專利名稱：檢測糖精鈉殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測食品中糖精鈉殘留的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
糖精鈉(Saccharin sodium，SA )，學(xué)名鄰磺酰苯酰亞胺鈉，又稱可溶性糖精，是糖精的鈉鹽，帶有兩個結(jié)晶水，是最古老的人工合成甜味添加劑，甜度約為蔗糖的200至500 倍，其十萬分之一的水溶液即有甜味感，濃度過高會出現(xiàn)苦味。糖精鈉于1878年被美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，很快就被食品工業(yè)界和消費者接受。在食品中主要應(yīng)用于飲料、果凍、涼果、蜜餞、果醬、糕點、蛋白糖等，它不被人體代謝吸收，除了在味覺上引起甜的感覺外，對人體無任何營養(yǎng)價值。相反，當(dāng)食用較多的糖精鈉時，會影響腸胃消化酶的正常分泌，降低小腸的吸收能力，使食欲減退。制造糖精鈉的原料主要有甲苯、氯磺酸、鄰甲苯胺等，均為石油化工產(chǎn)品。甲苯易揮發(fā)和燃燒，甚至引起爆炸，大量攝入人體后會引起急性中毒，對人體健康危害較大；氯磺酸極易吸水分解產(chǎn)生氯化氫氣體，對人體有害，并易爆炸；糖精鈉生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的中間體物質(zhì)對人體健康也有危害。糖精鈉在生產(chǎn)過程中還會嚴(yán)重污染環(huán)境。目前從部分中小糖精鈉廠私自流入廣大中小城鎮(zhèn)、農(nóng)村市場的糖精，還因為工藝粗糙、工序不完全等原因而含有重金屬、氨化合物、砷等雜物。它們在人體中長期存留、積累，不同程度地影響著人體的健康。糖精鈉是有機化工合成產(chǎn)品，是食品添加劑而不是食品。由于食用糖精鈉對人體帶來一定的危害，所以西方一些發(fā)達國家都對糖精鈉嚴(yán)格控制使用，其控制標(biāo)準(zhǔn)一般為不超過消費食糖總量的5%。我國與發(fā)達國家相比，我國糖精鈉使用量超出正常使用量的14倍。更有專家發(fā)出警告，至1999年下半年，全國糖業(yè)市場上糖精鈉的份額己高達市場總份額的55% 60%，嚴(yán)重擠占了蔗糖的份額。一些企業(yè)為了追逐利潤，在生產(chǎn)飲料和加工食品過程中，超量、超范圍使用糖精鈉，但在食品和飲料標(biāo)簽上卻不注明含有糖精鈉及其真實含量，使消費者卻誤以為吃的是食糖，損害了消費者的身體健康，也嚴(yán)重侵犯了消費者的知情權(quán)。特別是有少數(shù)的消費者在完全不知道糖精鈉危害的情況下，短時間內(nèi)食用大量糖精鈉，引起血小板減少而造成急性大出血、多臟器損害等，弓丨發(fā)惡性中毒事件。在中國廣大的中小城鎮(zhèn)和農(nóng)村市場上，糖精鈉的使用達到了泛濫的地步。 據(jù)中國消費者協(xié)會近年來對國內(nèi)近百種不同檔次、類型的飲料的調(diào)查表明，就全國范圍而言，大約有61. 2%的飲料中含有各類甜味劑，其中含糖精鈉的飲料達55. 1% ；有23. 5%的飲料在生產(chǎn)中使用了糖精鈉但卻未在標(biāo)簽中標(biāo)明；特別是在中小城鎮(zhèn)和農(nóng)村市場上，含有糖精鈉的飲料高達90. 9%，糖精鈉泛濫程度令人觸目驚心。此外，一些中小學(xué)校周圍遍布的各種小食攤，賣各類小食品及飲料基本上都含有糖精，如汽水、雪糕、話梅等，既無生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)又沒有標(biāo)識出處，長期食用，會導(dǎo)致青少年營養(yǎng)不良，對青少年的身體發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。一直以來，有關(guān)食用糖精鈉安全性問題頗受爭議。1958年，美國食品藥品管理局 (FDA)開始對食品添加劑的使用進行管理，當(dāng)時糖精鈉已經(jīng)能夠在美國廣泛使用了，因此它被列入最早的675種“公認(rèn)安全”(GRAS)的食品原料名單之中。1972年，美國FDA根據(jù)一項長期大鼠喂養(yǎng)實驗的結(jié)果決定取消糖精鈉的“公認(rèn)安全”資格。1977年，加拿大的一項多代大鼠喂養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，大量的糖精鈉可導(dǎo)致雄性大鼠膀胱癌。為此，美國FDA提議禁止使用糖精鈉，但這項決定遭到國會反對，并通過一項議案延緩禁用。1991年，美國FDA根據(jù)一些研究結(jié)果撤回了禁止糖鈉精使用的提議。但由于上述原因，在美國使用糖精鈉仍需在標(biāo)簽上注明“使用本產(chǎn)品可能對健康有害，本產(chǎn)品含有可以導(dǎo)致實驗動物癌癥的糖精鈉”。在國際上，糖精鈉的使用也因為這些關(guān)于大鼠致癌的研究發(fā)表后受到一定影響，歐美國家糖精的使用量不斷減少。目前JECFA規(guī)定糖精鈉的ADI值為每日每千克體重O 5mg。自從 1973年，我國就開始對糖精鈉的毒性進行了一系列的流行病學(xué)和毒理方面的研究，并進行糖精鋪與膀胱癌關(guān)系的調(diào)查。國內(nèi)外關(guān)于糖精鈉安全發(fā)生的爭議延續(xù)至今， 未取得一致意見。由于我國人民生活水平的現(xiàn)狀，糖精鈉的需求也略呈上升趨勢。在我國目前無更安全、非生熱量甜昧劑完全替代的情況下，為確保人民身體鍵康，糖精鈉作為食品添加劑，國家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-86規(guī)定糖精鈉用于醬菜、調(diào)味醬汁、濃縮果汁，蜜餞、配制酒、冷飲，糕點、餅干、面包中，最大限量為0. 15g/kg (濃縮果汁按濃縮倍數(shù)的80%加入)，涼果最大限量為5.0 g/kg。同時，衛(wèi)生部《食品添加劑衛(wèi)生管理辦法》(1987)還規(guī)定“專供嬰兒的主輔食品除按規(guī)定可加入強化劑外，不得加入人工合成甜昧劑、色素、香精、谷氨酸鈉及不適宜的添加劑等”。另外，病人食品和大量食用的主食(例如饅頭，發(fā)糕等)也都不應(yīng)使用糖精鈉。通常，檢測糖精鈉的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜法(GC)，薄層色譜法(TLC)、分光光度法、電位滴定法、電化學(xué)分析法等等。HPLC法是糖精鈉殘留檢測的確證方法，其優(yōu)點是檢測精確度高，但因其儀器化程度高、檢測時間長、過程繁瑣、檢測費用昂貴等而阻礙其推廣應(yīng)用，而酶聯(lián)免疫分析(ELISA)快速檢測技術(shù)因成本低、操作簡單、 速度快、一次檢測樣本量大、儀器化程度低，值得我們推廣成為常用的篩選方法。目前國內(nèi)外未有商品化的糖精鈉ELISA檢測試劑盒，有關(guān)糖精鈉免疫分析技術(shù) (IA)也鮮有報道，只有一篇關(guān)于糖精鈉殘留間接競爭ELISA方法檢測的文獻報道(Wang Y 等，2011)。但是存在設(shè)計原理的問題和穩(wěn)定性差、檢測步驟復(fù)雜等缺點。其采用間接競爭 ELISA法，在微孔條上預(yù)包被上偶聯(lián)抗原，加入樣本與糖精鈉抗體，樣本中的糖精鈉將和微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭糖精鈉抗體，經(jīng)過孵育及洗滌步驟，然后加入酶標(biāo)記物，再經(jīng)過孵育及洗滌步驟后顯色定量，操作步驟繁瑣，至少需8個步驟。由于操作復(fù)雜、步驟多，生產(chǎn)與保存成本高，很難滿足實際應(yīng)用的需求。另外，目前也未檢索到有關(guān)糖精鈉免疫方法相關(guān)技術(shù)文獻，發(fā)明名稱為“滴定法測定糖精鈉中和液含量的檢測方法”的中國專利申請(申請?zhí)?00710150236. 3)公開了一種糖精鈉酶檢測方法，采用滴定法測定糖精鈉中和液含量的檢測方法，該方法包括以下步驟首先精確稱取0. 5克糖精鈉中和液于100毫升三角燒瓶中，加入10毫升醋酸酐加熱至沸騰， 冷卻后加入20毫升冰醋酸；然后滴入結(jié)晶紫指示劑三滴，再用全自動滴定管將0. lmol/L 標(biāo)準(zhǔn)高氯酸非水滴定劑滴入上述溶液，至該溶液呈藍綠色即為終點；然后計算糖精鈉的含量。該方法存在不能同時批量測定糖精鈉，而且準(zhǔn)確性差，靈敏度低等缺陷。總之，目前國內(nèi)外現(xiàn)有糖精鈉采用的儀器檢測方法復(fù)雜、繁瑣，很難應(yīng)用于實踐， 且現(xiàn)有其他檢測方法產(chǎn)品由于普遍存在穩(wěn)定性差、準(zhǔn)確度低、樣品前處理及檢測步驟復(fù)雜、設(shè)備條件要求較高、價格昂貴等不足，嚴(yán)重影響了糖精鈉殘留檢測與監(jiān)控，因此研制穩(wěn)定性高、操作簡單、設(shè)備要求低、廉價的ELISA試劑盒對于準(zhǔn)確快速、高批量檢測糖精鈉具有非常重要的經(jīng)濟和社會意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是針對現(xiàn)有糖精鈉檢測產(chǎn)品的技術(shù)不足，提供一種高特異性、 高靈敏度、價格低廉、操作簡單，能大批量快速檢測糖精鈉的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供利用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測糖精鈉殘留的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計如下檢測思想首先將糖精鈉抗原包被于固相載體(酶標(biāo)板)上，然后加入標(biāo)樣或待測樣品，再加入酶標(biāo)記糖精鈉抗體，包被抗原與待測樣品中的糖精鈉競爭酶標(biāo)抗體，待測樣品糖精鈉含量高時，則與固相抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體就少，反之結(jié)合在固相抗原上的酶標(biāo)抗體就多，反應(yīng)后加入底物進行顯色加以測定，當(dāng)酶標(biāo)抗體量一定時，加入的待測樣品含糖精鈉越多，與固相抗原結(jié)合酶標(biāo)抗體就越少，發(fā)色反應(yīng)減弱，百分吸光度值低，反之，則發(fā)色反應(yīng)增強，百分吸光度增高，因而根據(jù)百分吸光度值與糖精鈉濃度之間的半對數(shù)關(guān)系作圖即得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)糖精鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢樣品的百分吸光度值，即可推算出待測樣品中糖精鈉的濃度。本發(fā)明的具體技術(shù)方案是
提供一種檢測糖精鈉的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被了糖精鈉抗原的酶標(biāo)板；酶標(biāo)記糖精鈉抗體工作液；糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液；底物液；底物緩沖液；反應(yīng)終止液；濃縮洗滌液；
所述酶標(biāo)板是96孔或40孔酶標(biāo)板，酶標(biāo)板孔內(nèi)包被有能與抗糖精鈉抗體特異結(jié)合的糖精鈉抗原，所述糖精鈉抗原是使用碳二亞胺法(EDC)、活潑酯法(DCC、NHS)、混合酸酐法 (氯甲酸異丁酯)將糖精鈉與載體蛋白偶聯(lián)得到的；所用的包被液為PH值為9. 6,0. 05mol/L 的碳酸鹽緩沖溶液(含1 2g碳酸鈉和2 4g碳酸氫鈉，雙蒸水1L)，封閉液為1 5%脫脂奶粉溶液；
所述糖精鈉抗體的制備過程中，所用的免疫原為采用活潑酯法(DCC、NHS)或混合酸酐法(氯甲酸異丁酯)將糖精鈉半抗原與載體蛋白共價偶聯(lián)合成得到的，以免疫抗原免疫兔子或小鼠，制備糖精鈉多克隆抗體、利用雜交瘤技術(shù)制備糖精鈉單克隆抗體或利用基因工程方法制備基因工程抗體。收集抗血清、腹水、發(fā)酵液等，用辛酸硫酸銨沉淀純化或過親和層析柱進行純化。所述酶標(biāo)記糖精鈉抗體工作液為采用戊二醛法或過碘酸鹽氧化法將酶與糖精鈉抗體進行偶聯(lián)得到的。所用標(biāo)記酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，本發(fā)明優(yōu)選辣根過氧化物酶，且采用改良后的過碘酸鹽氧化法進行標(biāo)記，提高了標(biāo)記效率，節(jié)省了酶與抗體的用量，保證標(biāo)記后酶與抗體具有良好的活性。

上述糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為12800μ g/L,3200 μ g/L、800 μ g/L、200 μ g/L、 50 μ g/L、0 μ g/L。所述底物顯色液當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，底物液為含有3，3，5，5 —四甲基聯(lián)苯胺(TMB)或鄰苯二胺(OPD)的pH5. 0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的PH5. 0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為1 2mol/L硫酸溶液或 2mol/L氫氧化鈉溶液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酶時，所述底物液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的PH 5. O磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液。所述濃縮洗滌液為含0. 5 1. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH值為 7. 4，濃度為0. lmol/L，為正常使用濃度的15 25倍?？梢宰鳛楣潭ㄌ蔷c抗原的載體的物質(zhì)較多，例如聚苯乙烯、硝酸纖維素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡萄糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以為凹孔、紙片、小珠等。本發(fā)明所述抗原、抗體的制備方法具體陳述如下 (一)抗原的合成
(1)半抗原的合成
采用6-氨基糖精(6-ASA)(常規(guī)市購)作為糖精鈉半抗原，分子式為C7H6N203S。(2)包被原和免疫原的合成
將糖精鈉半抗原和牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)等載體蛋白，通過碳二亞胺法(EDC)、活潑酯法(DCC、NHS)、混合酸酐法(氯甲酸異丁酯)進行偶聯(lián)得到包被抗原與免疫原。免疫原與包被原通過柱層析進行純化，純度經(jīng)SDS - PAGE電泳鑒定。(二)糖精鈉抗體的制備 (1)糖精鈉單克隆抗體的制備
動物免疫半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對Balb/c小鼠進行間隔免疫，間接 ELISA檢測并得到血液里含有糖精鈉特異性抗體的小鼠脾臟。細(xì)胞融合與克隆取產(chǎn)生特異性抗體的Balb/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP20融合，采用間接競爭酶聯(lián)免疫方法測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法或顯微克隆法對陽性孔進行克隆化，得到并建立產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油，7 14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7 10天后采集腹水。經(jīng)辛酸一飽和硫酸胺法或親和層析法進行腹水純化，純度經(jīng)SDS - PAGE電泳鑒定，小瓶分裝，-20°C保存。(2)糖精鈉兔多克隆抗體的制備
本發(fā)明采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以糖精鈉與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對新西蘭大白兔進行免疫，多次免疫后測定血清抗體效價，心臟采血，經(jīng)硫酸胺分級沉淀得到純化的多克隆抗體。(3)糖精鈉基因工程抗體的制備
基因工程抗體主要指小分子抗體，包括Fab (由完整的輕鏈和Fd構(gòu)成)，F(xiàn)v (由Vh和\ 構(gòu)成)，ScFv (單鏈抗體，V1^Pt之間由一條連接肽連接而成)，單域抗體(僅由VH組成)等經(jīng)基因工程技術(shù)改造后的抗體。提取分泌糖精鈉單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄擴增cDNA第一鏈。以擴增的cDNA為模板，采用鼠源單鏈抗體可變區(qū)基因通用引物，利用PCR和重疊延伸PCR技術(shù)擴增單鏈抗體基因，插入表達載體PBV220，在大腸桿菌中表達。利用鎳柱進行親和純化， SDS-PAGE電泳檢測純度。所述鼠源單鏈抗體可變區(qū)基因通用引物的核苷酸序列如下 VH_Back 5' -CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCff GG-3'；
VH_For 5' -TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC-3‘； VL_Back 5' -GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3‘； VL_For 5' -CCG TTT TAT TTC CAG CCT GGT CCC-3‘。所述PCR 條件為94 ° C 5 min，94 ° C 1 min，54 ° C 1 min，72 ° C 1 min, 25 個循環(huán)，72 ° C 10 min。其中，酶標(biāo)記糖精鈉抗體的制備
將糖精鈉抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用過碘酸鈉法進行偶聯(lián)。具體方法為 ①溶解5mg HRP于ImL超純水中，加入新配置的0. lmol/L過碘酸鈉75 μ L，置室溫或 4°C冰箱反應(yīng)20min或30min。②反應(yīng)完后裝入透析袋，0. OOlmol/L pH4. 0醋酸緩沖溶液4°C透析過夜，期間需更換透析液幾次。③將抗體用0. lmol/L碳酸緩沖液稀釋至10mg/mL，另外用0. lmol/L碳酸緩沖液將活化好的HRP的溶液pH調(diào)至9. 5。將0. 5mL抗體加入HRP溶液中，置室溫或4°C冰箱反應(yīng) 2h。④加入100 μ L 4mg/mL硼氫化鈉，4°C冰箱反應(yīng)2h。⑤對0. 01mol/L PBS透析過夜，加入保存液_20°C保藏備用。其中，酶標(biāo)板的制備方法為
用包被緩沖液將糖精鈉抗原按需要稀釋，向酶聯(lián)板微孔中加入抗原稀釋液，放入37°C 環(huán)境進行孵育，再放入4°C環(huán)境中過夜孵育(得到的酶聯(lián)板的穩(wěn)定性好)，傾去包被液，用洗滌液洗滌，然后在每孔中加入封閉液，37°C孵育，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。本發(fā)明還提供了利用上述酶聯(lián)免疫試劑盒進行食品中糖精鈉檢測的方法，包括以下步驟
(1)樣品前處理；
(2)使用試劑盒檢測；
(3)結(jié)果處理與分析。步驟(1)所述待測樣品前處理方法為 a.糕點樣本處理
將糕點粉碎，稱取樣品5g，加入15mL蒸餾水，震蕩20min，5000r/min離心lOmin，取ImL 上清至另一離心管，加入等量正己烷，震蕩搖勻2min后，8000 r/min離心lOmin，吸走上層正己烷，用下清液直接檢測，稀釋倍數(shù)3應(yīng)在結(jié)果計算中考慮。b.果醬樣本處理
稱取樣品5g，加入15mL蒸餾水，震蕩20min，5000r/min離心lOmin，吸取上層清液用蒸餾水稀釋5倍后直接檢測。稀釋倍數(shù)15應(yīng)在結(jié)果計算中考慮。
c.飲料類(汽水、果汁等) 汽水取適量樣品超聲lOmin，除去CO2后，稱取樣品5g，用蒸餾水稀釋10倍后直接檢測。稀釋倍數(shù)10應(yīng)在結(jié)果計算中考慮。果汁取適量樣品5000r/min離心lOmin，稱取樣品5g后，用蒸餾水稀釋10倍后直接檢測。稀釋倍數(shù)10應(yīng)在結(jié)果計算中考慮。d.蜜餞、涼果類
將樣品去核，將果肉絞碎，分別稱取5. OOg,加入30mL蒸餾水，浸泡2min后，再超聲 30min,5000r/min離心lOmin，取上清液分別用蒸餾水稀釋10倍后直接檢測。稀釋倍數(shù)60 應(yīng)在結(jié)果計算中考慮。使用試劑盒檢測步驟為
(1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡；
(2)將標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品加入已經(jīng)包被有糖精鈉抗原的酶標(biāo)板孔內(nèi)，然后每孔加入酶標(biāo)記物，輕拍混勻，孵育；
(3)洗滌；
(4)每孔加入等量的底物緩沖液與底物液，輕拍混勻，避光孵育；
(5)每孔加入反應(yīng)終止液，混合均勻，在波長450nm或492nm下，以空氣為空白，酶標(biāo)儀測定各孔吸光值；
檢測結(jié)果處理與分析
以所獲標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光值的平均值計算百分吸光度值，以百分吸光度值為縱坐標(biāo)，糖精鈉準(zhǔn)溶液濃度的半對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。用同樣的方法計算樣品溶液的百分吸光度值，根據(jù)方程式求出對應(yīng)樣品的糖精鈉濃度。所述百分吸光度值的計算式為
百分吸光度值(%)= (B/B0) XlOO
其中，B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品的平均吸光值，Btl為O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。所述檢測結(jié)果的分析還可以利用計算機專業(yè)軟件進行計算與分析。本發(fā)明對糖精鈉線性檢測范圍為50 12800 μ g/L，檢測限為50 μ g/L，整個檢測過程只需45min就可以完成。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的試劑盒采用直接競爭ELISA檢測模式，采用高特異性、高親合力的抗體，減少了操作步驟，提高了檢測的靈敏度、準(zhǔn)確度；采用包被抗原進行酶標(biāo)板的包被，相對于抗體包被，更有利于達到較好的包被效果與較長的保存時間，從而提高了試劑盒檢測的精密度與穩(wěn)定性；另外本試劑盒利用酶標(biāo)記抗體技術(shù)，將酶直接標(biāo)記于糖精鈉特異性抗體上，將糖精鈉特異性抗體與酶兩種最重要的反應(yīng)物合二為一，不僅大大簡化了操作步驟和反應(yīng)時間，減少了因操作復(fù)雜引起的誤差，而且無需在試劑盒內(nèi)再配置抗抗體，同時也節(jié)約了糖精鈉特異性抗體與酶的用量，從而大大降低了試劑盒的成本?；谝陨蟽?yōu)點本試劑盒非常適用于糖精鈉殘留的痕量分析與批量檢測，具有重要的現(xiàn)實意義。


圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明采用的試劑和材料及儀器，除非特別說明，皆為常規(guī)試劑和材料及儀器。實施例1抗原的制備糖精鈉抗原的制備
a.將lOmmol/L6-氨基糖精(6-ASA)溶解在ImL的蒸餾水中，用0. lmol/L的鹽酸調(diào)pH 值至1. 5，溶液用冰水冷卻。加入ImL 30mmol/L的NaNO2水溶液，磁力攪拌30min ；
b.離心，取上清液，緩慢加入到7mL6. 8mg/mL的BSA或90mg/mL OVA載體蛋白硼酸鹽緩沖溶液中，然后在磁力攪拌下反應(yīng)過夜；
c.待反應(yīng)完成后，裝入透析袋，然后用0.9%生理鹽水于4°C透析3天，透析液每天更換 3次，得產(chǎn)物；
d.采用紫外掃描測定結(jié)合比(方法參照陳新建等，1998)，將抗原濃縮保存或凍干保存得到糖精鈉免疫原(6-ASA-BSA)和包被原(6-ASA-0VA)，分裝保存于_20°C的冰箱中。
實施例2抗體的制備 (1)糖精鈉鼠單克隆抗體制備
動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以糖精鈉半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為60 μ g/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，腹腔注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按4 1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭酶聯(lián)免疫方法測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用顯微克隆法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5X IO6
個/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在一 70°C超低溫冰箱中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5X IO6個/只，14天后采集腹水。用免疫層析法進行腹水純化，小瓶分裝，-200C 保存。(2)糖精鈉兔多克隆抗體的制備
本發(fā)明參照本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法，采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以糖精鈉與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對新西蘭大白兔進行免疫，多次免疫后測定血清抗體效價，心臟采血， 經(jīng)硫酸胺分級沉淀得到純化的多克隆抗體。(3)糖精鈉基因工程抗體的制備
基因工程抗體主要指小分子抗體，包括Fab (由完整的輕鏈和Fd構(gòu)成)，F(xiàn)v (由Vh和\ 構(gòu)成)，ScFv (單鏈抗體，V1^Pt之間由一條連接肽連接而成)，單域抗體(僅由VH組成)等經(jīng)基因工程技術(shù)改造后的抗體。提取分泌糖精鈉單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄擴增cDNA第一鏈。以擴增的cDNA為模板，采用鼠源單鏈抗體可變區(qū)基因通用引物，利用PCR和重疊延伸PCR技術(shù)擴增單鏈抗體基因，插入表達載體PBV220，在大腸桿菌中表達。利用鎳柱進行親和純化， SDS-PAGE電泳檢測純度。所述鼠源單鏈抗體可變區(qū)基因通用引物的核苷酸序列如下 VH_Back 5' -CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCff GG-3'；
VH_For 5' -TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC-3‘； VL_Back 5' -GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3‘； VL_For 5' -CCG TTT TAT TTC CAG CCT GGT CCC-3‘。
所述PCR 條件為94 ° C 5 min，94 ° C 1 min，54 ° C 1 min，72 ° C 1 min, 25 個循環(huán)，72 ° C 10 min。實施例3酶標(biāo)記糖精鈉抗體的制備
辣根過氧化物酶HRP (購自Sigma公司)標(biāo)記糖精鈉抗體的制備采用過碘酸鹽氧化法， 具體方法為
a.溶解5mg HRP于ImL超純水中，加入新配置的0. lmol/L過碘酸鈉75 μ L，置室溫或 4°C冰箱反應(yīng)20min或30min。b.反應(yīng)完后裝入透析袋，O.OOlmol/L pH4. 0醋酸緩沖溶液4°C透析過夜，期間需更換透析液幾次。c.將糖精鈉抗體用0. lmol/L碳酸緩沖液稀釋至10mg/mL，另外用0. lmol/L碳酸緩沖液將活化好的HRP的溶液pH值調(diào)至9. 5。將0. 5mL抗體加入HRP溶液中，置室溫或4°C 冰箱反應(yīng)2h。d.加入100 μ L 4mg/mL硼氫化鈉，4°C冰箱反應(yīng)2h。e.對0. 01mol/L PBS透析過夜，加入保存液_20°C保藏備用。實施例4酶聯(lián)免疫試劑盒組分的配制
(1)濃縮洗滌緩沖液的配制含0.5 1.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(pH值為7. 4， 0. lmol/L),為正常使用濃度的15 25倍。(2)封閉液的配制脫脂奶粉1. 0 5. 0 g溶于IOOmL蒸餾水。(3)底物緩沖液的配制30%過氧化氫30 μ L溶于19mL的pH5. 0磷酸-檸檬酸緩沖液(0. 2M Na2HP0425. 7mL，0. IM檸檬酸24. 3mL，加蒸餾水50mL)中，4°C保存。(4)底物液的配制將3，3，5，5 一四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 80mg溶于IOmL
pH5. 0磷酸-檸檬酸緩沖液(0. 2M Na2HP0425. 7mL,0. IM檸檬酸24. 3mL，加蒸餾水50mL)
中，4°C保存。(5)酶標(biāo)板微孔板的包被包被抗原用pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液(含 1 2g碳酸鈉和2 4g碳酸氫鈉，雙蒸水1L)稀釋成0. 1 5ug/mL，在酶標(biāo)板的每孔加 IOOuL, 37°C包被Ih后4°C下包被過夜，傾去包被液，用PBST洗滌3次，拍干，然后在每孔中加入200uLl. 0 5. 0%脫脂奶粉，放入37°C溫箱中Ih后用PBST洗滌3次，干燥后封入鋁箔袋中4°C保存。(6)糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取糖精鈉標(biāo)樣12. 8mg，溶于0. IL緩沖液中，然后用去離子水稀釋分別配制12800 μ g/L、3200 μ g/L、800 μ g/L、200 μ g/L、50 μ g/L糖精鈉溶液，另外去離子水配制0 μ g/L對照樣，4°C保存。
(7)試劑分裝各種試劑按要求配制，測定合格后無菌分裝。酶標(biāo)記糖精鈉抗體工作液7mL/瓶，糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)樣品ImL/瓶，底物液7mL/瓶，底物緩沖液7mL/瓶，終止液7mL/ 瓶，濃縮洗液50mL/瓶。分裝后貼標(biāo)簽，注明批號和有效期，4°C保存。(8)試劑盒的組裝分別將可拆卸包被好包被抗原的微孔板1塊，酶標(biāo)記糖精鈉抗體工作液、底物液、底物緩沖液、終止液、濃縮洗液、各1瓶，糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，使用說明書1份置試劑盒內(nèi)指定位置。試劑盒檢驗合格后封裝，4°C保存。
實施例5酶聯(lián)免疫試劑盒組分的配制
實驗步驟同實施例4，不同的是采用購自Sigma公司的堿性磷酸酶為標(biāo)記酶，所述底物液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的PH5. 0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液，按照實驗室常規(guī)方法配制。實施例6檢測糖精鈉的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測糖精鈉的酶聯(lián)免疫試劑盒，包含下述組分
(1)包被糖精鈉抗原的酶標(biāo)板的96孔酶標(biāo)板；或根據(jù)產(chǎn)品需要選用40 孔酶標(biāo)板；
(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記糖精鈉單克隆抗體，7mL/瓶；
(3)糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μ g/L、50 μ g/L、200 μ g/L、 800 μ g/L、3200 μ g/L、12800 μ g/L,ImL/ 瓶；
(4)底物緩沖液，7mL/瓶；
(5)底物液，7mL/瓶；
(6)終止液，7mL/瓶;
(7)濃縮洗滌液，50mL/瓶；
(8)使用說明書，1份;
(9)蓋板膜，2張;
(10)自封袋(含干燥劑)，1個。實施例7應(yīng)用實施例一、樣品前處理
(1)糕點樣本處理
將糕點粉碎，稱取樣品5g，加入15mL蒸餾水，震蕩20min，5000r/min離心lOmin，取ImL 上清至另一離心管，加入等量正己烷，震蕩搖勻2min后，8000 r/min離心lOmin，吸走上層正己烷，用下清液直接檢測，稀釋倍數(shù)3應(yīng)在結(jié)果計算中考慮。(2)果醬樣本處理
稱取樣品5g，加入15mL蒸餾水，震蕩20min，5000r/min離心lOmin，吸取上層清液用蒸餾水稀釋5倍后直接檢測。稀釋倍數(shù)15應(yīng)在結(jié)果計算中考慮。(3)飲料類
汽水取適量樣品超聲lOmin，除去CO2后，稱取樣品5g，用蒸餾水稀釋10倍后直接檢測。稀釋倍數(shù)10應(yīng)在結(jié)果計算中考慮。果汁取適量樣品5000r/min離心lOmin，稱取樣品5g后，用蒸餾水稀釋10倍后
直接檢測。稀釋倍數(shù)10應(yīng)在結(jié)果計算中考慮。
(4)蜜餞、涼果類
將樣品去核，將果肉絞碎，分別稱取5. OOg,加入30mL蒸餾水，浸泡2min后，再超聲 30min,5000r/min離心lOmin，取上清液分別用蒸餾水稀釋10倍后直接檢測。稀釋倍數(shù)60 應(yīng)在結(jié)果計算中考慮。二、試劑盒的檢測方法
(1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20 24°C)平衡30min以上，將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的條板固定于支架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個平行實驗，按順序編號。(2)在標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50 μ L標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入50 μ L待測樣品。然后每孔加入 50 μ L酶標(biāo)記物，輕拍混勻。蓋上蓋板膜，在室溫孵育30min。(3)倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每輪洗板拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。用250 μ L蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中的液體，再重復(fù)操作3遍。(4)每孔加入100 μ L顯色液(將底物緩沖液與底物液等體積混合)，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，暗處室溫孵育15min。(5)加入50 μ L反應(yīng)終止液到微孔中?；旌虾迷诓ㄩL450nm (以空氣為空白)測定各孔吸光值，必須在加入終止液后60min內(nèi)讀取吸光值。檢測結(jié)果計算與分析
以所獲標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光值的平均值計算百分吸光度值，以百分吸光度值為縱坐標(biāo)， 糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的半對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。見附圖1。 Υ=-18. 395χ+102. 43 ；R2=O. 9973。用同樣的方法計算樣品溶液的百分吸光度值，根據(jù)方程式求出對應(yīng)樣品的糖精鈉濃度。所述百分吸光度值的計算式為 百分吸光度值(%)= (B/B0) XlOO
其中，B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品的平均吸光值，Btl為O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。檢測結(jié)果的分析還可以利用計算機專業(yè)軟件進行計算與分析，對糖精鈉線性檢測范圍為50 12800 μ g/L，檢測限為50 μ g/L，整個檢測過程只需45min就可以完成。實施例8試劑盒精密度與準(zhǔn)確度試驗 1、標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)性試驗
從3批按照實施例4 (6)中的方法制備的酶標(biāo)板中，各抽出20個微孔，測定800 μ g/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值)，重復(fù)20次，計算變異系數(shù)CV%，結(jié)果見表1。表1標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)性試驗
權(quán)利要求
1.一種檢測糖精鈉殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于包含下列各成分(1)包被了糖精鈉抗原的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記糖精鈉抗體工作液；(3)糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液；(4)底物液；(5)底物緩沖液；(6)反應(yīng)終止液；(7)濃縮洗滌液；其中，所述酶標(biāo)板包被有能與抗糖精鈉抗體特異性結(jié)合的糖精鈉抗原，并封閉微孔表面未吸附糖精鈉抗原的位點；所述糖精鈉抗原是采用6-氨基糖精與載體蛋白偶聯(lián)得到；所述糖精鈉抗體為糖精鈉單克隆抗體、兔多克隆抗體或基因工程抗體的任意一種；所述酶標(biāo)記糖精鈉抗體工作液是將標(biāo)記酶與糖精鈉抗體進行偶聯(lián)得到，所述標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取的堿性磷酸酯酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物液為含有3，3，5，5 —四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺的pH5. O磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的PH5. O磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L氫氧化鈉溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述標(biāo)記酶為細(xì)菌提取的堿性磷酸酯酶時，所述底物液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的PH5. O磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為1 2mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為含0.5^1. 5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH值為7. 4，濃度為0. lmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為12800 μ g/L,3200 μ g/L,800 μ g/L,200 μ g/L,50 μ g/ L、0 μ g/L0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)板是96或40孔酶標(biāo)板。
7.—種權(quán)利要求1、2、3、4、5或6任一項所述酶聯(lián)免疫試劑盒的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于檢測飲料、果凍、涼果、蜜餞、果醬、糕點或蛋白糖中的糖精鈉殘留方面。
8.—種權(quán)利要求1所述酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法，其特征在于包括以下步驟(1)待測樣品的前處理；(2)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡；將標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品加入已經(jīng)包被有糖精鈉抗原的酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔加入酶標(biāo)記物，輕拍混勻，孵育；洗滌；每孔加入等量的底物緩沖液與底物液，輕拍混勻，避光孵育；每孔加入反應(yīng)終止液，混合均勻，在波長450nm 或492nm下，以空氣為空白，酶標(biāo)儀測定各孔吸光值；(3)結(jié)果處理與分析。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于步驟(1)所述待測樣品為糕點、果醬、飲料、蜜餞肉或涼果肉 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測糖精鈉殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒及使用方法。所述試劑盒包括包被糖精鈉抗原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記糖精鈉抗體工作液、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、底物液、底物緩沖液、反應(yīng)終止液、濃縮洗滌液。本發(fā)明同時公開了應(yīng)用所述試劑盒檢測糖精鈉殘留的方法，包括進行樣品的前處理、利用試劑盒進行檢測和結(jié)果的處理與分析等步驟。本發(fā)明提供的檢測糖精鈉的試劑盒采用直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)，靈敏度高、穩(wěn)定性好，大大簡化了操作步驟和反應(yīng)時間，減少了因操作復(fù)雜引起的誤差，降低了成本，非常適合大量樣品的篩查，具有重要的實際應(yīng)用推廣意義。
文檔編號G01N33/543GK102353772SQ20111018053
公開日2012年2月15日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者孫遠(yuǎn)明, 楊金易, 梁康建, 沈玉棟, 王宇, 王弘, 雷紅濤 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)