)的物質(zhì), 其在不同批次的含量差異越大,便可作為玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo);VIP表示每個(gè)物質(zhì)對區(qū)分樣本的貢獻(xiàn)大小,VIP > 1可以認(rèn)為是對玉米漿質(zhì)量影響最為顯著的指標(biāo)。本發(fā)明采用高通量高分辨率的檢測技術(shù),可以同時(shí)測得玉米漿中的多種化學(xué)成分,方法簡便,經(jīng)過多批原料驗(yàn)證,重復(fù)性好。本發(fā)明的方法分辨率和靈敏度高,具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,采用的偏最小二乘判別分析法可以迅速有效地從高通量數(shù)據(jù)中篩選到區(qū)別不同批次原料的化學(xué)物質(zhì),發(fā)現(xiàn)玉米漿中九種化學(xué)物質(zhì)葡萄糖、乳酸、脯氨酸、磷酸、半乳糖、丙氨酸、果糖、5-酮脯氨酸、甘氨酸可以考慮作為玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo),是對現(xiàn)行玉米漿質(zhì)量檢查的一個(gè)補(bǔ)充。
圖1為不同批次玉米漿的偏最小二乘法判別分析得分圖,1-1為不同批次玉米漿主成分分析t[l]-t[2] ; 1-2圖不同批次玉米漿主成分分析t[l]-u[l]圖。圖2為不同批次玉米漿的偏最小二乘判別分析載荷圖,2-1為不同批次玉米漿 w*c[l]-w*c[2]散點(diǎn)圖;2-2為不同批次玉米漿第一主成分的p-p (corr) S圖。圖3為不同批次玉米漿的偏最小二乘判別分析VIP圖(VIP. > 1)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明本發(fā)明所用原料玉米漿是指質(zhì)量濃度大于40%的玉米漿。實(shí)施例1尋找發(fā)酵用原料玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo)的方法,包括下述步驟(1)對11批不同的玉米漿進(jìn)行化學(xué)成分測定①樣品的制備將Ig均勻的玉米漿樣品置于離心管中,離心收集上清;將獲得的上清液用超純水稀釋20倍,取20 μ L置于另一離心管中,加入30 μ L的0. 040mg/mL氘標(biāo)記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標(biāo)。冷凍干燥后,加入50 μ L濃度為20mg/mL甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶于30°C水浴中肟化反應(yīng)90min。反應(yīng)結(jié)束后再加入80 μ L N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于37°C 水浴進(jìn)行硅烷化反應(yīng)30min ;②氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀測定方法將1 μ 1步驟①獲得的樣品進(jìn)到氣相色譜中,色譜柱為DB-5MS,所述色譜柱的規(guī)格為30mX0. 25mm i. d.,進(jìn)樣口溫度250°C,載氣為高純氦氣,流速0. 6ml/min,分流比20 1, 柱溫箱升溫程序?yàn)槌跏?0°C保持2min,以5°C /min的速度升到290°C,保持lOmin,使用EI電離源,源溫280°C,檢測器電壓2500V,電離電壓80eV,電流50 μ A ;質(zhì)譜檢測范圍 50-800m/z ;成分的鑒定使用NIST數(shù)據(jù)庫,質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理和成分相對含量的測定使用Masslynx 4. 1軟件;并通過對色譜峰面積積分處理,并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積對照,得到發(fā)酵用原料玉米漿中成分的相對含量;一共檢測到80多種化合物,其中能鑒定到58種,見表1。(2)偏最小二乘法判別分析①將步驟(1)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和Pareto預(yù)處理,以消除同一樣品中不同成分含量的較大差異對偏最小二乘判別分析結(jié)果的影響。②用SIMCA-P 11. 5軟件對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘判別分析,得到用于表達(dá)樣本相似性和差異性的得分圖、載荷圖和VIP圖;在得分圖中,樣品點(diǎn)相互之間距離越近,說明樣本的相似度越大,距離越遠(yuǎn),說明樣本差異越大,可用來尋找不同批次玉米漿中各物質(zhì)的相似和差異;在載荷圖中,每個(gè)點(diǎn)表示每個(gè)物質(zhì),距離中心點(diǎn)距離越遠(yuǎn)的物質(zhì),其在不同批次的含量差異越大,便可作為玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo);VIP表示每個(gè)物質(zhì)的對區(qū)分樣本的貢獻(xiàn)大小,VIP > 1可以認(rèn)為是對玉米漿的質(zhì)量影響最為顯著的指標(biāo)。從圖1_1(不同批次玉米漿主成分分析t[l]-t[2]圖)中可以得到11批玉米漿可以被明顯區(qū)分為三類,即批次1和2聚在一起,批次3、4和11聚在一起,其余批次聚為一類。由圖1_2(不同批次玉米漿主成分分析t[l]-u[l]圖)可知,批次1和2的u[l]值最大,批次3、4和11的u[l]值最小,其余批次的u[l]值在原點(diǎn)附近,由此分為三類。這就表明即使玉米漿檢測符合現(xiàn)行的質(zhì)量檢查,但不同批次的玉米漿依然存在較大的差異,對發(fā)酵有較大的影響。從圖2中可以找到區(qū)分不同批次玉米漿的質(zhì)量的物質(zhì),在圖2-1 (不同批次玉米漿 w*c[l]-w*c[2]散點(diǎn)圖)根據(jù)距離中心點(diǎn)越遠(yuǎn),物質(zhì)的含量差異越大的原則,可以初步篩選不同批次玉米漿含量差異較大的物質(zhì);在圖2-2(不同批次玉米漿第一主成分的p-p (corr) S圖)根據(jù)Icorrl. > 0. 5的原則,進(jìn)一步篩選可以區(qū)分不同批次玉米漿的物質(zhì),ρ (corr) > 0. 5表明該物質(zhì)對圖1中聚類正半軸影響較大,ρ (corr) < -0. 5表明該物質(zhì)對圖1中聚類負(fù)半軸影響較大;根據(jù)圖3來確定各物質(zhì)的貢獻(xiàn)大小,VIP值越大表示各物質(zhì)對聚類分析的貢獻(xiàn)也越大,一般以VIP > 1為原則選擇標(biāo)志物。綜合三張圖的分析,從而最終可以確定區(qū)別不同批次玉米漿質(zhì)量的主要物質(zhì)有16個(gè),依次為葡萄糖、乳酸、脯氨酸、磷酸、半乳糖、 丙氨酸、果糖、5-酮脯氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、檸檬酸、谷氨酸和賴氨酸。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),乳酸和磷酸含量差異主要由玉米浸漬中微生物發(fā)酵引起的,是不同廠家玉米漿工藝差異而造成的;脯氨酸是玉米中的主要氨基酸成分,其差異可能由于不同廠家使用的玉米產(chǎn)地或季節(jié)不同而造成的;這些質(zhì)量差異標(biāo)志物主要是為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)的,另外脯氨酸和甘氨酸在發(fā)酵過程中還對微生物的滲透壓具有重要影響。由于前九個(gè)物質(zhì)影響尤為顯著,因此可以考慮作為玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo)。表1 實(shí)施例1所測得的玉米漿中的化學(xué)成分的種類
權(quán)利要求
1.尋找發(fā)酵用原料玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo)的方法,其特征是包括下述步驟(1)對玉米漿的化學(xué)成分的測定①樣品的制備將0. 5-2g均勻的發(fā)酵用原料玉米漿置于離心管中,離心收集上清;將獲得的上清液用超純水稀釋10-40體積倍,取10-40 μ L置于另一離心管中,加入30-50 μ L的0. 040mg/mL 氘標(biāo)記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標(biāo);冷凍干燥后,加入50-100 μ L濃度為20mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30°C -40°C水浴中肟化反應(yīng)60-120min ;再加入60-100 μ L N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35°C _40°C水浴進(jìn)行硅烷化反應(yīng)20-50min ;②氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀測定方法將Iy 1步驟①獲得的樣品進(jìn)到氣相色譜中,色譜柱為DB-5MS,所述色譜柱的規(guī)格為 30mX0. 25mm i. d.,進(jìn)樣口溫度250°C _280°C,載氣為高純氦氣,流速0. 6-0. 8ml/min,分流比30 1-10 1,柱溫箱升溫程序?yàn)槌跏?0°C-80°C保持2-5min,以4°C/min-8°C/min 的速度升到250°C -300°C,保持8-lOmin,使用EI電離源,源溫230°C _280°C,檢測器電壓 2300V-2700V,電離電壓60eV_80eV,電流30 μ Α-50 μ A ;質(zhì)譜檢測范圍50_800m/z ;成分的鑒定使用NIST數(shù)據(jù)庫,質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理和成分相對含量的測定使用Masslynx 4. 1軟件;并通過對色譜峰面積積分處理,并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積對照,得到發(fā)酵用原料玉米漿中化學(xué)成分的相對含量;(2)偏最小二乘判別分析法①將方法(1)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和預(yù)處理;②用SIMCA-P11. 5軟件對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘法判別分析,得到用于表達(dá)樣本相似性和差異性的得分圖、載荷圖和VIP圖;在得分圖中,樣品點(diǎn)相互之間距離越近,說明樣本的相似度越大,距離越遠(yuǎn),說明樣本差異越大,可用來尋找不同批次玉米漿中各物質(zhì)的相似和差異;在載荷圖中,每個(gè)點(diǎn)表示每個(gè)物質(zhì),距離中心點(diǎn)距離越遠(yuǎn)的物質(zhì),其在不同批次的含量差異越大,便可作為玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo);VIP表示每個(gè)物質(zhì)對區(qū)分樣本的貢獻(xiàn)大小,VIP > 1可以認(rèn)為是對玉米漿質(zhì)量影響最為顯著的指標(biāo)。
全文摘要
本發(fā)明公開了尋找發(fā)酵用原料玉米漿的質(zhì)量控制指標(biāo)的方法,包括下述步驟對玉米漿的化學(xué)成分的測定①樣品的制備②氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀測定方法(2)偏最小二乘判別分析法①將方法(1)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和預(yù)處理;②用SIMCA-P 11.5軟件對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘法判別分析,得到用于表達(dá)樣本相似性和差異性的得分圖、載荷圖和VIP圖;本發(fā)明采用高通量高分辨率的檢測技術(shù),可以同時(shí)測得玉米漿中的多種化學(xué)成分,方法簡便,經(jīng)過多批原料驗(yàn)證,重復(fù)性好。本發(fā)明的方法分辨率和靈敏度高,具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,是對現(xiàn)行玉米漿質(zhì)量檢查的一個(gè)補(bǔ)充。
文檔編號G01N30/72GK102331474SQ20111016568
公開日2012年1月25日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者元英進(jìn), 高赟 申請人:天津大學(xué)