專(zhuān)利名稱(chēng)：逆轉(zhuǎn)或降低食管癌放療抗性的增敏劑、篩選方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和免疫治療領(lǐng)域，具體而言涉及逆轉(zhuǎn)或降低食管癌放療抗性的增敏劑、篩選方法及其用途。進(jìn)一步地，涉及對(duì)食管癌放療抗性基因的基因沉默劑、沉默方法及其用途。本發(fā)明通過(guò)對(duì)選擇的特定抗性基因的沉默，能夠有效地實(shí)現(xiàn)放療的增敏效果，進(jìn)而能夠更好地進(jìn)行個(gè)體化治療，為食管癌的治療提供更有效的治療方案。
背景技術(shù)：
食管癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，在全世界是第六位癌癥相關(guān)的死亡原因[EnzingerPC&Mayer RJ. Esophageal cancer. N Engl J Med 2003 ;349 :2241 2252]。已知放射治療是食管癌的主要治療手段之一，但局部失敗率高達(dá)50% -55%，即使增加放療或化療劑量仍然不能改善局控率[Cooper J 等人，Radiation Therapy Oncology Group for the Chemoradiotherapy of locally advanced esophageal cancer Long-term follow-upof a prospective randomized trial (RT0G85-01). JAMA 1999 ;281 :16231627 ;MinskyB 等人，INT 0123 (Radiation Therapy Oncology Group 94-05)phase III trial ofcombinedmodality therapy for esophageal cancer :High_dose versus standard-doseradiation therapy. J Clin Oncol 2002 ;20 :11671174]。目前研究發(fā)現(xiàn)放療局部失敗除了與腫瘤乏氧、劑量限制性毒性降低照射量等因素有關(guān)外，與放射抵抗密切相關(guān)?？梢哉f(shuō)放射抵抗是放療后局部復(fù)發(fā)的主要原因。體內(nèi)食管癌瘤中某些基因的表達(dá)狀態(tài)直接影響著癌細(xì)胞的放射抗性[K Fukuda等人，Differentialgene expression profiles of radioresistant oesophageal cancer cell linesestablished by continuous fractionated irradiation. British Journal of cancer，2004 ；91 (8) :1543-1550] o對(duì)局部失敗率高達(dá)50% -55%的這部分患者人群，有必要尋找與食管癌的放療抗性相關(guān)基因，并以之為靶點(diǎn)獲得能夠增敏放療抗性基因的增敏劑，借助這種篩選抑制或者消除放療抗性，進(jìn)而為這部分食管癌患者提供個(gè)體化治療，提高患者的生存率。

發(fā)明內(nèi)容
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，發(fā)明人進(jìn)行了多方面的研究工作，先在抗性敏感基因搜索方面進(jìn)行了大量工作。主要包括應(yīng)用包含48000個(gè)探針的Illumine_6_V3人類(lèi)全基因組芯片，對(duì)比調(diào)查了經(jīng)多次照射產(chǎn)生放射抵抗性的食管癌細(xì)胞系KYSE-170R及其親代細(xì)胞系KYSE-170的基因表達(dá)譜差異。由qRT-PCR和Western blot證實(shí)該基因確實(shí)存在差異表達(dá)。應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾體系在體內(nèi)外驗(yàn)證差異基因與放射抵抗的關(guān)系，并對(duì)該基因在食管癌患者病理組織中的表達(dá)情況進(jìn)行回顧性分析。試驗(yàn)結(jié)果表明食管癌細(xì)胞系KYSE-170R及其親代細(xì)胞系KYSE-170的基因在未照射、照射后8小時(shí)及照射后24小時(shí)分別有945，733和1232個(gè)表達(dá)差異基因。qRT-PCR結(jié)果提示相對(duì)于親代細(xì)胞系KYSE-170，放射抵抗細(xì)胞系KYSE-170R在未照射、照射后8小時(shí)及照射后24小時(shí)AKR1C3分別有9. 39，5. 94和9. 20倍的表達(dá)上調(diào)。Western blot結(jié)果證實(shí)，在未照射的放射抵抗細(xì)胞系KYSE-170R中AKR1C3蛋白表達(dá)量顯著高于親代細(xì)胞系KYSE_170(P< O. 05)。應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾體系沉默AKR1C3后，放射抵抗細(xì)胞系KYSE-170R的放射敏感性顯著增強(qiáng)，應(yīng)用AKR1C3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)親代細(xì)胞系KYSE-170發(fā)現(xiàn)其放射抵抗性顯著增強(qiáng)。機(jī)制探討初步結(jié)果提示，AKR1C3沉默引起的放射敏感性增強(qiáng)，很可能與ROS晚聚集和放療后48小時(shí)內(nèi)G2期細(xì)胞阻滯有關(guān)。在對(duì)食管癌患者病理組織中的表達(dá)·情況進(jìn)行回顧性分析中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)AKR1C3表達(dá)于食管癌細(xì)胞，正常食管粘膜細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞及小血管上皮中。正常食管粘膜細(xì)胞的表達(dá)量明顯低于高分化食管鱗癌細(xì)胞；高分化食管鱗癌細(xì)胞表達(dá)量明顯高于低分化食管鱗癌細(xì)胞。而且后續(xù)的研究表明，AKR1C3可能會(huì)為食管癌，尤其是食管高分化鱗癌，提供新的放射增敏藥物作用靶點(diǎn)?？傊?，經(jīng)過(guò)上述多方面努力，發(fā)明人終于找到了與食管癌抗性相關(guān)的基因-AKR1C3 (Homo sapiens aldo-keto reductase family 1，memberC3(3-alphahydroxysteroid dehydrogenase, type II) (AKR1C3)，經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)該序列的 Genbank 號(hào)為NM—003739，其全序列如下I gcccattgtt tttgtaatct ctgaggagaa gcagcagcaa acatttgcta gtcagacaag61 tgacagggaa tggattccaa acaccagtgt gtaaagctaa atgatggcca cttcatgcct121 gtattgggat ttggcaccta tgcacctcca gaggttccga gaagtaaagc tttggaggtc181 acaaaattag caatagaagc tgggttccgc catatagatt ctgctcattt atacaataat241 gaggagcagg ttggactggc catccgaagc aagattgcag atggcagtgt gaagagagaa301 gacatattct acacttcaaa gctttggtcc acttttcatc gaccagagtt ggtccgacca361 gccttggaaa actcactgaa gaaagctcaa ttggactatg ttgacctcta tcttattcat421 tctccaatgt ctctaaagcc aggtgaggaa ctttcaccaa cagatgaaaa tggaaaagta481 atatttgaca tagtggatct ctgtaccacc tgggaggcca tggagaagtg taaggatgca541 ggattggcca agtccattgg ggtgtcaaac ttcaaccgca ggcagctgga gatgatcctc601 aacaagccag gactcaagta caagcctgtc tgcaaccagg tagaatgtca tccgtatttc661 aaccggagta aattgctaga tttctgcaag tcgaaagata ttgttctggt tgcctatagt721 gctctgggat ctcaacgaga caaacgatgg gtggacccga actccccggt gctcttggag781 gacccagtcc tttgtgcctt ggcaaaaaag cacaagcgaa ccccagccct gattgccctg841 cgctaccagc tgcagcgtgg ggttgtggtc ctggccaaga gctacaatga gcagcgcatc901 agacagaacg tgcaggtttt tgagttccag ttgactgcag aggacatgaa agccatagat961 ggcctagaca gaaatctcca ctattttaac agtgatagtt ttgctagcca ccctaattat1021 ccatattcag atgaatatta acatggaggg ctttgcctga tgtctaccag aagccctgtg1081 tgtggatggt gacgcagagg acgtctctat gccggtgact ggacatatca cctctactta1141 aatccgtcct gtttagcgac ttcagtcaac tacagctgag tccataggcc agaaagacaa1201 taaattttta tcattttgaa ataa(SEQ ID NO :1)該序列可以參見(jiàn)NCBI Genbank 網(wǎng)頁(yè) http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NM—003739. 4)，
在通過(guò)多個(gè)試驗(yàn)確定AKR1C3蛋白與放射抗性密切相關(guān)后，發(fā)明人對(duì)其進(jìn)行了多方面檢索，發(fā)現(xiàn)醛酮還原酶超家族(AKRlC)與腫瘤生物學(xué)非常密切。AKRlC家族為37kDa可溶性蛋白，可通過(guò)NAD(P) (H)介導(dǎo)的氫離子傳遞作用，將羰基還原為羥基。AKR1C3屬于醛酮還原酶超家族成員。在人類(lèi)，AKRlC有四個(gè)亞型，即AKRlCl，AKR1C2，AKR1C3和AKR1C4。AKR1C3有大于86 %的序列與其余3個(gè)AKRs同源。AKR1C3具有3 a -HSD, 17 β -HSD,20 a -HSD，和前列環(huán)素(PG)F合成酶活性，能夠催化雄激素、雌激素、前列腺素和前列環(huán)素及外源性物質(zhì)的代謝。AKRlC3mRNA首先被發(fā)現(xiàn)與表達(dá)于乳腺和前列腺，隨后在肝臟、肺、小腸、腎上腺、腦、子宮和睪丸陸續(xù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)。AKR1C3已被證明在多種類(lèi)型癌癥中表達(dá)失調(diào)，包括骨髓增生異常綜合征(MDS，難治性貧血)，子宮內(nèi)膜癌，肺癌中表達(dá)上調(diào)。但是目前，AKR1C3在食管癌中的表達(dá)尚無(wú)報(bào)道。
為了構(gòu)建藥物合適的藥物篩選模型，并且進(jìn)一步確認(rèn)放射抗性與AKR1C3的關(guān)系，發(fā)明人構(gòu)建了系列靶向AKR1C3的載體作為候選藥物在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平檢測(cè)該篩選方法的可行性。具體是通過(guò)所述構(gòu)建的載體來(lái)沉默AKR1C3的表達(dá)，對(duì)沉默后的細(xì)胞進(jìn)行放射檢驗(yàn)，觀察該基因沉默與放射抗性間的關(guān)系。此處，實(shí)施例中所用的候選藥物是反義分子，事實(shí)上還可以采用各種已知的化合物庫(kù)等對(duì)所述候選藥物進(jìn)行檢測(cè)。也可以通過(guò)其它能夠?qū)KR1C3的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的化合物例如蛋白核酸等進(jìn)行篩選。具體地，發(fā)明人建立了細(xì)胞篩選模型和動(dòng)物篩選模型，選取三種已知對(duì)AKR1C3基因有靶向作用的基因作為候選藥物，在動(dòng)物體上對(duì)AKR1C3進(jìn)行沉默篩選，對(duì)沉默成功的裸鼠的放療抗性進(jìn)行檢驗(yàn)，一方面驗(yàn)證了篩選模型的可靠性，一方面對(duì)篩選到的目的序列的增敏效果進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果從三個(gè)候選基因中篩選到一個(gè)有效的沉默序列，并且食管癌荷瘤裸鼠試驗(yàn)結(jié)果表明，沉默AKR1C3后，放射抵抗細(xì)胞系KYSE-170R的放射敏感性顯著增強(qiáng)。對(duì)放療后殘留的裸鼠腫瘤組織進(jìn)行HE染色發(fā)現(xiàn)，沉默AKR1C3后的放射抵抗細(xì)胞系KYSE-170R形成的腫瘤組織內(nèi)為大量瘢痕組織僅殘留小量腫瘤細(xì)胞，而對(duì)照的放射抵抗細(xì)胞系KYSE-170R形成的腫瘤組織內(nèi)有大量腫瘤細(xì)胞殘留。沉默AKR1C3將引起食管鱗癌細(xì)胞放射敏感性增強(qiáng)。該結(jié)果將為AKR1C3成為放療增敏藥物靶點(diǎn)提供生物學(xué)依據(jù)，尤其是針對(duì)食管高分化鱗癌。同時(shí)也驗(yàn)證了本發(fā)明的增敏劑效果。由此，一方面，本發(fā)明提供了用于食管癌放療抗性的增敏治療的靶點(diǎn)-AKR1C3基因，還提供了用于食管癌放療抗性的增敏治療的基因藥物，其為AKR1C3基因表達(dá)抑制劑，或者沉默劑，優(yōu)選地，所述增敏劑是反義核酸。任選地，其中含有藥學(xué)上可接受的佐劑。另外一方面，本發(fā)明提供了用于食管癌放療抗性的增敏治療的方法，其包括使AKR1C3基因沉默或者表達(dá)抑制的步驟。優(yōu)選地，在所述步驟之前，對(duì)待治療個(gè)體進(jìn)行食管癌細(xì)胞分類(lèi)檢驗(yàn)，優(yōu)選對(duì)食管鱗癌個(gè)體實(shí)施所述步驟，進(jìn)一步優(yōu)選對(duì)食管鱗癌高分化個(gè)體實(shí)施所述步驟。具體地，所述步驟為對(duì)有此需要的個(gè)體給予有效量的AKR1C3基因沉默劑或者AKR1C3基因抑制劑。一方面，本發(fā)明提供了一種非治療目的用于食管癌放療抗性細(xì)胞的篩選，其包括對(duì)所述細(xì)胞實(shí)施AKR1C3基因沉默或者表達(dá)抑制的步驟。其中所述細(xì)胞是離體的，或者所述細(xì)胞是來(lái)自食管鱗癌個(gè)體的，優(yōu)選來(lái)自食管鱗癌高分化個(gè)體的。另外一方面，本發(fā)明提供了一種非治療目的用于食管癌放療抗性動(dòng)物的篩選，其包括對(duì)所述動(dòng)物實(shí)施AKR1C3基因沉默或者表達(dá)抑制的步驟。所述動(dòng)物可以是荷有食管癌放療抗性細(xì)胞的大鼠，小鼠或者兔子等。本發(fā)明中使用AKR1C3基因沉默或者表達(dá)抑制的步驟包括施用藥物實(shí)現(xiàn)這一效果，所述的藥物，例如為基因治療藥物。也可以通過(guò)基因敲除技術(shù)等使之沉默。一方面，本發(fā)明提供了 AKR1C3基因表達(dá)抑制劑或沉默劑在制備用于食管癌放療抗性的增敏治療的基因藥物中的用途，其中，所述的抑制劑可以是茉莉酸甲酯(Methyljesmonate, MeJ);茉莉酸(Jesmonate, JA)。在本發(fā)明中，所述的沉默劑是指能夠在體外或者體內(nèi)使AKR1C3基因不表達(dá)的化合物，其可以是核酸片段，蛋白質(zhì)，糖類(lèi)等，也可以是化學(xué)小分子。
本發(fā)明中，所述的抑制劑是指能夠在體外或者體內(nèi)使AKR1C3基因不表達(dá)或者低表達(dá)的化合物，其可以是核酸片段，蛋白質(zhì)，糖類(lèi)等，也可以是化學(xué)小分子。其作用的靶點(diǎn)可以是AKR1C3基因本身，也可以是AKR1C3基因表達(dá)的調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子等。進(jìn)一步地，一方面，本發(fā)明提供了食管癌放射抗性增敏劑的初步篩選方法，其包括(I)提供高表達(dá)AKR1C3基因的宿主細(xì)胞；(2)提供候選藥物；(3)使(I)的宿主細(xì)胞和(2)的候選藥物在合適的條件下接觸；(4)檢測(cè)(3)中的經(jīng)過(guò)候選藥物作用的宿主細(xì)胞的AKR1C3基因的表達(dá)；能夠使AKR1C3基因表達(dá)下調(diào)或者消失的候選藥物，判定為具有食管癌放射抗性增敏劑潛力的藥物。任選地，可以進(jìn)行隨后的動(dòng)物試驗(yàn)等進(jìn)行驗(yàn)證。其中，高表達(dá)AKR1C3基因的宿主細(xì)胞是指相對(duì)未轉(zhuǎn)染AKR1C3基因的宿主細(xì)胞其
表達(dá)量高。另外一方面，本發(fā)明提供了食管癌放射抗性增敏劑的細(xì)胞水平篩選方法，其包括(I)提供高表達(dá)AKR1C3基因的食管癌細(xì)胞；(2)提供候選藥物；(3)使(I)的食管癌細(xì)胞和⑵的候選藥物在合適的條件下接觸；(4)檢測(cè)(3)中的經(jīng)過(guò)候選藥物作用的食管癌細(xì)胞的AKR1C3基因的表達(dá)；(5)能夠使AKR1C3基因表達(dá)下調(diào)或者消失，同時(shí)保持食管癌細(xì)胞存活的候選藥物可以判定為是食管癌放射抗性增敏劑。其中，高表達(dá)AKR1C3基因的食管癌細(xì)胞是指相對(duì)放射敏感的食管癌細(xì)胞其表達(dá)量高，例如KYSE-170R細(xì)胞系。其中，所述在合適的條件下接觸，是指使高表達(dá)AKR1C3基因的食管癌細(xì)胞的正常生長(zhǎng)除了受候選藥物影響外，其它生長(zhǎng)條件與常規(guī)生長(zhǎng)條件一致。一方面，本發(fā)明還提供了食管癌放射抗性增敏劑的動(dòng)物水平的篩選方法，其包括(I)提供荷有高表達(dá)AKR1C3基因的食管癌腫瘤的動(dòng)物；(2)提供候選藥物；
(3)將足夠量的(2)的候選藥物給予(I)的動(dòng)物，連續(xù)給藥一定時(shí)間；(4)檢測(cè)(3)中的給藥后的動(dòng)物所荷腫瘤的大?。?5)能夠使AKR1C3基因表達(dá)下調(diào)或者消失，同時(shí)使腫瘤變小或者消失的的候選藥物可以判定為是食管癌放射抗性增敏藥物。其中，高表達(dá)AKR1C3基因的食管癌細(xì)胞是指相對(duì)放射抗性的食管癌細(xì)胞其表達(dá)量高，例如KYSE-170R細(xì)胞系。其中所述動(dòng)物可以是裸鼠，也可以是其它試驗(yàn)動(dòng)物。其中的給予方式可以是通過(guò)口腔給藥，靜脈輸注，或者瘤內(nèi)注射等。以下，通過(guò)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。


圖I :表示的是放射抵抗細(xì)胞系KYSE-170R和非放射抗性細(xì)胞系KYSE-170間的差異表達(dá)基因的比較結(jié)果。其中，圖I-A :KYSE_170R及KYSE-170細(xì)胞系芯片差異比較結(jié)果?？梢园l(fā)現(xiàn)，在未照射、照射后8小時(shí)及照射后24小時(shí)分別有945，733和1232個(gè)表達(dá)差異基因。其中，AKR1C3在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Illumine差異值均彡50。其中Illumine差異值彡20被認(rèn)為是基因表達(dá)上調(diào)；Illumine差異值< ~20被認(rèn)為是基因表達(dá)上調(diào)。圖I-B :應(yīng)用qRT-PCR在mRNA水平上的驗(yàn)證，由圖可發(fā)現(xiàn)在mRNA水平AKR1C3表達(dá)差異顯著。與親代KYSE-170細(xì)胞相比，在照射后0h，8h及24h，抵抗的KYSE-170R細(xì)胞中AKR1C3的表達(dá)分別上調(diào)了 9. 39，5. 94和9. 20倍。圖I-C =Western blot結(jié)果，該結(jié)果證實(shí)，在未照射的放射抵抗細(xì)胞系KYSE-170R中AKR1C3蛋白表達(dá)量顯著高于親代細(xì)胞系KYSE-170(*P < O. 05)。圖2 AKR1C3沉默的KYSE-170R細(xì)胞和親代KYSE-170細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AKR1C3后的放射抗性檢測(cè)結(jié)果。其中圖2-A :表示qRT-PCR的結(jié)果，其表明AKR1C3沉默效率達(dá)60%。圖2_B、C :表示western blot的結(jié)果,其證實(shí)在蛋白水平,AKR1C3表達(dá)明顯下調(diào)。圖2-D、E AKR1C3沉默的KYSE-170R細(xì)胞的放射抗性檢測(cè)，克隆形成試驗(yàn)結(jié)果提示，未照射時(shí)，scramble-shRNA-KYSE-170R 及 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R 細(xì)胞克隆形成率無(wú)顯著性差異，說(shuō)明AKR1C3沉默并不影響KYSE-170R的增殖。經(jīng)2，4，8Gy照射后，AKR1C3沉默的KYSE-170R細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著減少，放射敏感性明顯增強(qiáng)。E中■代表scrambIe-shRNA-KYSE-170R 細(xì)胞組； 代表 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R 細(xì)胞組。圖2_F、G :在對(duì)放射相對(duì)敏感的親代KYSE-170細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AKR1C3后的Westernblot驗(yàn)證結(jié)果。其中將AKR1C3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染親代細(xì)胞株KYSE-170，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染scramble質(zhì)粒作為對(duì)照。結(jié)果Western blot驗(yàn)證過(guò)表達(dá)效果顯著。圖2-H、I :克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)AKR1C3過(guò)表達(dá)的KYSE-170細(xì)胞的放射抗性。結(jié)果未照射時(shí)scramble-KYSE-170及AKR1C3+KYSE-170細(xì)胞克隆形成率無(wú)顯著性差異，說(shuō)明AKR1C3過(guò)表達(dá)并不影響KYSE-170的增殖。經(jīng)2，4，8Gy照射后，AKR1C3過(guò)表達(dá)的KYSE-170細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著增多，放射抵抗性明顯增強(qiáng)。I中■代表AKR1C3+KYSE-170細(xì)胞組；·代表 scramble-KYSE-170 細(xì)胞組。圖3A-I :裸鼠成瘤模型檢測(cè)靶基因沉默后對(duì)瘤體放射抵抗性的影響。其中，
圖3-A 當(dāng)瘤體直徑達(dá)到6_8mm時(shí),第2組和第4組給予15Gy的照射劑量單次局部照射的狀況。圖3-B :根據(jù)觀察結(jié)果，繪制裸鼠腫瘤體積變化曲線。曲線提示在接受放療后，與接種 scramble-shRNA-KYSE-170R 細(xì)胞相比，穩(wěn)定沉默 AKR1C3 的 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R細(xì)胞所形成的腫瘤，體積縮小更為顯著；而兩組在未接受放療時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差異。 代表 scramble-shRNA-KYSE-170R細(xì)胞組；■代表 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R細(xì)胞組；▲代表 scramble-shRNA-KYSE-170R 細(xì)胞 + 放射治療組；+AKRlC3-shRNA-KYSE_170R 細(xì)胞 +放射治療組。圖3-C :對(duì)未接受放療的裸鼠腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其中的AKR1C3蛋白的結(jié)果。其為scramble-shRNA-KYSE-170R組AKR1C3蛋白表達(dá)量明顯高于AKRlC3-shRNA-KYSE-170R 組。圖3-D :對(duì)未接受放療的裸鼠腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其中的AKR1C3蛋 白的結(jié)果，其為 AKRlC3-shRNA-KYSE-170R 組。圖3-F :對(duì)放療后殘留的裸鼠腫瘤組織進(jìn)行HE染色結(jié)果，其表明AKRlC3-shRNA-KYSE-170R細(xì)胞所形成的腫瘤組織內(nèi)為大量瘢痕組織僅殘留小量腫瘤細(xì)胞。圖3-E:對(duì)放療后殘留的裸鼠腫瘤組織進(jìn)行HE染色結(jié)果，其表明作為對(duì)照的scramble-KYSE-170R細(xì)胞形成的腫瘤組織內(nèi)有大量腫瘤細(xì)胞殘留。圖3-G :取第 I 組 scramble-KYSE-170R 組及第 3 組 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R組各3只進(jìn)行qRT-RCR的結(jié)果。圖3-H，I :取第I組scramble-KYSE_170R組及第3組AKRlC3-shRNA-KYSE-170R 組各 3 只進(jìn)行 western blot 的結(jié)果。圖4 :在應(yīng)用免疫組織化學(xué)法，對(duì)食管癌患者病理組織中AKR1C3的表達(dá)情況進(jìn)行回顧性分析結(jié)果。其中圖4-A :在6例食管低分化鱗癌患者病理標(biāo)本中的表達(dá)，圖4-B :在6例食管高分化鱗癌患者病理標(biāo)本中的表達(dá)；圖4-C :在癌旁正常食管粘膜細(xì)胞病理標(biāo)本中的表達(dá)。圖4-D :圖4A-C的結(jié)果比較圖。以下，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，此處所述的實(shí)施例僅用來(lái)闡述本發(fā)明，其不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和本發(fā)明的教導(dǎo)得到的本發(fā)明的變體或者等價(jià)的發(fā)明都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :放療抗性基因的確認(rèn)I.細(xì)胞系和放療方法人類(lèi)食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-170(保藏日2011年6月14日，保藏號(hào)CGMCCNo :4937，分類(lèi)命名為人類(lèi)食管鱗癌細(xì)胞系的KYSE-170)，及經(jīng)過(guò)反復(fù)照射后形成的放射抵抗細(xì)胞系KYSE170R(保藏日2011年6月14日，保藏號(hào)CGMCC No :4936，分類(lèi)命名為人類(lèi)食管鱗癌細(xì)胞系的KYSE-170R)。以上KYSE-170和KYSE-170R兩株均保藏于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(GMCC)。以上兩株細(xì)胞均由美國(guó)MD Anderson Cancer Center胸部腫瘤放射治療科惠贈(zèng)。以上細(xì)胞系應(yīng)用高糖1640培養(yǎng)液(購(gòu)自Invitrogen公司)，HEK293T細(xì)胞(由北京大學(xué)藥學(xué)院國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)液(購(gòu)自Invitrogen公司)。上述培養(yǎng)液臨用時(shí)加入10%的滅活胎牛血清(FBS，購(gòu)自HyClone公司)及青鏈霉素(各50單位/mL)即可。培養(yǎng)條件37°C溫箱,5% CO2。應(yīng)用Backman Zl細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)(購(gòu)自美國(guó)Backman公司)。于北京大學(xué)第一臨床醫(yī)院腫瘤放射治療科，應(yīng)用6MV-X-射線，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射(直線加速器購(gòu)自美國(guó)瓦里安公司)。2.細(xì)胞總RNA的提取和基因芯片結(jié)果給予處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE-170及KYSE-170R細(xì)胞4Gy劑量照射，應(yīng)用TotalRNA提取試劑盒(SV Iosolation System購(gòu)自promega公司)，在照射前(Oh)及照射后不同時(shí)間點(diǎn)(8h，24h)提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用Illumine-6_V3人類(lèi)全基因組芯片，篩選KYSE-170及KYSE-170R在上述時(shí)間點(diǎn)基因的表達(dá)變化差異(由上海生物芯片有限公司完成)。 結(jié)果參見(jiàn)圖1，其中Illumine差異值彡20被認(rèn)為是基因表達(dá)上調(diào)；Illumine差異值彡-20被認(rèn)為是基因表達(dá)上調(diào)。對(duì)比分析KYSE-170R及KYSE-170細(xì)胞系芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在未照射、照射后8小時(shí)及照射后24小時(shí)分別有945，733和1232個(gè)表達(dá)差異基因。其中，AKR1C3在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的11 Iumine差異值均彡50，所以發(fā)明人選取該基因進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。3.應(yīng)用qRT-PCR及Western blot驗(yàn)證芯片結(jié)果(I)給處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE-170及KYSE-170R細(xì)胞予4Gy劑量照射，應(yīng)用TotalRNA提取試劑盒(SV Iosolation System購(gòu)自promega公司)，在照射前(Oh)及照射后不同時(shí)間點(diǎn)(8h, 24h)提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AMV Reverse Traslation System購(gòu)自promega公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成CDNA,應(yīng)用Go Taq qPCR Master Mix酶(購(gòu)自promega公司)行qRT-PCR。PCR引物由Primer 3. O軟件設(shè)計(jì)，并經(jīng)Blast驗(yàn)證其特異性。目標(biāo)序列AKR1C3 (GenBank 號(hào)NM_003739，SEQ ID NO 1)上游引物5，atttggcacctatgcacctc3，(SEQ ID NO 2)；下游引物5’ tgagttttccaaggctggtc 3，(SEQ ID NO:3)；目標(biāo)序列β-acting上游引物5，agcgagcatcccccaaagtt3，(SEQ ID NO 4)；下游引物5，gggcacgaaggctcatcatt3，(SEQ ID NO:5)。應(yīng)用Roche 480 PCR儀(美國(guó)Roche公司)行PCR反應(yīng)，具體條件第一個(gè)循環(huán)(950C -10 分鐘);第二個(gè)循環(huán)(95°C -30 秒，60°C -30 秒，72°C -30 秒)X 40。mRNA 表達(dá)差異倍數(shù)計(jì)算公式如下Δ CT (KYSE170R/KYSE170) = CT (AKR1C3) -CT ( β -acting) ； Δ Δ CT =Δ CT (KYSE-170R) - Δ CT (KYSE-170);表達(dá)差異倍數(shù)=2_ΔΔετ.應(yīng)用qRT-PCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)在mRNA水平AKR1C3表達(dá)差異顯著。與親代KYSE-170細(xì)胞相比，在照射后0h，8h及24h，抵抗的KYSE-170R細(xì)胞中AKR1C3的表達(dá)分別上調(diào)了 9. 39，
5.94 和 9. 20 倍(見(jiàn)圖 1-B)。(2)應(yīng)用 Western blot 分析 AKR1C3KYSE-170 及 KYSE-170R 細(xì)胞中的含量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE-170及KYSE-170R細(xì)胞，用冷的PBS洗2次，根據(jù)細(xì)胞量的多少，加入適量蛋白裂解液(RPIA購(gòu)自Applygene公司)，置于冰浴上裂解30min。4°C14000rpm離心30min,棄下層沉淀,收集上清即為細(xì)胞全蛋白。應(yīng)用Bio-Rad蛋白定量試劑盒(Bio-Rad,Hertfordshire,United Kingdom)定量蛋白，分裝。應(yīng)用 12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至ECL Chemiluminescent substrate膜(AmershamPharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA上，用含有5%脫脂奶粉和O. I %吐溫的封閉液室溫封閉I小時(shí)。一抗4°C孵育過(guò)夜，次日用TBST洗4次，每次5min，然后于二抗中室溫孵育2小時(shí)。TBST洗4次，每次15min。所用抗體鼠抗人AKR1C3單克隆抗體(I 1000)購(gòu)自Sigma公司；兔抗人GAPDH單克隆抗體(I 1000)購(gòu)自Santa Cruza公司。二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠及羊抗兔單克隆抗體(I : 4000)購(gòu)自Santa Cruza公司。所有Western blot至少重復(fù)2次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Quantity One imaging program分析程序進(jìn)行相對(duì)定量分析(Bio-Rad, Hercules, CA)。上述Western blot結(jié)果證實(shí)，在未照射的放射抵抗細(xì)胞系KYSE-170R中AKR1C3蛋白表達(dá)量顯著高于親代細(xì)胞系KYSE-170(*P < 0. 05)，見(jiàn)圖1-C。實(shí)施例2 :用放療抗性細(xì)胞建立藥物篩選模型I.沉默AKR1C3的shRNA慢病毒質(zhì)粒載體構(gòu)建和最佳shRNA載體篩選·為了構(gòu)建藥物合適的藥物篩選模型，并且進(jìn)一步確認(rèn)放射抗性與AKR1C3的關(guān)系，發(fā)明人選擇放療抗性KYSE-170R細(xì)胞系作為篩選細(xì)胞，同時(shí)構(gòu)建了系列靶向AKR1C3的載體作為候選藥物。具體是通過(guò)所述構(gòu)建的載體來(lái)沉默AKR1C3的表達(dá)，對(duì)沉默后的細(xì)胞進(jìn)行放射檢驗(yàn)，觀察該基因沉默與放射抗性間的關(guān)系。慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-I (人類(lèi)免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。發(fā)明人應(yīng)用優(yōu)化改建的慢病毒載體PSD31 (Zhang J等人，A more efficient RNAi induciblesystem for tight regulation of gene expression in mamma Iian cells and xenograftanimals. RNA. 2007Aug ；13(8) :1375-83.)，攜帶可以靶向沉默 AKR1C3 的 shRNA 序列，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，沉默目的基因。發(fā)明人查閱Sigma公司網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，選取3組靶向沉默AKR1C3基因的shRNA序列進(jìn)行載體構(gòu)建，分別命名為shRNA(O) ；shRNA (I) ；shRNA (2)其引物序列和具體靶點(diǎn)見(jiàn)下。shRNA引物由北京華大基因合成。應(yīng)用人類(lèi)U6啟動(dòng)子，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。其中，人類(lèi)U6啟動(dòng)子序列如下5，-TGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3’ (SEQ ID NO 6),作為陰性對(duì)照的無(wú)功能siRNA(scramble),上，下游引物序列見(jiàn)文獻(xiàn)(Zhang J等人，A more efficient RNAi inducible system for tight regulation of geneexpression in mammalian cells and xenograft animals. RNA. 2007Aug ； 13 (8)1375-83)，其中，scramble的下游引物序列如下下游引物5’-CTCTATCATTGATAGAGTGACTCCAGTGGTAATCTACCTCTTCTTTACCTTCTTTA-3’ (SEQ IDNO :7)，3條沉默AKR1C3的序列的下游引物序列如下shRNA(O):其對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO 1 的堿基位置:148-168
5’ -AGGATCCAAAAACCAGAGGTTCCGAGAAGTAAACTCGAGTTTACTTCTCGGAACCTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3’ (SEQ ID NO :8)；shRNA⑴其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1的堿基位置693-983 5，-AGGATCCAAAAACCTAGACAGAAATCTCCACTACTCGAGTAGTGGAGATTTCTGTCTAGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3’ (SEQ ID NO :9)；shRNA⑵其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的堿基位置372-390 5，-AGGATCCAAAAACTCACTGAAGAAAGCTCAATTCTCGAGAATTGAGCTTTCTTCAGTGAGCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3’ (SEQ ID NO: 10)。shRNA (O) - (2)這三個(gè)沉默載體的沉默序列的上游引物均為
5，-TGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3’ (SEQ ID NO :11)。hU6-shRNA序列通過(guò)PCR方法合成，具體步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[Y. Chen等人，Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breastcancer cell invasion invitro, Cancer Res. 2003(63)48014804 ;S. Matsukura 等人，Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns,Nucleic AcidsRes. 31 (2003)e77]。應(yīng)用T4DNA 連接試劑盒(NEB，Beverly, MA, USA)，將上述 PCR 產(chǎn)物與 pGEM T easyvector載體進(jìn)行連接，送華大基因公司進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證連接正確性。測(cè)序正確的TA克隆質(zhì)粒，根據(jù)mega tansl. O (Origen)轉(zhuǎn)染試劑盒步驟,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染KYSE-170R細(xì)胞。然后進(jìn)行Western blotting 進(jìn)行選擇。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,在候選的三個(gè)針對(duì)AKR1C3的沉默基因中，載體shRNA(2)的效果最好。即反義序列SEQ ID NO :I的堿基位置372-390能夠有效沉默AKR1C3的表達(dá)。在用pGEM T easy vector載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染驗(yàn)證成功后,發(fā)明人為了建立穩(wěn)定的篩選模型，又構(gòu)建了可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的載體。具體方法應(yīng)用BamHI FastDigest內(nèi)切酶(購(gòu)自Fermentas公司)酶切前述驗(yàn)證的沉默效果好的AKRlC3-shRNA(2)，并選擇了 PSD31慢病毒載體(攜帶puromycin抗性基因)做為新的載體，將該載體進(jìn)行酶切，制造連接粘末端，通過(guò)Rapid DNA Dephos&LigionKit連接試劑盒(ROCHE)將兩者連接，測(cè)序驗(yàn)證連接成功。2.構(gòu)建能夠穩(wěn)定沉默靶基因AKR1C3的載體應(yīng)用mega tans I. O (Origen)轉(zhuǎn)染試劑盒，將 PSD31-AKRlC3_shRNA 及病毒包裝輔助質(zhì)粒VSVG、PRSV及PMDL質(zhì)粒(購(gòu)自Invitrogen公司)共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞(購(gòu)自Invitrogen公司)，進(jìn)行病毒包裝,應(yīng)用mega tans I. O (Origen)轉(zhuǎn)染試劑盒。其中，共轉(zhuǎn)染4個(gè)質(zhì)粒就是病毒包裝過(guò)程。其中，PSD31-AKRlC3_shRNA質(zhì)粒是形成病毒的核心部分，VSVG、PRSV及PMDL病毒包裝輔助質(zhì)粒是輔助核心質(zhì)粒，起作用是輔助病毒包膜形成，細(xì)胞吐病毒等過(guò)程的。收集48小時(shí)及72小時(shí)上清(病毒液)轉(zhuǎn)導(dǎo)KYSE-170R經(jīng)Puromycin篩選10天后，應(yīng)用qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證。qRT-PCR結(jié)果表明，AKR1C3沉默效率達(dá)60% (圖2-A), western blot結(jié)果證實(shí)在蛋白水平，AKR1C3表達(dá)明顯下調(diào)(*P < O. 05)(參見(jiàn)圖2-B、C)。
以上結(jié)果表明發(fā)明人建立了穩(wěn)定表達(dá)PSD31-AKRlC3-shRNA的KYSE-170R細(xì)胞系。由此，發(fā)明人通過(guò)有效的細(xì)胞模型篩選得到了有效的AKR1C3表達(dá)沉默劑。3.克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)比觀察靶基因沉默后細(xì)胞系與原抵抗細(xì)胞系放射敏感性的變化克隆形成實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)放射治療效果的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。發(fā)明人將檢測(cè)在不同照射劑量下，AKR1C3基因穩(wěn)定沉默細(xì)胞系克隆形成數(shù)量與未沉默細(xì)胞系scramb I e-shRNA-KYSE-170R (該株系是與 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R 同時(shí)建立的作為陰性對(duì)照的細(xì)胞株。不同之處是，scramble-KYSE_170R連入的是無(wú)功能基因scramble。具體見(jiàn)建立穩(wěn)定沉默AKR1C3細(xì)胞系試驗(yàn))的區(qū)別?？寺⌒纬蓴?shù)量反映了該細(xì)胞系對(duì)放射治療的敏感性?？寺⌒纬稍蕉啵涿舾行栽降?，抵抗性越強(qiáng)。給予對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的scramble-KYSE-170R 及 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R 細(xì)胞照射， 劑量依次為(2，4，8Gy)，然后胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Vi-CELL (購(gòu)自BECKMAN公司)計(jì)數(shù)細(xì)胞。根據(jù)不同照射計(jì)量，調(diào)整接種細(xì)胞數(shù)量。在相同劑量下，將等量的scramble-KYSE-170R 及 AKRlC3-shRNA-KYSE-170R 細(xì)胞接種于六孔板上，經(jīng)7-10天培養(yǎng),取出，固定,結(jié)晶紫染色(Sigma Chemical Co.),應(yīng)用計(jì)數(shù)克隆數(shù)(包含50個(gè)及以上細(xì)胞的記為一個(gè)克隆)。計(jì)數(shù)相應(yīng)細(xì)胞未照射時(shí)的克隆數(shù)以糾正接種率，增強(qiáng)可比性。克隆形成試驗(yàn)結(jié)果示于表1，該結(jié)果提示，未照射時(shí)，scramble-shRNA-KYSE_170R及AKRlC3-shRNA-KYSE-170R細(xì)胞克隆形成率無(wú)顯著性差異，說(shuō)明AKRlC3沉默并不影響KYSE-170R的增殖。經(jīng)2，4，8Gy照射后，AKR1C3沉默的KYSE-170R細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著減少，放射敏感性明顯增強(qiáng)(*P < O. 05，**P < O. 01)。(見(jiàn)圖2-D、E)表-1AKR1C3沉默的KYSE-170R細(xì)胞克隆形成率變化表(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)
__soramble-shRNA-KYSE-170R__AKRlC3-shRNA-KYSE-17 OR
OGYII
2GY0. 6646 ± 0. 21780. 3740 ± O. 0873
4GYO. 2267 ± 0. 0236O. 0433 ±0.135
8GY__O. 0190 ± O. 055__O. 0014 ± O. 0005_4.過(guò)表達(dá)AKR1C3的放療敏感細(xì)胞建立的藥物篩選模型既然AKRlC3沉默后，放射抵抗的KYSE-170R細(xì)胞放射敏感性增強(qiáng)，發(fā)明人將AKR1C3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(Origene公司Cat. No SC321532)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染親代細(xì)胞株KYSE-170，方法同上。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染scramble質(zhì)粒作為對(duì)照。對(duì)放射相對(duì)敏感的親代KYSE-170細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AKR1C3，探索其放射敏感性的變化和藥物篩選效果。Western blot驗(yàn)證過(guò)表達(dá)效果顯著(*P < O. 05)(圖 2-F、G)?？寺⌒纬稍囼?yàn)結(jié)果示于表2,該結(jié)果提示，未照射時(shí)scramble-KYSE-170及AKR1C3+KYSE-170細(xì)胞克隆形成率無(wú)顯著性差異，說(shuō)明AKR1C3過(guò)表達(dá)并不影響KYSE-170的增殖。經(jīng)2，4，8Gy照射后，AKR1C3過(guò)表達(dá)的KYSE-170細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著增多，放射抵抗性明顯增強(qiáng)(*P < O. 05，**P < O. 01)。(見(jiàn)圖 2-H、I)表-2AKR1C3過(guò)表達(dá)的KYSE-170細(xì)胞克隆形成率變化表(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)
權(quán)利要求
1.逆轉(zhuǎn)或降低食管癌放療抗性的增敏藥物，其為AKR1C3基因表達(dá)抑制劑或沉默劑。
2.權(quán)利要求I的增敏藥物，其中還含有藥學(xué)上可接受的佐劑。
3.權(quán)利要求I的增敏藥物，其中的食管癌是食管鱗癌。
4.AKR1C3基因表達(dá)抑制劑或沉默劑在制備用于逆轉(zhuǎn)或降低食管癌放療抗性的增敏治療的藥物中的用途。
5.食管癌放射抗性增敏劑的初步篩選方法，其包括 (1)提供高表達(dá)AKR1C3基因的宿主細(xì)胞； (2)提供候選藥物； (3)使(I)的宿主細(xì)胞和(2)的候選藥物在合適的條件下接觸； (4)檢測(cè)(3)中的經(jīng)過(guò)候選藥物作用的宿主細(xì)胞的AKR1C3基因的表達(dá)；和 (5)能夠使AKR1C3基因表達(dá)下調(diào)或者消失的候選藥物，判定為具有食管癌放射抗性增敏劑潛力的藥物。
6.食管癌放射抗性增敏劑的細(xì)胞水平篩選方法，其包括 (1)提供高表達(dá)AKR1C3基因的食管癌細(xì)胞； (2)提供候選藥物； (3)使(I)的食管癌細(xì)胞和(2)的候選藥物在合適的條件下接觸； (4)檢測(cè)(3)中的經(jīng)過(guò)候選藥物作用的食管癌細(xì)胞的AKR1C3基因的表達(dá)； (5)將使AKR1C3基因表達(dá)下調(diào)或者消失，同時(shí)保持食管癌細(xì)胞存活的候選藥物判定為食管癌放射抗性增敏劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中的食管癌細(xì)胞是KYSE-170R細(xì)胞系或者轉(zhuǎn)化了AKR1C3表達(dá)載體的KYSE-170細(xì)胞系。
8.食管癌放射抗性增敏劑的動(dòng)物水平的篩選方法，其包括 (1)提供荷有高表達(dá)AKR1C3基因的食管癌的動(dòng)物； (2)提供候選藥物； (3)將足夠量的(2)的候選藥物給予(I)的動(dòng)物，連續(xù)給藥一定時(shí)間； (4)檢測(cè)(3)中的給藥后的動(dòng)物所荷腫瘤的大小或所荷腫瘤中的AKR1C3基因表達(dá)水平; (5)使AKR1C3基因表達(dá)下調(diào)或者消失，同時(shí)使腫瘤變小或消失的 候選藥物判定為食管癌放射抗性增敏潛在藥物。
9.一種非治療目的體外逆轉(zhuǎn)或降低食管癌細(xì)胞放療抗性的方法，其包括對(duì)實(shí)施沉默或者表達(dá)抑制AKR1C3基因的步驟。
10.AKR1C3基因檢測(cè)劑在制備用于檢測(cè)患者食管癌放療抗性高低、放療敏感性高低或者區(qū)分鱗癌分化程度的藥物中用途。
11.權(quán)利要求10的用途，其中的AKR1C3基因檢測(cè)劑是特異性檢測(cè)AKR1C3基因的DNA探針。
12.權(quán)利要求11的用途，其中特異性檢測(cè)AKR1C3基因的DNA探針固定在載體上。
13.AKR1C3基因在篩選用于逆轉(zhuǎn)或降低食管癌放療抗性的增敏治療的藥物中的用途。
14.AKR1C3基因作為食管癌病人不適合放療或放療效果不顯著的診斷生物標(biāo)志物的用途。
15.AKR1C3基因作為食管癌病人對(duì)放療的敏感性差的診斷生物標(biāo)志物的用途。
16.AKR1C3作為區(qū)分食管高分化鱗癌和低分化鱗癌的生物學(xué)標(biāo)志物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及逆轉(zhuǎn)或降低食管癌放療增敏劑、篩選方法及其用途。具體而言涉及對(duì)逆轉(zhuǎn)或降低食管癌放療抗性基因的基因沉默劑、沉默方法及其用途。本發(fā)明通過(guò)對(duì)選擇的特定抗性基因的沉默，能夠有效地實(shí)現(xiàn)放療的增敏效果，進(jìn)而能夠更好地進(jìn)行個(gè)體化治療，為食管癌的治療提供更有效的治療方案。
文檔編號(hào)G01N33/15GK102836433SQ20111016989
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者周德敏, 高獻(xiàn)書(shū), 熊偉, 趙靜, 張禮和 申請(qǐng)人:北京大學(xué), 北京大學(xué)第一醫(yī)院