專利名稱：一種油脂中黃曲霉毒素B₁快速檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種油脂中黃曲霉毒素B1快速檢測試劑盒及其制備方法，利用吐溫20對油脂樣品進(jìn)行乳化處理，再將處理后樣品用于黃曲霉毒素B1膠體金免疫層析檢測試紙條檢測，屬于免疫學(xué)和微生物菌類毒性代謝產(chǎn)物檢測方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
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黃曲霉毒素(AFT)是ー類結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似的ニ呋喃香豆素衍生物，基本結(jié)構(gòu)含有一個(gè)ニ呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?香豆素)，前者是產(chǎn)毒和致癌的主要結(jié)構(gòu)，后者對毒性和致癌性起加強(qiáng)作用。目前已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有20種左右，AFT在紫外線下能產(chǎn)生特定的熒光，根據(jù)熒光顏色不同，將其分為藍(lán)紫色熒光的B族和黃緑色熒光的G族兩大類及其衍生物，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)的急性毒性最強(qiáng)，是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的AFT中的最強(qiáng)致癌物。AFB1中毒癥狀表現(xiàn)為嘔吐、厭食、發(fā)熱、黃疸、腹水等肝炎癥狀，能誘導(dǎo)畸形、癌癥的發(fā)生，對魚類、禽類、家畜和靈長類動(dòng)物的試驗(yàn)證明其腫瘤誘導(dǎo)作用極大，井能誘導(dǎo)多種癌癥的發(fā)生。大量的流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，AFB1的高攝入量和人類肝癌的發(fā)病率呈正相關(guān)關(guān)系，例如在非洲和東南亞等ー些地區(qū)，AFB1污染飲食被確定是肝細(xì)胞癌最主要的誘發(fā)因素之一，因此對食品中AFB1進(jìn)行快速、有效的檢測在食品安全上具有重要意義。AFT的分子量在312-346之間，熔點(diǎn)為268_269°C。AFB1分子量為312. 27，在中性水溶液中較穩(wěn)定，在強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，易被堿或強(qiáng)氧化劑破壞，加熱至268-269°C的熔解溫度才開始裂解，故一般烹調(diào)溫度不破壞其毒性。AFB1和其它AFT —祥，難溶于水、己烷、石油醚，易溶于甲醇、こ醇、氯仿、ニ甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑，而花生等含油脂較高的糧食作物相對于其它食物而言更容易受到產(chǎn)AFB1的霉菌污染，因此被AFB1污染的食用油對人類健康危害極大。目前，金標(biāo)-AFB1快速免疫層析檢測試紙是ー種被大量應(yīng)用的AFB1檢測手段。此種試紙利用膠體金顆粒對黃曲霉素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物(AFB1-BSA)進(jìn)行標(biāo)記，使其與樣品中的AFB1競爭結(jié)合固定在試紙條檢測線上的抗體，檢測線如果顯現(xiàn)膠體金的紅色，則說明樣品中不含有AFB1，反之則有。此試紙操作簡單，靈敏度高，但是由于抗原抗體反應(yīng)無法在油脂中發(fā)生，故此試紙目前無法檢測含油脂的液體樣品，在檢測前必須對油脂樣品進(jìn)行復(fù)雜萃取處理和除油步驟，本項(xiàng)發(fā)明提供了ー種簡單處理油脂的液體，該液體與油脂混合后，可將混合液直接作為免疫層析檢測試紙(稍加改造)的點(diǎn)樣樣品并進(jìn)行快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的本發(fā)明提供一種簡單、有效的油脂樣品處理液，并對膠體金標(biāo)免疫層析檢測試紙結(jié)構(gòu)稍加改造后，使其適用于這種油脂混合樣品的檢測。本發(fā)明技術(shù)方案油脂樣品處理原理是采用吐溫20作為乳化劑對油脂樣品進(jìn)行乳化處理，使油脂在油脂處理液(甲醇-PBS-吐溫溶液)中均勻分散為微小油滴，形成穩(wěn)定的水包油(0/W)型乳化體系。在層析過程由于吐溫20發(fā)揮著表面活性劑的作用，微小的油滴完全被水分子穩(wěn)固包囊著，使作為親水膠體的抗體始終處于穩(wěn)定的水相環(huán)境中，抗體的活性與功能不會(huì)受到影響，并且油樣中的AFB1溶解于甲醇水溶液中可與AFB1-BSA在水相中競爭結(jié)合固定的抗AFB1抗體，纖維素膜上的免疫反應(yīng)正常發(fā)生而不受微小油滴干擾。檢測原理分別將AFB1-BSA與羊抗鼠抗體固定在硝酸纖維素膜上作為檢測線與質(zhì)控線，在層析過程中，處理后的油脂樣品中的AFB1首先與膠體金標(biāo)記的小鼠抗AFB1抗體反應(yīng)，在樣品中AFB1濃度越大，結(jié)合在固定抗體上的金標(biāo)-AFB1-BSA就越少，檢測線所顯現(xiàn)的膠體金的紅色就越淺。如果油樣中AFB1濃度超過檢測限度則所有的膠體金標(biāo)記的小鼠抗AFB1毒素抗體都將被結(jié)合，則在檢測線上就不會(huì)出現(xiàn)顯色。正常情況下，無論是否含有AFB1質(zhì)控線都顯示紅色。通過觀察檢測線的顔色可直接定性判斷油脂樣品中AFB1的有無。本發(fā)明的有益結(jié)果本發(fā)明采用改進(jìn)的膠體金標(biāo)免疫層析檢測試紙，可直接對食用油中的AFB1-行檢測。檢測時(shí)將油脂處理液與油脂簡單混合后，油脂即成為可有效進(jìn)行免疫層析檢測的乳濁液樣品，根據(jù)觀測區(qū)檢測線和質(zhì)控線的顏色變化，確定食用油樣品中 AFB1是否超標(biāo)。與現(xiàn)有膠體金標(biāo)免疫層析檢測試紙相比，本項(xiàng)發(fā)明的AFB1快速檢測試劑盒工作時(shí)無需復(fù)雜的油脂樣品處理工藝，不僅縮短了預(yù)處理時(shí)間，而且突破了常規(guī)膠體金標(biāo)免疫層析檢測試紙只能檢測水溶液樣品的限制，可對含油脂樣品直接檢測


圖I油脂樣品處理液工作原理示意2金標(biāo)免疫層析檢測試紙結(jié)構(gòu)示意3試劑盒檢測食用油中AFBi結(jié)果圖
具體實(shí)施例方式I.試劑材料玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜(NC膜)、吸水紙、塑膠板、羊抗小鼠IgG購自Solarbio公司！AFB1-BSA(溶于甲醇-PBS)、牛血清蛋白V購自Sigma公司AFB1單克隆抗體購自藍(lán)圖生物科技有限公司；氯金酸、朽1檬酸三鈉購自國藥；吐溫20購自amresco公司；本實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。2.油脂樣品處理液的制備向2. Oml離心管中準(zhǔn)確加入490iU PBS緩沖液、210ul甲醇、300 Ul吐溫20。漩渦震蕩混勻制成油脂樣品處理液，常溫密閉保存。3.金標(biāo)-AFB1免疫層析試紙制備I)配制1%氯金酸溶液將Ig氯金酸溶解于IOOml超純水中，4°C保存。2)配制1%朽1檬酸三鈉溶液稱取Ig朽1檬酸三鈉溶于IOOml超純水中，4°C保存。3)硝酸纖維素膜封閉液稱取Ig BSA溶解于IOOml 0. 01mol/L PBS緩沖液中，再加入100 u I吐溫20，充分混合，4°C保存。4)膠體金制備準(zhǔn)確量取IOOml 0.01%氯金酸溶液于硅化三角瓶中，搖勻后置于微波爐煮沸，攪動(dòng)后立即加入2ml I %檸檬酸三鈉溶液，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸10分鐘。待溶液冷卻至室溫后用超純水定容至100ml，采用紫外分光光度計(jì)檢測顆粒均勻度及粒度。5)膠體金標(biāo)記AFB1單克隆抗體
使用PBS緩沖液稀釋AFB1單克隆抗體為I. Omg/ml。取膠體金溶液100ml，用0. ImoVLK2CO3調(diào)節(jié)pH至9. O。將2ml稀釋后抗AFB1單抗溶液加入膠體金溶液中，滴加時(shí)應(yīng)在磁力快速攪拌下逐滴緩慢加入，繼續(xù)攪拌15min。電磁攪拌下加入200mg牛血清蛋白以穩(wěn)定金顆粒的殘留表位。再攪拌IOmin后，以1500rpm/min 4°C離心IOmin,棄沉淀,上清液再以12000rpm/min 4°C離心30min,小心吸去上清,所得沉淀即為膠體金-抗AFB1單抗結(jié)合物。使用lmmol/L Tris-HCl (pH 9. 0)緩沖液稀釋至5ml,以0. 5mg/ml疊氮鈉防腐,4°C保存?zhèn)溆谩?)處理玻璃纖維膜 將吸水玻璃纖維剪裁為長I. 5cm,寬0. 5cm矩形小片后浸泡于膠體金-抗AFB1單抗混合液中，37°C干燥2h，使玻璃纖維素膜吸附膠體金-杭AFB1單抗結(jié)合物，4°C密閉保存?zhèn)溆谩?)處理硝酸纖維素膜在硝酸纖維素膜上用AFB1-BSA (2. Omg/ml)及羊抗鼠IgG多克隆抗體(2. Omg/ml)劃約Imm寬的線，分別作為檢測線(T線)和對照線(C線)。37°C干燥20分鐘后，用NC膜封閉液封閉2h，以0. Olmol/L PBS洗滌3次。37°C干燥30min。干燥后切成0. 5cmX I. 5cm的小條裝入塑料盒中，加入干燥劑，密封避光，4°C保存?zhèn)溆谩?)試紙條的組裝試紙條由樣品墊(吸水紙)、吸水玻璃纖維、硝酸纖維素膜、余液吸收墊(吸水紙)、底板(塑膠板)紙四部分組成。作為樣品墊的吸水紙剪切為長寬均為0.7X0. 5cm的長方形小片。余液吸收墊(吸水紙)剪切為長I. 5cm,寬0. 5cm的矩形小條。將樣品墊、吸水玻璃纖維、硝酸纖維素膜和余液吸收墊依次粘貼于5. OcmXO. 5cm塑膠板表面制成金標(biāo)-AFB1免疫層析試紙，除硝酸纖維素膜和余液吸收墊重疊區(qū)為3mm外，吸水玻璃纖維和樣品墊及硝酸纖維素膜的重疊區(qū)為2mm，且硝酸纖維素膜含30°斜面。試劑盒的實(shí)際使用下面實(shí)際介紹本發(fā)明的使用方法，但不能作為對本發(fā)明的限制。I.試劑與樣品AFB1標(biāo)準(zhǔn)液購自Sigma公司；食用花生油購自超市。2.陽性樣品的準(zhǔn)備使用0. Olmol/L PBS將AFB1稀釋至2mg/ml標(biāo)準(zhǔn)液。分別向8管500iU花生油中添加不同體積AFB1標(biāo)準(zhǔn)液，制成終濃度為0ng/ml、0. 5ng/ml、l. Ong/ml、2. 0ng/ml、5. 0ng/ml> 10. 0ng/ml、20. 0ng/ml、30. Ong/ml 的陽性樣品。3.陰性樣品準(zhǔn)備取8管500 ill食用花生油，不添加AFBi標(biāo)準(zhǔn)液，但添加與各管陽性樣品所加標(biāo)準(zhǔn)液體積相同的0. Olmol/L PBS緩沖液。4.樣品檢測前的處理將陽性、陰性樣品各分別吸取300 Ul加入16管油脂樣品處理液中，顛倒混勻，制為16管待檢液。5.分別從16管待檢液中吸取300 Ul下層液體(不吸取泡沫)，緩慢滴加在金標(biāo)-AFB1免疫層析試紙樣品墊上，5分鐘后觀察檢測結(jié)果。6.檢測結(jié)果重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次。陰性樣品全部正確檢出陰性，假陽性率為0%。陽性樣品檢測結(jié)果如表I :表I黃曲霉毒素BI快速檢測試劑盒檢測靈敏度
權(quán)利要求
1.ー種油脂中黃曲霉毒素B1快速檢測試劑盒及其制備方法，其特征是由油脂樣品處理液和金標(biāo)試紙條組成，油脂經(jīng)油脂樣品處理液處理后，直接滴入金標(biāo)試紙條進(jìn)行黃曲霉毒素B1快速檢測。
2.如權(quán)利要求I所述的檢測試劑盒制備方法，其特征是油脂樣品處理液由2ml規(guī)格的Appendorf管以及其中所 裝試劑組成，每管依照4. 9 2. I 3的比例配制PBS、甲醇和吐溫20的混合溶液Iml ；
3.如權(quán)利要求I所述的檢測試劑盒制備方法，其特征是金標(biāo)試紙條中吸水濾紙與吸水玻璃纖維，吸水玻璃纖維與硝酸纖維素膜的互相重疊區(qū)為2mm。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒制備方法，其特征是金標(biāo)試紙條中玻璃纖維與吸水濾紙及硝酸纖維素膜重疊形成30°斜面角。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種油脂中黃曲霉毒素B1快速檢測試劑盒及其制備方法，屬于免疫學(xué)和微生物菌類毒性代謝產(chǎn)物檢測方法技術(shù)領(lǐng)域。結(jié)合吐溫20乳化油脂樣品技術(shù)，建立了可直接用于檢測油脂中黃曲霉毒素B1的金標(biāo)快速檢測試紙，該試劑盒最低檢出限度為10ng/ml。本項(xiàng)發(fā)明的油脂中黃曲霉毒素B1快速檢測試劑盒工作時(shí)無需復(fù)雜的油脂樣品處理工藝，不僅縮短了預(yù)處理時(shí)間，而且突破了常規(guī)膠體金標(biāo)免疫層析檢測試紙只能檢測水溶液樣品的限制，可對含油脂樣品直接檢測。
文檔編號G01N33/577GK102841202SQ201110172360
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月24日
發(fā)明者陳超, 王英典, 萬一非, 萬沅松, 龍?jiān)朴? 顏亨梅 申請人:安寶生, 袁劍鋒, 陳超