專利名稱：胰島素與血清蛋白可逆性結(jié)合的親和力指標(biāo)測(cè)定方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及胰島素與血清蛋白結(jié)合指標(biāo)的測(cè)定，具體涉及一種胰島素與血清蛋白可逆性結(jié)合的親和力指標(biāo)測(cè)定方法及應(yīng)用。本發(fā)明方法可用于糖尿病的預(yù)警、早期診斷、預(yù)后判斷、藥物篩選、指導(dǎo)預(yù)防和治療。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)公開了糖尿病是一種以血糖代謝紊亂為特點(diǎn)的常見慢性疾病，其中90%以上為2型糖尿病(Type 2diabeteS，T2DM)。胰島素抵抗在2型糖尿病發(fā)病中起重要作用，并貫穿于2型糖尿病全過程。胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，各種實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，胰島素抵抗的發(fā)生多是與炎癥反應(yīng)、激素因子作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及過量的營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)物在胰島素敏感組織堆積等共同作用所致。妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是指在妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖代謝異常。GDM發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，它由多種因素作用所致，有研究報(bào)道，胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞分泌降低是GDM發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。已知白蛋白是最主要的血漿蛋白之一，它可以作為一大類生物活性物質(zhì)和藥物的體內(nèi)儲(chǔ)存體和轉(zhuǎn)運(yùn)體。血清中的胰島素大多與血清蛋白相結(jié)合。有研究表明首先，在血清中存在兩種不同形式的胰島素，即游離胰島素和與其它蛋白結(jié)合的胰島素；游離胰島素作為活性形式而結(jié)合胰島素作為非活性形式存在；其次，血清白蛋白作為胰島素的轉(zhuǎn)運(yùn)體和存儲(chǔ)體。根據(jù)以上兩點(diǎn)，研究者提出胰島素抵抗發(fā)生機(jī)制的設(shè)想假設(shè)并證實(shí)游離胰島素是作為立即可供機(jī)體利用的形式，而結(jié)合胰島素處于非活性狀態(tài)，但可從結(jié)合蛋白質(zhì)中分離從而保持游離胰島素水平的穩(wěn)定。研究者認(rèn)為，在某些病理狀態(tài)下則可以改變這種平衡，例如高脂血癥和肥胖。如果血清白蛋白-胰島素結(jié)合力增加，則可供利用的游離胰島素水平降低；相反，如果血清白蛋白-胰島素結(jié)合力降低，由于游離胰島素半衰期很短，則可供利用的游離胰島素水平在餐后上升而在空腹水平時(shí)下降；因此，不論是在哪種條件下，胰腺都要分泌更多的胰島素以維持血糖在空腹和餐后狀態(tài)下的正常水平；如果這種補(bǔ)償機(jī)制失衡，則正常的空腹血糖水平無法維持。因此，本領(lǐng)域研究人員擬建立有關(guān)測(cè)定血清蛋白結(jié)合的胰島素和未結(jié)合有其它蛋白的胰島素的方法，為進(jìn)一步證實(shí)上述設(shè)想并探討影響白蛋白-胰島素結(jié)合力的未知的病理因素及其發(fā)揮作用的機(jī)制，提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種胰島素與血清蛋白結(jié)合指標(biāo)的測(cè)定方法，具體涉及一種胰島素與血清蛋白可逆性結(jié)合的親和力指標(biāo)測(cè)定方法。本發(fā)明方法獲得的測(cè)定指標(biāo)可進(jìn)一步為糖尿病的預(yù)警、早期診斷、預(yù)后判斷、藥物篩選、指導(dǎo)預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。本發(fā)明方法中，所述的親和力指標(biāo)，包括蛋白結(jié)合胰島素、游離胰島素、結(jié)合/游離胰島素比值以及蛋白捕獲胰島素能力。具體而言，本發(fā)明的胰島素與血清蛋白可逆性結(jié)合的親和力指標(biāo)測(cè)定方法，其特征在于，其包括步驟I)檢測(cè)胰島素濃度采用胰島素檢測(cè)試劑盒測(cè)定(DiagnosticSystem Laboratory,Webster, TX)血清和2%白蛋白中所含胰島素水平；為確定不同制備方法獲得白蛋白中的胰島素含量，本發(fā)明的實(shí)施例中，分別檢測(cè)了4種市售白蛋白的胰島素含量以及不同血清層及白蛋白溶液的胰島素含量；2)高壓液相色譜分析(HPLC)分析白蛋白-胰島素結(jié)合 HPLC檢測(cè)胰島素和白蛋白混合物中胰島素含量，HPLC檢測(cè)吐溫處理的胰島素和白蛋白混合物中胰島素含量；3)分離制備檢測(cè)游離胰島素和結(jié)合胰島素通過超濾離心柱(MicronconYM_30Centrifugal ultrafiltration tube,Millipore Corporation, Billerica, MA)分離溶液中的游離胰島素和蛋白結(jié)合胰島素；4)測(cè)定白蛋白捕獲膜島素能力采用一個(gè)固相系統(tǒng)檢測(cè)膽固醇對(duì)白蛋白-胰島素結(jié)合的影響，最大程度降低溶解膽固醇時(shí)需要的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，包括白蛋白包被ELISA法檢測(cè)不同血清層及白蛋白層的胰島素含量。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述的胰島素與血清蛋白可逆性結(jié)合的親和力指標(biāo)測(cè)定方法的用途。本發(fā)明中，進(jìn)行了細(xì)胞增殖試驗(yàn)，采用MTT(Sangon, Shanghai, China)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(AEC)及實(shí)驗(yàn)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd. 3)細(xì)胞活性的變化；本發(fā)明中，進(jìn)行了脂質(zhì)和藥物對(duì)胰島素結(jié)合能力的影響試驗(yàn)，通過超濾離心柱分離所檢標(biāo)本，將超濾后的上下層溶液進(jìn)行胰島素檢測(cè)；本發(fā)明中，檢測(cè)了脂質(zhì)和藥物影響胰島素-白蛋白結(jié)合的作用對(duì)細(xì)胞增殖的影響；本發(fā)明中，進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證⑴含與不含胰島素的白蛋白對(duì)正常和STZ誘導(dǎo)的I型糖尿病小鼠血糖的影響；(2) α I抗胰蛋白酶對(duì)白蛋白-胰島素結(jié)合以及血糖的影響；(3)外源性白蛋白對(duì)瘦素缺乏小鼠胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。本發(fā)明中，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P
<O. 05定義統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異。本發(fā)明中，進(jìn)一步的從體外生化研究、培養(yǎng)細(xì)胞模型、病人血清相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)、影響胰島素與血清蛋白質(zhì)可逆性結(jié)合的親和力的藥物和血清成份、正常動(dòng)物和糖尿病動(dòng)物胰島素與血清蛋白結(jié)合的親和力改變對(duì)血糖的影響等方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證I)體外生化研究表明市售的用冷乙醇沉淀法制備的白蛋白含有胰島素(用熱休克法制備的白蛋白不含胰島素)；去垢劑可將胰島素從白蛋白中分離，說明白蛋白-胰島素結(jié)合是通過親脂基團(tuán)介導(dǎo)的非共價(jià)結(jié)合；親脂基團(tuán)介導(dǎo)的每個(gè)白蛋白分子平均結(jié)合約4個(gè)胰島素分子，其中2個(gè)結(jié)合較松散，易解離；液體中蛋白結(jié)合的胰島素和游離胰島素的比例存在一種平衡，當(dāng)游離胰島素被清除后，結(jié)合于其它蛋白上的胰島素可被釋放，以補(bǔ)充被清除的游離胰島素；白蛋白-胰島素的解離與結(jié)合在化學(xué)是可逆的。2)在體外培養(yǎng)細(xì)胞模型證實(shí)白蛋白-胰島素的解離與結(jié)合在維持細(xì)胞生長(zhǎng)的功能上是可逆的。3)病人血清指標(biāo)檢測(cè)顯示，II型糖尿病人的血清未結(jié)合胰島素和結(jié)合胰島素的比例呈兩極分化，或過高，或過低；含游離胰島素的血清組份發(fā)揮促細(xì)胞增殖的能力快但持續(xù)時(shí)間很短，相反含蛋白結(jié)合胰島素的血清組份發(fā)揮促細(xì)胞增殖的能力慢但持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，總血清具有2者的共同作用，所有血清組份促細(xì)胞細(xì)胞增殖的功能均可被胰島素受體酪氨酸激酶抑制劑HNMPA- (AM) 3所抑制。4)胰島素與血清蛋白可逆性結(jié)合的親和力受藥物和血清成份調(diào)節(jié)脂質(zhì)如游離脂肪酸、甘油三酯、膽固醇和糖尿病治療藥物格列苯脲可以促進(jìn)游離胰島素的釋放；低濃度α I抗胰蛋白酶明顯增加結(jié)合胰島素/游離胰島素的比值；瘦素降低胰島素與白蛋白的結(jié) 口 ο5)腹腔注射結(jié)合有胰島素的白蛋白可降低正常小鼠的血糖，相反，注射未結(jié)合有胰島素的白蛋白可升高正常小鼠的血糖；注射未結(jié)合有胰島素的白蛋白可顯著抑制胰島素注射引起的血糖降低，防止低血糖休克，而注射結(jié)合有胰島素的白蛋白則無此作用。6)對(duì)STZ造成的胰島素缺乏小鼠，注射可使正常小鼠休克的等量胰島素對(duì)其血糖無顯著影響，但事先注射結(jié)合有胰島素的白蛋白，然后再注射胰島素，則血糖顯著下降，相反，如果事先改注未結(jié)合有胰島素的白蛋白，則小鼠血糖明顯高于僅注射胰島素組；在體內(nèi)，α I抗胰蛋白酶可通過與胰島素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合白蛋白，促使胰島素從胰島素-白蛋白復(fù)合物中解離和利用，從而調(diào)節(jié)血糖；白蛋白和瘦素兩者競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合胰島素，注射白蛋白可改變蛋白結(jié)合的胰島素與游離胰島素的比值，顯著減輕瘦素缺乏糖尿病小鼠的病理異常和血糖升聞，相反注射白蛋白可使非自發(fā)糖尿病的C57小鼠血糖升聞。本發(fā)明的胰島素與血清蛋白可逆性結(jié)合的親和力指標(biāo)測(cè)定方法，尤其可測(cè)定血清蛋白結(jié)合的胰島素和未結(jié)合有其它蛋白的胰島素，該方法經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了有關(guān)胰島素抵抗發(fā)生機(jī)制的設(shè)想假設(shè)并證實(shí)游離胰島素是作為立即可供機(jī)體利用的形式，而結(jié)合胰島素處于非活性狀態(tài)，但可從結(jié)合蛋白質(zhì)中分離從而保持游離胰島素水平的穩(wěn)定。本方法可用于探討影響白蛋白-胰島素結(jié)合力的未知的病理因素及其發(fā)揮作用的機(jī)制。本發(fā)明方法獲得的測(cè)定指標(biāo)可進(jìn)一步為糖尿病的預(yù)警、早期診斷、預(yù)后判斷、藥物篩選、指導(dǎo)預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。根據(jù)本發(fā)明方法獲得的測(cè)定指標(biāo)可進(jìn)一步制備有關(guān)預(yù)防和治療以及檢測(cè)糖尿病的試劑盒，其中可包括檢測(cè)白蛋白捕獲胰島素能力指標(biāo)，白蛋白在血清中調(diào)節(jié)結(jié)合胰島素、游離胰島素濃度及其比值，高甘油三酯、膽固醇對(duì)胰島素抵抗的影響指標(biāo)，以及血清各組份結(jié)合胰島素、游離胰島素的功能指標(biāo)等。根據(jù)本發(fā)明方法，有關(guān)α-I抗胰蛋白酶與白蛋白相互作用可進(jìn)一步應(yīng)用于糖尿病診斷和治療。根據(jù)本發(fā)明方法，有關(guān)瘦素與白蛋白相互作用可進(jìn)一步應(yīng)用于糖尿病診斷和治療。


圖I白蛋白中胰島素含量的檢測(cè)，
ELISA 4 種檢測(cè)市售血清白蛋白 BSA0281、A3803、HSA12666HSA、HSA126658 中胰島素含量，2nd Ab為不加抗白蛋白抗體的對(duì)照。圖2去污劑可將胰島素從白蛋白中分離，ELISA結(jié)果顯示I %吐溫20和2% SDS可以分別將35%和91 %的胰島素從白蛋白中釋放出來(A) ;HPLC結(jié)果顯示對(duì)比不加吐溫組，胰島素-白蛋白混合液中加入吐溫20可以將20. I %的胰島素釋放出來。圖3白蛋白具有持續(xù)釋放游離胰島素的能力，ELISA方法檢測(cè)溶液中第一次超濾和第二次超濾后游離胰島素和結(jié)合胰島素的量。圖4去除胰島素的白蛋白可以再次結(jié)合胰島素， 將白蛋白包被于酶標(biāo)板上用以捕獲胰島素，包被用白蛋白濃度為20μ g/ml，用以被捕獲的胰島素溶液濃度分別為5和10 μ IU/ml，被捕獲的胰島素含量用吸光度(0D405)表
/Jn ο圖5白蛋白結(jié)合在功能上是可逆的，采用無血清培養(yǎng)劑培養(yǎng)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)后采用MTT法分別檢測(cè)第I、
3、5天細(xì)胞的增殖情況，細(xì)胞處理分別為2%白蛋白、10000倍生理濃度的純胰島素、吐溫20處理的白蛋白、吐溫20處理的白蛋白中加入胰島素以及磷酸緩沖液對(duì)照。圖6白蛋白-胰島素的結(jié)合可以受到藥物的調(diào)節(jié)，將格列苯服(Glybenclamide)、甲基狐(Merform)和格列卩比嗪(Gliplide)加入3% BSA0281溶液中，溫浴30分鐘后檢測(cè)其中游離胰島素和結(jié)合胰島素的量。圖7脂質(zhì)對(duì)游離胰島素/結(jié)合胰島素濃度平衡的影響，在3 % BSA0281 中分別加入 O. 5mg/ml 或 2mg/ml 游離脂肪酸，2mg/ml 或 5. Omg/mlLDL, 5mmol/L甘油三酯和10mmol/L膽固醇后測(cè)定游離胰島素和結(jié)合胰島素,對(duì)照組采用PBS或溶解脂質(zhì)的氯仿。圖8膽固醇抑制白蛋白對(duì)胰島素利用的調(diào)節(jié)作用，A :僅加胰島素(12. 5U/L) ；B :僅加2%結(jié)合有胰島素(19. 23mU/L)的白蛋白；C :力口胰島素與白蛋白。*和**料表示兩組同時(shí)間點(diǎn)比較P小O. 05和O. 01。圖9 2型糖尿病人中游離胰島素和結(jié)合胰島素的比例兩極分化，左正常人的結(jié)合胰島素/游離胰島素比值；右糖尿病人的結(jié)合胰島素/游離胰島素平均比值。圖10 2型糖尿病患者和正常對(duì)照血清組份促細(xì)胞增殖能力，A :含游離胰島素的血清組分促細(xì)胞增殖的能力；B :含結(jié)合胰島素的組分促細(xì)胞增殖的能力；C:總血清含結(jié)合胰島素的組分促細(xì)胞增殖的能力。上述血清組份在含與不含胰島素受體酪氨酸激酶抑制劑HNMPA-(AM)3的條件下對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。圖11白蛋白對(duì)小鼠低血糖性休克的保護(hù)作用，注射胰島素可誘發(fā)低血糖昏迷，而不含胰島素的白蛋白預(yù)處理后則保持清醒。圖12含與不含胰島素的白蛋白對(duì)不同血胰島素作用的調(diào)節(jié)，A :正常小鼠注射PBS ；B :正常小鼠注射胰島素；C :STZ引起的I型糖尿病小鼠注射胰島素。a組事先注射PBS山組事先注射結(jié)合有胰島素的白蛋白；(組事先注射未結(jié)合有胰島素的白蛋白。圖13免疫共沉淀技術(shù)證明α I抗胰蛋白酶在血清中與白蛋白結(jié)合而不與胰島素
結(jié)合，用α I抗胰蛋白酶的抗體去沉淀與之結(jié)合的蛋白，非特異IgG作為對(duì)照。圖14不同濃度α I抗胰蛋白酶對(duì)白蛋白-胰島素結(jié)合力的影響，用高濃度、正常濃度和低濃度的α I抗胰蛋白酶(終濃度分別為10.3mg/ml，2. 58mg/ml和O. 645mg/ml)加入到預(yù)先混合有3%白蛋白和20mIU/L胰島素的PBS溶液中，觀察其對(duì)兩者結(jié)合力的影響，不加α I抗胰蛋白酶的3%白蛋白和20mIU/L胰島素的PBS溶液作為對(duì)照。圖15注射3%白蛋白和不同濃度α I抗胰蛋白酶的混合液后小鼠的不同反應(yīng)，C57BL/6J小鼠腹腔注射含有3%白蛋白和α I抗胰蛋白酶(終濃度分別為10. 3mg/ml (A), 2. 58mg/ml (B)和O. 645mg/ml (C))的混合液Ih后，再注射胰島素,觀察這三組小鼠的反應(yīng)能力，圖3A可以看出α I抗胰蛋白酶終濃度為10. 3mg/ml小鼠呈昏迷狀態(tài)，圖3B和C則可以看出其余2組小鼠的活力和行為正常，精神良好。圖16 α I抗胰蛋白酶的濃度與血糖水平的變化呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系，用含有O,O. 64mg/m 1、2· 58mg/m或10. 30mg/ml α I抗胰蛋白酶和3%白蛋白的PBS溶液腹腔注射小鼠后lh，再經(jīng)尾靜脈注射胰島素，觀察血糖濃度，以注射不含白蛋白但含相應(yīng)濃度的αI抗胰蛋白酶溶液為對(duì)照。圖17白蛋白和胰島素對(duì)小鼠血清α I抗胰蛋白酶濃度的影響，在不同初始白蛋白/α I抗胰蛋白酶比值條件下，單獨(dú)或同時(shí)注射白蛋白和胰島素對(duì)血清α I抗胰蛋白酶濃度的影響。圖18瘦素對(duì)胰島素與白蛋白力結(jié)合的影響，在3%白蛋白(BSA0281 sigma-aIdrich)溶液中加入2mg/ml的瘦素和lng/Ι的胰島素，常溫孵育2h，用30kD的超濾管離心此溶液，測(cè)定上層中的結(jié)合胰島素的濃度，以此檢測(cè)瘦素對(duì)胰島素與白蛋白結(jié)合的影響，圖中BSA+leptin vs BSA+insulin+leptin P< O. 01。圖19BSA對(duì)ob/ob和C57小鼠空腹血糖值的影響，四組小鼠從4周齡用于實(shí)驗(yàn)起，每三天測(cè)定一次空腹血糖，測(cè)定前一天禁食12h，血糖測(cè)量后，腹腔注射3%的BSA。ob/ob小鼠0. 5ml/每只;C57小鼠0. 3ml/每只，連續(xù)測(cè)量 8 周，圖中ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS P < O. 05 η = 10 ；C57+BSA vs C57+PBS P < 0. 05η = IO0圖20BSA對(duì)ob/ob和C57小鼠非空腹血糖值的影響，小鼠從4周齡用于實(shí)驗(yàn)起，每周測(cè)定一次非空腹血糖，測(cè)定前一天小鼠正常飲食，連續(xù)測(cè)量 8 周，ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS P < 0. 05 η = 10 (6、8、10、12 周齡時(shí)間點(diǎn))；C57+BSA vs C57+PBS P > 0. 05 η = 10。圖21BSA對(duì)ob/ob和C57小鼠體重的影響，ob/ob小鼠6周齡時(shí)體重約30g ；C57小鼠6周齡體重約16g,每周測(cè)量一次各組小鼠的體重值，觀測(cè) BSA 對(duì)體重的影響，ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS P < O. 05 η = 10 ；C57+BSAvs C57+PBS P > 0. 05 η = 10。
圖22BSA對(duì)ob/ob和C57小鼠血清中結(jié)合胰島素與游離胰島素比值的影響，Elisa方法檢測(cè)血清中總胰島素濃度和上層血清中的結(jié)合胰島素濃度，計(jì)算各組小鼠的結(jié)合胰島素與游離胰島素濃度的比值，圖中ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS P < O. 05 η=10 ；C57+BSA vs C57+PBS P > 0.05 η = 10。圖23BSA對(duì)ob/ob和C57小鼠胰島胰腺體積比值的影響，小鼠全胰島組織的石蠟切片，每隔50 μ m取一張，做HE染色，用Imagemeasurement統(tǒng)計(jì)軟件測(cè)量每張切片中的胰島總面積和胰腺總面積，計(jì)算兩者比值，乘以間隔距離50 μ m,即胰島胰腺的體積比值，ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS P < 0. 05 η = 10 ；C57+BSA vsC57+PBS P < 0. 05 η = 10。圖24BSA對(duì)C57小鼠血清瘦素水平的影響，
實(shí)驗(yàn)觀察至12周齡時(shí)處死小鼠，提取血清測(cè)定血清瘦素濃度，Elisa方法測(cè)定血 清中瘦素濃度，C57+BSA vs C57+PBS P < 0. 05 η = 10。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例II檢測(cè)胰島素濃度血清和2%白蛋白中所含胰島素水平依據(jù)廠家說明采用胰島素檢測(cè)試劑盒測(cè)定(DiagnosticSystem Laboratory, Webster, TX)。為確定不同制備方法獲得白蛋白中的胰島素含量，我們檢測(cè)了 4種白蛋白，分別是2%無游離脂肪酸和免疫球蛋白的牛血清白蛋白(BSA, Sigma-Aldrichcatalogue number A0281, BSA0281, St. Louis, MO)，牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich cataloguenumber A3803),人血清白蛋白(HSA,EMD Chemicals cataloguenumber 12666, San Diego, CA),高純度人血清白蛋白(EMD Chemicals catalogue number126658)。其它檢測(cè)包括ELISA檢測(cè)上層血清的胰島素含量，ELISA檢測(cè)下層血清的胰島素含量，ELISA檢測(cè)總血清的胰島素含量，ELISA檢測(cè)白蛋白的胰島素含量，ELISA檢測(cè)白蛋白上層的胰島素含量，ELISA檢測(cè)白蛋白下層的胰島素含量。2高壓液相色譜分析(HPLC)分析白蛋白-胰島素結(jié)合同為5mg/ml濃度的白蛋白和胰島素混合于PBST，37°C下放置2h。同時(shí)以PBS代替PBST作為對(duì)照。溫育后，100 μ I混合物上樣至gel filtration column (ULTRASPHERE0DSGF250, Beckman Coulter, Fullerton, CA),并用 HP Series 1100 solvent deliverysystem (Hewlett Packard, Palo Alto, CA)以 0. 5ml/min 流速進(jìn)行分析。柱子以 PBS 作為流動(dòng)相。用280nm吸光度監(jiān)測(cè)蛋白含量。樣本檢測(cè)包括HPLC檢測(cè)胰島素和白蛋白混合物中胰島素含量，HPLC檢測(cè)吐溫處理的胰島素和白蛋白混合物中胰島素含量。3分離制備游離胰島素和結(jié)合胰島素為了將游離胰島素和蛋白結(jié)合胰島素分離，溶液通過超濾離心柱(MicronconYM-30Centrifugal ultrafiltration tube,Millipore Corporation, Bi 11 erica, MA)進(jìn)行分離。游離胰島素分子量為5733KD，因此可以通過濾膜進(jìn)入下層，而結(jié)合胰島素則留在上層。上層用PBS恢復(fù)至原體積。包括超濾離心柱分離純化血清上層和下層，超濾離心柱分離純化白蛋白上層和下層。4測(cè)定白蛋白捕獲膜島素能力采用一個(gè)固相系統(tǒng)研究膽固醇對(duì)白蛋白-胰島素結(jié)合的影響，從而最大程度降低了溶解膽固醇時(shí)需要的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。普通白蛋白(BSA0281)、吐溫20處理的白蛋白和膽固醇預(yù)處理的吐溫20處理白蛋白分別包被于96孔酶標(biāo)板上用于捕獲不同濃度胰島素。10% BSA0281室溫孵育2小時(shí)，超濾管超濾去除胰島素。同時(shí)用PBS代替PBST作為對(duì)照。一半PBST處理的BSA0281置于膽固醇溶液(0.5% in PBS containing O. 1%ethanol)孵育2小時(shí)。余下的PBST和PBS處理的BSA0281相同環(huán)境下放置2小時(shí)。超濾純化后，蛋白濃度用PBS調(diào)至2%。上述蛋白的結(jié)合胰島素能力采用下面方法測(cè)定1)在96孔酶標(biāo)板上分別每孔加入100 μ I 2% Tween-20-treated BSA0281、未處理BSA0281或膽固醇預(yù)處理的Tween-20處理BSA0281，常溫孵育2h ；2)用2%甘氨酸封閉未結(jié)合位點(diǎn)防 止假陽性結(jié)果;3)每孔加100μ I胰島素標(biāo)準(zhǔn)品(5和10mU/l)，室溫孵育2小時(shí)；4)用固定液(1%甲醇和3.7%甲醛)將胰島素固定至酶標(biāo)板上；5)每孔加入100 μ I抗人胰島素單克隆抗體(I 100)，室溫孵育2h ；6)每孔加入100 μ I抗鼠IgG-HRP復(fù)合物(I 500)孵育 Ih ；7)加入 100 μ I TMB 溶液(EMD Chemicals, San Diego)室溫顯色 Ih ；8)加入 100 μ I終止液(0. 2mM sulfuric acid)并在酶標(biāo)儀(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)上讀取450nm處吸光度值。步驟4和7之間，采用PBST洗板3次x5min。陰性對(duì)照在第4步中采用PBS代替一抗。樣本檢測(cè)包括白蛋白包被ELISA法檢測(cè)上層血清的胰島素含量，白蛋白包被ELISA法檢測(cè)下層血清的胰島素含量，白蛋白包被ELISA法檢測(cè)總血清的胰島素含量，白蛋白包被ELISA法檢測(cè)白蛋白的胰島素含量，白蛋白包被ELISA法檢測(cè)白蛋白上層的胰島素含量，白蛋白包被ELISA法檢測(cè)白蛋白下層的胰島素含量，白蛋白包被ELISA法檢測(cè)白蛋白下層的胰島素含量。實(shí)施例2細(xì)胞增殖試驗(yàn)原代大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(AEC)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道從8-9周齡雄性Wistar大鼠分離。采用第4代細(xì)胞進(jìn)行研究。小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd. 3)購自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(ATCC，Manassas, VA) qAEC和 bEnd. 3 細(xì)胞都用含 10%胎牛血清(Invitrogen, carlsbad, CA)、100U/ml 氨芐西林，和 100mg/ml 鏈霉素的 DMEM(1000mg/L D-glucose)培養(yǎng)。0. 25%胰酶-0. 02%EDTA消化后，每孔加入150μ I含3000個(gè)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)劑，使其恢復(fù)12h。隨后用上述制備好的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)劑代替普通培養(yǎng)劑。采用MTT(Sangon, Shanghai, China).法檢測(cè)第1、3、5天細(xì)胞活性的變化變化。490nm出吸光度值采用酶標(biāo)儀檢測(cè)(Molecular Devices,Sunnyvale, CA)。吐溫20處理的白蛋白的促細(xì)胞增殖作用通過觀察2% BSA0281, Tween 20-處理的BSA0281或Tween 20-處理的BSA0281中加入胰島素(250mU/ml)對(duì)AEC細(xì)胞的作用來檢測(cè)。純胰島素和PBS分別用于陽性和陰性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)采用無血清培養(yǎng)系統(tǒng)。為了檢測(cè)糖尿病人血清對(duì)細(xì)胞的作用，分別用2型糖尿病病人全血清、上層血清和下層血清組分代替胎牛血清。胰島素的特異性作用通過比較加入200 μ M HNMPA-(AM) 3的結(jié)果得出。HNMPA-(AM) 3是一種可透過細(xì)胞膜的ΗΝΜΡΑ。它能特異性抑制胰島素受體酪氨酸激酶活性(IC50 = ΙΟΟμΜ)，并且可抑制小鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)的胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖氧化(IC50=10yM)。HNMPA-(AM) 3 采 用 DMSO (dimethyl sulfoxide)溶解。DMSO 在培養(yǎng)劑中的最大終濃度不超過O. I %。并用同劑量DMSO作為對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)與分組包括MTT檢測(cè)血清上層對(duì)細(xì)胞增殖的影響，MTT檢測(cè)血清下層對(duì)細(xì)胞增殖的影響，MTT檢測(cè)總血清對(duì)細(xì)胞增殖的影響，MTT檢測(cè)白蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響，MTT檢測(cè)吐溫處理的白蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響，MTT檢測(cè)膽固醇處理的吐溫預(yù)處理的白蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響，MTT檢測(cè)加入胰島素的吐溫處理的白蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響，MTT檢測(cè)加入HNMPA-(AM)3處理的白蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響，MTT檢測(cè)加入DMSO處理的白蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響。實(shí)施例3脂質(zhì)和藥物對(duì)胰島素結(jié)合能力的影響2 % BSA0281中分別加入PBS、高濃度(5mmol/L)和低濃度(2mmol/L)甘油三酉旨(sigma intralipids)、高濃度(10mmol/L)和低濃度(5mmol/L)膽固醇(amresco)、2mmol/L 游離脂肪酸(sigma FFAP)、5mmol/l LDL、lmg/L 格列苯脲(sigma)、15mg/L 格列齊特、5mg/L 二甲雙胍，室溫下放置30分鐘后，通過超濾離心柱(Microncon YM-30Centrifugalultrafiltration tube, Millipore Corporation, Billerica, MA)進(jìn)行分離，將超濾后的上下層溶液進(jìn)行胰島素檢測(cè)。為了觀察去除游離胰島素的白蛋白是否還能繼續(xù)釋放游離胰島素，將PBS組超濾后的上層溶液再加入PBS恢復(fù)至初始容量，并室溫下放置30分后再次超濾，上下層溶液同樣進(jìn)行胰島素檢測(cè)。實(shí)施例4脂質(zhì)和藥物影響胰島素-白蛋白結(jié)合的作用對(duì)細(xì)胞增殖的影響為了觀察藥物脂質(zhì)對(duì)胰島素結(jié)合能力的影響對(duì)細(xì)胞增殖的作用，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔小鼠Bend. 3腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的初始濃度為3000個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入2%人血清白蛋白組和胰島素(250mU/ml)，并分為5個(gè)小組分別加入5mmol/L甘油三酯(sigmaintralipids)、10mmol/L 膽固醇(amresco)、2mmol/L 游離脂肪酸(sigma FFAP)、
I.5mg/L格列苯脲(sigma)或0. 1% DMSO和1%氯仿。本實(shí)驗(yàn)采用無血清培養(yǎng)系統(tǒng)。純胰島素(250mU/ml)、2%人血清白蛋白和PBS作為對(duì)照組。實(shí)施例5體內(nèi)試驗(yàn)(一)含與不含胰島素的白蛋白對(duì)正常和STZ誘導(dǎo)的I型糖尿病小鼠血糖的影響選取20g左右體重的雄性C57BL/6J小鼠48只。實(shí)驗(yàn)前，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境，給予C57BL/6J小鼠嚙齒類動(dòng)物普通飼料；將小鼠禁食12h，按200mg/kg體重腹腔注射STZ I次，成功制備I型糖尿病小鼠模型，該模型具有高血糖、體重減輕、多飲多食多尿的特點(diǎn)，與臨床I型糖尿病吻合。
I.所有C57BL/6J小鼠在實(shí)驗(yàn)前一天予以禁食12h。次日先檢測(cè)空腹血糖，血糖均由 Abott 公司的 Medisense Optium Xceed 血糖儀和 Medisense Optium Xceed 血糖試紙進(jìn)行檢測(cè)。血液標(biāo)本采取小鼠尾尖取血的方式。為消除血糖檢測(cè)時(shí)小鼠可能的應(yīng)激反應(yīng)對(duì)血糖值的影響，所有小鼠在每次血糖檢測(cè)之前均予以異氟醚吸入麻醉。2. I隨后，53只C57BL/6J小鼠分為6組，分別做如下處理第I組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射3%含有胰島素的白蛋白(2ml/25g體重)溶液，Ih后注射胰島素溶液(2IU/kg體重)；n = 10，第II組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射PBS溶液，Ih后注射PBS溶液；n = 10，第III組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有3%含有胰島素的白蛋白(2ml/25g體重)溶液，Ih后注射PBS溶液；n = 9，
第IV組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射PBS溶液，Ih后注射胰島素溶液(2IU/kg體重)；n = 9,第V組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射3%不含有胰島素的白蛋白(2ml/25g體重)溶液，Ih后注射胰島素溶液(2IU/kg體重)；n = 8，第VI組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有3%不含有胰島素的白蛋白(2ml/25g體重)溶液，Ih后注射PBS溶液；n = 7，2. 2. 27只STZ誘導(dǎo)的C57BL/6J I型糖尿病小鼠，分為3組，分別做如下處理第I組腹腔注射3%含有胰島素的白蛋白(2ml/25g體重)溶液，Ih后注射胰島素溶液(2IU/kg體重)；n = 10,第II組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射PBS溶液，Ih后注射胰島素溶液(2IU/kg體重)；n = 8,第III組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有3%不含含胰島素的白蛋白(2ml/25g體重)溶液，Ih后注射胰島素溶液(2IU/kg體重);n = 9，3.注射完胰島素的lh，2h和3h后分別檢測(cè)每只小鼠的血糖值；4.隨后所有小鼠予以眼球取血先使小鼠眼球突出充血后，以彎頭眼科鑷迅速鉗取眼球，并將小鼠倒置，頭向下，眼眶內(nèi)很快流出血液，讓血液滴入Ep管，直至不流為止；5.提取血清將所有小鼠的血液標(biāo)本于37°C條件下放置半小時(shí)，2，OOOrpm離心15分鐘后取上清，-80°C保存。(二)α I抗胰蛋白酶對(duì)白蛋白-胰島素結(jié)合以及血糖的影響選取20g左右體重的雄性C57BL/6J小鼠96只。實(shí)驗(yàn)前，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境，給予C57BL/6J小鼠嚙齒類動(dòng)物普通飼料。I.所有C57BL/6J小鼠在實(shí)驗(yàn)前一天予以禁食12h。次日先檢測(cè)空腹血糖。血糖均由 Abott 公司的 Medisense Optium Xceed 血糖儀和 Medisense Optium Xceed 血糖試紙進(jìn)行檢測(cè)。血液標(biāo)本采取小鼠尾尖取血的方式。為消除血糖檢測(cè)時(shí)小鼠可能的應(yīng)激反應(yīng)對(duì)血糖值的影響，所有小鼠在每次血糖檢測(cè)之前均予以異氟醚吸入麻醉。2. 96只C57BL/6J小鼠分為16組，每組6只，分別做如下處理第I組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有5%白蛋白(2ml/25g體重)和α I抗胰蛋白酶(終濃度為10. 3mg/ml)的PBS溶液；第II組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射僅含有α I抗胰蛋白酶(終濃度為10. 3mg/ml)的PBS溶液；第III組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有5%白蛋白(2ml/25g體重)和α I抗胰蛋白酶(終濃度為2. 58mg/ml)的PBS溶液；第IV組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射僅含有α I抗胰蛋白酶(終濃度為2. 58mg/ml)的PBS溶液；第V組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有5%白蛋白(2ml/25g體重)和α I抗胰蛋白酶(終濃度為O. 645mg/ml)的PBS溶液；第VI組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射僅含α I抗胰蛋白酶(終濃度為O. 645mg/ml)的PBS溶液；
第VII組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射僅含有5%白蛋白(2ml/25g體重)的PBS溶液；第VIII組C57BL/6J小鼠予以腹腔注射PBS溶液。3.上述8組小鼠分別注射完Ih之后，予以第二次檢測(cè)各組小鼠的血糖值，每組小鼠均予以尾靜脈注射胰島素(2IU/kg體重)。4.在注射完胰島素的lh，2h和3h后分別檢測(cè)每只小鼠的血糖值。5.所有小鼠予以眼球取血先使小鼠眼球突出充血后，以彎頭眼科鑷迅速鉗取眼球，并將小鼠倒置，頭向下，眼眶內(nèi)很快流出血液，讓血液滴入Ep管，直至不流為止。6.提取血清將所有小鼠的血液標(biāo)本于37°C條件下放置半小時(shí)，2，OOOrpm離心15分鐘后取上清，-80°C保存。第IX至XVI組處理與以上8組相同，但用PBS替代胰島素進(jìn)行腹腔注射。(三)外源性白蛋白對(duì)瘦素缺乏小鼠胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制雄性ob/ob小鼠,4周齡,體重28g左右，由上海中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，雄性C57小鼠，4周齡，體重15g左右，由上海中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，20只ob/ob mice分為兩組A組10只注射3% BSA和B組10只注射PBS。20只C57分為兩組C組10只注射3% BSA和D組10只注射PBS。所有動(dòng)物每三天注射一次BSA，注射之前測(cè)空腹血糖，記錄血糖值；每一周測(cè)一次非空腹血糖，記錄血糖值；每一周稱量一次體重，記錄體重值。病人血清標(biāo)本采集正常人和糖尿病人空腹血清標(biāo)本通過中山醫(yī)院和上海松江醫(yī)院收集。受試者各組在年齡和性別上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。受試者無心、肝、肺、腎及其它重要器官功能障礙，也無懷孕。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤表示。以P < O. 05定義統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異。本發(fā)明所采用的關(guān)鍵材料為膜島素檢測(cè)試劑盒(DiagnosticSystem Laboratory, Webster, TX) 牛血清白蛋白(BSA, Sigma-Aldrich catalogue number A0281, BSA0281, St. Louis, MO),BSA(Sigma-Aldrichcatalogue number A3803),人血清白蛋白(HSA, EMD Chemicalscatalogue number 12666, San Diego, CA)和高純?nèi)搜?EMD Chemicals cataloguenumber 126658)。 gel filtrationcolumn(ULTRASPHERE ODS GF250, Beckman Coulter,Fullerton,CA),HP Series IlOOsolvent delivery system(Hewlett Packard,Palo Alto,CA)。66份正常人血清(空腹血糖4. 3-5. 6mmol/l)和217份新診斷為糖尿病的病人血清(空腹血糖 6. 9-22. 2 or 11. 9± I. Ommol/1)。離心超濾管 YM-30 (Millipore Corporation,Billerica, MA)。原代培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(按文獻(xiàn)報(bào)道制備)和bend. 3小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(ATCC, Manassas, VA)。TMB 溶液(EMD Chemicals, San Diego)。酶標(biāo)儀(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)。MTT 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(Sangon, Shanghai,China)。HNMPA- (AM) 3 (EMD Chemicals, San Diego)。小鼠 α I 抗胰蛋白酶 ELISA 試劑(ADL公司)，小鼠瘦素 Elisa 檢測(cè)試劑盒(Millipore Corporation Billerica, MA), OptiumXceed血糖儀和試紙(美國(guó)雅培公司)。結(jié)果顯示I市售白蛋白含有胰島素4種市售胰島素中只有一種顯著含有胰島素(BSA0281，Sigma, St. Louis, MO)，其 它3種基本不含胰島素(圖I) ,BSA0281采用改良Cohn法制備，第一步用冷乙醇沉淀，而其它的都是用經(jīng)典法制備，第一步采用的是熱休克的方法。因此BSA0281可以作為下述實(shí)驗(yàn)血清蛋白的替代。2去污劑可將胰島素從白蛋白中分離如果白蛋白可以作為胰島素的攜帶物和儲(chǔ)存庫，那么2者的結(jié)合必須是可逆的，以保證在血清中胰島素可以從白蛋白上釋放出來執(zhí)行游離胰島素的功能。ELISA結(jié)果顯示I %吐溫20和2% SDS可以分別將35%和91%的胰島素從白蛋白中釋放出來(圖2A)。隨后HPLC的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果。HPLC結(jié)果顯示對(duì)比不加吐溫組，胰島素-白蛋白混合液中加入吐溫20可以將20. I %的胰島素釋放出來。由于胰島素分子量為白蛋白的1/10，因此我們估算I個(gè)白蛋白分子可以釋放出2個(gè)胰島素分子(圖2B)。3白蛋白具有持續(xù)釋放游離胰島素的能力將3%白蛋白溶液靜置30分后，采用超濾管超濾，溶液中的游離胰島素可以通過超濾膜進(jìn)入下層，采用ELISA方法可以檢測(cè)該溶液中的游離胰島素含量。隨后用PBS溶液將已經(jīng)過濾掉游離胰島素的上層白蛋白溶液恢復(fù)至原體積，再次靜置30分鐘，超濾，并檢測(cè)游離胰島素的含量。結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)谝淮斡坞x胰島素被濾出后，第二次超濾仍然有胰島素被濾出，并且與第一次濾過后得到的游離胰島素的濃度無明顯差異(圖3)，提示白蛋白可以連續(xù)釋放游離胰島素，并且游離胰島素的濃度是相對(duì)固定的。4白蛋白可以再次結(jié)合胰島素將不含胰島素的白蛋白包被至96孔酶標(biāo)板上，分別采用吐溫20、PBS或膽固醇處理后，依次加入胰島素和抗胰島素抗體，并用羊抗鼠-AP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)隨著胰島素濃度的升高而升高，提示釋放出胰島素的白蛋白可以繼續(xù)結(jié)合胰島素。沒有用吐溫20處理的白蛋白結(jié)合胰島素能力明顯不如處理后的白蛋白。如果再用膽固醇處理吐溫20處理后的白蛋白，其結(jié)合能力則顯著降低，并且明顯低于不處理的白蛋白(圖4)。提示白蛋白結(jié)合能力可以被膽固醇所封閉，而吐溫20處理后則可以暴露出白蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)。5白蛋白結(jié)合在功能上是可逆的采用無血清培養(yǎng)劑培養(yǎng)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，2%白蛋白和純胰島素的促細(xì)胞生長(zhǎng)能力相當(dāng)。根據(jù)sigma建議純胰島素的終濃度大約為生理劑量的10000倍以保證培養(yǎng)過程中活性的丟失。吐溫20處理的白蛋白喪失了促細(xì)胞增殖的能力。在吐溫20處理的白蛋白中加入胰島素可以恢復(fù)其促細(xì)胞增殖能力(圖5)。6白蛋白-胰島素的結(jié)合可以受到藥物的調(diào)節(jié)在3% BSA溶液中加入3種常用抗糖尿病藥物，靜置30分后檢測(cè)其中結(jié)合胰島素與游離胰島素的含量，發(fā)現(xiàn)格列苯脲(Glybenclamide)能夠促進(jìn)游離胰島素的釋放，而另2個(gè)甲基胍(Merform)和格列吡嗪(Gliplide)則沒有類似作用(圖6)。7白蛋白-胰島素的結(jié)合可以受到脂質(zhì)的調(diào)節(jié)
在3% BSA0281中分別加入2mg/ml游離脂肪酸，5. Omg/ml LDL, 5mmol/L甘油三酯和lOmmol/L膽固醇后，發(fā)現(xiàn)這些脂質(zhì)都可以升高BSA溶液中的游離胰島素并降低結(jié)合胰島素，而低濃度的游離脂肪酸(0.5mg/ml)和LDL(2mg/ml)則沒有這種效果。對(duì)照組采用PBS或溶解脂質(zhì)的氯仿，二者也沒有引起上述胰島素比例的改變。8膽固醇抑制白蛋白對(duì)胰島素利用的調(diào)節(jié)作用采用無血清培養(yǎng)劑培養(yǎng)的腦微動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，在無白蛋白的條件下500倍生理濃度的純胰島素(12. 5U/L)僅能維持細(xì)胞2天，而后細(xì)胞數(shù)逐日減少(圖8A)。而結(jié)合有胰島素的白蛋白(2%)，雖然胰島素濃度(19.23mU/L)低，但可維持細(xì)胞生長(zhǎng)最少5天(圖SB)。白蛋白和胰島素同時(shí)加入培養(yǎng)液中，則細(xì)胞生長(zhǎng)最少維持5天，并且在第5天細(xì)胞數(shù)明顯高于其它兩組(圖8C)。在無白蛋白的條件下，膽固醇對(duì)胰島素的作用無影響(圖8A)，相反，在白蛋白和胰島素都存在的條件下，膽固醇的細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用(圖8B，8C)。92型糖尿病人中游離胰島素和結(jié)合胰島素的比例兩極分化本試驗(yàn)測(cè)定的正常人血清總胰島素濃度范圍是13. 29±1.68mU/l，糖尿病人是
4.38±1· OOmU/1 (P < O. 001)。正常人血清游離胰島素含量在 I. 35-5. 05(2. 71±0· 24)mU/1之間很窄的范圍內(nèi)變動(dòng)。而糖尿病人的血清游離胰島素濃度范圍擴(kuò)大(O. 07-10. 01，2. 23±0. 68mU/l)。正常人和糖尿病人的結(jié)合胰島素/游離胰島素平均平均比值相似(4.06±0.66vs 4.67±1.63)。但是糖尿病人極端化現(xiàn)象較突出。91. 2%正常人比值在1.4-10。而僅有11. 8%的患者比值在該范圍內(nèi)。其余的要么低于1.4(64. 7% )要么高于10(23. 5% )(圖9)。所有高甘油三酯(fasting TG彡3. 3mol/l)的糖尿病患者比值均大于
10(和余下患者比較P = 0.010)。為了確定低胰島素水平是否影響其比值，總胰島素含量正常的患者和正常人進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，所有總胰島素含量正常(>5mU/l)的患者其比值均小于I。10糖尿病患者和正常對(duì)照血清組份促細(xì)胞增殖能力I倍體積的血清組分加入9倍體積的無血清培養(yǎng)劑中進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)。含游離胰島素的組份在第一天具有明顯的促細(xì)胞增殖的能力，第3天該作用消失(圖10A)。相比較而言，含結(jié)合胰島素的組份在第一天促細(xì)胞增殖活性不強(qiáng)，但是其活性持續(xù)至第五天(圖10B)?？傃寰哂?者的共同作用(圖10C)。高甘油三酯和無高甘油三酯的患者血清沒有明顯差異。令人驚奇的是，采用含10%糖尿病人的血清的培養(yǎng)劑培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度明顯高于含10%正常人血清的培養(yǎng)劑，尤其是血清胰島素濃度正常的血清，其生長(zhǎng)速度明顯高于正常血清。所有血清促細(xì)胞細(xì)胞增殖的功能都可以被胰島素受體酪氨酸激酶抑制劑HNMPA-(AM) 3 所抑制(圖 10)。11白蛋白結(jié)合胰島素的能力可以保護(hù)小鼠的低血糖性休克
小鼠預(yù)先腹腔注射Iml 5%不含胰島素白蛋白溶液或等劑量PBS，Ih后靜脈注射2U/Kg胰島素，觀測(cè)小鼠的低血糖休克反應(yīng)。結(jié)果顯示未經(jīng)胰島素預(yù)處理的小鼠注射胰島素后發(fā)生了低血糖昏迷，而采用5%不含胰島素白蛋白溶液預(yù)處理的小鼠則未發(fā)生低血糖性昏迷(圖11)。12含與不含胰島素的白蛋白對(duì)不同血胰島素濃度作用的調(diào)節(jié)腹腔注射結(jié)合有胰島素的白蛋白可降低正常小鼠的血糖，相反，注射未結(jié)合有胰島素的白蛋白可升高正常小鼠的血糖(圖12A);注射未結(jié)合有胰島素的白蛋白可顯著抑制胰島素注射引起的血糖降低，注射結(jié)合有胰島素的白蛋白則無此作用(圖12B) JiSTZ造成的胰島素缺乏小鼠，注射同等量的胰島素對(duì)血糖無顯著影響，但事先注射結(jié)合有胰島素的白蛋白，然后在注射胰島素，則血糖顯著下降，相反，如果事先改注未結(jié)合有胰島素的白 蛋白，則小鼠血糖明顯高于僅注射胰島素組(圖12C)。13免疫共沉淀技術(shù)證明白蛋白與α I抗胰蛋白酶在血清中呈結(jié)合狀態(tài)用α I抗胰蛋白酶的抗體去沉淀與之結(jié)合的蛋白，非特異IgG作為對(duì)照。結(jié)果顯示在α I抗胰蛋白酶抗體組可明顯檢測(cè)到α I抗胰蛋白酶的表達(dá)，同時(shí)也可以檢測(cè)到白蛋白的表達(dá)；在control IgG組則未發(fā)現(xiàn)有α I抗胰蛋白酶的表達(dá)，但同時(shí)也檢測(cè)到白蛋白的表達(dá)，但含量明顯低于α I抗胰蛋白酶抗體組(P < O. 05)(圖13)，分析可能是由于蛋白A/G瓊脂糖珠制備過程中用白蛋白作為非特異吸附的封閉無所致。14體外實(shí)驗(yàn)證明不同濃度α I抗胰蛋白酶對(duì)白蛋白-胰島素結(jié)合力的影響分別用高濃度、正常濃度和低濃度的α I抗胰蛋白酶(終濃度分別為10. 3mg/ml,
2.58mg/ml和O. 645mg/ml)加入到預(yù)先混合有3%白蛋白和20mIU/L胰島素的PBS溶液中觀察對(duì)兩者結(jié)合力的影響，不加α I抗胰蛋白酶的3%白蛋白和20mIU/L胰島素的PBS溶液作為對(duì)照。圖14A和B顯示的是加入不同濃度的α I抗胰蛋白酶后所測(cè)得的結(jié)合胰島素和游離胰島素的值，結(jié)果顯示與PBS組相比，低濃度的α I抗胰蛋白酶可以增加結(jié)合胰島素的含量，同時(shí)也降低游離胰島素的含量，高濃度和正常濃度的α I抗胰蛋白酶對(duì)結(jié)合胰島素或游離胰島素的含量沒有影響。圖14C顯示的是加入不同濃度的α I抗胰蛋白酶后結(jié)合胰島素/游離胰島素的比值。結(jié)果顯示與正常濃度α I抗胰蛋白酶/白蛋白組相比，低濃度α I抗胰蛋白酶明顯增加了結(jié)合胰島素/游離胰島素的比值(2.41±0. 17 vs I. 76±0. 20，P = O. 0024);低濃度α I抗胰蛋白酶/白蛋白組和高濃度α I抗胰蛋白酶/白蛋白組之間該比值更加明顯(2. 41±0. 17vs 1.53±0. 18，Ρ = O. 0004);而正常濃度α I抗胰蛋白酶/白蛋白組和高濃度α I抗胰蛋白酶/白蛋白組之間該比值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = O. 1406)。15動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明不同濃度α I抗胰蛋白酶對(duì)白蛋白-胰島素相互作用和血糖的影響I)注射3%白蛋白和不同濃度α I抗胰蛋白酶的混合液后小鼠的不同反應(yīng)圖3顯示的是予以C57BL/6J小鼠腹腔注射含有3%白蛋白和α I抗胰蛋白酶(終濃度分別為10. 3mg/ml, 2. 58mg/ml和O. 645mg/ml)的混合液Ih后，再注射胰島素,觀察這三組小鼠的反應(yīng)能力。圖15A可以看出小鼠呈昏迷狀態(tài)，圖15B和C則可以看出小鼠的活力和行為都比較正常，精神良好。其余各組小鼠在行為和反應(yīng)上均沒有明顯變化。2)不同濃度的α I抗胰蛋白酶對(duì)白蛋白_胰島素相互作用后血糖濃度的影響用含有O. 64mg/ml α I抗胰蛋白酶和3%白蛋白的PBS溶液腹腔注射小鼠后，該組小鼠的血糖水平明顯升高，阻止了胰島素誘導(dǎo)的低血糖反應(yīng)。將α I抗胰蛋白酶的濃度增加到2. 58mg/ml和10. 30mg/ml后，胰島素誘導(dǎo)的低血糖反應(yīng)則出現(xiàn)加大且延長(zhǎng)(圖16)。α I抗胰蛋白酶的濃度與血糖水平的變化呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖16)。注射不含白蛋白的α I抗胰蛋白酶(分別為O. 64，2. 58和10. 30mg/ml)則與注射正常濃度和高濃度的α I抗
胰蛋白酶/白蛋白組類似。16白蛋白和胰島素對(duì)小鼠血清α I抗胰蛋白酶濃度的影響白蛋白/α I抗胰蛋白酶比值低于正常時(shí)，注射白蛋白可提高血清α I抗胰蛋白酶濃度(圖17a，17b)，而白蛋白/ α I抗胰蛋白酶比值正?；蛘吒哂谡r(shí)，白蛋白對(duì)α I抗胰蛋白酶濃度無影響(圖17c，17d)。相反，注射胰島素可顯著降低注射PBS或者少量(O. 64mg/ml) α I抗胰蛋白酶小鼠的血清α I抗胰蛋白酶濃度(圖17a，17b)。17白蛋白和瘦素對(duì)胰島素體外自然滅活的影響將單純胰島素溶液、胰島素加白蛋白或者瘦素溶液以及三種物質(zhì)混合液在室溫下放置8小時(shí)，檢測(cè)胰島素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種溶液胰島素的降解率分別為99. 2%、10. 9%、70. 2%和26. 1%。進(jìn)一步研究顯示瘦素降低胰島素與白蛋白的結(jié)合。18瘦素對(duì)胰島素和白蛋白結(jié)合的影響瘦素可以降低BSA與游離胰島素的結(jié)合(圖18)。BSA+insulin+leptin上層結(jié)合胰島素濃度為O. 38±0. 04 ；BSA+leptin的上層結(jié)合胰島素濃度為O. 49±0. 06，兩者相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = O. 00015)。19BSA對(duì)ob/ob小鼠空腹血糖值的影響血糖測(cè)量值結(jié)果顯示，C57小鼠注射BSA(η = 10)后，空腹血糖相對(duì)值與注PBS(n=10)對(duì)照組相比有增高趨勢(shì)，且9周后血糖顯著增高(P <0.01)。至12周齡時(shí)，C57注BSA組(η = 10)血糖相對(duì)值比ob/ob注BSA組血糖相對(duì)值高3. 2倍(P < O. 01)。ob/ob注BSA組(η = 10)空腹血糖相對(duì)值低于PBS對(duì)照組(η = 10)，血糖變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致(圖 19)。20BSA對(duì)ob/ob小鼠非空腹血糖值的影響血糖測(cè)量值結(jié)果顯示C57小鼠注射BSA后，非空腹血糖相對(duì)值與PBS對(duì)照組相差不明顯，血糖變化趨勢(shì)一致。ob/ob注BSA后，非空腹血糖相對(duì)值低于對(duì)照組，在6、8、10、12周時(shí)血糖相對(duì)值差異明顯(P < 0.01)血糖變化趨勢(shì)與PBS對(duì)照組一致(圖20)。ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS在6、8、10、12周齡時(shí)血糖相對(duì)值分別為0.64±0.06vs 0·88±0·04，Ρ = O. 0036 ;0· 57±0. 04 vs 0·85±0·03，Ρ = 4. 4Ε-05 ；O. 73±0· 07vs0. 95±0· 04,P = O. 0113 ；0. 78±0· 07 vs I. 09±0· 06,P = O. 0039。C57+BSAvs C57+PBS 在 8 周齡時(shí)血糖相對(duì)值為 O. 72±0· 04 vs 0. 87±0· 02，P = 0. 0021。BSA注入ob/ob小鼠體內(nèi)，降低非空腹血糖值，BSA注入C57后，非空腹血糖變化不明顯，只在8周齡時(shí)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各周齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)。2IBSA對(duì)ob/ob小鼠體重的影響C57注BSA組和PBS組的每周測(cè)定體重值沒有差異(P > 0. 05)，即BSA對(duì)C57小鼠的體重沒有影響。ob/ob小鼠體重從第7周齡開始，BSA組的體重值明顯低于PBS組，7、8、9、10、11、12周齡兩組體重的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤分別為41.41±0. 43 vs45. 3±0· 77 ；42. 26±0· 57 vs 45. 7±0· 76 ；46. 02±0· 72 vs 49. 6±0· 82 ；45. 16±0· 72 vs49. 29±0. 91 ;45. 11±0. 87 vs 49. 16±0. 94 ;47. 15±0. 95 vs 51. 03±0. 96 (各組 P 值均
<0. 01)(圖21)，所以BSA對(duì)ob/ob小鼠體重的增加有明顯的抑制作用。22BSA對(duì)ob/ob小鼠血清中結(jié)合胰島素與游離胰島素比值的影響ob/ob小鼠的結(jié)合胰島素與游離胰島素濃度的比值高于C57小鼠(P < O. 05)。ob/ob注BSA后兩者比值與注PBS對(duì)照組相比明顯降低(3. 46±0. 89 vs 13. 79±2. 61) (P =0.0354)。C57注BSA后比值與PBS對(duì)照組相比無變化(I. 41 ±0.28 vs I. 27±0. 49)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P = 0. 808)(圖22)。23胰島胰腺體積比值的影響ob/ob小鼠注BSA后胰島胰腺體積比值與對(duì)照組相比降低24. 3% (0. 068±0. 017vsO. 089±0. 018) (P = 0. 0036) ；C57小鼠注射BSA后胰島胰腺比值與對(duì)照組相比降低30% (0. 014±0· 009 vs 0. 023±0. 012)兩者均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P = 0. 0082)(圖 23)。24BSA注射降低血清中瘦素水平的測(cè)定ob/ob小鼠血清中無瘦素。C57注BSA后血清瘦素濃度為I. 54±0. 1，PBS對(duì)照組血清瘦素濃度為2. 4±0. 25，兩組瘦素水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0. 0135)(圖24)。
權(quán)利要求
1.胰島素與血清蛋白可逆性結(jié)合的親和力指標(biāo)測(cè)定方法，其特征在于，其包括步驟 1)檢測(cè)胰島素濃度 采用胰島素檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清和2%白蛋白中所含胰島素水平； 2)高壓液相色譜分析分析白蛋白-胰島素結(jié)合 HPLC檢測(cè)胰島素和白蛋白混合物中胰島素含量，HPLC檢測(cè)吐溫處理的胰島素和白蛋白混合物中胰島素含量； 3)分離制備檢測(cè)游離胰島素和結(jié)合胰島素 通過超濾離心柱分離溶液中的游離胰島素和蛋白結(jié)合胰島素； 4)測(cè)定白蛋白捕獲胰島素能力 采用一個(gè)固相系統(tǒng)檢測(cè)膽固醇對(duì)白蛋白-胰島素結(jié)合的影響，包括白蛋白包被ELISA法檢測(cè)不同血清層及白蛋白層的胰島素含量；超濾法測(cè)定蛋白結(jié)合胰島素、非蛋白結(jié)合的游離胰島素及其比值的方法。
2.按權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述步驟I)中分別檢測(cè)不同血清層及白蛋白溶液的胰島素含量。
3.按權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述步驟I)中分別檢測(cè)下述血清層及白蛋白溶液的胰島素含量 ELISA檢測(cè)上層血清的胰島素含量， ELISA檢測(cè)下層血清的胰島素含量， ELISA檢測(cè)總血清的胰島素含量， ELISA檢測(cè)白蛋白溶液的胰島素含量， ELISA檢測(cè)白蛋白溶液超濾上層的胰島素含量， ELISA檢測(cè)白蛋白溶液超濾下層的胰島素含量。
4.按權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述步驟2)中，將同為5mg/ml濃度的白蛋白和胰島素混合于PBST溶液，37°C下放置2h，以PBS代替PBST作為對(duì)照。
5.按權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述步驟3)中，所述的游離胰島素分子量為5733KD，通過濾膜進(jìn)入下層，結(jié)合胰島素留在上層；上層用PBS恢復(fù)至原體積，超濾離心柱分離純化含白蛋白和胰島素溶液的上層和下層。
6.按權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述步驟4)中，包括 白蛋白包被ELISA法檢測(cè)上層血清的胰島素含量， 白蛋白包被ELISA法檢測(cè)下層血清的胰島素含量， 白蛋白包被ELISA法檢測(cè)總血清的胰島素含量， 白蛋白包被ELISA法檢測(cè)白蛋白的胰島素含量， 白蛋白包被ELISA法檢測(cè)白蛋白上層的胰島素含量， 白蛋白包被ELISA法檢測(cè)白蛋白下層的胰島素含量， 白蛋白包被ELISA法檢測(cè)白蛋白下層的胰島素含量。
7.權(quán)利要求I所述的方法在糖尿病預(yù)警、診斷、預(yù)后判斷、藥物篩選、預(yù)防和治療中的應(yīng)用。
8.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所獲得的測(cè)定指標(biāo)在制備預(yù)防和治療以及檢測(cè)糖尿病的試劑盒中的用途。
9.按按權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所獲得的測(cè)定指標(biāo)包括檢測(cè)白蛋白捕獲胰島素能力指標(biāo)，白蛋白在血清中調(diào)節(jié)結(jié)合胰島素、游離胰島素濃度及其比值，高甘油三酯、膽固醇對(duì)胰島素抵抗的影響指標(biāo)，以及血清各組份結(jié)合胰島素、游離胰島素的功能指標(biāo)。
10.按權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的血清各組份結(jié)合胰島素、游離胰島素的功能指標(biāo)在制備診斷和治療糖尿病制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及胰島素與血清蛋白結(jié)合指標(biāo)的測(cè)定，具體涉及一種胰島素與血清蛋白可逆性結(jié)合的親和力指標(biāo)測(cè)定方法及應(yīng)用。本發(fā)明方法包括蛋白結(jié)合胰島素、游離胰島素、結(jié)合/游離胰島素比值以及蛋白捕獲胰島素能力測(cè)定。經(jīng)體外生化研究、培養(yǎng)細(xì)胞模型、病人血清指標(biāo)檢測(cè)、影響胰島素與血清蛋白可逆性結(jié)合的親和力的藥物和血清成份、正常動(dòng)物和糖尿病動(dòng)物胰島素與血清蛋白結(jié)合的親和力改變對(duì)血糖的影響等試驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明方法獲得的測(cè)定指標(biāo)可進(jìn)一步為糖尿病的預(yù)警、早期診斷、預(yù)后判斷、藥物篩選、指導(dǎo)預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N33/74GK102854325SQ20111018436
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者陳思鋒, 陸超, 欒麗娟, 張雪晴, 侯彥強(qiáng), 孟丹, 李曉波, 向萌, 王麗, 趙鳳娣 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)