專利名稱：檢測肺炎衣原體IgM抗體的試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學檢測試劑，特別是一種檢測肺炎衣原體IgM抗體的試劑盒。
背景技術(shù)：
肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, Cpn)是1989年確定的一種嚴格真核細胞內(nèi)寄生的原核細胞微生物，根據(jù)2004年公布的伯杰氏細菌分類學手冊，已被更名為肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumoniae，Cpn)，與鸚鵡熱嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、豚鼠嗜衣原體、貓嗜衣原體、獸類嗜衣原體共同組成嗜衣原體屬。CPn基因組大小約1. 2Mbp，由21個 Pmp基因，一個III型分泌毒力因子系統(tǒng)，3個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，2個磷脂酶-D樣蛋白基因組成。Cpn的感染極為普遍，呈世界性的分布，主要引起人類的呼吸道感染，與人口密度呈正相關(guān)，在臨床上多以隱性、持續(xù)性感染形式存在，反復遷延導致難以治療的并發(fā)癥，與哮喘、支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病等心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。兒童感染率在20%左右，隨著年齡的增加感染率迅速上升，青壯年可達50-60%，老年70-80%。肺炎衣原體通過呼吸道分泌物的進行人與人傳播，家庭、學校、 軍隊以及其他人口集中的工作區(qū)域可存在小范圍的流行。目前，肺炎衣原體已是繼肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌之后引起社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)的主要病原體，肺炎衣原體急性感染率占23%，肺炎病人僅占感染者的小部分，70-90%為亞臨床表現(xiàn)。肺炎衣原體感染的潛伏期為15-23天，可引起上呼吸道感染，如鼻竇炎、中耳炎和咽炎，也可引起下呼吸道感染，如支氣管炎和肺炎。呼吸道感染多數(shù)表現(xiàn)為咽痛、發(fā)熱、咳嗽，病情通常較輕，有自限性。老年肺炎衣原體肺炎病人癥狀可能較為嚴重，有時甚至致死， 尤其是合并細菌性感染或存在慢性阻塞性肺疾病等時。因此，Cpn感染早期診斷對于盡早發(fā)現(xiàn)和治療Cpn感染性疾病非常重要。目前對Cpn的實驗室診斷方法主要有病原體分離培養(yǎng)技術(shù)、核酸檢測技術(shù)、血清學診斷技術(shù)等方法，國際上尚無公認的標準方法。其中病原體分離培養(yǎng)技術(shù)，由于CPn的抵抗力較弱，對室溫或冰凍敏感，難以從臨床標本中分離培養(yǎng)成功，一般實驗室難以開展， 已逐漸為其他快速檢測方法所取代。補體結(jié)合試驗雖然試驗條件要求低，不需要特殊儀器， 但具有影響因素復雜、操作步驟繁鎖等缺陷。微量免疫熒光(micro-immunofluorescence， MIF)是目前CPn感染診斷最常用且最敏感的血清學方法，其結(jié)果被認為是檢測CPn感染的 “金標準”。其缺點是非常費時費力，MIF檢測結(jié)果的可靠性在很大程度上依賴于抗原的制備和檢測者的個人經(jīng)驗，實驗操作的主觀性很大，僅限于少數(shù)研究實驗室使用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應用，成為最廣泛應用的檢測方法之一?；瘜W發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)是近年來繼放射免疫分析和酶免疫分析之后發(fā)展起來的一種高靈敏度的微量測定技術(shù)。具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快速等優(yōu)點，作為放射性免疫分析、酶免疫分析的替代者，是當前最理想的免疫分析方法。親和素-生物素系統(tǒng)在免疫分析中的應用有多種形式，其中包括信號放大、間接包被等形式。信號放大指生物素化的抗原或抗體與酶標親和素反應體系，其優(yōu)點是利用生物素-親和素放大效應提高檢測靈敏度，缺點是親和素的等電點較高，對聚苯乙烯等固相載體有較高的非特異性吸附，因而導致本底較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領域的存在的空白和需求，提供一種檢測肺炎衣原體IgM抗體的試劑盒，實驗證明，具有操作簡便，靈敏度高，特異性好的優(yōu)點。檢測肺炎衣原體IgM抗體的試劑盒，包括包被親和素的微孔板，生物素化的肺炎衣原體抗原、辣根過氧化物酶標記的抗人IgM和化學發(fā)光底物，所述化學發(fā)光底物包括底物液A和底物液B，其中A液為的組成為pH值為7. 2 8. 5，濃度為10 30mM的磷酸鹽緩沖液中加入終濃度(W/V)為0. 02 0. l%Proclin300,0. 1 1. 0%吐溫-20和IOmM過氧化脲溶液；B液為50mM的Tris-HCI緩沖液中加入終濃度(W/V)為0. 02 0. 1 % Proclin300, 1.0 3. OmM的4-碘苯酚，0. 的BSA，0. 1 1 %的溴化十六烷基三甲基銨，10 50mM魯米諾溶液。所述生物素化的肺炎衣原體抗原采用如下方法制備而得(1)生物素溶于N，N-二甲基甲酰胺終濃度為lmg/mL ；⑵用0. lmol/L pH 9. 0的NaHCO3衣原體抗原稀釋為1 2mg/mL ； (3)按生物素與抗原重量比1 7左右混合，室溫攪拌下反應2 4h ； (4)裝入透析袋，用0. 05mol/L pH7. 2的PBS，4°C透析過夜得到生物素化抗原，透析產(chǎn)物加等體積甘油溶解備用。所述包被親和素的微孔板制備方法為用PH 9. 6的碳酸鹽緩沖液配制成2ug/ml 的親和素包被液包被微孔板。所述試劑盒還包括稀釋液，洗滌液，衣原體抗體IgM陰性對照、陽性對照、校準品， 辣根過氧化物酶標記的抗人IgM。所述抗人IgM為羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM單抗。本發(fā)明的試劑盒采用親和素包被微孔板，與生物素化抗原和待測樣本中肺炎衣原體IgM形成固相親和素-生物化抗原-抗體復合物，再與標記的抗人IgM形成固相親和素-生物素化抗原-抗體-標記二抗夾心復合物，然后加入化學發(fā)光底物，利用化學發(fā)光儀檢測相對發(fā)光強度，定性或半定量檢測待測樣本中肺炎衣原體IgM抗體，從而避免了酶免試劑存在的靈敏度低、部分底物有毒或致癌等缺點，該試劑盒具有反應速度快、光信號不受溫度變化影響、成本低、易儲存等優(yōu)勢，可為臨床肺炎衣原體相關(guān)的急性呼吸道疾病輔助診斷提供更為特異、快速、可靠的診斷依據(jù)。本發(fā)明的了一個主要的貢獻在于提供了一種新的化學發(fā)光底物液配方，與采用現(xiàn)有常規(guī)底物液配方的試劑盒相比，具有靈敏度高，穩(wěn)定性好等優(yōu)點。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明的試劑盒制備方法1、本發(fā)明試劑盒包括
1)肺炎衣原體IgM陽性對照；2)肺炎衣原體IgM陰性對照；3)肺炎衣原體IgM校準品；4)包被親和素的微孔板；5)生物素化的肺炎衣原體抗原；6)抗人IgM酶標記物；7) 20 倍濃縮洗滌液；以及8)化學發(fā)光底物液。其中，微孔板為M、48或96孔的微孔板條；抗人IgM為羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM單抗；酶為辣根過氧化物酶； 化學發(fā)光底物液:A液和B液。2、本發(fā)明I號試劑盒的制備方法以肺炎衣原體IgM陽性血清配制陽性對照，以健康人血清配制陰性對照，以肺炎衣原體IgM陽性血清配制校準品，微孔板包被親和素，使肺炎衣原體抗原生物素化，標記抗人IgM，配制化學發(fā)光底物，分裝上述組份，以及組裝為成品。2. 1微孔板包被親和素2. 1. 1 包被用pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液配制成所需濃度的親和素包被液，并將包被液負載于微孔板(IOOul/孔)親和素包被液配方2. 1. 2封閉用含BSA，pH值為7. 0-7. 5，濃度為IOmM的Tris緩沖液作為封閉液封閉上述洗滌后的固相載體。封閉液配方
權(quán)利要求
1.檢測肺炎衣原體IgM抗體的試劑盒，包括包被親和素的微孔板，生物素化的肺炎衣原體抗原、辣根過氧化物酶標記的抗人IgM和化學發(fā)光底物，所述化學發(fā)光底物包括底物液A和底物液B，其中A液為的組成為pH值為7. 2 8. 5，濃度為10 30mM的磷酸鹽緩沖液中加入終濃度(W/V)為0. 02 0. l%Proclin300，0. 1 1.0%吐溫-20和IOmM過氧化脲溶液；B液為50mM的Tris-HCI緩沖液中加入終濃度(W/V)為0. 02 0. 1 % Proclin300, 1.0 3. OmM的4-碘苯酚，0. 的BSA，0. 1 1 %的溴化十六烷基三甲基銨，10 50mM魯米諾溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述生物素化的肺炎衣原體抗原采用如下方法制備而得⑴生物素溶于N，N- 二甲基甲酰胺終濃度為lmg/mL ；⑵用0. lmol/L pH 9. 0的 NaHCO3衣原體抗原稀釋為1 ang/mL ； (3)按生物素與抗原重量比1 7左右混合，室溫攪拌下反應2 4h ； (4)裝入透析袋，用0. 05mol/L pH7. 2的PBS，4°C透析過夜得到生物素化抗原，透析產(chǎn)物加等體積甘油溶解備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述包被親和素的微孔板制備方法為用PH值為 9. 6的碳酸鹽緩沖液配制成2ug/ml親和素包被液包被微孔板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述試劑盒還包括稀釋液，洗滌液，肺炎衣原體抗體 IgM陰性對照、陽性對照、校準品，辣根過氧化物酶標記的抗人IgM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一所述的試劑盒，辣根過氧化物酶標記的抗人IgM為羊抗人 IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM單抗。
全文摘要
本發(fā)明“檢測肺炎衣原體IgM抗體的試劑盒”，屬于醫(yī)學檢測試劑。包括包被親和素的微孔板，生物素化的肺炎衣原體抗原、辣根過氧化物酶標記的抗人IgM和化學發(fā)光底物。本發(fā)明以親和素包被微孔板，通過親和素-生物素系統(tǒng)間接包被生物素化的抗原，不僅便于放大生產(chǎn)、易于監(jiān)控生產(chǎn)過程，而且避免了直接包被固相存在的活性損失大、工藝優(yōu)化繁瑣等缺點，同時保證了批次間的穩(wěn)定性。
文檔編號G01N33/531GK102368068SQ20111018327
公開日2012年3月7日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者彭京勝, 李全, 焦守恕 申請人:同昕生物技術(shù)(北京)有限公司